JPH06277073A - 蛋白質のトランスロケーションマシナリーをコードする遺伝子ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
からセックイー（ｓｅｃＥ）遺伝子ＤＮＡを単離し、該
遺伝子の塩基配列を決定すると共に、該遺伝子を含むＤ
ＮＡを有するコリネ型細菌内で安定なプラスミドｐＣＲ
Ｙ３０−ｓｅｃＥを構築した。 【効果】該プラスミドを用いて形質転換されたコリネ型
細菌を用いることで、従来よりも高効率に有用微生物産
物を生産することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コリネ型細菌に由来し
蛋白質のトランスロケーションに関与する遺伝子ＤＮ
Ａ、特に蛋白質のトランスロケーションマシナリーをコ
ードする遺伝子ＤＮＡに関する。さらに詳しくは、蛋白
質のトランスロケーションマシナリーをコードする遺伝
子群の中でも重要な遺伝子の一つであるセックイー（ｓ
ｅｃＥ）遺伝子に関する。ここで、トランスロケーショ
ンマシナリーとは、膜蛋白質および分泌蛋白質各々が細
胞膜に組み込まれる過程、あるいは菌体外に分泌される
過程において必要不可欠な蛋白質群であり、本発明に言
う「蛋白質のトランスロケーションマシナリーをコード
する遺伝子ＤＮＡ」は、蛋白質のトランスロケーション
マシナリーを構成する蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡ
を意味する。以上の如く、ｓｅｃＥ遺伝子は蛋白質のト
ランスロケーションが行われる過程において重要な遺伝
子の一つであり、さらには必要不可欠な遺伝子であると
報告されている（薬学雑誌，112, (6), 349, 1992）。
従って、該遺伝子を高度に発現させることにより蛋白質
のトランスロケーション効率が向上し、例えば有用な膜
蛋白質および分泌蛋白質等の量的増加が図れるものと期
待される。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質のトランスロケーション機構につ
いては、主としてエシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）を材料として研究が進められており［Annual Revie
wGenetics, 24, 215-248, 1990；Annual Review of Bio
chemistry, 60, 101-124,1991］、蛋白質のトランスロ
ケーションに関与する遺伝子として、ｓｅｃＡ［Journa
l of Bacteriology, 150, 686-691, 1982］、ｓｅｃＢ
［Journal ofBacteriology, 154, 254-260, 1983］、ｓ
ｅｃＤ［Journal of Bacteriology,169, 1286-1290, 19
87］、ｓｅｃＥ［Genetics, 118, 571-579, 1988］、ｓ
ｅｃＦ［EMBO Journal, 9, 3209-3216, 1990］、ｓｅｃ
Ｙ［Nucleic Acids Research, 11, 2599-2616, 1983］
等が報告されている。また、エシェリヒア・コリの各種
変異株を用いた研究により、これら遺伝子群の中でもｓ
ｅｃＡ、ＥおよびＹ遺伝子が蛋白質のトランスロケーシ
ョンにおいて特に重要な役割を演じていることが示され
ている。現在のところ、ｓｅｃＥ遺伝子についてはエシ
ェリヒア・コリ由来の遺伝子［Genetics, 118, 571-57
9,1988 参照］、およびバチルス・サブチルス（Bacillu
s subtilis）由来の遺伝子［日本農芸化学会誌、67(02),
p137, 1993 参照］の単離は報告されているものの、産
業上極めて重要な細菌であるコリネ型細菌由来のｓｅｃ
Ｅ遺伝子については報告されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】トランスロケーション
マシナリーの利用例の１つとして、例えばコリネ型細菌
を用いた分泌型蛋白質の生産が挙げられる。しかしなが
ら、コリネ型細菌由来のトランスロケーションマシナリ
ーについての知見が少ないこと、および他種に由来する
トランスロケーションマシナリーはコリネ型細菌中で十
分に機能しないことが示唆されていることから［Molecu
lar Microbiology, 4, 305-314, 1990；FEBS Letters,
273, 75-78, 1990 参照］、実際に工業的生産において
利用することは不可能であった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、トランスロケーショ
ンマシナリーをコードする遺伝子ＤＮＡ群に属するｓｅ
ｃＥ遺伝子ＤＮＡを単離することに成功し、本発明を完
成するに至った。かくして本発明によれば、（１）コリ
ネ型細菌に由来し蛋白質のトランスロケーションマシナ
リーをコードする遺伝子ＤＮＡ、（２）該遺伝子ＤＮＡ
が導入された組換えプラスミド、及び（３）該組換えプ
ラスミドを保有するコリネ型細菌、が提供される。以
下、本発明についてさらに詳細に説明する。

