JPH06169780A - 膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子dna - Google Patents
膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子dnaInfo
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- JPH06169780A JPH06169780A JP32692792A JP32692792A JPH06169780A JP H06169780 A JPH06169780 A JP H06169780A JP 32692792 A JP32692792 A JP 32692792A JP 32692792 A JP32692792 A JP 32692792A JP H06169780 A JPH06169780 A JP H06169780A
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【目的】 コリネ型細菌由来の膜蛋白質の膜への組み込
みに関与する遺伝子DNAの提供。 【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
からセックワイ(secY)遺伝子DNAを単離し、こ
の遺伝子の塩基配列を決定し、該遺伝子DNA断片を有
するコリネ型細菌内で安定なプラスミドpCRY30−
secYを構築した。
みに関与する遺伝子DNAの提供。 【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
からセックワイ(secY)遺伝子DNAを単離し、こ
の遺伝子の塩基配列を決定し、該遺伝子DNA断片を有
するコリネ型細菌内で安定なプラスミドpCRY30−
secYを構築した。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、コリネ型細菌由来の膜
蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子DNAに関
し、さらに詳しくは膜蛋白質の膜への組み込みに関与す
る主要な遺伝子の1つセックワイ(secY)遺伝子に
関する。secY遺伝子産物は、膜蛋白質、分泌蛋白質
が各々、細胞膜内へ組み込まれる、菌体外へ分泌される
過程に必要不可欠な遺伝子である。該遺伝子を利用する
ことにより、膜蛋白質の膜中含量の増加、分泌蛋白質の
菌体外分泌量の増加が期待される。また、膜蛋白質、例
えば酸化還元酵素の含量増加により、高活性を有する高
性能生体触媒として菌体を利用し、部位特異的酸化還元
等による様々の物質生産に応用することが可能である。
蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子DNAに関
し、さらに詳しくは膜蛋白質の膜への組み込みに関与す
る主要な遺伝子の1つセックワイ(secY)遺伝子に
関する。secY遺伝子産物は、膜蛋白質、分泌蛋白質
が各々、細胞膜内へ組み込まれる、菌体外へ分泌される
過程に必要不可欠な遺伝子である。該遺伝子を利用する
ことにより、膜蛋白質の膜中含量の増加、分泌蛋白質の
菌体外分泌量の増加が期待される。また、膜蛋白質、例
えば酸化還元酵素の含量増加により、高活性を有する高
性能生体触媒として菌体を利用し、部位特異的酸化還元
等による様々の物質生産に応用することが可能である。
【0002】
【従来の技術】蛋白質の膜への組み込み及び分泌に関す
る機構は、エシェリヒア・コリ(Escherichi
a coli)においてよく研究されており[Annu
alReview Genetics 24,215−
248,1990.Annual Review of
Biochemistry,60,101−124,
1991]、蛋白質の膜への組み込みに関する遺伝子と
してsecA[Journal of Bacteri
ology,150,686−691,1982]、s
ecB[Journal of Bacteriolo
gy,154,254−260,1983]、secD
[Journal of Bacteriology,
169,1286−1290,1987]、secE
[Genetics;118,571−579,198
8]、secF[EMBO Journal,9,32
09−3216,1990]、secY[Nuclei
c Acids Research,11,2599−
2616,1983]等が知られている。
る機構は、エシェリヒア・コリ(Escherichi
a coli)においてよく研究されており[Annu
alReview Genetics 24,215−
248,1990.Annual Review of
Biochemistry,60,101−124,
1991]、蛋白質の膜への組み込みに関する遺伝子と
してsecA[Journal of Bacteri
ology,150,686−691,1982]、s
ecB[Journal of Bacteriolo
gy,154,254−260,1983]、secD
[Journal of Bacteriology,
169,1286−1290,1987]、secE
[Genetics;118,571−579,198
8]、secF[EMBO Journal,9,32
09−3216,1990]、secY[Nuclei
c Acids Research,11,2599−
2616,1983]等が知られている。
【0003】これらの中でsecA,E,Y遺伝子は、
各種変異株を用いた研究により蛋白質の膜への組込みに
特に重要な役割を演じていることが示されている。上記
secY遺伝子としては、エシェリヒア・コリ(Esc
herichia coli)由来の遺伝子[Nucl
eic Acids Research,11,p.2
599−2616,1983参照]、バチルス・サチル
ス(Bacillussubtilis)由来の遺伝子
[Journal of Biochemistry,
107,p.603−607,1990参照]等が単離
されている。しかしながら、産業上重要な細菌であるコ
リネ型細菌由来のsecY遺伝子については、従来の報
告例は見当らない。
各種変異株を用いた研究により蛋白質の膜への組込みに
特に重要な役割を演じていることが示されている。上記
secY遺伝子としては、エシェリヒア・コリ(Esc
herichia coli)由来の遺伝子[Nucl
eic Acids Research,11,p.2
599−2616,1983参照]、バチルス・サチル
ス(Bacillussubtilis)由来の遺伝子
[Journal of Biochemistry,
107,p.603−607,1990参照]等が単離
されている。しかしながら、産業上重要な細菌であるコ
リネ型細菌由来のsecY遺伝子については、従来の報
告例は見当らない。
【0004】一般に、膜蛋白質は細胞膜中より抽出した
場合不安定であり、生体触媒として利用するには限界が
ある。特定膜蛋白質の膜中含量のみを増加させることが
可能であれば、高含量の膜、もしくは微生物自体を触媒
として利用することができる。しかしながら、膜蛋白質
を微生物細胞内で高発現させても、細胞質内でインクル
ージョン・ボディ(inclusion body)を
形成し、細胞膜内へ組み込まれない。膜蛋白質を高発現
させ、膜内に安定に保持させるためには、蛋白質の膜へ
の組み込み系を強化する必要があると考えられるが、コ
リネ型細菌由来の膜組み込み系についての知見がなく、
また、多種由来の膜組み込み系は、コリネ型細菌中で十
分に機能しないと考えられる[Molecular M
icrobiology,4,305−314,199
0,FEBS Letters,273,75−78,
1990参照]。
場合不安定であり、生体触媒として利用するには限界が
ある。特定膜蛋白質の膜中含量のみを増加させることが
可能であれば、高含量の膜、もしくは微生物自体を触媒
として利用することができる。しかしながら、膜蛋白質
を微生物細胞内で高発現させても、細胞質内でインクル
ージョン・ボディ(inclusion body)を
形成し、細胞膜内へ組み込まれない。膜蛋白質を高発現
させ、膜内に安定に保持させるためには、蛋白質の膜へ
の組み込み系を強化する必要があると考えられるが、コ
リネ型細菌由来の膜組み込み系についての知見がなく、
また、多種由来の膜組み込み系は、コリネ型細菌中で十
分に機能しないと考えられる[Molecular M
icrobiology,4,305−314,199
0,FEBS Letters,273,75−78,
1990参照]。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記問
題点を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細
菌由来の膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子を
単離し、改変することにより、特定膜蛋白質の膜中含量
増加を達成できると考え、コリネ型細菌由来の膜蛋白質
の膜への組み込みに関与する主要な遺伝子であるsec
Y遺伝子DNAを単離することに成功し、本発明を完成
するに至った。
題点を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細
菌由来の膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子を
単離し、改変することにより、特定膜蛋白質の膜中含量
増加を達成できると考え、コリネ型細菌由来の膜蛋白質
の膜への組み込みに関与する主要な遺伝子であるsec
Y遺伝子DNAを単離することに成功し、本発明を完成
するに至った。
【0006】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、(1)コリネ型細菌由来の膜蛋白質の膜への組み込
みに関与する遺伝子DNA、(2)該遺伝子DNAが導
入された組換えプラスミド及び(3)該組換えプラスミ
ドで形質転換されたコリネ型細菌が提供される。
ば、(1)コリネ型細菌由来の膜蛋白質の膜への組み込
みに関与する遺伝子DNA、(2)該遺伝子DNAが導
入された組換えプラスミド及び(3)該組換えプラスミ
ドで形質転換されたコリネ型細菌が提供される。
【0007】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明の「膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺
伝子DNA」とは、細胞膜中蛋白質の膜への組み込み、
菌体外分泌蛋白質の分泌に関与する装置を構成する主要
成分をコードする遺伝子DNAを意味するものである。
該主要成分をコードする遺伝子DNAであるsecY遺
伝子DNAを含むDNA断片(以下、これを「A断片」
と略称することがある)は、その塩基配列が決定された
後においては合成することも可能であるが、通常は微生
物からクローニングされる場合が多く、その供給源とな
る微生物としては、コリネ型細菌が有利に使用される。
る。本発明の「膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺
伝子DNA」とは、細胞膜中蛋白質の膜への組み込み、
菌体外分泌蛋白質の分泌に関与する装置を構成する主要
成分をコードする遺伝子DNAを意味するものである。
該主要成分をコードする遺伝子DNAであるsecY遺
伝子DNAを含むDNA断片(以下、これを「A断片」
と略称することがある)は、その塩基配列が決定された
後においては合成することも可能であるが、通常は微生
物からクローニングされる場合が多く、その供給源とな
る微生物としては、コリネ型細菌が有利に使用される。
【0008】これらの供給源微生物からA断片を調製す
るための基本操作の一例を述べれば次のとおりである:
A断片は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウ
ム・フラバム(Brevibacterium fla
vum)MJ−233(FERM BP−1497)株
の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限酵素で切
断することにより生ずる切断断片の中から以下に述べる
方法で、分離取得することができる。
るための基本操作の一例を述べれば次のとおりである:
A断片は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウ
ム・フラバム(Brevibacterium fla
vum)MJ−233(FERM BP−1497)株
の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限酵素で切
断することにより生ずる切断断片の中から以下に述べる
方法で、分離取得することができる。
【0009】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムMJ
−233株の培養物から染色体DNAを抽出する。この
染色体DNAを適当な制限酵素、例えばEcoRIを用
いて染色体DNAを完全に分解する。得られるDNA断
片をクローニングベクター、例えばpUC118(宝酒
造製)に挿入し、このベクターを用いてエシエリヒア・
コリJM109(宝酒造製)を形質転換し、形質転換体
を取得する。
−233株の培養物から染色体DNAを抽出する。この
染色体DNAを適当な制限酵素、例えばEcoRIを用
いて染色体DNAを完全に分解する。得られるDNA断
片をクローニングベクター、例えばpUC118(宝酒
造製)に挿入し、このベクターを用いてエシエリヒア・
コリJM109(宝酒造製)を形質転換し、形質転換体
を取得する。
【0010】得られる形質転換体よりプラスミドDNA
を抽出し、エシエリヒア・コリ、バチルス・サチルス由
来secY遺伝子の共通領域配列をプローブとして用い
