JPH0928391A

JPH0928391A - Ｌ−トリプトファンの製造法

Info

Publication number: JPH0928391A
Application number: JP7181730A
Authority: JP
Inventors: Kazuhisa Hatakeyama; 和久畠山; Makoto Goto; 誠後藤; Masato Terasawa; 真人寺沢; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1995-07-18
Publication date: 1997-02-04
Also published as: US5776740A

Abstract

(57)【要約】【構成】セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
を含有する微生物菌体又はその処理物とトリプトファン
シンターゼ又はトリプトファナーゼを含有する微生物菌
体又はその処理物との共存下に、グリシン、ホルムアル
デヒド及びインドールからＬ−トリプトファンを生成せ
しめるに際し、反応液中のｐＨを９〜１０に維持し、反
応液中の生成Ｌ−セリン濃度を５０ｍＭ以下に制御しな
がらＬ−トリプトファンを反応液中に連続的に生成せし
めることを特徴とするＬ−トリプトファンの製造方法。【効果】本発明の製造方法により、Ｌ−トリプトファン
を高効率で安価に製造することが可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−トリプトファンの
製造法に関し、更に詳しくは、原料としてインドール、
グリシンおよびホルムアルデヒドを用い、トリプトファ
ンシンーゼとセリンヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼの共存下酵素反応を行いＬ−トリプトファンを生成蓄
積せしめる、Ｌ−トリプトファンの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−トリプトファンの酵素的な合
成は、トリプトファンシンターゼ又はトリプトファナー
ゼの存在下にインドールとＬ−セリンを反応させて行な
われている（特公平５−７９３１１、特開平１−５１０
９３等）。しかしながら、Ｌ−セリンは比較的高価であ
ることから、Ｌ−セリン以外の原料を使う方法が検討さ
れている。インドール、グリシンおよびホルムアルデヒ
ドからのＬ−トリプトファン製造法に関して、酵素反応
の第１段階でセリンヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼの作用でグリシンとホルムアルデヒドからＬ−セリン
を製造し、次いで第２段階で反応系へインドールを添加
し製造する方法が提案されている（特開昭６２−５０２
９３４）。

【０００３】しかしながら上記の方法では、反応を２段
階に別ける為、操作が繁雑であり、製造も回分式に限定
されるので決して工業的に有利な方法とは言い難い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前述の如く、インドー
ル、グリシンおよびホルムアルデヒドを原料とするＬ−
トリプトファン製造法では工業的に有利な方法は提案さ
れていない。本発明は、上記問題を解決し、従来に比べ
て効率的かつ安価なＬ−トリプトファンの製造方法を提
供すべくなされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、セリンヒドロキシ
メチルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体又はそ
の処理物とトリプトファンシンターゼ又はトリプトファ
ナーゼを含有する微生物菌体又はその処理物との共存下
に、インドール、グリシン及びホルムアルデヒドからＬ
−トリプトファンを連続式に効率良くＬ−トリプトファ
ンを反応液中に生成蓄積せしめ得ることを見い出し、本
発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明はセリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体又はその処
理物とトリプトファンシンターゼ又はトリプトファナー
ゼを含有する微生物菌体又はその処理物との共存下に、
グリシン、ホルムアルデヒド及びインドールからＬ−ト
リプトファンを生成せしめ、反応液よりＬ−トリプトフ
ァンを採取する方法を提供するものである。

【０００７】さらに、本発明を詳細に説明する。本発明
に用いられるトリプトファンシンターゼを含有する微生
物としてはインドールとＬ−セリンからＬ−トリプトフ
ァンを生成し得る能力を有する微生物であれば特に限定
されるものではなく、例えば、エシェリヒア・コリＫ−
１２（ＡＴＣＣ２７３２５）、エシェリヒア・コリＫ
−１２ＹＫ２００４（ＦＥＲＭＢＰ−１７３２）、エ
シェリヒア・コリＫ−１２ＹＫ２００９（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３２４４）、バチルス・ズブチリス（Henner, D.
J. etal. (1984) Gene, vol. 34, 169〜177) ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム（Matsui etal.(198
6) Agric. Biol. Chem.,Vol. 51, 823〜828）、サルモ
ネラ・チフィムリム（Kawasaki,H. st al. (1987) J. B
iol. Chem., Vol. 267, 10678〜10683）、バチルス・ス
テアロサーモフィラスＩＦＯ１３７３７、ブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１
４９７）等が挙げられる。好ましくは、エシェリヒア
・コリＫ−１２ＹＫ２００９（ＦＥＲＭＢＰ−３
２４４）が挙げられる。

