JPH05284972A - スレオニンシンターゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
からスレオニンシンターゼをコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を単離し、この遺伝子の塩基配列を決定した。 【効果】 このスレオニンシンターゼをコードする遺伝
子ＤＮＡを導入したコリネ型細菌内で複製増殖可能なプ
ラスミドで形質転換されたブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ２３３−ｔｈｓのＬ−スレオニンの産生能は著し
く増加した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、スレオニンシンターゼ
（Ｅ．Ｃ．４．２．９９．２．）をコードする遺伝子を
含むコリネ型細菌に属するブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）由
来の遺伝子ＤＮＡ、該遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラス
ミド、該プラスミドで形質転換されたコリネ型細菌、及
び該コリネ型細菌を用いるＬ−リジンの製造法に関す
る。

【０００２】Ｌ−リジンは、必須アミノ酸として蛋白質
中にその存在が知られ、医薬や食品添加物として用いら
れている。

【０００３】

【従来の技術】従来、Ｌ−スレオニンの工業的製造法と
しては、グルタミン生産菌であるコリネ型細菌の各種栄
養要求株、各種製剤耐性株、各種薬剤感受性株を用いて
Ｌ−スレオニンを製造する方法が知られている〔例え
ば、特開昭４７−１９０８７号公報、特公昭５４−３２
０７０号公報、特開昭５４−９２６９２号公報等参
照〕。また、組換え菌を用いた製造法も提案されている
〔特開昭５８−１２６７８９号公報、特開昭６０−３０
６９３号公報、特開昭６２−１８６７９５号公報等参
照〕。しかしながら、従来提案されている方法によるＬ
−スレオニンの製造法では、対糖収率が低く及び／又は
Ｌ−スレオニンの蓄積に限界があり、新たな観点から、
遺伝子工学的手法による菌株の改良等を含め、Ｌ−スレ
オニンをより効率的に生成させる方法の提供が強く求め
られている。

【０００４】一方、スレオニンシンターゼ（Ｅ．Ｃ．
４．２．９９．２．）をコードする遺伝子としては、エ
シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）由来の遺伝子〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ １１，ｐ７３３１〜ｐ７３４５参照〕が
よく研究されている。また、グラム陽性細菌由来のスレ
オニンシンターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．９９．２．）とし
ては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎ
ｔｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等
が知られている〔Ｎｕｃｉｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ １６，ｐ９８５９，１９８８；Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４，ｐ１６９３
〜ｐ１７０２，１９９０参照〕。しかしながら、ブレビ
バクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｆｌａｖｕｍ）由来のスレオニンシンターゼ（Ｅ．
Ｃ．４．２．９９．２．）をコードする遺伝子について
は従来の報告例は見当らない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ブレ
ビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｆｌａｖｕｍ）由来のスレオニンシンターゼ
（Ｅ．Ｃ．４．２．９９．２．）をコードする遺伝子を
単離し、該遺伝子を同種であるコリネ型細菌に導入し、
該コリネ型細菌を用いて、新たな観点から効率的にＬ−
スレオニンを製造することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ブレビバクテリウ
ム・フラバム染色体よりスレオニンシンターゼ遺伝子を
単離し、該遺伝子を適当なベクタープラスミドに導入し
て、コリネ型細菌を形質転換し、該形質転換されたコリ
ネ型細菌を用いると、効率的にＬ−スレオニンを製造し
うることを見い出し本発明を完成するに至った。

【０００７】かくして本発明によれば （１）コリネ型細菌に属するブレビバクテリウム・フラ
バム由来のスレオニンシンターゼをコードする遺伝子Ｄ
ＮＡ； （２）該遺伝子ＤＮＡが導入された組換えプラスミド； （３）該組換えプラスミドで形質転換されたコリネ型細
菌；及び （４）該形質転換されたコリネ型細菌を用い、グルコー
スを原料としてＬ−スレオニンを製造する方法が提供さ
れる。

【０００８】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明の「スレオニンシンターゼをコードする遺伝
子ＤＮＡ」とは、ホスホホモセリンよりリン酸を解離さ
せる酵素、すなわちスレオニンシンターゼ（Ｅ．Ｃ．
４．２．９９．２．）をコードする遺伝子ＤＮＡを意味
するものである。スレオニンシンターゼをコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ断片」と略称
することがある）は、その塩基配列が決定された後にお
いては合成することも可能であるが、通常はスレオニン
シンターゼ生産性微生物からクローニングされる場合が
多く、その供給源となる微生物としては、コリネ型細
菌、殊にブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ２３３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９７）およびその由来株が有利に使用さ
れる。

【０００９】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本的操作の一例を述べれば次のとおりであ
る：Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）株の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限
酵素で切断することにより生ずる切断断片の中から以下
に述べる方法で分離、取得することができる。

【００１０】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳｐｈＩを用い
て染色体ＤＮＡを完全に分解する。得られるＤＮＡ断片
をクローニングベクター、例えばｐＨＳＧ３９９（宝酒
造製）に挿入し、このベクターを用いて、スレオニンシ
ンターゼ遺伝子が欠損したＬ−スレオニン要求性大腸菌
（エシェリヒア・コリ）変異株ＣＧＳＣ５０７７〔エシ
ェリヒア・コリ ジエネテック・ストック センター
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、デパートメントオブバ
イオロジー、エールユニバーシィティ（Ｄｅｐａｒｔｍ
ｅｎｔ ｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ）；Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ６６６６Ｎｅｗ Ｈａｖｅ
ｎ，ＣＴ ０６５１１−７４４、Ｕ．Ｓ．Ａ．保存菌
株〕を形質転換し、選択培地に塗抹することにより、形
質転換株を取得する。

【００１１】得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のＡ断片を確認・取得することができる。かくして得ら
れるＡ断片をさらに適当な制限酵素を用いて切断し、得
られるＤＮＡ断片を、大腸菌で複製可能なベクタープラ
スミドに挿入し、このベクタープラミスドを、通常用い
られる形質転換法、例えば、塩化カルシウム法、電気パ
ルス法等による形質転換により、前記スレオニンシンタ
ーゼが欠損したＬ−スレオニン要求性大腸菌変異株ＣＧ
ＳＣ５０７７に導入し、選択培地に塗抹する。