るサザンハイブリダイゼーションにより、挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムMJ−233株染色体由来
のA断片を確認・取得することができる。かくして得ら
れるA断片をさらに適当な制限酵素を用いて切断し、得
られるDNA断片を同種のベクターに挿入し、エシエリ
ヒア・コリJM109を形質転換する。得られる形質転
換体よりプラスミドDNAを抽出し、ハイブリダイゼー
ションにより挿入されたブレビバクテリウム・フラバム
MJ−233株染色体由来のA断片を確認・取得するこ
とができる。
を抽出し、エシエリヒア・コリ、バチルス・サチルス由
来secY遺伝子の共通領域配列をプローブとして用い
るサザンハイブリダイゼーションにより、挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムMJ−233株染色体由来
のA断片を確認・取得することができる。かくして得ら
れるA断片をさらに適当な制限酵素を用いて切断し、得
られるDNA断片を同種のベクターに挿入し、エシエリ
ヒア・コリJM109を形質転換する。得られる形質転
換体よりプラスミドDNAを抽出し、ハイブリダイゼー
ションにより挿入されたブレビバクテリウム・フラバム
MJ−233株染色体由来のA断片を確認・取得するこ
とができる。
【0011】このようにして得られるA断片の一つは、
上記ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233株の染
色体DNAを制限酵素EcoRIの完全分解により切り
出し、さらにそれを制限酵素KpnIで切断又は制限酵
素KpnIで直接切断することによって得られる大きさ
が約1.5kbのDNA断片を挙げることができる。こ
の約1.5kbのsecY遺伝子DNAを含むDNA断
片を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位数及び
切断断片の大きさを下記第1表に示す。
上記ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233株の染
色体DNAを制限酵素EcoRIの完全分解により切り
出し、さらにそれを制限酵素KpnIで切断又は制限酵
素KpnIで直接切断することによって得られる大きさ
が約1.5kbのDNA断片を挙げることができる。こ
の約1.5kbのsecY遺伝子DNAを含むDNA断
片を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位数及び
切断断片の大きさを下記第1表に示す。
【0012】
【表1】第1表 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) BalI 1 0.4,1.1 PstI 2 0.3,0.5,0.7 SacI 1 0.6,0.9 SmaI 1 0.2,1.3
【0013】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、DNA断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い1%アガロースゲル電気泳動および5
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。
「認識部位数」は、DNA断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い1%アガロースゲル電気泳動および5
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。
【0014】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ(λphag
e)のDNAを制限酵素HindIIIで切断して得ら
れる分子量既知のDNA断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス174ファージ(φx17
4phage)のDNAを制限酵素HaeIIIで切断
して得られる分子量既知のDNA断片の同一ポリアクリ
ルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づ
き、切断DNA断片又はプラスミドの各DNA断片の大
きさを算出する。プラスミドの大きさは、切断断片のそ
れぞれの大きさを加算して求める。なお、各DNA断片
の大きさの決定において、1kb以上の断片の大きさに
ついては、1%アガロースゲル電気泳動によって得られ
る結果を採用し、約0.1kbから1kb未満の断片の
大きさについては4%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって得られる結果を採用した。
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ(λphag
e)のDNAを制限酵素HindIIIで切断して得ら
れる分子量既知のDNA断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス174ファージ(φx17
4phage)のDNAを制限酵素HaeIIIで切断
して得られる分子量既知のDNA断片の同一ポリアクリ
ルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づ
き、切断DNA断片又はプラスミドの各DNA断片の大
きさを算出する。プラスミドの大きさは、切断断片のそ
れぞれの大きさを加算して求める。なお、各DNA断片
の大きさの決定において、1kb以上の断片の大きさに
ついては、1%アガロースゲル電気泳動によって得られ
る結果を採用し、約0.1kbから1kb未満の断片の
大きさについては4%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって得られる結果を採用した。
【0015】一方、上記のブレビバクテリウム・フラバ
ムMJ−233の染色体DNAを制限酵素EcoRI、
KpnIによって切断又は制限酵素KpnIで直接切断
することにより得られる大きさが約1.5kbのDNA
断片については、その塩基配列をプラスミドpUC11
8またはpUC119(宝酒造製)を用いるジデオキシ
ヌクレオチド酵素法(dideoxy chain t
ermination法、Sanger,F.et.a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,74,5463,1977)により決定することが
できる。このようにして決定した上記約1.5kbのD
NA断片の塩基配列のオープンリーディングフレームの
存在から決定したsecY遺伝子DNAは、後記配列表
の配列番号1に示す配列を有するものであり、440個
のアミノ酸をコードする1320の塩基対から構成され
る。
ムMJ−233の染色体DNAを制限酵素EcoRI、
KpnIによって切断又は制限酵素KpnIで直接切断
することにより得られる大きさが約1.5kbのDNA
断片については、その塩基配列をプラスミドpUC11
8またはpUC119(宝酒造製)を用いるジデオキシ
ヌクレオチド酵素法(dideoxy chain t
ermination法、Sanger,F.et.a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,74,5463,1977)により決定することが
できる。このようにして決定した上記約1.5kbのD
NA断片の塩基配列のオープンリーディングフレームの
存在から決定したsecY遺伝子DNAは、後記配列表
の配列番号1に示す配列を有するものであり、440個
のアミノ酸をコードする1320の塩基対から構成され
る。
【0016】上記の塩基配列を包含する本発明のsec
Y遺伝子を含むDNA断片は、天然のコリネ型細菌染色
体DNAから分離されたもののみならず、通常用いられ
るDNA合成装置、例えばベックマン社製System
−1 Plusを用いて合成されたものであってもよ
い。
Y遺伝子を含むDNA断片は、天然のコリネ型細菌染色
体DNAから分離されたもののみならず、通常用いられ
るDNA合成装置、例えばベックマン社製System
−1 Plusを用いて合成されたものであってもよ
い。
【0017】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムMJ−233の染色体DNAから取得される本発
明の膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子DNA
は、secY遺伝子産物の機能を実質的に損なうことが
ない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換され
ていてもよく又は削除されていてもよく、或いは新たに
塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が
転位されているものであってもよく、これらの誘導体の
いずれもが、本発明の遺伝子DNAに包含されるもので
ある。
ラバムMJ−233の染色体DNAから取得される本発
明の膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子DNA
は、secY遺伝子産物の機能を実質的に損なうことが
ない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換され
ていてもよく又は削除されていてもよく、或いは新たに
塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が
転位されているものであってもよく、これらの誘導体の
いずれもが、本発明の遺伝子DNAに包含されるもので
ある。
【0018】以上に詳述した大きさが約1.5kbのD
NA断片の制限酵素による切断点地図を図1に示す。本
発明のsecY遺伝子DNAを含むDNA断片(A断
片)は、適当なプラスミド、例えば、コリネ型細菌内で
プラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含
むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型
細菌内でsecY遺伝子産物の高発現可能な組換えプラ
スミドを得ることができる。
NA断片の制限酵素による切断点地図を図1に示す。本
発明のsecY遺伝子DNAを含むDNA断片(A断
片)は、適当なプラスミド、例えば、コリネ型細菌内で
プラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含
むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型
細菌内でsecY遺伝子産物の高発現可能な組換えプラ
スミドを得ることができる。
【0019】また、本発明のsecY遺伝子を発現させ
るためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモ
ーターであることができるが、それに限られるものでは
なく、secY遺伝子の転写を開始させるための原核生
物由来の塩基配列であればいかなるプロモーターであっ
てもよい。
るためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモ
ーターであることができるが、それに限られるものでは
なく、secY遺伝子の転写を開始させるための原核生
物由来の塩基配列であればいかなるプロモーターであっ
てもよい。
【0020】本発明のA断片を導入することができる、
コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なく
とも含むプラスミドベクターとしては、例えば、特開平
3−210184号公報に記載のプラスミドpCRY3
0;特開平2−276575号公報に記載のプラスミド
pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pC
RY31、pCRY3KE及びpCRY3KX;特開平
1−191686号公報に記載のプラスミドpCRY2
及びpCRY3;特開昭58−67679号公報に記載
のpAM330;特開昭58−77895号公報に記載
のpHM1519;特開昭58−192900号公報に
記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ184
4;特開昭57−134500号に記載のpCG1;特
開昭58−35197号公報に記載のpCG2;特開昭
57−183799号公報に記載のpCG4及びpCG
11等を挙げることができる。
コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なく
とも含むプラスミドベクターとしては、例えば、特開平
3−210184号公報に記載のプラスミドpCRY3
0;特開平2−276575号公報に記載のプラスミド
pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pC
RY31、pCRY3KE及びpCRY3KX;特開平
1−191686号公報に記載のプラスミドpCRY2
及びpCRY3;特開昭58−67679号公報に記載
のpAM330;特開昭58−77895号公報に記載
のpHM1519;特開昭58−192900号公報に
記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ184
4;特開昭57−134500号に記載のpCG1;特
開昭58−35197号公報に記載のpCG2;特開昭
57−183799号公報に記載のpCG4及びpCG
11等を挙げることができる。
【0021】中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で
用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌
内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型
