JPH06169780A - 膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 コリネ型細菌由来の膜蛋白質の膜への組み込
みに関与する遺伝子ＤＮＡの提供。 【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
からセックワイ（ｓｅｃＹ）遺伝子ＤＮＡを単離し、こ
の遺伝子の塩基配列を決定し、該遺伝子ＤＮＡ断片を有
するコリネ型細菌内で安定なプラスミドｐＣＲＹ３０−
ｓｅｃＹを構築した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コリネ型細菌由来の膜
蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子ＤＮＡに関
し、さらに詳しくは膜蛋白質の膜への組み込みに関与す
る主要な遺伝子の１つセックワイ（ｓｅｃＹ）遺伝子に
関する。ｓｅｃＹ遺伝子産物は、膜蛋白質、分泌蛋白質
が各々、細胞膜内へ組み込まれる、菌体外へ分泌される
過程に必要不可欠な遺伝子である。該遺伝子を利用する
ことにより、膜蛋白質の膜中含量の増加、分泌蛋白質の
菌体外分泌量の増加が期待される。また、膜蛋白質、例
えば酸化還元酵素の含量増加により、高活性を有する高
性能生体触媒として菌体を利用し、部位特異的酸化還元
等による様々の物質生産に応用することが可能である。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質の膜への組み込み及び分泌に関す
る機構は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）においてよく研究されており［Ａｎｎｕ
ａｌＲｅｖｉｅｗ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４，２１５−
２４８，１９９０．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０，１０１−１２４，
１９９１］、蛋白質の膜への組み込みに関する遺伝子と
してｓｅｃＡ［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ，１５０，６８６−６９１，１９８２］、ｓ
ｅｃＢ［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ，１５４，２５４−２６０，１９８３］、ｓｅｃＤ
［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，
１６９，１２８６−１２９０，１９８７］、ｓｅｃＥ
［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；１１８，５７１−５７９，１９８
８］、ｓｅｃＦ［ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，９，３２
０９−３２１６，１９９０］、ｓｅｃＹ［Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，２５９９−
２６１６，１９８３］等が知られている。

【０００３】これらの中でｓｅｃＡ，Ｅ，Ｙ遺伝子は、
各種変異株を用いた研究により蛋白質の膜への組込みに
特に重要な役割を演じていることが示されている。上記
ｓｅｃＹ遺伝子としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来の遺伝子［Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，ｐ．２
５９９−２６１６，１９８３参照］、バチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の遺伝子
［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１０７，ｐ．６０３−６０７，１９９０参照］等が単離
されている。しかしながら、産業上重要な細菌であるコ
リネ型細菌由来のｓｅｃＹ遺伝子については、従来の報
告例は見当らない。

【０００４】一般に、膜蛋白質は細胞膜中より抽出した
場合不安定であり、生体触媒として利用するには限界が
ある。特定膜蛋白質の膜中含量のみを増加させることが
可能であれば、高含量の膜、もしくは微生物自体を触媒
として利用することができる。しかしながら、膜蛋白質
を微生物細胞内で高発現させても、細胞質内でインクル
ージョン・ボディ（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を
形成し、細胞膜内へ組み込まれない。膜蛋白質を高発現
させ、膜内に安定に保持させるためには、蛋白質の膜へ
の組み込み系を強化する必要があると考えられるが、コ
リネ型細菌由来の膜組み込み系についての知見がなく、
また、多種由来の膜組み込み系は、コリネ型細菌中で十
分に機能しないと考えられる［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４，３０５−３１４，１９９
０，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２７３，７５−７８，
１９９０参照］。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記問
題点を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細
菌由来の膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子を
単離し、改変することにより、特定膜蛋白質の膜中含量
増加を達成できると考え、コリネ型細菌由来の膜蛋白質
の膜への組み込みに関与する主要な遺伝子であるｓｅｃ
Ｙ遺伝子ＤＮＡを単離することに成功し、本発明を完成
するに至った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、（１）コリネ型細菌由来の膜蛋白質の膜への組み込
みに関与する遺伝子ＤＮＡ、（２）該遺伝子ＤＮＡが導
入された組換えプラスミド及び（３）該組換えプラスミ
ドで形質転換されたコリネ型細菌が提供される。

【０００７】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明の「膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺
伝子ＤＮＡ」とは、細胞膜中蛋白質の膜への組み込み、
菌体外分泌蛋白質の分泌に関与する装置を構成する主要
成分をコードする遺伝子ＤＮＡを意味するものである。
該主要成分をコードする遺伝子ＤＮＡであるｓｅｃＹ遺
伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ断片」
と略称することがある）は、その塩基配列が決定された
後においては合成することも可能であるが、通常は微生
物からクローニングされる場合が多く、その供給源とな
る微生物としては、コリネ型細菌が有利に使用される。

【０００８】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本操作の一例を述べれば次のとおりである：
Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウ
ム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａ
ｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）株
の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限酵素で切
断することにより生ずる切断断片の中から以下に述べる
方法で、分離取得することができる。