【０００５】蛋白質のトランスロケーションマシナリー
を構成する蛋白質群をコードする遺伝子ＤＮＡ群の一つ
であるｓｅｃＥ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片（以下こ
れを「Ａ断片」と略称することがある）を、コリネ型細
菌から調製する基本操作の一例を以下に述べる：ｓｅｃ
Ｅ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片（Ａ断片）は、上記コ
リネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバム（Br
evibacterium flavum）ＭＪ−２３３（FERM BP-1497）
株の染色体上に存在するので、該菌株の染色体を適当な
制限酵素で切断して生じる切断断片の中から分離取得す
ることができる。

【０００６】具体的には、先ずブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３株の培養物から常法により染色体Ｄ
ＮＡを抽出する。次いで、得られた染色体ＤＮＡを適当
な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩを用いて完全分解する。
生じたＤＮＡ断片をクローニングベクター、例えばｐＵ
Ｃ１１８（宝酒造社製）に挿入し、該組換えベクターに
より適当な宿主菌、例えばエシェリヒア・コリＪＭ１０
９（宝酒造社製）を形質転換する。この形質転換体を培
養した後、プラスミドＤＮＡを抽出する。エシェリヒア
・コリおよびバチルス・サブチルスにそれぞれ由来する
ｓｅｃＥ遺伝子に共通な領域のＤＮＡ配列をプローブと
したサザンハイブリダイゼーションを用いて、得られた
プラスミドＤＮＡからブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３染色体に由来する挿入Ａ断片を確認し、取得
することができる。このようにして得られるＡ断片の一
つとして、上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩにより完全
分解して得られる大きさ約０.６ｋｂのＤＮＡ断片が挙
げられる。この大きさ約０.６ｋｂのｓｅｃＥ遺伝子Ｄ
ＮＡを含むＤＮＡ断片を各種制限酵素で切断したときの
認識部位数及び切断断片の大きさを下記第１表に示す。

【０００７】

【表１】

【０００８】なお、本明細書においては、ＤＮＡ断片又
はプラスミドを制限酵素により完全分解して得られた断
片をそれ自体既知の方法に従い１％アガロースゲル電気
泳動および５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
し、これにより分離された断片数を制限酵素による「認
識部位数」とした。また、「切断断片の大きさ」および
プラスミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用い
る場合には、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λ
phage）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片を試料に用いたと同一のア
ガロースゲルで泳動して得られる標準線に基づき、また
はポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、
エシェリヒア・コリのファイ・エックス１７４ファージ
（φｘ174phage）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅIIIで切断
して得られる分子量既知のＤＮＡ断片を試料に用いたと
同一ポリアクリルアミドゲルで泳動して得られる標準線
に基づき、それぞれ切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各
ＤＮＡ断片の大きさを算出した。プラスミドの大きさは
各切断断片の大きさを加算して求めた。なお、各ＤＮＡ
断片の大きさを決定するさいに、大きさ１ｋｂ以上の断
片については１％アガロースゲル電気泳動による値を採
用し、大きさ１ｋｂ未満の断片については５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動による値を採用した。

【０００９】一方、上記ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断
して得られる大きさ約０.６ｋｂのＤＮＡ断片について
は、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵ
Ｃ１１９（宝酒造社製）を用いたジデオキシヌクレオチ
ド酵素法（dideoxy chain termination法；Sanger,F.
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977 参
照）により決定した。該方法を用いて決定した上記ＤＮ
Ａ断片の塩基配列中に存在するオープンリーディングフ
レームを基にｓｅｃＥ遺伝子ＤＮＡの塩基配列を決定し
たところ、該遺伝子ＤＮＡは後記配列表の配列番号１に
示す配列を有し、５０個のアミノ酸をコードする１５０
塩基対から構成されていた。上記塩基配列を包含する本
発明のＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから
分離されたＤＮＡのみならず、通常用いられるＤＮＡ合
成装置、例えばベックマン社製システム１−プラス（Sy
stem-1 Plus）を用いて合成したＤＮＡであってもよ
い。また、上記手順によりブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得され、かつ蛋白
質のトランスロケーションに関与する本発明の遺伝子Ｄ
ＮＡは、ｓｅｃＥ遺伝子産物の機能を実質的に損なうこ
とがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換
されていてもよく、または削除されていてもよく、ある
いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基
配列の一部が転位されているものであってもよく、これ
らの誘導体のいずれもが本発明の遺伝子ＤＮＡに包含さ
れるものである。