細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを持つ
ものが好ましく、例えば、プラスミドpCRY30、p
CRY21、pCRY2KE、pCRY2KE、pCR
Y2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY
3KX等が好適に使用される。
用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌
内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型
細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを持つ
ものが好ましく、例えば、プラスミドpCRY30、p
CRY21、pCRY2KE、pCRY2KE、pCR
Y2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY
3KX等が好適に使用される。
【0022】上記プラスミドベクターpCRY30を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス(Brevibacterium stationi
s)IFO12144(FERM BP−2515)か
らプラスミドpBY503(このプラスミドの詳細につ
いては特開平1−95785号公報参照)DNAを抽出
し、制限酵素XhoIで大きさが約4.0kbのプラス
ミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むDNA断片を切
り出し、制限酵素EcoRIおよびKpnIで大きさが
約2.1kbのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を
含むDNA断片を切り出す。これらの両断面をプラスミ
ドpHSG298(宝酒造製)のEcoRI−KpnI
部位及びSalI部位に組み込むことにより、プラスミ
ドベクターpCRY30を調製することができる。
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス(Brevibacterium stationi
s)IFO12144(FERM BP−2515)か
らプラスミドpBY503(このプラスミドの詳細につ
いては特開平1−95785号公報参照)DNAを抽出
し、制限酵素XhoIで大きさが約4.0kbのプラス
ミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むDNA断片を切
り出し、制限酵素EcoRIおよびKpnIで大きさが
約2.1kbのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を
含むDNA断片を切り出す。これらの両断面をプラスミ
ドpHSG298(宝酒造製)のEcoRI−KpnI
部位及びSalI部位に組み込むことにより、プラスミ
ドベクターpCRY30を調製することができる。
【0023】次に、上記プラスミドベクターへの本発明
のA断片の導入は、例えばプラスミドベクター中に1個
所だけ存在する制限酵素部位を、該制限酵素で開裂し、
そこに前記A断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてS1ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターDNAの存在下にDNA
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。
のA断片の導入は、例えばプラスミドベクター中に1個
所だけ存在する制限酵素部位を、該制限酵素で開裂し、
そこに前記A断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてS1ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターDNAの存在下にDNA
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。
【0024】プラスミドpCRY30への本発明のA断
片の導入は、プラスミドpCRY30を制限酵素Eco
RIで開裂させ、そこに前記secY遺伝子DNAを含
むDNA断片(A断片)をDNAリガーゼで連結させる
ことにより行うことができる。このようにして造成され
るプラスミドpCRY30に本発明の大きさが約1.5
kbのA断片を導入した組換えプラスミドをpCRY3
0−secYと命名した。プラスミドpCRY30−s
ecYの作成方法の詳細については、後記実施例4で説
明する。
片の導入は、プラスミドpCRY30を制限酵素Eco
RIで開裂させ、そこに前記secY遺伝子DNAを含
むDNA断片(A断片)をDNAリガーゼで連結させる
ことにより行うことができる。このようにして造成され
るプラスミドpCRY30に本発明の大きさが約1.5
kbのA断片を導入した組換えプラスミドをpCRY3
0−secYと命名した。プラスミドpCRY30−s
ecYの作成方法の詳細については、後記実施例4で説
明する。
【0025】本発明によるプラスミドで形質転換しうる
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムMJ−233(FERM BP−1
497)、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
−AB−41(FERM BP−1498)、ブレビバ
クテリウム・フラバムMJ−233−ABT−11(F
ERM BP−1500)、ブレビバクテリウム・フラ
バムMJ−233−ABD−21(FERM BP−1
499)等が挙げられる。
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムMJ−233(FERM BP−1
497)、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
−AB−41(FERM BP−1498)、ブレビバ
クテリウム・フラバムMJ−233−ABT−11(F
ERM BP−1500)、ブレビバクテリウム・フラ
バムMJ−233−ABD−21(FERM BP−1
499)等が挙げられる。
【0026】なお、上記のFERM BP−1498の
菌株は、FERM BP−1497の菌株を親株として
DL−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
ール資化性微生物である(特公昭59−28398号公
報第3〜4欄参照)。また、FERM BP−1500
の菌株は、FERM BP−1497の菌株を親株とし
たL−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株
である(特開昭62−5198号公報参照)。さらに、
FERM BP−1499の菌株はFERMBP−14
97の菌株を親株としたD−α−アミノ酪酸デアミナー
ゼ高活性変異株である(特開昭61−177993号公
報参照)。
菌株は、FERM BP−1497の菌株を親株として
DL−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
ール資化性微生物である(特公昭59−28398号公
報第3〜4欄参照)。また、FERM BP−1500
の菌株は、FERM BP−1497の菌株を親株とし
たL−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株
である(特開昭62−5198号公報参照)。さらに、
FERM BP−1499の菌株はFERMBP−14
97の菌株を親株としたD−α−アミノ酪酸デアミナー
ゼ高活性変異株である(特開昭61−177993号公
報参照)。
【0027】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス(Brevibacterium
ammoniagenes)ATCC6871、同A
TCC13745、同ATCC13746;ブレビバク
テリウム・デバリカタム(Brevibacteriu
m divaricatum)ATCC14020;ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevi
bacteriumlactofermentum)A
TCC13869;コリネバクテリウム・グルタミカム
(Corynebacterium glutamic
um)ATCC31831等を宿主微生物として用いる
こともできる。
ム・アンモニアゲネス(Brevibacterium
ammoniagenes)ATCC6871、同A
TCC13745、同ATCC13746;ブレビバク
テリウム・デバリカタム(Brevibacteriu
m divaricatum)ATCC14020;ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevi
bacteriumlactofermentum)A
TCC13869;コリネバクテリウム・グルタミカム
(Corynebacterium glutamic
um)ATCC31831等を宿主微生物として用いる
こともできる。
【0028】なお、宿主としてブレビバクテリウム・フ
ラバムMJ−233由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドpBY502(特開昭63−367
87号公報参照)のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
pBY502を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドpBY502を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
[Bact.Rev.36 p.361〜405(19
72)参照]。上記プラスミドpBY502を人為的に
除去する方法の一例を示せば次のとおりである。
ラバムMJ−233由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドpBY502(特開昭63−367
87号公報参照)のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
pBY502を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドpBY502を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
[Bact.Rev.36 p.361〜405(19
72)参照]。上記プラスミドpBY502を人為的に
除去する方法の一例を示せば次のとおりである。
【0029】宿主ブレビバクテリウム・フラバムMJ−
233の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ(濃度:0.2〜50μg/ml)もしくはエチジ
ウムブロミド(濃度:0.2〜50μg/ml)等を含
む培地に、1ml当り約10細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら約24時間約35℃で培養
する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約35℃で約
2日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラス
ミド抽出操作を行い、プラスミドpBY502が除去さ
れている株を選択する。この操作によりプラスミドpB
Y502が除去されたブレビバクテリウム・フラバムM
J−233由来菌株が得られる。
233の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ(濃度:0.2〜50μg/ml)もしくはエチジ
ウムブロミド(濃度:0.2〜50μg/ml)等を含
む培地に、1ml当り約10細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら約24時間約35℃で培養
する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約35℃で約
2日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラス
ミド抽出操作を行い、プラスミドpBY502が除去さ
れている株を選択する。この操作によりプラスミドpB
Y502が除去されたブレビバクテリウム・フラバムM
J−233由来菌株が得られる。
【0030】このようにして得られるブレビバクテリウ
ム・フラバムMJ−233由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシェリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように[Cal
vin,N.M.and Hanawalt,P.
C.,Journal of Bacteriolog
y,170,2796(1988);Ito,K.,N
ishida,T.andIzaki.K.,Agri
cultural and Biological C
hemistry,52,293(1988)参照]、
DNA受容菌へのパルス波通電[Satoh,Y.e
t.al.,Journal of Industri
al Microbiology,5,159(199
0)参照]によりプラスミドを導入することが可能であ
る。
ム・フラバムMJ−233由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシェリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように[Cal
vin,N.M.and Hanawalt,P.