【００１２】得られる形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のＡ断片を確認・取得することができる。このようにし
て得られるＡ断片の一つは、上記ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓｐ
ｈＩの完全分解により切り出すことによって得られる大
きさが約２．６ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができ
る。

【００１３】この約２．６ｋｂのスレオニンシンターゼ
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、各種の制限酵
素で切断したときの認識部位数及び切断断片の大きさを
下記第１表に示す。

【００１４】

【表１】 第 １ 表 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ １ １．２、１．４ ＰｓｔＩ １ １．０、１．６ ＤｄｅＩ ２ ０．５、０．７、１．４ ＭｌｕＩ １ ０．６、２．０ ＸｈｏＩ １ ０．８、１．８ ＨｉｎｃII ２ ０．１、０．９、１．６

【００１５】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。

【００１６】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇ
ｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ III で切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ IIIで切断し
て得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリル
アミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、
切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさ
を算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれ
の大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大き
さの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。

【００１７】一方、上記のブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩによ
って切断することにより得られる大きさが約２．６ｋｂ
のＤＮＡ断片については、その塩基配列をプラスミドｐ
ＵＣ１１８および／またはｐＵＣ１１９（宝酒造製）を
用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ
ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法、Ｓａｎｇｅ
ｒ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，ｐ５４６３，１９７７）に
より決定することができる。このようにして決定した上
記約２．６ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列のオープンリー
ディングフレームの存在から決定したスレオニンシンタ
ーゼをコードする遺伝子は、後記配列表の配列番号：１
に示す配列を有するものであり、４８１個のアミノ酸を
コードする１４４３の塩基対から構成されている。

【００１８】上記した後記配列表の配列番号：１に示す
塩基配列を包含する本発明のスレオニンシンターゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天然のブレビバク
テリウム・フラバム染色体ＤＮＡから分離されたものの
みならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベッ
クマン社製Ｓｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕｓを用いて合成さ
れたものであってもよい。

【００１９】また、上記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のＤＮＡ断片は、スレオニンシンターゼをコードする
機能を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部
の塩基が他の塩基と置換されていてもよく又は削除され
ていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよ
く、さらに塩基配列の一部が転位されているものであっ
てもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明のスレ
オニンシンターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片
に包含されるものである。

【００２０】以上に詳述した大きさが約２．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片の制限酵素による切断点地図を図１に示す。本
発明のスレオニンシンターゼをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ（Ａ断片）は、適当なプラスミド、例えば、コリ
ネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を
少くとも含むプラスミドベクターに導入することによ
り、コリネ型細菌内でスレオニンシンターゼの高発現可
能な組換えプラスミドを得ることができる。

【００２１】また、本発明のスレオニンシンターゼをコ
ードする遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリ
ネ型細菌が保有する該遺伝子自身のプロモーターである
ことができるが、それに限られるものではなく、スレオ
ニンシンターゼ遺伝子の転写を開始させるための原核生
物由来の塩基配列であればいかなるプロモーターであっ
てもよい。

【００２２】本発明のＡ断片を導入することができる、
コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少くと
も含むプラスミドベクターとしては、例えば、特開平３
−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３
０；特開平２−２７６５７５号公報に記載のプラスミド
ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣ
ＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平
１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２
及びｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載
のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載
のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に
記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４
４；特開昭５７−１３４５００号に記載のｐＣＧ１；特
開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭
５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ
１１等を挙げることができる。

【００２３】中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で
用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌
内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型
細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とをもつ
ものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐ
ＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲ
Ｙ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ
３ＫＸ等が好適に使用される。

【００２４】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉ
ｓ）ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）か
らプラスミドｐＢＹ５０３（このプラスミドの詳細につ
いては特開平１−９５７８５号公報参照）ＤＮＡを抽出
し、制限酵素ＸｈｏＩで大きさが約４．０ｋｂのプラス
ミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を切
り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが
約２．１ｋｂのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を
含むＤＮＡ断片を切り出す。これらの両断片をプラスミ
ドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ
部位及びＳａｌＩ部位に組み込むことにより、プラスミ
ドベクターｐＣＲＹ３０を調製することができる。

【００２５】次に、上記プラスミドベクターへの本発明
のＡ断片の導入は、例えばプラスミドベクター中に１個
所だけ存在する制限酵素部位を、該制限酵素で開裂し、
そこに前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下にＤＮＡ
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。

【００２６】プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のＡ断
片の導入は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで開裂させ、そこに前記スレオニンシンターゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）をＤＮＡリ
ガーゼで連結させることにより行うことができる。

【００２７】かくして造成されるプラスミドｐＣＲＹ３
０に本発明の大きさが約２．６ｋｂのＡ断片を導入した
組換えプラスミドは、Ｌ−スレオニンの製造に好適に用
いることができる組換えプラスミドの一つであり、本発
明者らはこれをプラスミドｐＣＲＹ３０−ｔｈｓと命名
した。プラスミドｐＣＲＹ３０−ｔｈｓの作成方法の詳
細については、後記実施例４で説明する。

【００２８】このようにして造成されるスレオニンシン
ターゼ遺伝子を含むコリネ型細菌内で複製増殖可能なプ
ラスミドを、宿主微生物に導入して該微生物の培養物を
用いてＬ−スレオニンを安定に効率よく生産することが
可能となる。本発明によるプラスミドで形質転換しうる
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９９）等が挙げられる。

【００２９】なお、上記のＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８の
菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株として
ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
ール資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公
報参照）。また、ＦＥＲＭＢＰ−１５００の菌株は、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株としたＬ−α−ア
ミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株である（特開
昭６２−５１９９８号公報参照）。さらに、ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌
株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活性
変異株である（特開昭６１−１７７９９３号公報参
照）。

【００３０】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同Ａ
ＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６；ブレビバク
テリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０；ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）Ａ
ＴＣＣ１３８６９；コリネバクテリウム・グルタミカム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用いる
こともできる。