【０００９】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩを用
いて染色体ＤＮＡを完全に分解する。得られるＤＮＡ断
片をクローニングベクター、例えばｐＵＣ１１８（宝酒
造製）に挿入し、このベクターを用いてエシエリヒア・
コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、形質転換体
を取得する。

【００１０】得られる形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、エシエリヒア・コリ、バチルス・サチルス由
来ｓｅｃＹ遺伝子の共通領域配列をプローブとして用い
るサザンハイブリダイゼーションにより、挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のＡ断片を確認・取得することができる。かくして得ら
れるＡ断片をさらに適当な制限酵素を用いて切断し、得
られるＤＮＡ断片を同種のベクターに挿入し、エシエリ
ヒア・コリＪＭ１０９を形質転換する。得られる形質転
換体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、ハイブリダイゼー
ションにより挿入されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３株染色体由来のＡ断片を確認・取得するこ
とができる。

【００１１】このようにして得られるＡ断片の一つは、
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染
色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩの完全分解により切り
出し、さらにそれを制限酵素ＫｐｎＩで切断又は制限酵
素ＫｐｎＩで直接切断することによって得られる大きさ
が約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。こ
の約１．５ｋｂのｓｅｃＹ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断
片を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位数及び
切断断片の大きさを下記第１表に示す。

【００１２】

【表１】第１表 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｌＩ １ ０．４，１．１ ＰｓｔＩ ２ ０．３，０．５，０．７ ＳａｃＩ １ ０．６，０．９ ＳｍａＩ １ ０．２，１．３

【００１３】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。

【００１４】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇ
ｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断
して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリ
ルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づ
き、切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大
きさを算出する。プラスミドの大きさは、切断断片のそ
れぞれの大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片
の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさに
ついては、１％アガロースゲル電気泳動によって得られ
る結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の
大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって得られる結果を採用した。

【００１５】一方、上記のブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、
ＫｐｎＩによって切断又は制限酵素ＫｐｎＩで直接切断
することにより得られる大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ
断片については、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１
８またはｐＵＣ１１９（宝酒造製）を用いるジデオキシ
ヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法、Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７４，５４６３，１９７７）により決定することが
できる。このようにして決定した上記約１．５ｋｂのＤ
ＮＡ断片の塩基配列のオープンリーディングフレームの
存在から決定したｓｅｃＹ遺伝子ＤＮＡは、後記配列表
の配列番号１に示す配列を有するものであり、４４０個
のアミノ酸をコードする１３２０の塩基対から構成され
る。

【００１６】上記の塩基配列を包含する本発明のｓｅｃ
Ｙ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色
体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられ
るＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製Ｓｙｓｔｅｍ
−１ Ｐｌｕｓを用いて合成されたものであってもよ
い。

【００１７】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明の膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺伝子ＤＮＡ
は、ｓｅｃＹ遺伝子産物の機能を実質的に損なうことが
ない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換され
ていてもよく又は削除されていてもよく、或いは新たに
塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が
転位されているものであってもよく、これらの誘導体の
いずれもが、本発明の遺伝子ＤＮＡに包含されるもので
ある。

【００１８】以上に詳述した大きさが約１．５ｋｂのＤ
ＮＡ断片の制限酵素による切断点地図を図１に示す。本
発明のｓｅｃＹ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片（Ａ断
片）は、適当なプラスミド、例えば、コリネ型細菌内で
プラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含
むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型
細菌内でｓｅｃＹ遺伝子産物の高発現可能な組換えプラ
スミドを得ることができる。

【００１９】また、本発明のｓｅｃＹ遺伝子を発現させ
るためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモ
ーターであることができるが、それに限られるものでは
なく、ｓｅｃＹ遺伝子の転写を開始させるための原核生
物由来の塩基配列であればいかなるプロモーターであっ
てもよい。

【００２０】本発明のＡ断片を導入することができる、
コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なく
とも含むプラスミドベクターとしては、例えば、特開平
３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３
０；特開平２−２７６５７５号公報に記載のプラスミド
ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣ
ＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平
１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２
及びｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載
のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載
のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に
記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４
４；特開昭５７−１３４５００号に記載のｐＣＧ１；特
開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭
５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ
１１等を挙げることができる。

【００２１】中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で
用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌
内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型
細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを持つ
ものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐ
ＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲ
Ｙ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ
３ＫＸ等が好適に使用される。

【００２２】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉ
ｓ）ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）か
らプラスミドｐＢＹ５０３（このプラスミドの詳細につ
いては特開平１−９５７８５号公報参照）ＤＮＡを抽出
し、制限酵素ＸｈｏＩで大きさが約４．０ｋｂのプラス
ミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を切
り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが
約２．１ｋｂのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を
含むＤＮＡ断片を切り出す。これらの両断面をプラスミ
ドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ
部位及びＳａｌＩ部位に組み込むことにより、プラスミ
ドベクターｐＣＲＹ３０を調製することができる。