【００１０】本発明のＡ断片は、例えばエシェリヒア・
コリ内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少な
くとも含むプラスミドベクターに導入し、該ベクターを
用いてｓｅｃＥ遺伝子低温感受性変異菌株であるために
２０℃では生育不可能なエシェリヒア・コリＰＳ１６３
株［EMBO Journal, 10 (No7),1749-1757, 1991］を形
質転換し、２０℃培養における該菌株の生育を可能とす
る等の機能を有する。また本発明のＡ断片を、適当なプ
ラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増
殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクタ
ーに導入することにより、コリネ型細菌内でｓｅｃＥ遺
伝子産物を高発現することが可能な組換えプラスミドを
得ることができる。本発明で得られたｓｅｃＥ遺伝子を
発現させるためのプロモーターとしては、例えばコリネ
型細菌の保有するプロモーターを挙げることができる
が、それに限られるものではなく、コリネ型細菌内で機
能し、ｓｅｃＥ遺伝子の転写を開始させ得る塩基配列で
あればいかなるプロモーターであってもよい。

【００１１】本発明のＡ断片を導入することが可能であ
り、コリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子を少な
くとも含むプラスミドベクターとしては、例えば特開平
3-210184号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開
平2-276575号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐ
ＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲ
Ｙ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平1-191686号公報
に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開
昭58-67679号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭58-778
95号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭58-192900号
公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１およびｐＡＪ
１８４４；特開昭57-134500号に記載のｐＣＧ１；特開
昭58-35197号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭57-183799
号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げるこ
とができる。コリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いら
れるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプ
ラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内
でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを共に有する
ベクターが特に好ましく、例えばプラスミドｐＣＲＹ３
０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、
ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよび
ｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。

【００１２】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する手順を以下に示す。まず、ブレビバクテリウム・
スタチオニス（Brevibacterium stationis）IFO12144
（FERMBP-2515）からプラスミドｐＢＹ５０３（特開平1
-95785号公報参照）ＤＮＡを抽出する。次に、抽出され
たＤＮＡの一部を制限酵素ＸｈｏＩで切断してプラスミ
ドの複製増殖機能を司る遺伝子を含む大きさ約４.０ｋ
ｂのＤＮＡ断片（複製機能領域）を切り出し、また、抽
出ＤＮＡの残余を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで
切断してプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含む大
きさ約２.１ｋｂのＤＮＡ断片（安定化機能領域）をも
切り出す。そして、これらの断片をプラスミドｐＨＳＧ
２９８（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ部位及び
ＳａｌＩ部位に常法により組み込むことで、プラスミド
ベクターｐＣＲＹ３０を調製することができる。

【００１３】本発明のＡ断片を上記に例示したプラスミ
ドベクターに導入するには、例えば該プラスミドベクタ
ー中に認識部位を１カ所だけ有する制限酵素を用いて該
プラスミドベクターを開裂させ、次に必要に応じて前記
Ａ断片および開裂したプラスミドベクターをＳ１ヌクレ
アーゼで処理して平滑末端とするかまたは適当なアダプ
ターＤＮＡを添加した後、ＤＮＡリガーゼ処理により両
者を連結させればよい。本発明のＡ断片をプラスミドｐ
ＣＲＹ３０に導入するには、まずプラスミドｐＣＲＹ３
０を制限酵素ＥｃｏＲＩにより処理して１カ所で開裂さ
せ、そこに前記ｓｅｃＥ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片
（Ａ断片）をＤＮＡリガーゼで連結させればよい。この
ようにして造成されたプラスミドｐＣＲＹ３０に本発明
の大きさ約０.６ｋｂのＡ断片を導入した組換えプラス
ミドを、ｐＣＲＹ３０−ｓｅｃＥと命名した。プラスミ
ドｐＣＲＹ３０−ｓｅｃＥの作成方法の詳細について
は、後記実施例４で説明する。