【００３１】なお、宿主としてブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７
８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
ｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
〔Ｂａｃｔ．Ｒｅｖ．３６ ｐ．３６１〜４０５（１９
７２）参照〕。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的に
除去する方法の一例を示せば次のとおりである。

【００３２】宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムブロミド（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら約２４時間約３５℃で培養
する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３５℃で約
２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラス
ミド抽出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去さ
れている株を選択する。この操作によりプラスミドｐＢ
Ｙ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３由来菌株が得られる。

【００３３】このようにして得られるブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシェリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように〔Ｃａｌ
ｖｉｎ，Ｎ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｎａｗａｌｔ，Ｐ．
Ｃ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ，１７０，２７９６（１９８８）；Ｉｔｏ，Ｋ．，Ｎ
ｉｓｈｉｄａ，Ｔ．ａｎｄＩｚａｋｉ．Ｋ．，Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２，２９３（１９８８）参照〕、
ＤＮＡ受容菌へのパルス波通電〔Ｓａｔｏｈ，Ｙ．ｅｔ
ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１５９（１９９
０）参照〕によりプラスミドを導入することが可能であ
る。

【００３４】かくして得られる、本発明の、スレオニン
シンターゼをコードする遺伝子ＤＮＡが導入されたプラ
スミド形質転換されたコリネ型細菌は、スレオニンシン
ターゼ高産生能を有しており、Ｌ−スレオニンの製造に
好適に用いることができる。これらのコリネ型細菌の好
適具体例としては、例えば前記したプラスミドｐＣＲＹ
３０−ｔｈｓを保有するブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ２３３−ｔｈｓ（ＦＥＲＭ Ｐ−１２８５８）を挙
げることができる。

【００３５】上記の方法で形質転換して得られるスレオ
ニンシンターゼ産生能を有するコリネ型細菌、例えばブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来株の培養
方法を以下に述べる。培養は炭素源、窒素源、無機塩等
を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源として
は、例えばグルコース、エタノール、メタノール、廃糖
蜜等が、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いられ
る。また、無機塩としては、例えばリン酸−水素カリウ
ム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用い
られる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種
ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。

【００３６】培養は、通常、通気撹拌、振盪等の好気条
件下に、約２０〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３
５℃の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜
１０、好ましくは７〜８付近とすることができ、培養中
のｐＨ調整は酸又はアルカリを添加して行うことができ
る。培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１〜５容量
％、更に好ましくは２〜３容量％である。また、培養期
間は通常１〜７日間とすることができ、最適期間は３日
間である。

【００３７】このようにして得られる培養物又は培養物
から得られる菌体はＬ−スレオニンの製造に使用するこ
とができる。Ｌ−スレオニン生成反応においては、これ
らの培養物又は菌体をそのまま用いることができ、ある
いは菌体に超音波処理等を加えた菌体破砕物、さらにそ
れから分離回収した粗酵素又は精製酵素として、あるい
はそれらを適当な担体に固定化して用いることができ
る。以上に述べた如き菌体の破砕物や粗または精製酵
素、固定化物等を本明細書ではまとめて「菌体処理物」
という。

【００３８】しかして本発明に従えば、グルコースを、
上記培養菌体又は菌体処理物と接触させて、Ｌ−スレオ
ニンを生成せしめることからなるＬ−スレオニンの製造
法が提供される。グルコースと上記培養菌体又は菌体処
理物との接触は、通常の酵素反応と同様に、水性反応液
中において、行なうことができる。

【００３９】特に、本発明のプラスミドで形質転換しう
る宿主微生物がビオチン要求性のコリネ型細菌である場
合は、上記の如く調製された培養菌体またはその固定化
物と、少なくともグルコースを含有しかつビオチンを含
有しない水性反応液中で、グルコースを接触させてＬ−
スレオニンを生成せしめるのが好適である。この場合、
ビオチン要求性のコリネ型細菌はビオチンを実質的に含
有しない水性反応液中では菌体増殖せずに、該菌体の保
有する代謝系においてグルコースがエネルギー共役を伴
う酵素反応を介して反応せしめられ、Ｌ−スレオニンが
製造される。

【００４０】上記水性反応液中のグルコース濃度は、通
常０．１〜５．０重量％の範囲内とすることができる。
グルコースは反応中上記範囲内の濃度に維持されるよう
に連続的または間欠的に水性反応液に添加するのが好ま
しい。

【００４１】該水性反応液は、上記のように、グルコー
スを含有し且つビオチンを実質的に含有しない水あるい
はリン酸またはトリス塩酸等の緩衝液であることもでき
るが、好ましくはグルコースを含有し且つビオチンを含
有しない合成培地が用いられる。この合成培地には、酵
母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー等の天然
栄養物質を含まない化学構造が既知の無機窒素源及び／
又は無機物を含有する水溶液が包含される。本発明にお
いて用いうる合成培地の無機窒素源としては、例えばア
ンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等を例示することが
でき、また無機物としては、例えば、リン酸−水素カリ
ウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
マンガン、硫酸鉄等を例示することができる。これらの
無機窒素源および無機塩はそれぞれ、単独でまたは２種
以上混合して用いることができる。

【００４２】本発明に従うＬ−スレオニン製造法におい
て用いられる合成培地の一例を示すと次のとおりであ
る：（ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ ２ｇ／１；ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ
／１；Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．５ｇ／１；ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂
Ｏ０．５ｇ／１；ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ２０ｐｐｍ；Ｍ
ｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ２０ｐｐｍ含有するｐＨ７．６
の水溶液。

【００４３】本発明のＬ−スレオニン製造法において使
用される前記のようにして調製された培養菌体又は菌体
処理物の使用量は、特に制限されるものではないが、培
地の容量を基準にして一般に１〜５０％（ｗｔ／ｖｏ
ｌ）、好ましくは２〜２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の範囲内
の濃度で使用することができる。上記したとおりの組成
を有する水性反応液中における培養菌体又は菌体処理物
を用いる酵素反応は、一般に約２０〜約５０℃、好まし
くは約３０〜約４０℃の温度で通常約１０〜約７２時間
行うことができる。