【００２３】次に、上記プラスミドベクターへの本発明
のＡ断片の導入は、例えばプラスミドベクター中に１個
所だけ存在する制限酵素部位を、該制限酵素で開裂し、
そこに前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下にＤＮＡ
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。

【００２４】プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のＡ断
片の導入は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで開裂させ、そこに前記ｓｅｃＹ遺伝子ＤＮＡを含
むＤＮＡ断片（Ａ断片）をＤＮＡリガーゼで連結させる
ことにより行うことができる。このようにして造成され
るプラスミドｐＣＲＹ３０に本発明の大きさが約１．５
ｋｂのＡ断片を導入した組換えプラスミドをｐＣＲＹ３
０−ｓｅｃＹと命名した。プラスミドｐＣＲＹ３０−ｓ
ｅｃＹの作成方法の詳細については、後記実施例４で説
明する。

【００２５】本発明によるプラスミドで形質転換しうる
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９９）等が挙げられる。

【００２６】なお、上記のＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８の
菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株として
ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
ール資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公
報第３〜４欄参照）。また、ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００
の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株とし
たＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株
である（特開昭６２−５１９８号公報参照）。さらに、
ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲＭＢＰ−１４
９７の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナー
ゼ高活性変異株である（特開昭６１−１７７９９３号公
報参照）。

【００２７】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同Ａ
ＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６；ブレビバク
テリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０；ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）Ａ
ＴＣＣ１３８６９；コリネバクテリウム・グルタミカム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用いる
こともできる。

【００２８】なお、宿主としてブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７
８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
ｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
［Ｂａｃｔ．Ｒｅｖ．３６ ｐ．３６１〜４０５（１９
７２）参照］。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的に
除去する方法の一例を示せば次のとおりである。

【００２９】宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムブロミド（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら約２４時間約３５℃で培養
する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３５℃で約
２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラス
ミド抽出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去さ
れている株を選択する。この操作によりプラスミドｐＢ
Ｙ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３由来菌株が得られる。

【００３０】このようにして得られるブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシェリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように［Ｃａｌ
ｖｉｎ，Ｎ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｎａｗａｌｔ，Ｐ．
Ｃ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ，１７０，２７９６（１９８８）；Ｉｔｏ，Ｋ．，Ｎ
ｉｓｈｉｄａ，Ｔ．ａｎｄＩｚａｋｉ．Ｋ．，Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２，２９３（１９８８）参照］、
ＤＮＡ受容菌へのパルス波通電［Ｓａｔｏｈ，Ｙ．ｅ
ｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１５９（１９９
０）参照］によりプラスミドを導入することが可能であ
る。

【００３１】上記の方法で形質転換して得られるｓｅｃ
Ｙ遺伝子産物産性能を有するコリネ型細菌、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来株の培養方
法を以下に述べる。培養は炭素源、窒素源、無機塩等を
含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源として
は、例えばグルコース、エタノール、メタノール、廃糖
蜜等が、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いられ
る。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウ
ム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用い
られる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種
ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。

【００３２】培養は、通常、通気攪拌、振盪等の好気条
件下に、約２０〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３
５℃の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜
１０、好ましくは７〜８付近とすることができ、培養中
のｐＨ調整は酸又はアルカリを添加して行うことができ
る。培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１〜５容量
％、更に好ましくは２〜３容量％である。また、培養期
間は通常１〜７日間とすることができ、最適期間は３日
間である。

【００３３】かくして得られる培養物から遠心分離等に
より菌体を集めることにより、ｓｅｃＹ遺伝子産物を高
含有する菌体を取得することができる。

【００３４】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。実施例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｓｅ
ｃＹ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片（Ａ断片）のクロー
ン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ
₄ ７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５
ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ₄ ４〜６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．
５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チア
ミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１１］１ｌ
に、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、
菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度に
リゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液
１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫを、最終濃度
が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時
間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度
が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温し
て溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロ
ホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪し
た後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１
０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを
０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノール
をゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在す
るＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗
浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液
５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用い
た。

【００３５】（Ｂ）組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ ５０ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１時間反応させ完
全分解した。このＥｃｏＲＩ分解ＤＮＡにクローニング
ベクターｐＵＣ１１８（宝酒造より市販）を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合
し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 及びＴ₄ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加
し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間
反応させ、結合させた。

【００３６】上記（Ｂ）項で得られたプラスミド混液を
用い、塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９
７０）によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地
［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、Ｎ
ａｃｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１１に溶解］に塗
抹した。

【００３７】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲルを用いて泳
動した。このアガロースゲルよりＤＮＡをナイロンメン
ブレン上に移しとり、エシェリヒア・コリ、バチルスサ
チルス由来ｓｅｃＹ遺伝子の共通領域をプローブとして
サザンハイブリダイゼーションを行なった。用いたプロ
ーブとしては、エシェリヒア・コリ、バチルス・サチル
ス由来のｓｅｃＹ遺伝子から推定されるアミノ酸配列で
特に相同性の高い領域に注目し、そのアミノ酸配列より
想定される混合オリゴヌクレオチドプローブをアプライ
ド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー
（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。