【００１４】本発明によるプラスミドで形質転換し得る
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）、ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１
（FERM BP-1498）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３−ＡＢＤ−２１（FERM BP-1499）、およびブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１
（FERM BP-1500）等が挙げられる。なお、上記の FERM
BP-1498〜1500 株は全て FERM BP-1497 を親株としてお
り、FERM BP-1498 株はＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積
極的に付与されたエタノール資化性株（特公昭59-28398
号公報第３〜４欄参照）、FERM BP-1499 株はＤ−α−
アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株（特開昭61-17799
3号公報参照）、および FERM BP-1500 株はＬ−α−ア
ミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株（特開昭62-5
198号公報参照）である。上記微生物の他に、ブレビバ
クテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoni
agenes）ATCC6871、同 ATCC13745、同 ATCC13746；ブレ
ビバクテリウム・デバリカタム（Brevibacterium divar
icatum) ATCC14020；ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ATCC138
69；コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacter
ium glutamicum）ATCC31831 等を宿主微生物として用い
ることもできる。

【００１５】なお、宿主としてブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、該菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭63-36787号公
報参照）のために形質転換が困難となる場合があるの
で、そのような場合には、該菌株よりプラスミドｐＢＹ
５０２を除去することが望ましい。プラスミドｐＢＹ５
０２を除去する方法としては、例えば継代培養を繰り返
すことにより自然に欠失させることも可能であるし、人
為的に除去することも可能である［Bact. Rev.36 p.361
〜405 (1972)参照］。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人
為的に除去する方法の一例を示せば次のとおりである。
宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の生育
を不完全に阻害する濃度、例えば０.２〜５０ μg/mｌ
のアクリジンオレンジもしくはエチジウムブロミド等を
含有する培地に１ｍｌ当り約１０菌体の密度で該宿主菌
を植菌し、その生育を不完全に阻害しながら約３５℃で
約２４時間培養する。培養液を希釈して寒天培地に塗布
し、約３５℃で約２日培養する。得られたコロニーから
各々独立にプラスミド抽出操作を行い、プラスミドｐＢ
Ｙ５０２が除去されている株を選択する。この一連の操
作により、プラスミドｐＢＹ５０２が除去されたブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株が得られ
る。

【００１６】上記操作により得られるブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株を前記プラスミドに
より形質転換する方法としては、エシェリヒア・コリお
よびエルビニア・カロトボラ（Erwinia carotovora）に
ついて知られているように［Calvin,N.M. および Hanaw
alt,P.C., Journal of Bacteriology, 170, 2796(198
8)；Ito,K. ,Nishida,T. および Izaki.K., Agricultur
al and BiologicalChemistry, 52, 293(1988) 参照］、
ＤＮＡ受容菌にパルス波を通電する方法［Satoh,Y. ら,
Journal of Industrial Microbiology, 5, 159 (1990)
参照］等を利用することができる。上記方法で形質転換
して得られるｓｅｃＥ遺伝子産物産性能を有するコリネ
型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３由来株の培養方法を以下に述べる。培養は炭素源、
窒素源、無機塩等を含む通常の栄養培地を用いて行うこ
とができ、その際の炭素源として、例えばグルコース、
エタノール、メタノールおよび廃糖蜜等を、そして窒素
源として、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、硝酸アンモニウムおよび尿素等をそれぞ
れ単独で、もしくは混合して用いることができる。ま
た、無機塩として、例えばリン酸一水素カリウム、リン
酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等を用いることが
できる。この他にも、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン等
の各種ビタミン等を栄養源として培地に添加してもよ
い。通常、培養は通気攪拌または振盪等の好気条件下
に、約２０〜４０℃、好ましくは約２５℃〜３５℃の温
度範囲で行う。培養中、培地のｐＨは５〜１０、好まし
くは７〜８付近に維持されることが望ましく、適当な酸
又はアルカリを適宜培地に添加してｐＨを調整する。培
養開始時における培地中の炭素源濃度は、好ましくは１
〜５重量％、更に好ましくは２〜３重量％である。ま
た、培養期間は通常１〜７日間であるが、好ましくは２
〜５日間、最も好ましくは３日間である。かくして得ら
れる培養物から遠心分離等により菌体を収集し、ｓｅｃ
Ｅ遺伝子産物を高率に含有する菌体を取得することがで
きる。