【０００８】また、トリプトファナーゼを含有する微生
物としては、インドールとＬ−セリンからＬ−トリプト
ファンを生成しうる能力を有する微生物であれば特に限
定されるものではなく、例えば、エシェリヒア・コリＫ
−１２（ＡＴＣＣ２７３２５）、エシェリヒア・コリ
ＡＴＣＣ２５０１９、エシェリヒア・コリＩＦＯ３３
０１、エシェリヒア・コリＫ−１２ＹＫ３００２
（ＦＥＲＭＢＰ−１７３３）、エシェリヒア・コリ
Ｋ−１２ＹＫ３００３（ＦＥＲＭＢＰ−１７３
４）、エシェリヒア・コリＫ−１２ＹＫ３００５
（ＦＥＲＭＢＰ−１７３６）、シンビオバクテリウム
・サーモフィラム（Suzuki, S. et al. (1988) J. Gen.
Microbial. 134, 2353)等が挙げられる。好ましくは、
エシェリヒア・コリＫ−１２ＹＫ３００５（ＦＥＲ
ＭＢＰ−１７３６）が挙げられる。

【０００９】さらに、セリンヒドロキシメチルトランス
フェラーゼを含有する微生物としては、グリシンとホル
ムアルデヒドからＬ−セリンを生成しうる能力を有する
微生物であれば特に限定されるものではなく、例えば、
エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ２７３２
５）、エシェリヒア・コリＭＴ−１０３５０（ＦＥ
ＲＭＰ−７４３７、ＦＥＲＭＢＰ−７９３）、エシ
ェリヒア・コリＭＴ−１０３５１（ＦＥＲＭＰ−７
４３８、ＦＥＲＭＢＰ−７９４）、ハイホミクロビウ
ム・メチロボラム(Hyphomicrobium methyloborum)ＧＭ
２（特開平６−１８１７７６）、ハイホミクロビウム・
ＳＰ(Hyphomicrobium SP)（ＦＥＲＭ−Ｐ２２３６）、
コリネバクテリウム・グリシノフィラム(Corynebacteri
um glycinophilum) ＡＴＣＣ２１３４１、コリネバク
テリウム・グリシノフィラム(Corynebacterium glycino
philum) ＡＪ３４１４（ＦＥＲＭＰ−１６８７）、
コリネバクテリウム・グリシノフィラム(Corynebacteri
um glycinophilum) ＡＪ１２４０１（ＦＥＲＭＰ−
１１６０６）、ブレビバクテリウム・フラバム(Breviba
cterium flavum) ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１
４９７）等が挙げられる。好ましくは、ブレビバクテリ
ウム・フラバム(Brevibacterium flavum) ＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）が挙げられる。また、
これらの菌株のセリンヒドロキシメチルトランスフェラ
ーゼをコードする遺伝子をエシェリヒア・コリＫ−１
２（ＡＴＣＣ２７３２５）、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）、バチ
ルス・サチルス（Chang, S. and Cohen, S. N. Molec.
Gen. Genet., 168, 111(1979))等の菌株に組換えた微生
物等も、好適に使用できる（特開平２−４２９９４、特
開平６−１８１７７６等）。

【００１０】セリンヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼ、トリプトファンシンターゼ、あるいは、トリプトフ
ァナーゼを含有する微生物の培養は、それ自体既知の通
常用いられる、炭素源、窒素源、無機塩等を含む培地で
行うことができる。炭素源としては、例えばグルコー
ス、グリセロール、フラクトース、シュクロース、廃糖
蜜等が、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム
がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無
機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二
水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この
他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティー
プリカー、カザミノ酸、ビオチン、チアミン等の各種ビ
タミン等の栄養素を培地に添加することができる。

【００１１】培養は、通常、通気攪拌、振盪等の好気的
条件下に、培養温度は一般に２０℃〜５０℃の温度で行
うことができる。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましく
は７〜８付近とすることができ、培養中のｐＨ調整は酸
又はアルカリを添加して行うことができる。培養開始時
の炭素源濃度は、特に制限するものではないが、通常１
〜１０％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは２〜５％（ｗ／
ｖ）である。また、培養期間は通常約５時間〜約５日間
である。