【００４４】上記の如く酵素反応によって生成するＬ−
スレオニンの水性反応液からの分離、精製は、それ自体
既知の通常用いられる方法に従って行なうことができ、
例えば、イオン交換樹脂処理法、晶析法等の方法を適宜
組合せて行うことができる。また、本発明のコリネ型細
菌は、通常の酵素法及び菌体増殖を伴う通常の発酵法に
よるＬ−スレオニンの製造法にも用いることができる。

【００４５】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。実施例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のスレ
オニンシンターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ（Ａ
断片）のクローン化

【００４６】（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄
７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ、
ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ６ｍｇ、Ｍ
ｎＳＯ₄ ４〜６Ｈ₂ Ｏ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カ
ザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２０
０μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１ｌ〕１ｌにブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集め
た。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチーム
を含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ溶液１５ｍｌに
懸濁した。次にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μ
ｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温し
た。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５
％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌し
た。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶
液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全
量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２
℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍ
となるように添加した後、２倍量のエタノールをゆっく
りと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡ
をガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した
後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌ
に加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。

【００４７】（Ｂ）組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＳｐｈＩ
５０ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１時間反応させ完全分
解した。このＳｐｈＩ分解ＤＮＡにクローニングベクタ
ーｐＵＣ１１９（宝酒造より市販）を制限酵素ＳｐｈＩ
で切断した後、脱リン酸化処理したものを混合し、５０
ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレ
イトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 及び
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成
分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応さ
せ、結合させた。

【００４８】（Ｃ）スレオニンシンターゼをコードする
遺伝子を含むプラスミドの選択 上記遺伝子の選抜に用いたスレオニンシンターゼ欠損Ｌ
−スレオニン要求性大腸菌変異株は、エシェリヒア・コ
リＣＧＳＣ５０７７（ｔｈｅ Ｃ１００１）である
〔（ ）内はスレオニンシンターゼ遺伝子型（Ｇｅｎｏ
ｔｙｐｅ）を示す〕。

【００４９】上記（Ｂ）項で得られたプラスミド混液を
用い、塩化カルシウム（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７
０）により上記エシェリヒア・コリＣＧＳＣ５０７７株
を形質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む選
択培地〔Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ２ｇ、（ＮＨ
₄)₂ ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．１ｇ、グル
コース２０ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗
抹した。

【００５０】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＵＣ１１９の長さ
３．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ２．６ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限酵素で切断したと
きの長さ約２．６ｋｂのＤＮＡ断片の認識部位数、およ
び切断断片の大きさは前記表１に示したとおりであっ
た。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に示
す。

【００５１】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記第２表に示す。

【００５２】

【表２】 第２表 プラスミドｐＵＣ１１９−ｔｈｓ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ ２ １．４、４．４ ＰｓｔＩ ２ ０．９、４．９ Ｈｉｎｄ III １ ５．８

【００５３】上記の制限酵素により特徴づけられるプラ
スミドをｐＵＣ１１９−ｔｈｓと命名した。以上により
スレオニンシンターゼをコードする遺伝子を含む大きさ
が約２．７ｋｂのＤＮＡ断片（ＳｐｈＩ断片）を得るこ
とができた。

【００５４】実施例２ スレオニンシンターゼをコードする遺伝子の塩基配列の
決定 実施例１の（Ｃ）項で得られたスレオニンシンターゼを
コードする遺伝子を含む長さが約２．６ｋｂのＤＮＡ断
片について、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１８お
よびｐＵＣ１１９（宝酒造製）を用いるジデオキシヌク
レオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｏｎ法）（Ｓａｈｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７４，５４６３，１９７７）により図２に示した戦略図
に従って決定した。

【００５５】その塩基配列中のオープンリーディングフ
レームの存在から、アスパルトキナーゼをコードする遺
伝子は、後記配列表の配列番号：１に示す配列を有する
４８１個のアミノ酸をコードする１４４３の塩基対より
構成されていることが判明した。

【００５６】実施例３ コリネ型細菌内で複製し安定なプラスミドベクターｐＣ
ＲＹ３０の作成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。

【００５７】半合成培地Ａ培地〔尿素２ｇ、（ＮＨ₄)₂
ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．
５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ６ｍｇ、酵母エキス２．
５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビチオン２００μｇ、塩酸チア
ミン２００μｇ、グルコース２０ｇ及び蒸留水１ｌ〕１
ｌに、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１
４４を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得ら
れた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む緩
衝液〔２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース〕２０ｍ
ｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反応液にアル
カリ−ＳＤＳ液〔０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％（Ｗ／Ｖ）
ＳＤＳ〕４０ｍｌを添加し、緩やかに混和して室温にて
１５分間静置した。次に、この反応液に酢酸カリウム溶
液〔５Ｍ酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１．５ｍ
ｌ、蒸留水２８．５ｍｌの混合液〕３０ｍｌを添加し、
充分混和してから氷水中に１５分間静置した。

【００５８】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノ
ール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸濁した
後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇ
の遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍量のエ
タノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃で１０
分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収
した。

【００５９】沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液〔トリス１
０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８．０に調
整〕２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液〔５
倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液〕１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１．３９２ｇ／
ｍｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６，０００×ｇの遠心分離を行った。

【００６０】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。次いでこ
の分画液を等量のイソアミルアルコールで４回処理して
エチジウムブロマイドを抽出除去し、その後にＴＥ緩衝
液に対して透析を行った。得られたプラスミドｐＢＹ５
０３を含む透析液に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度
３０ｍＭに添加した後、２倍量エタノールを加え、−２
０℃１時間静置した。この溶液を１５，０００×ｇの遠
心分離にかけてＤＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５
０３を５０μｇ得た。

【００６１】（Ｂ）プラスミドベクターｐＣＲＹ３０の
作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０．５μｇを制
限酵素ＳａｌＩ（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃１時間反応さ
せ、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。上記（Ａ）項
で調製したプラスミドｐＢＹ５０３の２μｇに制限酵素
ＸｈｏＩ（１ｕｎｉｔ）を３７℃で３０分間反応させ、
プラスミドＤＮＡを部分分解した。