【００３８】実際に用いたプローブの塩基配列は、次の
アミノ酸配列： Ala Gly Va l Ile Pro Val Ile Phe Ala より想定される下記の塩基配列： GCI GGI GTI ATH CCI GTI ATH TTY GC （配列中、ＨはＡ又はＣ又はＴ、ＹはＣ又はＴを示し、
ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔ
はチミン、Ｉはデオキシイノシンを示す。）の２６ｍｅ
ｒ（２６塩基対）である。なお、プローブの合成にあた
っては、混合の度合が著しくなりすぎぬようにデオキシ
イノシンを用いた。

【００３９】合成した上記オリゴヌクレオチドプローブ
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を用い
る手法で、５′末端リン酸基を［γ−³²Ｐ］ＡＴＰでラ
ジオアイソトープラベルした［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５８，３０７−３１５，
１９８６］。サザンハイブリダイゼーションは、常法
［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９８９）］の通り行なった。この結果、ポ
ジティブなバンドを生ずるクローンを選定することがで
き、プラスミドｐＵＣ１１８の長さ３．２ｋｂのＤＮＡ
断片に加え、長さ約４．２ｋｂの挿入断片が認められ
た。

【００４０】本プラスミドをｐＵＣ１１８−Ｙ−ｆｒａ
ｇと命名した。 （Ｄ）ｓｅｃＹＤＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）断
片のサブクローニング 上記（Ｃ）項で得たプラスミドｐＵＣ１１８−Ｙ−ｆｒ
ａｇに含まれるＤＮＡ挿入断片を、必要な部分だけに小
型化するために、プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造より
市販）へｓｅｃＹ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片を下記
のとおりサブクローニングした。

【００４１】上記（Ｃ）項で得たプラスミドｐＵＣ１１
８−Ｙ−ｆｒａｇを制限酵素ＫｐｎＩで切断したもの
と、プラスミドｐＵＣ１１８を制限酵素ＫｐｎＩで切断
したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉ
ｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、１２℃で１５時間反応させ、結合させた。

【００４２】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により前記
エシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換し、アンピシ
リン５０ｍｇを含む培地［トリプトン１０ｇ、イースト
エキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを
蒸留水１１に溶解］に塗抹した。

【００４３】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、ハイブリダイゼーション法
を用いて調べたところ、プラスミドｐＵＣ１１８の長さ
３．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１．５ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限酵素で切断した
ときの、長さ約１．５ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素認識
部位数および切断断片の大きさは前記表１に示したとお
りであった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図
１に示す。

【００４４】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の第２表に示す。

【００４５】

【表２】 第２表 プラスミドｐＵＣ１１８−ｓｅｃＹ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ １ ４．７ ＳａｃＩ ２ ４．１，０．６ ＰｓｔＩ ３ ３．５，０．７，０．５

【００４６】上記の制限酵素により特徴づけられるプラ
スミドをｐＵＣ１１８−ｓｅｃＹと命名した。以上によ
りｓｅｃＹ遺伝子ＤＮＡを含む大きさが約１．５ｋｂの
ＤＮＡ断片（ＫｐｎＩ断片）を得ることができた。

【００４７】実施例２ ｓｅｃＹ遺伝子ＤＮＡの塩基配列の決定 実施例１の（Ｄ）項で得られたｓｅｃＹ遺伝子ＤＮＡを
含む長さが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片について、その塩
基配列をプラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９
（宝酒造製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５４６３，１
９７７）により図２に示した戦略図に従って決定した。

【００４８】その塩基配列中のオープンリーディングフ
レームの存在から、ｓｅｃＹ遺伝子ＤＮＡは、後記配列
表の配列番号１に示す塩基配列を有する４４０個のアミ
ノ酸をコードする１３２０の塩基対より構成されている
ことが判明した。

【００４９】実施例３ コリネ型細菌内で複製し安定なプラスミドベクターｐＣ
ＲＹ３０の作成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。

【００５０】半合成培地Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ₄ ）
₂ ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ
₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂
Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、酵母
エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビチオン２００μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ及び蒸
留水１１］１１に、ブレビバクテリウム・スタチオニス
ＩＦＯ１２１４４を対数増殖期後期まで培養し、菌体を
集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチ
ームを含む緩衝液［２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭグル
コース］２０ｍｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させ
た。反応液にアルカリ−ＳＤＳ液［０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ］４０ｍｌを添加し、緩やか
に混和して室温にて１５分間静置した。次に、この反応
液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸カリウム溶液６０ｍ
ｌ、酢酸１１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌの混合液］
３０ｍｌを添加し、充分混和してから氷水中に１５分間
静置した。

【００５１】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノ
ール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸濁した
後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇ
の遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍量のエ
タノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃で１０
分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収
した。

【００５２】沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［トリス１
０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８．０に調
整］２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５
倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液］１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１．３９２ｇ／
ｍｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６，０００×ｇの遠心分離を行った。