【００１２】本発明の方法は、上記の如く培養して得た
培養物、該培養物を遠心分離法等により分離して得られ
る菌体または該菌体の処理物、例えば洗浄菌体、乾燥菌
体、あるいはそれらの固定化物等の種々の形態が使用さ
れる。また、菌体破砕物、あるいはそれらを抽出・精製
して得た酵素または該酵素を固定化した固定化酵素を使
用してもよい。

【００１３】かくして得られる、セリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼを含有する微生物またはその処理
物、および、トリプトファンシンターゼまたはトリプト
ファナーゼを含有する微生物またはその処理物の混合物
をインドールとグリシンおよびホルムアルデヒドを含有
する水溶液中で酵素反応させて、反応液中にＬ−トリプ
トファンを生成蓄積せしめることができる。基質である
インドールの反応液中の濃度は、特に制限はないが、好
ましくは０．５〜２ｍＭである。

【００１４】グリシンの反応液中の濃度は、特に制限は
ないが、好ましくは、１ｍｍｏｌ〜１０ｍｏｌである。
ホルムアルデヒドの反応液中の濃度は、特に制限はない
が、好ましくは、１ｍｍｏｌ〜１０ｍｏｌである。Ｌ−
セリンは反応液中のグリシンおよびホルムアルデヒドか
らセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼにより合
成され、反応液中のＬ−セリン濃度は、液中のグリシン
あるいはホルムアルデヒドの濃度あるいはセリンヒドロ
キシメチルトランスフェラーゼの酵素量の調節により制
御可能である。かくして決定されるＬ−セリンの反応液
中の濃度は、２０ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは３０ｍＭ
〜５０ｍＭ、である。反応液には、基質であるインドー
ル、グリシン、および、ホルムアルデヒドの他に、Ｌ−
トリプトファンの生成率を高めるためにピリドキサール
リン（ＰＬＰ）、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）、およ
び、塩化ナトリウムあるいは塩化カリウムを添加せしめ
ることが好ましい。

【００１５】溶媒としては、一般には、水が用いられ、
必要に応じてトリトンＸ−１００（ポリオキシエチレン
アルキルフェノールエーテル系非イオン性界面活性
剤）、ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノラウレイト系非イオン性界面活性剤）等の界面活性剤
を添加することもできる。反応液中のｐＨは、９〜１０
であり、ｐＨの調整は酸又はアルカリを添加して行うこ
とができる。

【００１６】反応温度は１０〜５５℃、好ましくは、１
５〜４５℃である。上記の如く酵素反応させることによ
りＬ−トリプトファンを、高濃度で生成蓄積させること
ができる。さらに、本製造法は、該酵素や微生物を、膜
を利用して系内に封じ込め、反応と同時に生成物を含有
した透過液を抜き出し、菌体分離を連続的に行いＬ−ト
リプトファンを高濃度に効率よく連続製造することもで
きる。

【００１７】得られたＬ−トリプトファンの分離・精製
は、通常のイオン交換樹脂法、晶析法、その他の公知の
方法を組み合わせることにより、容易に行うことができ
る。

【００１８】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、下記
の実施例は本発明について具体的な認識を得る一助とし
てのみ挙げるものであり、これによって本発明の範囲は
何ら限定されるものではない。

【００１９】実施例１セリンヒドロキシメチルトラン
スフェラーゼおよびトリプトファンシンターゼによるＬ
−トリプトファン生成反応における、セリン濃度の影響（１）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来
セリンヒドロキシメチルトラスフェラーゼ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片のクローン化（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の
全ＤＮＡの抽出ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３(FERM BP-1
497)を、半合成培地であるＡ培地［組成：尿素２ｇ、
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、Ｋ
Ｈ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄０．５ｇ、ＦｅＳＯ
₄・７Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ６
ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン
２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０
ｇを蒸留水に溶解して１リットルとする］１リットル中
で対数増殖期後期まで培養した後に菌体を回収した。

【００２０】得られた菌体をリゾチームを１０mg/ml の
濃度で含有する溶液［組成：１０ｍＭＮａＣｌ、２０
ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ
・２Ｎａ］１５ｍｌに懸濁した。該懸濁液にプロテナー
ゼＫを１００μg/mlの最終濃度で添加し、これを３７℃
で１時間インキュベートした。次に、ドデシル硫酸ナト
リウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０
℃で６時間インキュベートして溶菌させた。得られた溶
菌液に等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加して
室温で１０分間穏やかに振盪した後、その全量を１０〜
１２℃で２０分間、５，０００×ｇの遠心分離に供し、
その上清画分を分取した。該上清画分中に酢酸ナトリウ
ムをその濃度が０．３Ｍとなるように添加し、次いで２
倍量のエタノールを穏やかに添加した。水層とエタノー
ル層の間に存在するＤＮＡをガラス棒で搦め取り、これ
を７０％エタノールで洗浄して風乾した。得られたＤＮ
Ａは、溶液［組成：１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
５）、１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍｌを加えて４℃
で一晩静置した後、実験に供した。