【００６２】両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、
制限酵素を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処
理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５
０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及
びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を
強化し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いて
エシェリヒア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒
造製）を形質転換した。

【００６３】形質転換株は３０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び蒸留水１ｌ、ｐＨ７．
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育してき
たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法
〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”（１９８２）ｐ９０〜９１参照〕により抽出
した。

【００６４】その結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８のＳ
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４．０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒ
ｉが得られた。次に同様の方法を用い、前記（Ａ）項で
得られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐ
ｎＩ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２．１ｋｂ
のＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉ
のＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラ
スミドベクターｐＣＲＹ３０を調製した。

【００６５】実施例４ プラスミドｐＣＲＹ３０−ｔｈｓの作成及びコリネ型細
菌の導入 実施例１の（Ｃ）項で得られたプラスミドｐＵＣ１１９
−ｔｈｓ５μｇを制限酵素ＳｐｈＩ５ｕｎｉｔｓ用い、
３７℃で１時間反応させ分解したものと、ＥｃｏＲＩリ
ンカー（宝酒造より市販）１μｌを混合し、５０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトー
ル、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ およびＴ４
ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の
濃度は最終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ結
合させた。

【００６６】このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ ３ｕｎ
ｉｔｓを用い３７℃で１時間反応させ分解したものと、
実施例３の（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＣＲＹ３０
１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ １ｕｎｉｔを用い、３
７℃で１時間反応させ分解したものを混合し、５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ およびＴ
４ＤＡＮリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分
の濃度は最終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ
結合させた。このプラスミドを用いて、前記方法に従い
前記エシェリヒア・コリＣＧＳＣ５０７７株を形質転換
し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む選択培地〔Ｋ₂
ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ２ｇ、（ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ １
ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．１ｇ、グルコース２０ｇ
及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗抹した。

【００６７】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ
８．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ２．６ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片が認められた。上記の如く調製されたプラ
スミドＤＮＡを、電気パルス法を用いてコリネ型細菌へ
次のとおり形質転換した。

【００６８】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０
２除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで
培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌになるように
添加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分離により菌
体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭ
Ｓｕｃｒｏｓｅ、７ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、１ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂ ；ｐＨ７．４）にて洗浄した。さらに菌体を遠
心分離して集め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０．
７５ｍｌの細胞と、前記で得られたプラスミドＤＮＡ溶
液５０μｌとを混合し、水中にて２０分間静置した。ジ
ーンパルサー（バイオラド社製）を用いて、２５００ボ
ルト、２５μＦＤに設定し、パルスを印加後氷中に２０
分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し３０℃
にて１時間培養後、カナマイシン１５μｇ／ｍｌ（最終
濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で２〜３日
間培養した。出現したカナマイシン耐性株より、前記実
施例３（Ａ）項に記載の方法を用いてプラスミドを得
た。このプラスミドを各種制限酵素で切断して、切断断
片の大きさを測定した。その結果を下記第３表に示す。

【００６９】

【表３】 第３表 プラスミドｐＣＲＹ３０−ｔｈｓ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ ２ ８．７、２．６ ＢａｍＨＩ ２ ３．３、８．０ ＫｐｎＩ ２ ３．６、７．７ ＸｈｏＩ ２ ２．９、８．４

【００７０】上記制限酵素により特徴づけられるプラス
ミドをｐＣＲＹ３０−ｔｈｓと命名した。このラスミド
ｐＣＲＹ３０−ｔｈｓの制限酵素による切断点地図を図
３に示す。なお、プラスミドｐＣＲＹ３０−ｔｈｓによ
り形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３−ｔｈｓは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の
工業技術院微生物工業技術研究所に、平成４年３月１０
日付で：微工研菌寄第１２８５８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
２８５８）として寄託されている。

【００７１】実施例５ プラスミドｐＣＲＹ３０−ｔｈｓの安定性 前記のＡ培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実施
例４で得た形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ｔｈｓを植菌し、３０℃にて２４時間振盪培
養を行った後、同様にして調製したＡ培地１００ｍｌを
５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分
間滅菌したものに、１ｍｌ当たり５０ｃｅｌｌｓの割合
になるように植継し、同じく３０℃にて２４時間振盪培
養を行った。次に遠心分離して集菌し、菌体を洗浄後、
カナマイシンを１５μｇ／ｍｌの割合で添加したＡ培地
及び無添加のＡ培地を用いて調製した平板培地に一定量
塗抹し、３０℃にて１日培養後生育コロニーをカウント
した。

【００７２】この結果、カナマイシン添加および無添加
培地に生育したコロニーは同数であること、さらにＡ培
地生育コロニーは全てカナマイシン添加培地に生育する
こと、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認し
た。

【００７３】実施例６ Ｌ−スレオニンの生産 培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％、ＫＨ
₂ ＰＯ₄ ０．０５％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．０５％、ＭｇＳ
Ｏ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０５％、ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ ₂ Ｏ２ｐ
ｐｍ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ２ｐｐｍ、ＭｎＳＯ₄ ・４
〜６Ｈ₂ Ｏ２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ２ｐｐｍ、
ＮａＣｌ ２ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チアミ
ン・ＨＣｌ １００μｇ／ｌ、カザミノ酸０．１％、酵
母エキス０．１％）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラ
スコに分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７．０）した後ブレビバ
クテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ２３３−ｔｈｓ（ＦＥＲＭ Ｐ−１
２８５８号）を植菌し、無菌的にグルコースを５ｇ／ｌ
の濃度になるように加え、３０℃にて２日間振盪培養を
行った。

【００７４】次に、本培養培地（グルコース５％、硫酸
アンモニウム２．３％、ＫＨ₂ ＰＯ ₄ ０．０５％、Ｋ₂
ＨＰＯ₄ ０．０５％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０５
％、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ₄ ・４
〜６Ｈ₂ Ｏ２０ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チア
ミン・ＨＣｌ １００μｇ／ｌ、カザミノ酸０．３％、
酵母エキス０．３％）の１０００ｍｌを２ｌ容通気撹拌
槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、前記前培
養物の２０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ、通
気量１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７．６にて２４時間培
養を行った。