C.,Journal of Bacteriolog
y,170,2796(1988);Ito,K.,N
ishida,T.andIzaki.K.,Agri
cultural and Biological C
hemistry,52,293(1988)参照]、
DNA受容菌へのパルス波通電[Satoh,Y.e
t.al.,Journal of Industri
al Microbiology,5,159(199
0)参照]によりプラスミドを導入することが可能であ
る。
【0031】上記の方法で形質転換して得られるsec
Y遺伝子産物産性能を有するコリネ型細菌、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバムMJ−233由来株の培養方
法を以下に述べる。培養は炭素源、窒素源、無機塩等を
含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源として
は、例えばグルコース、エタノール、メタノール、廃糖
蜜等が、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いられ
る。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウ
ム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用い
られる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種
ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。
Y遺伝子産物産性能を有するコリネ型細菌、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバムMJ−233由来株の培養方
法を以下に述べる。培養は炭素源、窒素源、無機塩等を
含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源として
は、例えばグルコース、エタノール、メタノール、廃糖
蜜等が、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いられ
る。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウ
ム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用い
られる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種
ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。
【0032】培養は、通常、通気攪拌、振盪等の好気条
件下に、約20〜約40℃、好ましくは約25℃〜約3
5℃の温度で行うことができる。培養途中のpHは5〜
10、好ましくは7〜8付近とすることができ、培養中
のpH調整は酸又はアルカリを添加して行うことができ
る。培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは1〜5容量
%、更に好ましくは2〜3容量%である。また、培養期
間は通常1〜7日間とすることができ、最適期間は3日
間である。
件下に、約20〜約40℃、好ましくは約25℃〜約3
5℃の温度で行うことができる。培養途中のpHは5〜
10、好ましくは7〜8付近とすることができ、培養中
のpH調整は酸又はアルカリを添加して行うことができ
る。培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは1〜5容量
%、更に好ましくは2〜3容量%である。また、培養期
間は通常1〜7日間とすることができ、最適期間は3日
間である。
【0033】かくして得られる培養物から遠心分離等に
より菌体を集めることにより、secY遺伝子産物を高
含有する菌体を取得することができる。
より菌体を集めることにより、secY遺伝子産物を高
含有する菌体を取得することができる。
【0034】
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。実施例1 ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233由来のse
cY遺伝子DNAを含むDNA断片(A断片)のクロー
ン化 (A)ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233の全
DNAの抽出 半合成培地A培地[組成:尿素2g、(NH4 )2 SO
4 7g、K2 HPO40.5g、KH2 PO4 0.5
g、MgSO4 0.5g、FeSO4 ・7H2 O6m
g、MnSO4 4〜6H2 O 6mg、酵母エキス2.
5g、カザミノ酸5g、ビオチン200μg、塩酸チア
ミン200μg、グルコース20g、蒸留水11]1l
に、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233(FE
RM BP−1497)を対数増殖期後期まで培養し、
菌体を集めた。得られた菌体を10mg/mlの濃度に
リゾチームを含む10mM NaCl−20mMトリス
緩衝液(pH8.0)−1mM EDTA・2Na溶液
15mlに懸濁した。次にプロテナーゼKを、最終濃度
が100μg/mlになるように添加し、37℃で1時
間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度
が0.5%になるように添加し、50℃で6時間保温し
て溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール/クロロ
ホルム溶液を添加し、室温で10分間ゆるやかに振盪し
た後、全量を遠心分離(5,000×g、20分間、1
0〜12℃)し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを
0.3Mとなるように添加した後、2倍量のエタノール
をゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在す
るDNAをガラス棒でまきとり、70%エタノールで洗
浄した後、風乾した。得られたDNAに10mMトリス
緩衝液(pH7.5)−1mM EDTA・2Na溶液
5mlを加え、4℃で一晩静置し、以後の実験に用い
た。
例によりさらに具体的に説明する。実施例1 ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233由来のse
cY遺伝子DNAを含むDNA断片(A断片)のクロー
ン化 (A)ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233の全
DNAの抽出 半合成培地A培地[組成:尿素2g、(NH4 )2 SO
4 7g、K2 HPO40.5g、KH2 PO4 0.5
g、MgSO4 0.5g、FeSO4 ・7H2 O6m
g、MnSO4 4〜6H2 O 6mg、酵母エキス2.
5g、カザミノ酸5g、ビオチン200μg、塩酸チア
ミン200μg、グルコース20g、蒸留水11]1l
に、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233(FE
RM BP−1497)を対数増殖期後期まで培養し、
菌体を集めた。得られた菌体を10mg/mlの濃度に
リゾチームを含む10mM NaCl−20mMトリス
緩衝液(pH8.0)−1mM EDTA・2Na溶液
15mlに懸濁した。次にプロテナーゼKを、最終濃度
が100μg/mlになるように添加し、37℃で1時
間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度
が0.5%になるように添加し、50℃で6時間保温し
て溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール/クロロ
ホルム溶液を添加し、室温で10分間ゆるやかに振盪し
た後、全量を遠心分離(5,000×g、20分間、1
0〜12℃)し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを
0.3Mとなるように添加した後、2倍量のエタノール
をゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在す
るDNAをガラス棒でまきとり、70%エタノールで洗
浄した後、風乾した。得られたDNAに10mMトリス
緩衝液(pH7.5)−1mM EDTA・2Na溶液
5mlを加え、4℃で一晩静置し、以後の実験に用い
た。
【0035】(B)組換え体の創製 上記(A)項で得たブレビバクテリウム・フラバムMJ
−233の全DNA溶液の90μlを制限酵素EcoR
I 50unitsを用い、37℃で1時間反応させ完
全分解した。このEcoRI分解DNAにクローニング
ベクターpUC118(宝酒造より市販)を制限酵素E
coRIで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合
し、50mMトリス緩衝液(pH7.6)、10mMジ
チオスレイトール、1mM ATP、10mM MgC
l2 及びT4 DNAリガーゼ1unitの各成分を添加
し(各成分の濃度は最終濃度である)、4℃で15時間
反応させ、結合させた。
−233の全DNA溶液の90μlを制限酵素EcoR
I 50unitsを用い、37℃で1時間反応させ完
全分解した。このEcoRI分解DNAにクローニング
ベクターpUC118(宝酒造より市販)を制限酵素E
coRIで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合
し、50mMトリス緩衝液(pH7.6)、10mMジ
チオスレイトール、1mM ATP、10mM MgC
l2 及びT4 DNAリガーゼ1unitの各成分を添加
し(各成分の濃度は最終濃度である)、4℃で15時間
反応させ、結合させた。
【0036】上記(B)項で得られたプラスミド混液を
用い、塩化カルシウム法(Journal of Mo
lecular Biology,53,159,19
70)によりエシェリヒア・コリJM109(宝酒造
製)を形質転換し、アンピシリン50mgを含む培地
[トリプトン10g、イーストエキストラクト5g、N
acl 5g及び寒天16gを蒸留水11に溶解]に塗
抹した。
用い、塩化カルシウム法(Journal of Mo
lecular Biology,53,159,19
70)によりエシェリヒア・コリJM109(宝酒造
製)を形質転換し、アンピシリン50mgを含む培地
[トリプトン10g、イーストエキストラクト5g、N
acl 5g及び寒天16gを蒸留水11に溶解]に塗
抹した。
【0037】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲルを用いて泳
動した。このアガロースゲルよりDNAをナイロンメン
ブレン上に移しとり、エシェリヒア・コリ、バチルスサ
チルス由来secY遺伝子の共通領域をプローブとして
サザンハイブリダイゼーションを行なった。用いたプロ
ーブとしては、エシェリヒア・コリ、バチルス・サチル
ス由来のsecY遺伝子から推定されるアミノ酸配列で
特に相同性の高い領域に注目し、そのアミノ酸配列より
想定される混合オリゴヌクレオチドプローブをアプライ
ド・バイオシステムズ(AppliedBiosyst
ems)社製394 DNA/RNAシンセサイザー
(synthesizer)を用いて合成した。
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲルを用いて泳
動した。このアガロースゲルよりDNAをナイロンメン
ブレン上に移しとり、エシェリヒア・コリ、バチルスサ
チルス由来secY遺伝子の共通領域をプローブとして
サザンハイブリダイゼーションを行なった。用いたプロ
ーブとしては、エシェリヒア・コリ、バチルス・サチル
ス由来のsecY遺伝子から推定されるアミノ酸配列で
特に相同性の高い領域に注目し、そのアミノ酸配列より
想定される混合オリゴヌクレオチドプローブをアプライ
ド・バイオシステムズ(AppliedBiosyst
ems)社製394 DNA/RNAシンセサイザー
(synthesizer)を用いて合成した。
【0038】実際に用いたプローブの塩基配列は、次の
アミノ酸配列: Ala Gly Va l Ile Pro Val Ile Phe Ala より想定される下記の塩基配列: GCI GGI GTI ATH CCI GTI ATH TTY GC (配列中、HはA又はC又はT、YはC又はTを示し、
ここでAはアデニン、Gはグアニン、Cはシトシン、T
はチミン、Iはデオキシイノシンを示す。)の26me
r(26塩基対)である。なお、プローブの合成にあた
っては、混合の度合が著しくなりすぎぬようにデオキシ
イノシンを用いた。
アミノ酸配列: Ala Gly Va l Ile Pro Val Ile Phe Ala より想定される下記の塩基配列: GCI GGI GTI ATH CCI GTI ATH TTY GC (配列中、HはA又はC又はT、YはC又はTを示し、
ここでAはアデニン、Gはグアニン、Cはシトシン、T
はチミン、Iはデオキシイノシンを示す。)の26me
r(26塩基対)である。なお、プローブの合成にあた
っては、混合の度合が著しくなりすぎぬようにデオキシ
イノシンを用いた。
【0039】合成した上記オリゴヌクレオチドプローブ
をT4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造社製)を用い
る手法で、5′末端リン酸基を[γ−32P]ATPでラ
ジオアイソトープラベルした[Analytical
Biochemistry,158,307−315,
1986]。サザンハイブリダイゼーションは、常法
[Molecular Cloning,Cold S
pring Harbor Laboratory P
ress(1989)]の通り行なった。この結果、ポ
ジティブなバンドを生ずるクローンを選定することがで
き、プラスミドpUC118の長さ3.2kbのDNA
断片に加え、長さ約4.2kbの挿入断片が認められ
た。
をT4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造社製)を用い
る手法で、5′末端リン酸基を[γ−32P]ATPでラ
ジオアイソトープラベルした[Analytical
Biochemistry,158,307−315,
1986]。サザンハイブリダイゼーションは、常法
[Molecular Cloning,Cold S
pring Harbor Laboratory P
ress(1989)]の通り行なった。この結果、ポ
ジティブなバンドを生ずるクローンを選定することがで
き、プラスミドpUC118の長さ3.2kbのDNA
断片に加え、長さ約4.2kbの挿入断片が認められ
た。
【0040】本プラスミドをpUC118−Y−fra
gと命名した。 (D)secYDNA遺伝子を含むDNA断片(A)断
片のサブクローニング 上記(C)項で得たプラスミドpUC118−Y−fr
agに含まれるDNA挿入断片を、必要な部分だけに小
型化するために、プラスミドpUC118(宝酒造より
市販)へsecY遺伝子DNAを含むDNA断片を下記
のとおりサブクローニングした。
gと命名した。 (D)secYDNA遺伝子を含むDNA断片(A)断
片のサブクローニング 上記(C)項で得たプラスミドpUC118−Y−fr
agに含まれるDNA挿入断片を、必要な部分だけに小
型化するために、プラスミドpUC118(宝酒造より
市販)へsecY遺伝子DNAを含むDNA断片を下記
のとおりサブクローニングした。
【0041】上記(C)項で得たプラスミドpUC11
8−Y−fragを制限酵素KpnIで切断したもの
と、プラスミドpUC118を制限酵素KpnIで切断
したものを混合し、50mMトリス緩衝液(pH7.