【００２１】（Ｂ）セリンヒドロキシメチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製上記（Ａ）項で調製したブレビバクテリウム・フラバム
の染色体ＤＮＡ２５μｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩ５０
ｕｎｉｔと３７℃で１時間反応させて切断し、染色体Ｄ
ＮＡのＥｃｏＲＩ分解物を調製した。この分解物溶液
に、プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造製）１μｇを制限
酵素ＥｃｏＲＩと３７℃で１時間反応させて得た分解物
溶液を混合し、これにそれぞれ最終濃度が５０ｍＭトリ
ス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトー
ル、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、および
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔとなるように各成分を添
加し、１６℃で１５時間反応させて、ＤＮＡ分解物を結
合させた。

【００２２】得られた溶液を用いて常法［M. Mandel、
A. Higa ; J. Mol. Biol.、 53、 159(1970)参照］に従
ってグリシン要求性大腸菌変異株、エシエリヒア・コリ
ＡＴ２４５７（ｇｌｙＡ）［静岡県三島市谷田１−１１
１国立遺伝学研究所遺伝実験生物保存研究センターに
系統番号：ＭＥ５３６２として保管されており、同セン
ターから入手可能］を形質転換し、得られた形質転換菌
をアンピシリンを５０μg/ml含む選択培地［組成；Ｋ₂
ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇ、（ＮＨ ₄）₂Ｓ
Ｏ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．１ｇ、グルコ
ース２ｇ、および寒天１６ｇを蒸留水に溶解して１リッ
トルとする］に塗抹した。選択培地上に生育した菌株
を、アンピシリンを最終濃度で５０μg/ml含有するＬ培
地に植菌し、これを３７℃で７時間培養した。培養液を
４℃で１０分間８,０００×ｇの遠心分離にかけて菌体
を回収した。回収した菌体からアルカリ−ＳＤＳ法［T.
Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook、 Molecular
cloning、 p.90-91(1982)参照］によりプラスミドを抽
出した。該プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、
その切断断片をアガロースゲル電気泳動に供したとこ
ろ、プラスミドｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ部位に大きさ
約３．８ｋｂのＤＮＡ断片の挿入が認められた。

【００２３】上記の大きさ約３．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断
片をアガロースゲル中より回収し、さらに制限酵素Ｂａ
ｍＨＩと制限酵素ＳｍａＩとで処理した。この分解物溶
液と、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素
ＢａｍＨＩと制限酵素ＳｍａＩとで処理して得た分解物
溶液を混合し、ｐＨ７．６で１０ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂の存在
下、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりＤＮＡ分解物を結合させ
た。

【００２４】得られた結合ＤＮＡ溶液を用いて常法に従
って、前記グリシン要求性大腸菌変異株エシエリヒア・
コリＡＴ２４５７を形質転換し、得られた形質転換菌を
アンピシリンを５０μg/ml含む前記選択培地に塗抹し
た。選択培地上に生育した菌株を、アンピシリンを最終
濃度で５０μg/ml含有するＬ培地［トリプトン１０ｇ、
酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇおよび寒天１６ｇ
を蒸留水１リットルに溶解して調製］に植菌し、これを
３７℃で７時間培養した。培養液を４℃で１０分間、
８,０００×ｇの遠心分離にて菌体を回収した。

【００２５】回収した菌体から前記のアルカリ−ＳＤＳ
法によりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素
ＢａｍＨＩとＳｍａＩとで切断し、その切断断片をアガ
ロースゲル電気泳動に供したところ、プラスミドｐＵＣ
１１９のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位に大きさ約２．１ｋ
ｂのＤＮＡ断片の挿入が認められた。そこで、本プラス
ミドをｐＵＣ１１９−ＭＪｇｌｙＡと命名した。

【００２６】（Ｃ）グリシン要求性大腸菌変異株への相
補試験上記（Ｂ）項で調製したプラスミド溶液を用いて前記グ
リシン要求性大腸菌変異株エシエリヒア・コリＡＴ２４
５７を形質転換したところ、約１０⁵ 細胞／μｇＤＮＡ
の頻度で前記選択培地上に形質転換株を得た。これによ
り、上記（Ｂ）項で調製したプラスミドｐＵＣ１１９−
ＭＪｇｌｙＡの大きさ約２．１ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓｍ
ａＩＤＮＡ断片上にセリンヒドロキシメチルトランス
フェラーゼ遺伝子が含まれることが確認された。