【００１７】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記実施例
によりさらに具体的に説明する。 ＜実施例１＞ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｓｅ
ｃＥ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片（Ａ断片）のクロー
ン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-
1497）を、半合成培地であるＡ培地［組成：尿素 ２
ｇ、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.５ｇ、ＫＨ₂
ＰＯ₄ ０.５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０.５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、酵母エキ
ス ２.５ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２００μｇ、
塩酸チアミン ２００μｇ、グルコース ２０ｇを蒸留水
に溶解して１ｌとする］１ｌ中で対数増殖期後期まで培
養した後に菌体を回収した。得られた菌体を、リゾチー
ムを１０ mg/mｌ の濃度で含有する溶液［組成：１０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス緩衝液(ｐＨ８.０)、１
ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ］１５ｍｌに懸濁した。該懸濁
液にプロテナーゼＫを１００ μg/mｌ の最終濃度で添
加し、これを３７℃で１時間インキュベートした。次
に、ドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０.５％とな
るように添加し、５０℃で６時間インキュベートして溶
菌させた。得られた溶菌液に等量のフェノール/クロロ
ホルム溶液を添加して室温で１０分間穏やかに振盪した
後、その全量を１０〜１２℃で２０分間、５,０００×
ｇの遠心分離に供し、その上清画分を分取した。該上清
画分に酢酸ナトリウムをその濃度が０.３Ｍとなるよう
に添加し、次いで２倍量のエタノールを穏やかに添加し
た。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス
棒で搦め取り、これを７０％エタノールで洗浄して風乾
した。得られたＤＮＡは、溶液［組成：１０ｍＭ トリ
ス緩衝液（ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ］５
ｍｌを加えて４℃で一晩静置した後、実験に供した。

【００１８】（Ｂ）組換えプラスミドｐＵＣ１１８−ｓ
ｅｃＥの創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ溶液９０μｌを制限酵素ＥｃｏＲＩ
５０ units と３７℃で１時間反応させて完全分解し
た。得られたＤＮＡ断片に、制限酵素ＥｃｏＲIで切断
した後に脱リン酸化処理したクローニングベクターｐＵ
Ｃ１１８（宝酒造社製）を混合した。この混合液に、そ
れぞれの最終濃度が ５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.
６）、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ uni
t となるように各成分を添加し、４℃で１５時間反応さ
せてＤＮＡ断片とベクターを結合させた。得られたプラ
スミド混液を用いて、塩化カルシウム法（Journal of M
olecularBiology, 53, 159, 1970 参照）によりエシェ
リヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造社製）を形質転換
し、アンピシリンを５０ｍｇ含有する培地［トリプトン
１０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ
および寒天 １６ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする］に
塗抹した。

【００１９】この培地上に生育した株を常法により液体
培養し、その培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドを制限酵素により切断し、得られた
断片をアガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、アガ
ロースゲルよりＤＮＡをナイロンメンブレンに移しと
り、エシェリヒア・コリおよびバチルス・サブチルスに
それぞれ由来するｓｅｃＥ遺伝子に共通な領域をプロー
ブとしてサザンハイブリダイゼーションを行なった。用
いたプローブは、エシェリヒア・コリおよびバチルス・
サブチルスに由来するｓｅｃＥ遺伝子から推定されるア
ミノ酸配列において特に相同性の高い領域に注目し、そ
のアミノ酸配列から想定された混合オリゴヌクレオチド
プローブをアプライド・バイオシステムズ（Applied Bi
osystems）社製３９４ ＤＮＡ/ＲＮＡシンセサイザーに
より合成したプローブであった。実際に用いたプローブ
の塩基配列は、次のアミノ酸配列： Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr より想定される下記の塩基配列： GAR GTI CGI AAR GTI ATY TGG CCI AC （配列中、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴを示し、こ
こでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔは
チミン、Ｉはデオキシイノシンを示す。）の２６ｍｅｒ
（塩基対）である。なお、プローブの合成にあたって
は、デオキシイノシンを用いることで、混合の度合が著
しく高くなることを回避した。

【００２０】Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社
製）を用いて、合成した上記オリゴヌクレオチドプロー
ブの５'末端リン酸基を[γ−³²Ｐ］ＡＴＰによりラジオ
アイソトープラベルした［Analytical Biochemistry, 1
58, 307-315, 1986］。サザンハイブリダイゼーション
は、常法［Molecular Cloning, Cold Spring HarborLab
oratory Press(1989)］に従い実施した。この結果、ラ
ジオアイソトープでラベルされたポジティブなバンドを
生ずるクローンが選定されたが、該クローンはプラスミ
ドｐＵＣ１１８の大きさ３.２ｋｂのＤＮＡ断片に加え
て、大きさ約０.６ｋｂの挿入断片を有することが認め
られた。この大きさ約０.６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を各
種の制限酵素で切断して認められた制限酵素認識部位数
および切断断片の大きさは、前記表１に示したとおりで
あった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に
示す。また上記選定されたプラスミドを各種制限酵素で
切断し、生じる切断断片の大きさを測定した。その結果
を下記第２表に示す。