6)、10mMジチオスレイトール、1mM ATP、
10mM MgCl2 及びT4DNAリガーゼ1uni
tの各成分を添加し(各成分の濃度は最終濃度であ
る)、12℃で15時間反応させ、結合させた。
8−Y−fragを制限酵素KpnIで切断したもの
と、プラスミドpUC118を制限酵素KpnIで切断
したものを混合し、50mMトリス緩衝液(pH7.
6)、10mMジチオスレイトール、1mM ATP、
10mM MgCl2 及びT4DNAリガーゼ1uni
tの各成分を添加し(各成分の濃度は最終濃度であ
る)、12℃で15時間反応させ、結合させた。
【0042】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法(Journal ofMolecular
Biology,53,159,1970)により前記
エシェリヒア・コリJM109を形質転換し、アンピシ
リン50mgを含む培地[トリプトン10g、イースト
エキストラクト5g、NaCl 5g及び寒天16gを
蒸留水11に溶解]に塗抹した。
シウム法(Journal ofMolecular
Biology,53,159,1970)により前記
エシェリヒア・コリJM109を形質転換し、アンピシ
リン50mgを含む培地[トリプトン10g、イースト
エキストラクト5g、NaCl 5g及び寒天16gを
蒸留水11に溶解]に塗抹した。
【0043】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、ハイブリダイゼーション法
を用いて調べたところ、プラスミドpUC118の長さ
3.2kbのDNA断片に加え、長さ約1.5kbの挿
入DNA断片が認められた。各種の制限酵素で切断した
ときの、長さ約1.5kbのDNA断片の制限酵素認識
部位数および切断断片の大きさは前記表1に示したとお
りであった。このDNA断片の制限酵素切断点地図を図
1に示す。
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、ハイブリダイゼーション法
を用いて調べたところ、プラスミドpUC118の長さ
3.2kbのDNA断片に加え、長さ約1.5kbの挿
入DNA断片が認められた。各種の制限酵素で切断した
ときの、長さ約1.5kbのDNA断片の制限酵素認識
部位数および切断断片の大きさは前記表1に示したとお
りであった。このDNA断片の制限酵素切断点地図を図
1に示す。
【0044】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の第2表に示す。
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の第2表に示す。
【0045】
【表2】 第2表 プラスミドpUC118−secY 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) BamHI 1 4.7 SacI 2 4.1,0.6 PstI 3 3.5,0.7,0.5
【0046】上記の制限酵素により特徴づけられるプラ
スミドをpUC118−secYと命名した。以上によ
りsecY遺伝子DNAを含む大きさが約1.5kbの
DNA断片(KpnI断片)を得ることができた。
スミドをpUC118−secYと命名した。以上によ
りsecY遺伝子DNAを含む大きさが約1.5kbの
DNA断片(KpnI断片)を得ることができた。
【0047】実施例2 secY遺伝子DNAの塩基配列の決定 実施例1の(D)項で得られたsecY遺伝子DNAを
含む長さが約1.5kbのDNA断片について、その塩
基配列をプラスミドpUC118またはpUC119
(宝酒造製)を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
(dideoxychain termination
法)(Sanger,F.et al.,Proc.N
at.Acad.Sci.USA 74,5463,1
977)により図2に示した戦略図に従って決定した。
含む長さが約1.5kbのDNA断片について、その塩
基配列をプラスミドpUC118またはpUC119
(宝酒造製)を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
(dideoxychain termination
法)(Sanger,F.et al.,Proc.N
at.Acad.Sci.USA 74,5463,1
977)により図2に示した戦略図に従って決定した。
【0048】その塩基配列中のオープンリーディングフ
レームの存在から、secY遺伝子DNAは、後記配列
表の配列番号1に示す塩基配列を有する440個のアミ
ノ酸をコードする1320の塩基対より構成されている
ことが判明した。
レームの存在から、secY遺伝子DNAは、後記配列
表の配列番号1に示す塩基配列を有する440個のアミ
ノ酸をコードする1320の塩基対より構成されている
ことが判明した。
【0049】実施例3 コリネ型細菌内で複製し安定なプラスミドベクターpC
RY30の作成 (A)プラスミドpBY503の調製 プラスミドpBY503は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスIFO12144(FERM BP−251
5)から分離された分子量約10メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平1−95785号公報に記載のよう
にして調製した。
RY30の作成 (A)プラスミドpBY503の調製 プラスミドpBY503は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスIFO12144(FERM BP−251
5)から分離された分子量約10メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平1−95785号公報に記載のよう
にして調製した。
【0050】半合成培地A培地[尿素2g、(NH4 )
2 SO4 7g、K2 HPO4 0.5g、KH2 PO
4 0.5g、MgSO4 0.5g、FeSO4 ・7H2
O 6mg、MnSO4 ・4〜6H2 O 6mg、酵母
エキス2.5g、カザミノ酸5g、ビチオン200μ
g、塩酸チアミン200μg、グルコース20g及び蒸
留水11]11に、ブレビバクテリウム・スタチオニス
IFO12144を対数増殖期後期まで培養し、菌体を
集めた。得られた菌体を10mg/mlの濃度にリゾチ
ームを含む緩衝液[25mMトリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン、10mM EDTA、50mMグル
コース]20mlに懸濁し、37℃で1時間反応させ
た。反応液にアルカリ−SDS液[0.2N NaO
H、1%(W/V)SDS]40mlを添加し、緩やか
に混和して室温にて15分間静置した。次に、この反応
液に酢酸カリウム溶液[5M酢酸カリウム溶液60m
l、酢酸11.5ml、蒸留水28.5mlの混合液]
30mlを添加し、充分混和してから氷水中に15分間
静置した。
2 SO4 7g、K2 HPO4 0.5g、KH2 PO
4 0.5g、MgSO4 0.5g、FeSO4 ・7H2
O 6mg、MnSO4 ・4〜6H2 O 6mg、酵母
エキス2.5g、カザミノ酸5g、ビチオン200μ
g、塩酸チアミン200μg、グルコース20g及び蒸
留水11]11に、ブレビバクテリウム・スタチオニス
IFO12144を対数増殖期後期まで培養し、菌体を
集めた。得られた菌体を10mg/mlの濃度にリゾチ
ームを含む緩衝液[25mMトリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン、10mM EDTA、50mMグル
コース]20mlに懸濁し、37℃で1時間反応させ
た。反応液にアルカリ−SDS液[0.2N NaO
H、1%(W/V)SDS]40mlを添加し、緩やか
に混和して室温にて15分間静置した。次に、この反応
液に酢酸カリウム溶液[5M酢酸カリウム溶液60m
l、酢酸11.5ml、蒸留水28.5mlの混合液]
30mlを添加し、充分混和してから氷水中に15分間
静置した。
【0051】溶菌物全量を遠心管に移し、4℃で10分
間、15,000×gの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール−クロロホルム液(フェノ
ール:クロロホルム=1:1混和液)を加え懸濁した
後、遠心管に移し、室温下で5分間、15,000×g
の遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に2倍量のエ
タノールを加え、−20℃で1時間静置後、4℃で10
分間、15,000×gの遠心分離にかけ、沈澱を回収
した。
間、15,000×gの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール−クロロホルム液(フェノ
ール:クロロホルム=1:1混和液)を加え懸濁した
後、遠心管に移し、室温下で5分間、15,000×g
の遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に2倍量のエ
タノールを加え、−20℃で1時間静置後、4℃で10
分間、15,000×gの遠心分離にかけ、沈澱を回収
した。
【0052】沈澱を減圧乾燥後、TE緩衝液[トリス1
0mM、EDTA 1mM;HClにてpH8.0に調
整]2mlに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液[5
倍濃度のTE緩衝液100mlに塩化セシウム170g