【００５３】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。次いでこ
の分画液を等量のイソアミルアルコールで４回処理して
エチジウムブロマイドを抽出除去し、その後にＴＥ緩衝
液に対して透析を行った。このようにして得られたプラ
スミドｐＢＹ５０３を含む透析液に３Ｍ酢酸ナトリウム
溶液を最終濃度３０ｍＭに添加した後、２倍量エタノー
ルを加え、−２０℃１時間静置した。この溶液を１５，
０００×ｇの遠心分離にかけてＤＮＡを沈降させ，プラ
スミドｐＢＹ５０３を５０μｇ得た。

【００５４】（Ｂ）プラスミドベクターｐＣＲＹ３０の
作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０．５μｇに制
限酵素ＳａｌＩ（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃１時間反応さ
せ、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。前記（Ａ）項
で調製したプラスミドｐＢＹ５０３の２μｇに制限酵素
ＸｈｏＩ（１ｕｎｉｔ）を３７℃で３０分間反応させ、
プラスミドＤＮＡを部分分解した。両者のプラスミドＤ
ＮＡ分解物を混合し、制限酵素を不活性化するために６
５℃で１０分間加熱処理した後、該失活溶液中の成分が
最終濃度として各々５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．６、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭジチオスレイトール、
１ｍＭ ＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔにな
るように各成分を強化し、１６℃で１５時間保温した。
この溶液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９コンピ
テントセル（宝酒造製）を形質転換した。

【００５５】形質転換株は３０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び蒸留水１１、ｐＨ７．
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育してき
たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法
［Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”（１９８２），９０−９１参照］により抽出
した。

【００５６】その結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８のＳ
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４．０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒ
ｉが得られた。次に同様の方法を用い、前記（Ａ）項で
得られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐ
ｎＩ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２．１ｋｂ
のＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉ
のＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラ
スミドベクターｐＣＲＹ３０を調製した。

【００５７】実施例４ プラスミドｐＣＲＹ３０−ｓｅｃＹの作成及びコリネ型
細菌への導入 実施例１の（Ｃ）項で得られたプラスミドｐＵＣ１１８
−ｓｅｃＹ５μｇを制限酵素ＫｐｎＩを各５ｕｎｉｔｓ
用い、３７℃で１時間反応させ分解したものと、実施例
３の（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＣＲＹ３０ １μ
ｇを制限酵素ＫｐｎＩ １ｕｎｉｔを用い、３７℃で１
時間反応させ分解したものを混合し、５０ｍＭトリス緩
衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ およびＴ４ＤＮＡ
リガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は
最終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ結合させ
た。このプラスミドを用いて、前記方法に従い前記エシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換し、カナマイシ
ン５０μｇ／ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ、イー
ストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６
ｇを蒸留水１１に溶解］に塗抹した。

【００５８】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ
８．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ１．５ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片が認められた。上記の如く調製されたプラ
スミドＤＮＡを、コリネ型細菌へ形質転換した。

【００５９】形質転換は、電気パルス法を用いて次のと
おり行った。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０
２除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで
培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌになるように
添加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分離により菌
体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭ
Ｓｕｃｒｏｓｅ、７ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、１ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂ ；ｐＨ７．４）にて洗浄した。さらに菌体を遠
心分離して集め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０．
７５ｍｌの細胞と、前記で得られたプラスミドＤＮＡ溶
液５０μｌとを混合し、水中にて２０分間静置した。ジ
ーンパルサー（バイオラド社製）を用いて、２５００ボ
ルト、２５μＦＤに設定し、パルスを印加後氷中に２０
分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し３０℃
にて１時間培養後、カナマイシン１５μｇ／ｍｌ（最終
濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で２〜３日
間培養した。出現したカナマイシン耐性株より、前記実
施例３（Ａ）項に記載の方法を用いてプラスミドを得
た。このプラスミドを各種制限酵素で切断して、切断断
片の大きさを測定した。その結果を下記の第３表に示
す。

【００６０】

【表３】 第３表 プラスミドｐＣＲＹ３０−ｓｅｃＹ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ １ １０．１ ＢａｍＨＩ １ １０．１ ＫｐｎＩ ２ ８．６，１．５ ＸｈｏＩ １ １０．１

【００６１】上記制限酵素により特徴づけられるプラス
ミドをｐＣＲＹ３０−ｓｅｃＹと命名した。なお、プラ
スミドｐＣＲＹ３０−ｓｅｃＹにより形質転換されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ｓｅｃＹは、
茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院微生物工
業技術研究所に、平成４年１１月２４日付で：微工研菌
寄第１３３０２号（ＦＥＲＭ−１３３０２）として寄託
されている。