【００２１】

【表２】

【００２２】上記制限酵素の切断断片により特徴付けら
れるプラスミドを、ｐＵＣ１１８−ｓｅｃＥと命名し
た。 ＜実施例２＞ｓｅｃＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）の塩基配列
の決定 実施例１（Ｂ）項で得られたｓｅｃＥ遺伝子ＤＮＡを含
む大きさ約０.６ｋｂのＤＮＡ断片について、その塩基
配列をプラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９（宝
酒造社製）を用いたジデオキシヌクレオチド酵素法（di
deoxy chaintermination 法）（Sanger,F.ら，Proc. Na
t. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977）により、図２に
示した戦略図に従って決定した。

【００２３】＜実施例３＞ｐＵＣ１１８−ｓｅｃＥプラスミドのエシェリヒア・コ
リｓｅｃＥ低温感受性変異株への導入 実施例１（Ｂ）項で得られたｐＵＣ１１８−ｓｅｃＥプ
ラスミドを用いて、エシェリヒア・コリのｓｅｃＥ低温
感受性変異株であるＰＳ１６３（ｓｅｃＥｃｓ１５）
［EMBO Journal, 10(No7), 1749-1757, 1991］を塩化カ
ルシウム法（Journal of Molecular Biology, 53, 159,
1970）により形質転換し、これをアンピシリンを５０
ｍｇ含有する寒天培地［組成：トリプトン １０ｇ、イ
ーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天
１６ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする］に塗抹し、２
０℃で培養した。Ａ断片を挿入しない無処理のベクター
のみをＰＳ１６３株に導入した場合には２０℃で培養し
て寒天培地上に生育する菌体は認められなかったのに対
し、該株にｐＵＣ１１８−ｓｅｃＥプラスミドを導入し
た場合には、ＤＮＡ１μｇ当たり１０⁴個以上の形質転
換体が得られた。この結果、該プラスミド中にｓｅｃＥ
遺伝子が挿入され、かつ該遺伝子ＤＮＡが供試菌体内で
機能することが確認された。

【００２４】＜実施例４＞コリネ型細菌内で自律複製し安定なプラスミドベクター
ｐＣＲＹ３０の作成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニス IFO12144（FERM BP-2515）から分離された分
子量約１０メガダルトンのプラスミドであり、特開平1-
95785号公報に記載の方法に従い調製した。ブレビバク
テリウム・スタチオニス IFO12144 を、半合成培地Ａ培
地［組成：尿素 ２ｇ、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ
₄ ０.５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０.５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０.５ｇ、
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ
６ｍｇ、酵母エキス ２.５ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビチ
オン ２００μｇ、塩酸チアミン ２００μｇ、グルコー
ス ２０ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする］１ｌ中で対
数増殖期後期まで培養した後、菌体を収集した。得られ
た菌体を、リゾチームを１０mg/mｌ の濃度で含有する
緩衝液［組成：２５ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコー
ス］２０ｍｌに懸濁して、３７℃で１時間反応させた。
この反応液にアルカリ−ＳＤＳ液［組成：０.２Ｎ Ｎａ
ＯＨ、１％（Ｗ/Ｖ）ＳＤＳ］４０ｍｌを添加し、緩や
かに混和して室温にて１５分間静置した。次に、この反
応液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ 酢酸カリウム溶液 ６０
ｍｌ、酢酸１１.５ｍｌ、蒸留水２８.５ｍｌの混合液］
３０ｍｌを添加し、充分混和してから氷水中に１５分間
静置した。

【００２５】得られた溶菌物全量を遠心管に移し、４℃
で１０分間、１５,０００×ｇの遠心分離に供し、上澄
液を得た。これに等量のフェノール−クロロホルム液
（フェノール：クロロホルム＝１：１混和液）を加えて
懸濁した後、再び全量を遠心管に移し、室温下で５分
間、１５,０００×ｇの遠心分離に供して、その水層を
回収した。得られた水層に２倍量のエタノールを加え、
−２０℃で１時間静置した後、４℃で１０分間、１５,
０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収した。得られ
た沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［組成：１０ｍＭ ト
リス、１ｍＭＥＤＴＡ；塩酸にてｐＨを８.０に調整］
２ｍｌに溶解した。該溶解液に塩化セシウム溶液［組
成：５倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１
７０ｇを溶解した］１５ｍｌおよび１０ mg/mｌ 濃度の
エチジウムブロマイド溶液１ｍｌを添加し、該液の密度
を１.３９２ g/mｌ に調整した。この溶液を１２℃で４
２時間、１１６,０００×ｇの遠心分離に供した。