を溶解させた液]15mlと10mg/mlエチジウム
ブロマイド溶液1mlを加えて、密度を1.392g/
mlに合わせた。この溶液を12℃で42時間、11
6,000×gの遠心分離を行った。
0mM、EDTA 1mM;HClにてpH8.0に調
整]2mlに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液[5
倍濃度のTE緩衝液100mlに塩化セシウム170g
を溶解させた液]15mlと10mg/mlエチジウム
ブロマイド溶液1mlを加えて、密度を1.392g/
mlに合わせた。この溶液を12℃で42時間、11
6,000×gの遠心分離を行った。
【0053】プラスミドpBY503は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドpBY503を含む分画液を得た。次いでこ
の分画液を等量のイソアミルアルコールで4回処理して
エチジウムブロマイドを抽出除去し、その後にTE緩衝
液に対して透析を行った。このようにして得られたプラ
スミドpBY503を含む透析液に3M酢酸ナトリウム
溶液を最終濃度30mMに添加した後、2倍量エタノー
ルを加え、−20℃1時間静置した。この溶液を15,
000×gの遠心分離にかけてDNAを沈降させ,プラ
スミドpBY503を50μg得た。
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドpBY503を含む分画液を得た。次いでこ
の分画液を等量のイソアミルアルコールで4回処理して
エチジウムブロマイドを抽出除去し、その後にTE緩衝
液に対して透析を行った。このようにして得られたプラ
スミドpBY503を含む透析液に3M酢酸ナトリウム
溶液を最終濃度30mMに添加した後、2倍量エタノー
ルを加え、−20℃1時間静置した。この溶液を15,
000×gの遠心分離にかけてDNAを沈降させ,プラ
スミドpBY503を50μg得た。
【0054】(B)プラスミドベクターpCRY30の
作成 プラスミドpHSG298(宝酒造製)0.5μgに制
限酵素SalI(5units)を37℃1時間反応さ
せ、プラスミドDNAを完全に分解した。前記(A)項
で調製したプラスミドpBY503の2μgに制限酵素
XhoI(1unit)を37℃で30分間反応させ、
プラスミドDNAを部分分解した。両者のプラスミドD
NA分解物を混合し、制限酵素を不活性化するために6
5℃で10分間加熱処理した後、該失活溶液中の成分が
最終濃度として各々50mMトリス緩衝液pH7.6、
10mM MgCl2 、10mMジチオスレイトール、
1mM ATP及びT4DNAリガーゼ1unitにな
るように各成分を強化し、16℃で15時間保温した。
この溶液を用いてエシェリヒア・コリJM109コンピ
テントセル(宝酒造製)を形質転換した。
作成 プラスミドpHSG298(宝酒造製)0.5μgに制
限酵素SalI(5units)を37℃1時間反応さ
せ、プラスミドDNAを完全に分解した。前記(A)項
で調製したプラスミドpBY503の2μgに制限酵素
XhoI(1unit)を37℃で30分間反応させ、
プラスミドDNAを部分分解した。両者のプラスミドD
NA分解物を混合し、制限酵素を不活性化するために6
5℃で10分間加熱処理した後、該失活溶液中の成分が
最終濃度として各々50mMトリス緩衝液pH7.6、
10mM MgCl2 、10mMジチオスレイトール、
1mM ATP及びT4DNAリガーゼ1unitにな
るように各成分を強化し、16℃で15時間保温した。
この溶液を用いてエシェリヒア・コリJM109コンピ
テントセル(宝酒造製)を形質転換した。
【0055】形質転換株は30μg/ml(最終濃度)
のカナマイシン、100μg/ml(最終濃度)のIP
TG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシ
ド)100μg/ml(最終濃度)のX−gal(5−
ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラク
トピラノシド)を含むL培地(トリプトン10g、酵母
エキス5g、NaCl 5g及び蒸留水11、pH7.
2)で37℃にて24時間培養し、生育株として得られ
た。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育してき
たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−SDS法
[T.Maniatis,E.F.Fritsch,
J.Sambrook,“Molecular clo
ning”(1982),90−91参照]により抽出
した。
のカナマイシン、100μg/ml(最終濃度)のIP
TG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシ
ド)100μg/ml(最終濃度)のX−gal(5−
ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラク
トピラノシド)を含むL培地(トリプトン10g、酵母
エキス5g、NaCl 5g及び蒸留水11、pH7.
2)で37℃にて24時間培養し、生育株として得られ
た。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育してき
たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−SDS法
[T.Maniatis,E.F.Fritsch,
J.Sambrook,“Molecular clo
ning”(1982),90−91参照]により抽出
した。
【0056】その結果、プラスミドpHSG298のS
alI部位にプラスミドpBY503由来の約4.0k
bの断片が挿入されたプラスミドpHSG298−or
iが得られた。次に同様の方法を用い、前記(A)項で
得られたプラスミドpBY503DNAを制限酵素Kp
nI及びEcoRIにて処理して得られる約2.1kb
のDNA断片を上記プラスミドpHSG298−ori
のKpnI及びEcoRI部位にクローニングし、プラ
スミドベクターpCRY30を調製した。
alI部位にプラスミドpBY503由来の約4.0k
bの断片が挿入されたプラスミドpHSG298−or
iが得られた。次に同様の方法を用い、前記(A)項で
得られたプラスミドpBY503DNAを制限酵素Kp
nI及びEcoRIにて処理して得られる約2.1kb
のDNA断片を上記プラスミドpHSG298−ori
のKpnI及びEcoRI部位にクローニングし、プラ
スミドベクターpCRY30を調製した。
【0057】実施例4 プラスミドpCRY30−secYの作成及びコリネ型
細菌への導入 実施例1の(C)項で得られたプラスミドpUC118
−secY5μgを制限酵素KpnIを各5units
用い、37℃で1時間反応させ分解したものと、実施例
3の(B)項で得られたプラスミドpCRY30 1μ
gを制限酵素KpnI 1unitを用い、37℃で1
時間反応させ分解したものを混合し、50mMトリス緩
衝液(pH7.6)、10mMジチオスレイトール、1
mM ATP、10mM MgCl2 およびT4DNA
リガーゼ1unitの各成分を添加し(各成分の濃度は
最終濃度である)、12℃で15時間反応させ結合させ
た。このプラスミドを用いて、前記方法に従い前記エシ
ェリヒア・コリJM109株を形質転換し、カナマイシ
ン50μg/mlを含む培地[トリプトン10g、イー
ストエキストラクト5g、NaCl 5g及び寒天16
gを蒸留水11に溶解]に塗抹した。
細菌への導入 実施例1の(C)項で得られたプラスミドpUC118
−secY5μgを制限酵素KpnIを各5units
用い、37℃で1時間反応させ分解したものと、実施例
3の(B)項で得られたプラスミドpCRY30 1μ
gを制限酵素KpnI 1unitを用い、37℃で1
時間反応させ分解したものを混合し、50mMトリス緩
衝液(pH7.6)、10mMジチオスレイトール、1
mM ATP、10mM MgCl2 およびT4DNA
リガーゼ1unitの各成分を添加し(各成分の濃度は
最終濃度である)、12℃で15時間反応させ結合させ
た。このプラスミドを用いて、前記方法に従い前記エシ
ェリヒア・コリJM109株を形質転換し、カナマイシ
ン50μg/mlを含む培地[トリプトン10g、イー
ストエキストラクト5g、NaCl 5g及び寒天16
gを蒸留水11に溶解]に塗抹した。
【0058】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドpCRY30の長さ
8.6kbのDNA断片に加え、大きさ1.5kbの挿
入DNA断片が認められた。上記の如く調製されたプラ
スミドDNAを、コリネ型細菌へ形質転換した。
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドpCRY30の長さ
8.6kbのDNA断片に加え、大きさ1.5kbの挿
入DNA断片が認められた。上記の如く調製されたプラ
スミドDNAを、コリネ型細菌へ形質転換した。
【0059】形質転換は、電気パルス法を用いて次のと
おり行った。ブレビバクテリウム・フラバムMJ−23
3(FERM BP−1497)プラスミドpBY50
2除去株を100mlの前記A培地で対数増殖初期まで
培養し、ペニシリンGを1ユニット/mlになるように
添加して、さらに2時間振盪培養し、遠心分離により菌
体を集め、菌体を20mlのパルス用溶液(272mM
Sucrose、7mM KH2 PO4 、1mM M
gCl2 ;pH7.4)にて洗浄した。さらに菌体を遠
心分離して集め、5mlのパルス用溶液に懸濁し、0.