【００７５】培養終了後、培養物５００ｍｌから遠心分
離にて集菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応
液〔（ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ ２ｇ／ｌ；ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ
／ｌ；ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂
Ｏ０．５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂ Ｏ２０ｐｐｍ；Ｍ
ｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ２０ｐｐｍ；チアミン塩酸塩１
００μｇ／ｌ；ｐＨ７．６〕の１０００ｍｌに懸濁後、
該懸濁液を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、グルコース９ｇ
を添加して、回転数３００ｒｐｍ、通気量０．１ｖｖ
ｍ、温度３３℃、ｐＨ７．６にて２４時間反応を行っ
た。

【００７６】反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−スレオニ
ンを定量した。その結果、上清液中のＬ−スレオニン生
成量は、０．１５ｇ／ｌであった。この反応終了後の培
養液５００ｍｌを、強酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ⁺ 型）
のカラムに通してＬ−スレオニンを吸着させ、水洗後、
０．５Ｎアンモニア水で溶出させた後、Ｌ−スレオニン
画分を濃縮し、冷エタノールでＬ−スレオニンの結晶を
析出させた。その結果、５０ｍｇのＬ−スレオニン結晶
を得た。

【００７７】また、比較例として、同様の条件にて、ブ
レビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７）を培養し、同様の条件にて反応させた後上
清液中のＬ−スレオニンを定量した。その結果、上清液
中のＬ−スレオニン生成量は０．１ｇ／ｌであった。

【００７８】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ1446 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名 ：MJ233 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1-1446 特徴を決定した方法：P 配列 GTG GAC TAC ATT TCG ACG CGT GAT GCC AGC CGT ACC CCT GCC CGC TTC 48 Val Asp Tyr Ile Ser Thr Arg Asp Ala Ser Arg Thr Pro Ala Arg Phe 1 5 10 15 AGT GAT ATT TTG CTG GGC GGT CTA GCA CCA GAC GGC GGC CTA TAC CTG 96 Ser Asp Ile Leu Leu Gly Gly Leu Ala Pro Asp Gly Gly Leu Tyr Leu 20 25 30 CCT GCA ACC TAC CCT CAA CTA GAT GAT GCC CAG CTG AGT AAA TGG CGT 144 Pro Ala Thr Tyr Pro Gln Leu Asp Asp Ala Gln Leu Ser Lys Trp Arg 35 40 45 GAG GTA TTA GCC AAC GAA GGA TAC GCA GCT TTG GCT GCT GAA GTT ATC 192 Glu Val Leu Ala Asn Glu Gly Tyr Ala Ala Leu Ala Ala Glu Val Ile 50 55 60 TCC CTG TTT GTT GAT GAC ATC CCA GTA GAA GAC ATC AAG GCG ATC ACC 240 Ser Leu Phe Val Asp Asp Ile Pro Val Glu Asp Ile Lys Ala Ile Thr 65 70 75 80 GCA CGC GCC TAC ACC TAC CCG AAG TTC AAC AGC GAA GAC ATC GTT CCT 288 Ala Arg Ala Tyr Thr Tyr Pro Lys Phe Asn Ser Glu Asp Ile Val Pro 85 90 95 GTC ACC GAA CTC GAG GAC AAC ATT TAC CTG GGC CAC CTT TCC GAA GGC 336 Val Thr Glu Leu Glu Asp Asn Ile Tyr Leu Gly His Leu Ser Glu Gly 100 105 110 CCA ACC GCT GCA TTC AAA GAC ATG GCC ATG CAG CTG CTC GGC GAA CTT 384 Pro Thr Ala Ala Phe Lys Asp Met Ala Met Gln Leu Leu Gly Glu Leu 115 120 125 TTC GAA TAC GAG CTT CGC CGC CGC AAC GAA ACC ATC AAC ATC CTA GGC 432 Phe Glu Tyr Glu Leu Arg Arg Arg Asn Glu Thr Ile Asn Ile Leu Gly 130 135 140 GCT ACC TCT GGC GAT ACC GGC TCC TCT GCG GAA TAC GCC ATG CGC GGC 480 Ala Thr Ser Gly Asp Thr Gly Ser Ser Ala Glu Tyr Ala Met Arg Gly 145 150 155 160 CGC GAG GGA ATC CGC GTA TTC ATG CTG ACC CCA GCT GGC CGC ATG ACC 528 Arg Glu Gly Ile Arg Val Phe Met Leu Thr Pro Ala Gly Arg Met Thr 165 170 175 CCA