【００６２】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：1320 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名：MJ233 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1-1320 特徴を決定した方法：P 配列 GTG TCC GCC ATT ATT CAG GCA TTC AAG GAC GCC GAT CTG CGT AAG AAG Val Ser Ala Ile Ile Gln Ala Phe Lys Asp Ala Asp Leu Arg Lys Lys 1 5 10 15 ATT TTC TTC ACT ATC GCC ATG ATC GTT CTA TAC CGC ATC GGT GCG CAG Ile Phe Phe Thr Ile Ala Met Ile Val Leu Tyr Arg Ile Gly Ala Gln 20 25 30 ATC CCT TCC CCG GGA GTT GAC TAT GCA ACG ATT AGT GGT CGT CTG CGT Ile Pro Ser Pro Gly Val Asp Tyr Ala Thr Ile Ser Gly Arg Leu Arg 35 40 45 GAC TTG ACT CAG GAT CAG TCA AGC GTT TAT TCG CTG ATT AAC CTG TTT Asp Leu Thr Gln Asp Gln Ser Ser Val Tyr Ser Leu Ile Asn Leu Phe 50 55 60 TCC GGT GGA GCG CTG CTG CAG CTG TCC ATT TTT GCT ATT GGT ATC ATG Ser Gly Gly Ala Leu Leu Gln Leu Ser Ile Phe Ala Ile Gly Ile Met 65 70 75 80 CCG TAC ATC ACG GCG TCT ATT ATC GTG CAG CTG CTG ACT GTG GTT ATT Pro Tyr Ile Thr Ala Ser Ile Ile Val Gln Leu Leu Thr Val Val Ile 85 90 95 CCA CAC TTT GAG GAG TTG AAG AAG GAA GGC CAG TCT GGC CAG GCC AAG Pro His Phe Glu Glu Leu Lys Lys Glu Gly Gln Ser Gly Gln Ala Lys 100 105 110 ATG ATG CAG TAC ACC AGG TAC TTA ACG GTT GCC TTG GCG TTG CTT CAG Met Met Gln Tyr Thr Arg Tyr Leu Thr Val Ala Leu Ala Leu Leu Gln 115 120 125 TCT TCG GGC ATC GTC GCG TTG GCG GAC CGT GAG CAG CTG CTT GGC GCA Ser Ser Gly Ile Val Ala Leu Ala Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gly Ala 130 135 140 GGC ATT CGC GTG CTG TCG GCT GAT CGC AAC TTC TTC GAC CTC ATT GTT Gly Ile Arg Val Leu Ser Ala Asp Arg Asn Phe Phe Asp Leu Ile Val 145 150 155 160 TTG GTC ATC ACC ATG ACT GCG GGT GCA GTG CTT GTG ATG TGG ATG GGT Leu Val Ile Thr Met Thr Ala Gly Ala Val Leu Val Met Trp Met Gly 165 170 175 GAG CTC ATC ACG GAA AAG GGC GTA GGC AAT GGT ATG TCG CTG CTG ATT Glu Leu Ile Thr Glu Lys Gly Val Gly Asn Gly Met Ser Leu Leu Ile 175 180 185 TTC GCT GGT ATC GCA ACT CGC CTC CCA ACT GAT GGC ATG AAC ATT CTG Phe Ala Gly Ile Ala Thr Arg Leu Pro Thr Asp Gly Met Asn Ile Leu 190 195 200 GGC AAC TCC GGC GGC GTG GTT TTC GCT GTT GTT CTG GCT TCC GTT CTG Gly Asn Ser Gly Gly Val Val Phe Ala Val Val Leu Ala Ser Val Leu 205 210 215 ATC CTG GTC ATT GGT GTT GTA TTC GTT GAG CAG GGC CAG CGT CGT ATT Ile Leu Val Ile Gly Val Val Phe Val Glu Gln Gly Gln Arg Arg Ile 220 225 230 235 CCA GTG CAG TAC GCA AAG CGC ATG GTG GGT CGT CGT CAG TAC GGT GGT Pro Val Gln Tyr Ala Lys Arg Met Val Gly Arg Arg Gln Tyr Gly Gly 240 245 250 TCT TCC ACT TAC CTG CCT TTG AAG GTC AAC CAA GCT GGT GTT ATC CCA Ser Ser Thr Tyr Leu Pro Leu Lys Val Asn Gln Ala Gly Val Ile Pro 255 260 265 GTG ATC TTC GCG TCT TCC TTG ATT TAC ATG CCA GTG CTG ATT ACT CAG Val Ile Phe Ala Ser Ser Leu Ile Tyr Met Pro Val Leu Ile Thr Gln 270 275 280 ATC GTG AAC TCT GGT TCG CTG GAA GTG TCT GAT AAC TGG TGG CAG CGC Ile Val Asn Ser Gly Ser Leu Glu Val Ser Asp Asn Trp Trp Gln Arg 285 290 295 AAC ATC ATT GCG CAC CTG CAG ACG CCT TCT TCC TGG CAG TAC ATT GTT Asn Ile Ile Ala His Leu Gln Thr Pro Ser Ser Trp Gln Tyr Ile Val 300 305 310 315 TTG TAC TTT GCA CTG ACC ATC TTC TTC TCT TAC TTC TAT GTT TCT GTT Leu Tyr Phe Ala Leu Thr Ile Phe Phe Ser Tyr Phe Tyr Val Ser Val 320 325 330 CAG TAT GAT CCA GCT GAG CAG GCT GAA AAC ATG AAG AAG TAC GGC GGA Gln Tyr Asp Pro Ala Glu Gln Ala Glu Asn Met Lys Lys Tyr Gly Gly 335 340 345 TTT ATC CCT GGT ATT CGT CCG GGC CGT CCG ACT GCT GAG TAC TTG GGA Phe Ile Pro Gly Ile Arg Pro Gly Arg Pro Thr Ala Glu Tyr Leu Gly 350 355 360 TTC GTC ATG AAC CGC CTG CTG TTT GTT GGT TCC CTG TAC CTG GCT GTC Phe Val Met Asn Arg Leu Leu Phe Val Gly Ser Leu Tyr Leu Ala Val 365 370 375 ATT GCT GTG CTG CCA AAC ATT ATG CTG GAT CTA GGT GTT GAC GCC GGT Ile Ala Val Leu Pro Asn Ile Met Leu Asp Leu Gly Val Asp Ala Gly 380 385 390 400 TCG GCC GGA GCA ACT CCA TTC GGC GGA ACC GCA ATC TTG ATT CTT GTA Ser Ala Gly Ala Thr Pro Phe Gly Gly Thr Ala Ile Leu Ile Leu Val 405 410 415 TCT GTT GCA CTG ACC ACA GTG AAG CAG ATT GAG AGC CAG CTC CTG CAA Ser Val Ala Leu Thr Thr Val Lys Gln Ile Glu Ser Gln Leu Leu Gln 420 425 430 AGC AAC TAC GAA GGA CTT CTA AAA TAA Ser Asn Tyr Glu Gly Leu Leu Lys *** 435 440