75mlの細胞と、前記で得られたプラスミドDNA溶
液50μlとを混合し、水中にて20分間静置した。ジ
ーンパルサー(バイオラド社製)を用いて、2500ボ
ルト、25μFDに設定し、パルスを印加後氷中に20
分間静置した。全量を3mlの前記A培地に移し30℃
にて1時間培養後、カナマイシン15μg/ml(最終
濃度)を含む前記A寒天培地に植菌し30℃で2〜3日
間培養した。出現したカナマイシン耐性株より、前記実
施例3(A)項に記載の方法を用いてプラスミドを得
た。このプラスミドを各種制限酵素で切断して、切断断
片の大きさを測定した。その結果を下記の第3表に示
す。
おり行った。ブレビバクテリウム・フラバムMJ−23
3(FERM BP−1497)プラスミドpBY50
2除去株を100mlの前記A培地で対数増殖初期まで
培養し、ペニシリンGを1ユニット/mlになるように
添加して、さらに2時間振盪培養し、遠心分離により菌
体を集め、菌体を20mlのパルス用溶液(272mM
Sucrose、7mM KH2 PO4 、1mM M
gCl2 ;pH7.4)にて洗浄した。さらに菌体を遠
心分離して集め、5mlのパルス用溶液に懸濁し、0.
75mlの細胞と、前記で得られたプラスミドDNA溶
液50μlとを混合し、水中にて20分間静置した。ジ
ーンパルサー(バイオラド社製)を用いて、2500ボ
ルト、25μFDに設定し、パルスを印加後氷中に20
分間静置した。全量を3mlの前記A培地に移し30℃
にて1時間培養後、カナマイシン15μg/ml(最終
濃度)を含む前記A寒天培地に植菌し30℃で2〜3日
間培養した。出現したカナマイシン耐性株より、前記実
施例3(A)項に記載の方法を用いてプラスミドを得
た。このプラスミドを各種制限酵素で切断して、切断断
片の大きさを測定した。その結果を下記の第3表に示
す。
【0060】
【表3】 第3表 プラスミドpCRY30−secY 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) EcoRI 1 10.1 BamHI 1 10.1 KpnI 2 8.6,1.5 XhoI 1 10.1
【0061】上記制限酵素により特徴づけられるプラス
ミドをpCRY30−secYと命名した。なお、プラ
スミドpCRY30−secYにより形質転換されたブ
レビバクテリウム・フラバムMJ233−secYは、
茨城県つくば市東1丁目1番3号の工業技術院微生物工
業技術研究所に、平成4年11月24日付で:微工研菌
寄第13302号(FERM−13302)として寄託
されている。
ミドをpCRY30−secYと命名した。なお、プラ
スミドpCRY30−secYにより形質転換されたブ
レビバクテリウム・フラバムMJ233−secYは、
茨城県つくば市東1丁目1番3号の工業技術院微生物工
業技術研究所に、平成4年11月24日付で:微工研菌
寄第13302号(FERM−13302)として寄託
されている。
【0062】
【配列表】配列番号:1 配列の長さ:1320 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:ブレビバクテリウム フラバム 株名:MJ233 配列の特徴 特徴を表す記号:peptide 存在位置:1-1320 特徴を決定した方法:P 配列 GTG TCC GCC ATT ATT CAG GCA TTC AAG GAC GCC GAT CTG CGT AAG AAG Val Ser Ala Ile Ile Gln Ala Phe Lys Asp Ala Asp Leu Arg Lys Lys 1 5 10 15 ATT TTC TTC ACT ATC GCC ATG ATC GTT CTA TAC CGC ATC GGT GCG CAG Ile Phe Phe Thr Ile Ala Met Ile Val Leu Tyr Arg Ile Gly Ala Gln 20 25 30 ATC CCT TCC CCG GGA GTT GAC TAT GCA ACG ATT AGT GGT CGT CTG CGT Ile Pro Ser Pro Gly Val Asp Tyr Ala Thr Ile Ser Gly Arg Leu Arg 35 40 45 GAC TTG ACT CAG GAT CAG TCA AGC GTT TAT TCG CTG ATT AAC CTG TTT Asp Leu Thr Gln Asp Gln Ser Ser Val Tyr Ser Leu Ile Asn Leu Phe 50 55 60 TCC GGT GGA GCG CTG CTG CAG CTG TCC ATT TTT GCT ATT GGT ATC ATG Ser Gly Gly Ala Leu Leu Gln Leu Ser Ile Phe Ala Ile Gly Ile Met 65 70 75 80 CCG TAC ATC ACG GCG TCT ATT ATC GTG CAG CTG CTG ACT GTG GTT ATT Pro Tyr Ile Thr Ala Ser Ile Ile Val Gln Leu Leu Thr Val Val Ile 85 90 95 CCA CAC TTT GAG GAG TTG AAG AAG GAA GGC CAG TCT GGC CAG GCC AAG Pro His Phe Glu Glu Leu Lys Lys Glu Gly Gln Ser Gly Gln Ala Lys 100 105 110 ATG ATG CAG TAC ACC AGG TAC TTA ACG GTT GCC TTG GCG TTG CTT CAG Met Met Gln Tyr Thr Arg Tyr Leu Thr Val Ala Leu Ala Leu Leu Gln 115 120 125 TCT TCG GGC ATC GTC GCG TTG GCG GAC CGT GAG CAG CTG CTT GGC GCA Ser Ser Gly Ile Val Ala Leu Ala Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gly Ala 130 135 140 GGC ATT CGC GTG CTG TCG GCT GAT CGC AAC TTC TTC GAC CTC ATT GTT Gly Ile Arg Val Leu Ser Ala Asp Arg Asn Phe Phe Asp Leu Ile Val 145 150 155 160 TTG GTC ATC ACC ATG ACT GCG GGT GCA GTG CTT GTG ATG TGG ATG GGT Leu Val Ile Thr Met Thr Ala Gly Ala Val Leu Val Met Trp Met Gly 165 170 175 GAG CTC ATC ACG GAA AAG GGC GTA GGC AAT GGT ATG TCG CTG CTG ATT Glu Leu Ile Thr Glu Lys Gly Val Gly Asn Gly Met Ser Leu Leu Ile 175 180 185 TTC GCT GGT ATC GCA ACT CGC CTC CCA ACT GAT GGC ATG AAC ATT CTG Phe Ala Gly Ile Ala Thr Arg Leu Pro Thr Asp Gly Met Asn Ile Leu 190 195 200 GGC AAC TCC GGC GGC GTG GTT TTC GCT GTT GTT CTG GCT TCC GTT CTG Gly Asn Ser Gly Gly Val Val Phe Ala Val Val Leu Ala Ser Val Leu 205 210 215 ATC CTG GTC ATT GGT GTT GTA TTC GTT GAG CAG GGC CAG CGT CGT ATT Ile Leu Val Ile Gly Val Val Phe Val Glu Gln Gly Gln Arg Arg Ile 220 225 230 235 CCA GTG CAG TAC GCA AAG CGC ATG GTG GGT CGT CGT CAG TAC GGT GGT Pro Val Gln Tyr Ala Lys Arg Met Val Gly Arg Arg Gln Tyr Gly Gly 240 245 250 TCT TCC ACT TAC CTG CCT TTG AAG GTC AAC CAA GCT GGT GTT ATC CCA Ser Ser Thr Tyr Leu Pro Leu Lys Val Asn Gln Ala Gly Val Ile Pro 255 260 265 GTG ATC TTC GCG TCT TCC TTG ATT TAC ATG CCA GTG CTG ATT ACT CAG Val Ile Phe Ala Ser Ser Leu Ile Tyr Met Pro Val Leu Ile Thr Gln 270 275 280 ATC GTG AAC TCT GGT TCG CTG GAA GTG TCT GAT AAC TGG TGG CAG CGC Ile Val Asn Ser Gly Ser Leu Glu Val Ser Asp Asn Trp Trp Gln Arg 285 290 295 AAC ATC ATT GCG CAC CTG CAG ACG CCT TCT TCC TGG CAG TAC ATT GTT Asn Ile Ile Ala His Leu Gln Thr Pro Ser Ser Trp Gln Tyr Ile Val 300 305 310 315 TTG TAC TTT GCA CTG ACC ATC TTC TTC TCT TAC TTC TAT GTT TCT GTT Leu Tyr Phe Ala Leu Thr Ile Phe Phe Ser Tyr Phe Tyr Val Ser Val 320 325 330 CAG TAT GAT CCA GCT GAG CAG GCT GAA AAC ATG AAG AAG TAC GGC GGA Gln Tyr Asp Pro Ala Glu Gln Ala Glu Asn Met Lys Lys Tyr Gly Gly 335 340 345 TTT ATC CCT GGT ATT CGT CCG GGC CGT CCG ACT GCT GAG TAC TTG GGA Phe Ile Pro Gly Ile Arg Pro Gly Arg Pro Thr Ala Glu Tyr Leu Gly 350 355 360 TTC GTC ATG AAC CGC CTG CTG TTT GTT GGT TCC CTG TAC CTG GCT GTC Phe Val Met Asn Arg Leu Leu Phe Val Gly Ser Leu Tyr Leu Ala Val 365 370 375 ATT GCT GTG CTG CCA AAC ATT ATG CTG GAT CTA GGT GTT GAC GCC GGT Ile Ala Val Leu Pro Asn Ile Met Leu Asp Leu Gly Val Asp Ala Gly 380 385 390 400 TCG GCC GGA GCA ACT CCA TTC GGC GGA ACC GCA ATC TTG ATT CTT GTA Ser Ala Gly Ala Thr Pro Phe Gly Gly Thr Ala Ile Leu Ile Leu Val 405 410 415 TCT GTT GCA CTG ACC ACA GTG AAG CAG ATT GAG AGC CAG CTC CTG CAA Ser Val Ala Leu Thr Thr Val Lys Gln Ile Glu Ser Gln Leu Leu Gln 420 425 430 AGC AAC TAC GAA GGA CTT CTA AAA TAA Ser Asn Tyr Glu Gly Leu Leu Lys *** 435 440
【図1】本発明のsecY遺伝子DNAを含むDNA断
片の制限酵素による切断点地図。
片の制限酵素による切断点地図。
【図2】大きさが約1.5kbの本発明のsecY遺伝
子DNAを含むDNA断片の塩基配列決定のための戦略
図。
子DNAを含むDNA断片の塩基配列決定のための戦略
図。
【図3】本発明のプラスミドpCRY30−secYの
制限酵素の切断点地図。
制限酵素の切断点地図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // C12P 21/02 C 8214−4B (C12N 1/21 C12R 1:13) (C12P 21/02 C12R 1:13)