TTC CAG CAA GCA CAG ATG TTT GGC CTT GAC GAT CCA AAC ATC TTC 576 Pro Phe Gln Gln Ala Gln Met Phe Gly Leu Asp Asp Pro Asn Ile Phe 180 185 190 AAC ATC GCC CTC GAC GGC GTT TTC GAC GAT TGC CAA GAC GTA GTC AAG 624 Asn Ile Ala Leu Asp Gly Val Phe Asp Asp Cys Gln Asp Val Val Lys 195 200 205 GCT GTC TCC GCC GAC GCG GAA TTT AAA AAA GAC AAC CGC ATC GGT GCC 672 Ala Val Ser Ala Asp Ala Glu Phe Lys Lys Asp Asn Arg Ile Gly Ala 210 215 220 GTG AAC TCC ATC AAC TGG GCT CGC CTC ATG GCA CAG GTT GTG TAC TAC 720 Val Asn Ser Ile Asn Trp Ala Arg Leu Met Ala Gln Val Val Tyr Tyr 225 230 235 240 GTT TCC TCA TGG ATC CGC ACC ACA ACC AGC AAT GAC CAA AAG GTC AGC 768 Val Ser Ser Trp Ile Arg Thr Thr Thr Ser Asn Asp Gln Lys Val Ser 245 250 255 TTC TCC GTA CCA ACC GGC AAC TTC GGT GAC ATT TGC GCA GGC CAC ATC 816 Phe Ser Val Pro Thr Gly Asn Phe Gly Asp Ile Cys Ala Gly His Ile 260 265 270 GCC CGC CAA ATG GGA CTT CCC ATC GAT CGC CTC ATC GTG GCC ACC AAC 864 Ala Arg Gln Met Gly Leu Pro Ile Asp Arg Leu Ile Val Ala Thr Asn 275 280 285 GAA AAC GAT GTG CTC GAC GAG TTC TTC CGT ACC GGC GAC TAC CGA GTC 912 Glu Asn Asp Val Leu Asp Glu Phe Phe Arg Thr Gly Asp Tyr Arg Val 290 295 300 CGC AGC TCC GCA GAC ACC CAC GAG ACC TCC TCA CCT TCG ATG GAT ATC 960 Arg Ser Ser Ala Asp Thr His Glu Thr Ser Ser Pro Ser Met Asp Ile 305 310 315 320 TCC CGC GCC TCC AAC TTC GAG CGT TTC ATC TTC GAC CTG CTC GGC CGC 1008 Ser Arg Ala Ser Asn Phe Glu Arg Phe Ile Phe Asp Leu Leu Gly Arg 325 330 335 GAC GCC ACC CGC GTC AAC GAT CTA TTT GGT ACC CAG GTT CGC CAA GGC 1056 Asp Ala Thr Arg Val Asn Asp Leu Phe Gly Thr Gln Val Arg Gln Gly 340 345 350 GGA TTC TCA CTG GCT GAT GAC GCC AAC TTT GAA AAG GCT GCA GCA GAA 1104 Gly Phe Ser Leu Ala Asp Asp Ala Asn Phe Glu Lys Ala Ala Ala Glu 355 360 365 TAC GGT TTC GCC TCC GGA CGA TCC ACC CAT GCT GAC CGT GTG GCA ACC 1152 Tyr Gly Phe Ala Ser Gly Arg Ser Thr His Ala Asp Arg Val Ala Thr 370 375 380 ATC GCT GAC GTG CAT TCC CGC CTC GAC GTA CTA ATC GAT CCC CAC ACC 1200 Ile Ala Asp Val His Ser Arg Leu Asp Val Leu Ile Asp Pro His Thr 385 390 395 400 GCC GAC GGC GTT CAC GTG GCA CGC CAG TGG AGG GAC GAG GTC AAC ACC 1248 Ala Asp Gly Val His Val Ala Arg Gln Trp Arg Asp Glu Val Asn Thr 405 410 415 CCA ATC ATC GTC CTA GAA ACT GCA CTC CCA GTG AAA TTT GCC GAC ACC 1296 Pro Ile Ile Val Leu Glu Thr Ala Leu Pro Val Lys Phe Ala Asp Thr 420 425 430 ATC GTC GAA GCA ATT GGT GAA GCA CCT CAA ACT CCA GAG CGT TTC GCC 1344 Ile Val Glu Ala Ile Gly Glu Ala Pro Gln Thr Pro Glu Arg Phe Ala 435 440 445 GCG ATC ATG GAT GCT CCA TTC AAG GTT TCC GAC CTA CCA AAC GAC ACC 1392 Ala Ile Met Asp Ala Pro Phe Lys Val Ser Asp Leu Pro Asn Asp Thr 450 455 460 GAT GCA GTT AAG CAG TAC ATA GTC GAT GCG ATT GCA AGC ACT TCC GTG 1440 Asp Ala Val Lys Gln Tyr Ile Val Asp Ala Ile Ala Asn Thr Ser Val 465 470 475 480 AAG TAA 1446 Lys