【００２６】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方に位置するバンドとして見い出され
る。このバンドを注射器で遠心管の側面から抜きとり、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。次いでこ
の分画液を等量のイソアミルアルコールで４回処理して
エチジウムブロマイドを抽出除去し、その後にＴＥ緩衝
液に対して透析を行った。このようにして得られたプラ
スミドｐＢＹ５０３を含む透析液に、最終濃度が３０ｍ
Ｍとなるように３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液を添加した
後、２倍量のエタノールを添加し、−２０℃で１時間静
置した。該液を１５,０００×ｇで遠心分離してＤＮＡ
を沈降させ，これを回収してプラスミドｐＢＹ５０３
５０μｇを得た。

【００２７】（Ｂ）プラスミドベクターｐＣＲＹ３０の
作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）０.５μｇと
制限酵素ＳａｌＩ ５units を３７℃で１時間反応させ
て、プラスミドＤＮＡを完全分解した。また、前記
（Ａ）項で調製したプラスミドｐＢＹ５０３ ２μｇと
制限酵素ＸｈｏＩ １ unit を３７℃で３０分間反応さ
せてプラスミドＤＮＡを部分分解した。両者のプラスミ
ドＤＮＡ分解物を混合し、その混合液を６５℃で１０分
間加熱処理して液中の制限酵素を失活させた後、該失活
溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭ トリス緩
衝液（ｐＨ７.６)、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ １ unit となるように各成分を強化し、１６℃
で１５時間インキュベートした。この溶液を用いてエシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造社
製）を形質転換した。形質転換菌体を、各々最終濃度で
３０ μg/mｌ のカナマイシン、１００ μg/mｌ のＩＰ
ＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド)、１００μg/mｌ のＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド）を含むＬ培地［組成：トリプトン １０ｇ、酵母エ
キス ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを蒸留水に溶解して１ｌとす
る、ｐＨ７.２］を用いて３７℃で２４時間培養した。
上記培地上に生育した生育株のうち、白いコロニーを形
成して生育してきた株を選択し、各々の株からプラスミ
ドをアルカリ−ＳＤＳ法［T.Maniatis, E.F.Fritsch,
J.Sambrook, Molecular cloning (1982), 90-91 参照］
により抽出した。以上の手順により、プラスミドｐＨＳ
Ｇ２９８のＳａｌＩ認識部位にプラスミドｐＢＹ５０３
に由来する大きさ約４.０ｋｂの断片が挿入されたプラ
スミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉが得られた。同様の方法
を用いて、前記（Ａ）項で得られたプラスミドｐＢＹ５
０３を制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで処理して得ら
れる大きさ約２.１ｋｂのＤＮＡ断片を上記プラスミド
ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉのＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ認識
部位にクローニングし、プラスミドベクターｐＣＲＹ３
０を調製した。

【００２８】＜実施例５＞プラスミドｐＣＲＹ３０−ｓｅｃＥの調製およびコリネ
型細菌への導入 実施例１（Ｃ）項で得られたプラスミドｐＵＣ１１８−
ｓｅｃＥ ５μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ ５ units と３
７℃で１時間反応させて得られたプラスミド分解物、な
らびに実施例３（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＣＲＹ
３０ １μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ １ unit と３７℃で
１時間反応させて得られたプラスミド分解物を混合し
た。この混合液に、それぞれの最終濃度が５０ｍＭ ト
リス緩衝液（ｐＨ７.６)、１０ｍＭ ジチオスレイトー
ル、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ 1 unit となるように各成分を添加し、１２℃で
１５時間反応させて双方のプラスミド分解物を結合させ
た。得られた結合プラスミドを用い、前記方法に従って
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換し、これを
カナマイシンを５０ μg/mｌ 含む培地［組成：トリプ
トン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ
５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水に溶解して１ｌとす
る］に塗抹した。