Claims (8)
- 【請求項1】 コリネ型細菌由来の膜蛋白質の膜への組
み込みに関与する遺伝子DNA。 - 【請求項2】 コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フ
ラバム(Brevibacterium flavu
m)MJ233である請求項1記載の遺伝子DNA。 - 【請求項3】 膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺
伝子がセックワイ(secY)である請求項1記載の遺
伝子DNA。 - 【請求項4】 次のDNA塩基配列で示されるセックワ
イ(secY)遺伝子DNA。 GTGTCCGCCA TTATTCAGGC ATTCAAGGAC GCCGATCTGC GTAAGAAGAT TTTCTTCACT 60 ATCGCAATGA TCGTTCTATA CCGCATCGGT GCGCAGATCC CTTCCCCGGG AGTTGACTAT 120 GCAACGATTA GTGGTCGTCT GCGTGACTTG ACTCAGGATC AGTCAAGCGT TTATTCGCTG 180 ATTAACCTGT TTTCCGGTGG AGCGCTGCTG CAGCTGTCCA TTTTTGCTAT TGGTATCATG 240 CCGTACATCA CGGCGTCTAT TATCGTGCAG CTGCTGACTG TGGTTATTCC ACACTTTGAG 300 GAGTTGAAGA AGGAAGGCCA GTCTGGCCAG GCCAAGATGA TGCAGTACAC CAGGTACTTA 360 ACGGTTGCCT TGGCGTTGCT TCAGTCTTCG GGCATCGTCG CGTTGGCGGA CCGTGAGCAG 420 CTGCTTGGCG CAGGCATTCG CGTGCTGTCG GCTGATCGCA ACTTCTTCGA CCTCATTGTT 480 TTGGTCATCA CCATGACTGC GGGTGCAGTG CTTGTGATGT GGATGGGTGA GCTCATCACG 540 GAAAAGGGCG TAGGCAATGG TATGTCGCTG CTGATTTTCG CTGGTATCGC AACTCGCCTC 600 CCAACTGATG GCATGAACAT TCTGGGCAAC TCCGGCGGCG TGGTTTTCGC TGTTGTTCTG 660 GCTTCCGTTC TGATCCTGGT CATTGGTGTT GTATTCGTTG AGCAGGGCCA GCGTCGTATT 720 CCAGTGCAGT ACGCAAAGCG CATGGTGGGT CGTCGTCAGT ACGGTGGTTC TTCCACTTAC 780 CTGCCTTTGA AGGTCAACCA AGCTGGTGTT ATCCCAGTGA TCTTCGCGTC TTCCTTGATT 840 TACATGCCAG TGCTGATTAC TCAGATCGTG AACTCTGGTT CGCTGGAAGT GTCTGATAAC 900 TGGTGGCAGC GCAACATCAT TGCGCACCTG CAGACGCCTT CTTCCTGGCA GTACATTGTT 960 TTGTACTTTG CACTGACCAT CTTCTTCTCT TACTTCTATG TTTCTGTTCA GTATGATCCA 1020 GCTGAGCAGG CTGAAAACAT GAAGAAGTAC GGCGGATTTA TCCCTGGTAT TCGTCCGGGC 1080 CGTCCGACTG CTGAGTACTT GGGATTCGTC ATGAACCGCC TGCTGTTTGT TGGTTCCCTG 1140 TACCTGGCTG TCATTGCTGT GCTGCCAAAC ATTATGCTGG ATCTAGGTGT TGACGCCGGT 1200 TCGGCCGGAG CAACTCCATT CGGCGGAACC GCAATCTTGA TTCTTGTATC TGTTGCACTG 1260 ACCACAGTGA AGCAGATTGA GAGCCAGCTC CTGCAAAGCA ACTACGAAGG ACTTCTAAAA 1320 TAA - 【請求項5】 次のアミノ酸配列で示されるセックワイ
(secY)遺伝子DNA。 Val Ser Ala Ile Ile Gln Ala Phe Lys Asp Ala Asp Leu Arg Lys Lys 1 5 10 15 Ile Phe Phe Thr Ile Ala Met Ile Val Leu Tyr Arg Ile Gly Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ser Pro Gly Val Asp Tyr Ala Thr Ile Ser Gly Arg Leu Arg 35 40 45 Asp Leu Thr Gln Asp Gln Ser Ser Val Tyr Ser Leu Ile Asn Leu Phe 50 55 60 Ser Gly Gly Ala Leu Leu Gln Leu Ser Ile Phe Ala Ile Gly Ile Met 65 70 75 80 Pro Tyr Ile Thr Ala Ser Ile Ile Val Gln Leu Leu Thr Val Val Ile 85 90 95 Pro His Phe Glu Glu Leu Lys Lys Glu Gly Gln Ser Gly Gln Ala Lys 100 105 110 Met Met Gln Tyr Thr Arg Tyr Leu Thr Val Ala Leu Ala Leu Leu Gln 115 120 125 Ser Ser Gly Ile Val Ala Leu Ala Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gly Ala 130 135 140 Gly Ile Arg Val Leu Ser Ala Asp Arg Asn Phe Phe Asp Leu Ile Val 145 150 155 160 Leu Val Ile Thr Met Thr Ala Gly Ala Val Leu Val Met Trp Met Gly 165 170 175 Glu Leu Ile Thr Glu Lys Gly Val Gly Asn Gly Met Ser Leu Leu Ile 175 180 185 Phe Ala Gly Ile Ala Thr Arg Leu Pro Thr Asp Gly Met Asn Ile Leu 190 195 200 Gly Asn Ser Gly Gly Val Val Phe Ala Val Val Leu Ala Ser Val Leu 205 210 215 Ile Leu Val Ile Gly Val Val Phe Val Glu Gln Gly Gln Arg Arg Ile 220 225 230 235 Pro Val Gln Tyr Ala Lys Arg Met Val Gly Arg Arg Gln Tyr Gly Gly 240 245 250 Ser Ser Thr Tyr Leu Pro Leu Lys Val Asn Gln Ala Gly Val Ile Pro 255 260 265 Val Ile Phe Ala Ser Ser Leu Ile Tyr Met Pro Val Leu Ile Thr Gln 270 275 280 Ile Val Asn Ser Gly Ser Leu Glu Val Ser Asp Asn Trp Trp Gln Arg 285 290 295 Asn Ile Ile Ala His Leu Gln Thr Pro Ser Ser Trp Gln Tyr Ile Val 300 305 310 315 Leu Tyr Phe Ala Leu Thr Ile Phe Phe Ser Tyr Phe Tyr Val Ser Val 320 325 330 Gln Tyr Asp Pro Ala Glu Gln Ala Glu Asn Met Lys Lys Tyr Gly Gly 335 340 345 Phe Ile Pro Gly Ile Arg Pro Gly Arg Pro Thr Ala Glu Tyr Leu Gly 350 355 360 Phe Val Met Asn Arg Leu Leu Phe Val Gly Ser Leu Tyr Leu Ala Val 365 370 375 Ile Ala Val Leu Pro Asn Ile Met Leu Asp Leu Gly Val Asp Ala Gly 380 385 390 400 Ser Ala Gly Ala Thr Pro Phe Gly Gly Thr Ala Ile Leu Ile Leu Val 405 410 415 Ser Val Ala Leu Thr Thr Val Lys Gln Ile Glu Ser Gln Leu Leu Gln 420 425 430 Ser Asn Tyr Glu Gly Leu Leu Lys 435 440 - 【請求項6】 請求項1〜5のいずれかに記載の遺伝子
DNAが導入された組換えプラスミド。 - 【請求項7】 請求項1〜5のいずれかに記載の遺伝子
DNAと、コリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子
を含むDNAを保有する組換えプラスミド。 - 【請求項8】 請求項7記載のプラスミドで形質転換さ
れたコリネ型細菌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP32692792A JPH06169780A (ja) | 1992-12-07 | 1992-12-07 | 膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子dna |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP32692792A JPH06169780A (ja) | 1992-12-07 | 1992-12-07 | 膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子dna |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06169780A true JPH06169780A (ja) | 1994-06-21 |
Family
ID=18193321
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP32692792A Pending JPH06169780A (ja) | 1992-12-07 | 1992-12-07 | 膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子dna |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH06169780A (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
US8597907B2 (en) | 2004-04-20 | 2013-12-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing proteins |
-
1992
- 1992-12-07 JP JP32692792A patent/JPH06169780A/ja active Pending
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
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US7425435B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-09-16 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
US8597907B2 (en) | 2004-04-20 | 2013-12-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing proteins |
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