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のスレオニンシンターゼをコードする遺
伝子を含む大きさが約２．６ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵
素による切断点地図。

【図２】大きさが約２．６ｋｂの本発明ＤＮＡ断片の塩
基配列決定のための戦略図。

【図３】本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ｔｈｓの制
限酵素による切断点地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コリネ型細菌に属するブレビバクテリウ
   ム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａ
   ｖｕｍ）由来のスレオニンシンターゼ（Ｅ．Ｃ．４．
   ２．９９．２．）をコードする遺伝子ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 次のＤＮＡ塩基配列 GTGGACTACA TTTCGACGCG TGATGCCAGC CGTACCCCTG CCCGCTTCAG TGATATTTTG 60 CTGGGCGGTC TAGCACCAGA CGGCGGCCTA TACCTGCCTG CAACCTACCC TCAACTAGAT 120 GATGCCCAGC TGAGTAAATG GCGTGAGGTA TTAGCCAACG AAGGATACGC AGCTTTGGCT 180 CGTGAAGTTA TCTCCCTGTT TGTTGATGAC ATCCCAGTAG AAGACATCAA GGCGATCACC 240 GCACGCGCCT ACACCTACCC GAAGTTCAAC AGCGAAGACA TCGTTCCTGT CACCGAACTC 300 GAGGACAACA TTTACCTGGG CCACCTTTCC GAAGGCCCAA CCGCTGCATT CAAAGACATG 360 GCCATGCAGC TGCTCGGCGA ACTTTTCGAA TACGAGCTTC GCCGCCGCAA CGAAACCATC 420 AACATCCTAG GCGCTACCTC TGGCGATACC GGCTCCTCTG CGGAATACGC CATGCGCGGC 480 CGCGAGGGAA TCCGCGTATT CATGCTGACC CCAGCTGGCC GCATGACCCC ATTCCAGCAA 540 GCACAGATGT TTGGCCTTGA CGATCCAAAC ATCTTCAACA TCGCCCTCGA CGGCGTTTTC 600 GACGATTGCC AAGACGTAGT CAAGGCTGTC TCCGCCGACG CGGAATTTAA AAAAGACAAC 660 CGCATCGGTG CCGTGAACTC CATCAACTGG GCTCGCCTCA TGGCACAGGT TGTGTACTAC 720 GTTTCCTCAT GGATCCGCAC CACAACCAGC AATGACCAAA AGGTCAGCTT CTCCGTACCA 780 ACCGGCAACT TCGGTGACAT TTGCGCAGGC CACATCGCCC GCCAAATGGG ACTTCCCATC 840 GATCGCCTCA TCGTGGCCAC CAACGAAAAC GATGTGCTCG ACGAGTTCTT CCGTACCGGC 900 GACTACCGAG TCCGCAGCTC CGCAGACACC CACGAGACCT CCTCACCTTC GATGGATATC 960 TCCCGCGCCT CCAACTTCGA GCGTTTCATC TTCGACCTGC TCGGCCGCGA CGCCACCCGC 1020 GTCAACGATC TATTTGGTAC CCAGGTTCGC CAAGGCGGAT TCTCACTGGC TGATGACGCC 1080 AACTTTGAAA AGGCTGCAGC AGAATACGGT TTCGCCTCCG GACGATCCAC CCATGCTGAC 1140 CGTGTGGCAA CCATCGCTGA CGTGCATTCC CGCCTCGACG TACTAATCGA TCCCCACACC 1200 GCCGACGGCG TTCACGTGGC ACGCCAGTGG AGGGACGAGG TCAACACCCC AATCATCGTC 1260 CTAGAAACTG CACTCCCAGT GAAATTTGCC GACACCATCG TCGAAGCAAT TGGTGAAGCA 1320 CCTCAAACTC CAGAGCGTTT CGCCGCGATC ATGGATGCTC CATTCAAGGT TTCCGACCTA 1380 CCAAACGACA CCGATGCAGT TAAGCAGTAC ATAGTCGATG CGATTGCAAG CACTTCCGTG 1440 AAGTAA 1446 で示されるスレオニンシンターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．９
   ９．２）をコードする遺伝子ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 次のアミノ酸配列 Val Asp Tyr Ile Ser Thr Arg Asp Ala Ser Arg Thr Pro Ala Arg Phe 1 5 10 15 Ser Asp Ile Leu Leu Gly Gly Leu Ala Pro Asp Gly Gly Leu Tyr Leu 20 25 30 Pro Ala Thr Tyr Pro Gln Leu Asp Asp Ala Gln Leu Ser Lys Trp Arg 35 40 45 Glu Val Leu Ala Asn Glu Gly Tyr Ala Ala Leu Ala Ala Glu Val Ile 50 55 60 Ser Leu Phe Val Asp Asp Ile Pro Val Glu Asp Ile Lys Ala Ile Thr 65 70 75 80 Ala Arg Ala Tyr Thr Tyr Pro Lys Phe Asn Ser Glu Asp Ile Val Pro 85 90 95 Val Thr Glu Leu Glu Asp Asn Ile Tyr Leu Gly His Leu Ser Glu Gly 100 105 110 Pro Thr Ala Ala Phe Lys Asp Met Ala Met Gln Leu Leu Gly Glu Leu 115 120 125 Phe Glu Tyr Glu Leu Arg Arg Arg Asn Glu Thr Ile Asn Ile Leu Gly 130 135 140 Ala Thr Ser Gly Asp Thr Gly Ser Ser Ala Glu Tyr Ala Met Arg Gly 145 150 155 160 Arg Glu Gly Ile Arg Val Phe Met Leu Thr Pro Ala Gly Arg Met Thr 165 170 175 Pro Phe Gln Gln Ala Gln Met Phe Gly Leu Asp Asp Pro Asn Ile Phe 180 185 190 Asn Ile Ala Leu Asp Gly Val Phe Asp Asp Cys Gln Asp Val Val Lys 195 200 205 Ala Val Ser Ala Asp Ala Glu Phe Lys Lys Asp Asn Arg Ile Gly Ala 210 215 220 Val Asn Ser Ile Asn Trp Ala Arg Leu Met Ala Gln Val Val Tyr Tyr 225 230 235 240 Val Ser Ser Trp Ile Arg Thr Thr Thr Ser Asn Asp Gln Lys Val Ser 245 250 255 Phe Ser Val Pro Thr Gly Asn Phe Gly Asp Ile Cys Ala Gly His Ile 260 265 270 Ala Arg Gln Met Gly Leu Pro Ile Asp Arg Leu Ile Val Ala Thr Asn 275 280 285 Glu Asn Asp Val Leu Asp Glu Phe Phe Arg Thr Gly Asp Tyr Arg Val 290 295 300 Arg Ser Ser Ala Asp Thr His Glu Thr Ser Ser Pro Ser Met Asp Ile 305 310 315 320 Ser Arg Ala Ser Asn Phe Glu Arg Phe Ile Phe Asp Leu Leu Gly Arg 325 330 335 Asp Ala Thr Arg Val Asn Asp Leu Phe Gly Thr Gln Val Arg Gln Gly 340 345 350 Gly Phe Ser Leu Ala Asp Asp Ala Asn Phe Glu Lys Ala Ala Ala Glu 355 360 365 Tyr Gly Phe Ala Ser Gly Arg Ser Thr His Ala Asp Arg Val Ala Thr 370 375 380 Ile Ala Asp Val His Ser Arg Leu Asp Val Leu Ile Asp Pro His Thr 385 390 395 400 Ala Asp Gly Val His Val Ala Arg Gln Trp Arg Asp Glu Val Asn Thr 405 410 415 Pro Ile Ile Val Leu Glu Thr Ala Leu Pro Val Lys Phe Ala Asp Thr 420 425 430 Ile Val Glu Ala Ile Gly Glu Ala Pro Gln Thr Pro Glu Arg Phe Ala 435 440 445 Ala Ile Met Asp Ala Pro Phe Lys Val Ser Asp Leu Pro Asn Asp Thr 450 455 460 Asp Ala Val Lys Gln Tyr Ile Val Asp Ala Ile Ala Asn Thr Ser Val 465 470 475 480 Lys で示されるスレオニンシンターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．９
   ９．２．）をコードする遺伝子ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子
   ＤＮＡが導入された組換えプラスミド。
5. 【請求項５】 請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子
   ＤＮＡと、コリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子
   を含むＤＮＡを保有する組換えプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組換えプラスミドで形質
   転換されたコリネ型細菌。
7. 【請求項７】 グルコースを、請求項６記載のコリネ型
   細菌の培養菌体又は菌体処理物と接触させてＬ−スレオ
   ニンを生成せしめることを特徴とするＬ−スレオニンの
   製造法。