【００２９】この培地上に生育してきた株を常法により
液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出プラスミドを制限酵素により切断し、アガロースゲ
ル電気泳動を用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ
３０の大きさ８.６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ０.
６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。上記の如く調製
されたプラスミドＤＮＡを用いて、コリネ型細菌を形質
転換した。形質転換は、電気パルス法を用いて下記の如
く行った。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
（FERM BP-1497）のプラスミドｐＢＹ５０２除去株を前
記Ａ培地 １００ｍｌ中で対数増殖期初期まで培養し、
これにペニシリンＧを最終濃度で１ unit/mｌ となるよ
うに添加して、さらに２時間振盪培養した。培養物を遠
心分離にかけて菌体を収集し、得られた菌体をパルス用
溶液［組成：２７２ｍＭ シュークロース、７ｍＭ ＫＨ
₂ＰＯ₄、１ｍＭＭｇＣｌ₂；ｐＨ７.４］２０ｍｌにて洗
浄した。洗浄後、再び遠心分離して菌体を収集し、この
菌体を前記パルス用溶液５ｍｌに懸濁した。該懸濁液
０.７５ｍｌを前記手順により得たプラスミドＤＮＡ溶
液５０μｌと混合し、水中に２０分間静置した後、ジー
ンパルサー（バイオラド社製）のパルス条件を２５００
ボルト、２５μＦＤに設定し、該装置により前記混合液
にパルスを印加した。パルス加印後、この混合液を氷中
に２０分間静置した。次いで、該液の全量を前記Ａ培地
３ｍｌに移し、３０℃にて１時間培養した。さらに、培
養菌体を最終濃度１５ μg/mｌのカナマイシンを含有す
る前記Ａ寒天培地に植菌し、３０℃で２〜３日間培養し
た。前記実施例３（Ａ）項に記載の方法を用いて、出現
したカナマイシン耐性株よりプラスミドを得た。このプ
ラスミドを各種制限酵素で切断し、その切断断片の大き
さを測定した。その結果を下記の第３表に示す。

【００３０】

【表３】

【００３１】上記制限酵素の切断断片により特徴付けら
れるプラスミドを、ｐＣＲＹ３０−ｓｅｃＥと命名し
た。なお、プラスミドｐＣＲＹ３０−ｓｅｃＥにより形
質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３
−ｓｅｃＥは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業
技術院生命工学工業技術研究所に、平成５年３月９日付
で受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３５１７として寄託され
ている。

【００３２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：150 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名：MJ233 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1-150 特徴を決定した方法：E 配列 GTG GGA GAA GTC CGT AAG GTT ATT TGG CCT ACT GCG CGC CAG ATG GTC ACG TACV al Gly Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr Ala Arg Gln Met Val Thr Tyr 1 5 10 15 ACC CTT GTG GTT TTG GGA TTT TTG ATT GTT TTG ACC GCT TTG GTG TCT GGT GTGT hr Leu Val Val Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Val Ser Gly Val 20 25 30 35 GAT TTC CTA GCT GGT CTT GGA GTT GAG AAG ATT CTG ACT CCG TAG Asp Phe Leu Ala Gly Leu Gly Val Glu Lys Ile Leu Thr Pro 40 45 50

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で得られたｓｅｃＥ遺伝子ＤＮＡを含む
ＤＮＡ断片の制限酵素による切断点地図である。

【図２】本発明で得られたｓｅｃＥ遺伝子ＤＮＡを含
む、大きさ約０.６ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を決定
する戦略図である。

【図３】本発明で得られたプラスミドｐＣＲＹ３０−ｓ
ｅｃＥの制限酵素による切断点地図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コリネ型細菌に由来し蛋白質のトランス
   ロケーションマシナリーをコードする、遺伝子ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 前記コリネ型細菌がブレビバクテリウム
   ・フラバム(Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３であ
   る、請求項１に記載の遺伝子ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 セックイー（ｓｅｃＥ）遺伝子を含む、
   請求項１に記載の遺伝子ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 下記塩基配列で示される、請求項１〜３
   のいずれかに記載の遺伝子ＤＮＡ： GTGGGAGAAG TCCGTAAGGT TATTTGGCCT ACTGCGCGCC AGATGGTCAC GTACACCCTT 60 GTGGTTTTGG GATTTTTGAT TGTTTTGACC GCTTTGGTGT CTGGTGTGGA TTTCCTAGCT 120 GGTCTTGGAG TTGAGAAGAT TCTGACTCCG TAG 153
5. 【請求項５】 下記アミノ酸配列を含む蛋白質をコード
   する、請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子ＤＮＡ： Val Gly Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr Ala Arg Gln Met Val Thr Tyr 1 5 10 15 Thr Leu Val Val Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Val Ser Gly Val 20 25 30 35 Asp Phe Leu Ala Gly Leu Gly Val Glu Lys Ile Leu Thr Pro 40 45 50
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子
   ＤＮＡを導入した、組換えプラスミド。
7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子
   ＤＮＡおよびコリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝
   子を含むＤＮＡを保有する、請求項６に記載の組換えプ
   ラスミド。
8. 【請求項８】 請求項６または７に記載の組換えプラス
   ミドを保有する、コリネ型細菌。