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のｓｅｃＹ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断
片の制限酵素による切断点地図。

【図２】大きさが約１．５ｋｂの本発明のｓｅｃＹ遺伝
子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片の塩基配列決定のための戦略
図。

【図３】本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ｓｅｃＹの
制限酵素の切断点地図。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:13）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コリネ型細菌由来の膜蛋白質の膜への組
   み込みに関与する遺伝子ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フ
   ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕ
   ｍ）ＭＪ２３３である請求項１記載の遺伝子ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 膜蛋白質の膜への組み込みに関与する遺
   伝子がセックワイ（ｓｅｃＹ）である請求項１記載の遺
   伝子ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 次のＤＮＡ塩基配列で示されるセックワ
   イ（ｓｅｃＹ）遺伝子ＤＮＡ。 GTGTCCGCCA TTATTCAGGC ATTCAAGGAC GCCGATCTGC GTAAGAAGAT TTTCTTCACT 60 ATCGCAATGA TCGTTCTATA CCGCATCGGT GCGCAGATCC CTTCCCCGGG AGTTGACTAT 120 GCAACGATTA GTGGTCGTCT GCGTGACTTG ACTCAGGATC AGTCAAGCGT TTATTCGCTG 180 ATTAACCTGT TTTCCGGTGG AGCGCTGCTG CAGCTGTCCA TTTTTGCTAT TGGTATCATG 240 CCGTACATCA CGGCGTCTAT TATCGTGCAG CTGCTGACTG TGGTTATTCC ACACTTTGAG 300 GAGTTGAAGA AGGAAGGCCA GTCTGGCCAG GCCAAGATGA TGCAGTACAC CAGGTACTTA 360 ACGGTTGCCT TGGCGTTGCT TCAGTCTTCG GGCATCGTCG CGTTGGCGGA CCGTGAGCAG 420 CTGCTTGGCG CAGGCATTCG CGTGCTGTCG GCTGATCGCA ACTTCTTCGA CCTCATTGTT 480 TTGGTCATCA CCATGACTGC GGGTGCAGTG CTTGTGATGT GGATGGGTGA GCTCATCACG 540 GAAAAGGGCG TAGGCAATGG TATGTCGCTG CTGATTTTCG CTGGTATCGC AACTCGCCTC 600 CCAACTGATG GCATGAACAT TCTGGGCAAC TCCGGCGGCG TGGTTTTCGC TGTTGTTCTG 660 GCTTCCGTTC TGATCCTGGT CATTGGTGTT GTATTCGTTG AGCAGGGCCA GCGTCGTATT 720 CCAGTGCAGT ACGCAAAGCG CATGGTGGGT CGTCGTCAGT ACGGTGGTTC TTCCACTTAC 780 CTGCCTTTGA AGGTCAACCA AGCTGGTGTT ATCCCAGTGA TCTTCGCGTC TTCCTTGATT 840 TACATGCCAG TGCTGATTAC TCAGATCGTG AACTCTGGTT CGCTGGAAGT GTCTGATAAC 900 TGGTGGCAGC GCAACATCAT TGCGCACCTG CAGACGCCTT CTTCCTGGCA GTACATTGTT 960 TTGTACTTTG CACTGACCAT CTTCTTCTCT TACTTCTATG TTTCTGTTCA GTATGATCCA 1020 GCTGAGCAGG CTGAAAACAT GAAGAAGTAC GGCGGATTTA TCCCTGGTAT TCGTCCGGGC 1080 CGTCCGACTG CTGAGTACTT GGGATTCGTC ATGAACCGCC TGCTGTTTGT TGGTTCCCTG 1140 TACCTGGCTG TCATTGCTGT GCTGCCAAAC ATTATGCTGG ATCTAGGTGT TGACGCCGGT 1200 TCGGCCGGAG CAACTCCATT CGGCGGAACC GCAATCTTGA TTCTTGTATC TGTTGCACTG 1260 ACCACAGTGA AGCAGATTGA GAGCCAGCTC CTGCAAAGCA ACTACGAAGG ACTTCTAAAA 1320 TAA
5. 【請求項５】 次のアミノ酸配列で示されるセックワイ
   （ｓｅｃＹ）遺伝子ＤＮＡ。 Val Ser Ala Ile Ile Gln Ala Phe Lys Asp Ala Asp Leu Arg Lys Lys 1 5 10 15 Ile Phe Phe Thr Ile Ala Met Ile Val Leu Tyr Arg Ile Gly Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ser Pro Gly Val Asp Tyr Ala Thr Ile Ser Gly Arg Leu Arg 35 40 45 Asp Leu Thr Gln Asp Gln Ser Ser Val Tyr Ser Leu Ile Asn Leu Phe 50 55 60 Ser Gly Gly Ala Leu Leu Gln Leu Ser Ile Phe Ala Ile Gly Ile Met 65 70 75 80 Pro Tyr Ile Thr Ala Ser Ile Ile Val Gln Leu Leu Thr Val Val Ile 85 90 95 Pro His Phe Glu Glu Leu Lys Lys Glu Gly Gln Ser Gly Gln Ala Lys 100 105 110 Met Met Gln Tyr Thr Arg Tyr Leu Thr Val Ala Leu Ala Leu Leu Gln 115 120 125 Ser Ser Gly Ile Val Ala Leu Ala Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gly Ala 130 135 140 Gly Ile Arg Val Leu Ser Ala Asp Arg Asn Phe Phe Asp Leu Ile Val 145 150 155 160 Leu Val Ile Thr Met Thr Ala Gly Ala Val Leu Val Met Trp Met Gly 165 170 175 Glu Leu Ile Thr Glu Lys Gly Val Gly Asn Gly Met Ser Leu Leu Ile 175 180 185 Phe Ala Gly Ile Ala Thr Arg Leu Pro Thr Asp Gly Met Asn Ile Leu 190 195 200 Gly Asn Ser Gly Gly Val Val Phe Ala Val Val Leu Ala Ser Val Leu 205 210 215 Ile Leu Val Ile Gly Val Val Phe Val Glu Gln Gly Gln Arg Arg Ile 220 225 230 235 Pro Val Gln Tyr Ala Lys Arg Met Val Gly Arg Arg Gln Tyr Gly Gly 240 245 250 Ser Ser Thr Tyr Leu Pro Leu Lys Val Asn Gln Ala Gly Val Ile Pro 255 260 265 Val Ile Phe Ala Ser Ser Leu Ile Tyr Met Pro Val Leu Ile Thr Gln 270 275 280 Ile Val Asn Ser Gly Ser Leu Glu Val Ser Asp Asn Trp Trp Gln Arg 285 290 295 Asn Ile Ile Ala His Leu Gln Thr Pro Ser Ser Trp Gln Tyr Ile Val 300 305 310 315 Leu Tyr Phe Ala Leu Thr Ile Phe Phe Ser Tyr Phe Tyr Val Ser Val 320 325 330 Gln Tyr Asp Pro Ala Glu Gln Ala Glu Asn Met Lys Lys Tyr Gly Gly 335 340 345 Phe Ile Pro Gly Ile Arg Pro Gly Arg Pro Thr Ala Glu Tyr Leu Gly 350 355 360 Phe Val Met Asn Arg Leu Leu Phe Val Gly Ser Leu Tyr Leu Ala Val 365 370 375 Ile Ala Val Leu Pro Asn Ile Met Leu Asp Leu Gly Val Asp Ala Gly 380 385 390 400 Ser Ala Gly Ala Thr Pro Phe Gly Gly Thr Ala Ile Leu Ile Leu Val 405 410 415 Ser Val Ala Leu Thr Thr Val Lys Gln Ile Glu Ser Gln Leu Leu Gln 420 425 430 Ser Asn Tyr Glu Gly Leu Leu Lys 435 440
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子
   ＤＮＡが導入された組換えプラスミド。
7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子
   ＤＮＡと、コリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子
   を含むＤＮＡを保有する組換えプラスミド。
8. 【請求項８】 請求項７記載のプラスミドで形質転換さ
   れたコリネ型細菌。