【００２７】（Ｄ）セリンヒドロキシメチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定上記実施例１の（Ｃ）項でセリンヒドロキシメチルトラ
ンスフェラーゼが含まれることが確認された大きさ約
２．１ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を下記の操作により
決定し、このＤＮＡ断片上に存在するセリンヒドロキシ
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の存在部位を特定し
た。

【００２８】大きさ約２．１ｋｂのＤＮＡ断片溶液１４
μｌを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いて３７℃で１〜５分
間処理してＤＮＡ断片を部分分解した。また、クローニ
ングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造製）を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで切断した。得られたベクターＤＮＡ断片と部分
分解ＤＮＡ断片とを混合し、この混合液にそれぞれ最終
濃度が５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂ 、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔとなる
ように各成分を添加し、ベクターＤＮＡ断片と部分分解
ＤＮＡ断片とを結合させた。

【００２９】上記と同様に大きさ約２．１ｋｂのＤＮＡ
断片溶液１４μｌを制限酵素ＴａｑＩ５０ｕｎｉｔと
５〜８分間反応させて部分分解ＤＮＡ断片を調製した。
クローニングベクターｐＵＣ１１８を制限酵素ＡｃｃＩ
で切断した後、これを上記と同様にして部分分解ＤＮＡ
と結合させた。

【００３０】得られたプラスミド混液を用い、常法［J.
Mol. Biol.、 53、 159(1970)参照］によりエシエリヒ
ア・コリＪＭ１０９株（宝酒造製）を形質転換し、アン
ピシリンを５０μｇ含む前記のＬ培地に塗抹した。上記
培地に生育した菌株を常法に従い液体培養し、得られた
培養物よりプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラ
スミドＤＮＡを用いて、ベクターｐＵＣ１１８に挿入さ
れた部分分解ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシヌクレ
オチド酵素法［dideoxy chain termination method、 S
anger、 F. et al.、 Proc. Natl.Acad. Sci. USA、 7
4、 5463(1977) 参照］により決定した。

【００３１】具体的には、上記培養物より抽出したプラ
スミドＤＮＡをパーキン・エルマー社製カタリスト８０
０モレキュラー・バイオロジー・ラボステーション(CAT
ALYST 800 Moleculer Biology Labostation ; Prkin-El
mer)を用いてプロトコールに従い反応させた後、パーキ
ン・エルマー社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによ
り各々のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定
した。そして、これらの個々の配列の連結は、パーキン
・エルマー社製のシークエンス解析ソフトインヘリッ
ト(INHERIT) を用いて行い、大きさ約２．１ｋｂのＤＮ
Ａ断片の全塩基配列を決定した。その配列を後記配列表
の配列番号：１に示す。

【００３２】決定した塩基配列中にはオープンリーディ
ングフレームの存在が認められ、既知のエシエリヒア・
コリのｇｌｙＡ遺伝子との相同性の比較により、それが
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のｇｌｙＡ
遺伝子（塩基番号５５６〜１８５７）であることが判明
した。

【００３３】（Ｅ）セリンヒドロキシメチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子発現ベクターの構築上記（Ｂ）項で調製したプラスミドｐＵＣ１１９−ＭＪ
ｇｌｙＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＳｍａＩで切断し、
その切断断片をアガロース電気泳動に供した後、約２．
１ｋｂのＤＮＡ断片をGene Clean II （フナコシ
製）を用いて抽出した。得られたＤＮＡ断片を、ＤＮＡ
ＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔ（宝酒造製）を用いて平滑
末端化処理した後、制限酵素ＳｍａＩで切断した発現ベ
クターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア製）とＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより結合させた。得られた結合ＤＮＡ溶液
を用いて常法に従ってエシエリヒア・コリＪＭ１０９株
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリンを５０μｇ含
む前記のＬ培地に塗抹した。

【００３４】上記培地に生育した菌株を常法に従い液体
培養し、得られた培養物よりプラスミドＤＮＡを抽出
し、該プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ
とで切断し、その切断断片をアガロースゲル電気泳動に
供したところ、プラスミドｐＫＫ２２３−３の約４．６
ｋｂのベクター中に、約２．１ｂｐの前記ＤＮＡ断片
が、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのオー
プンリーディングフレームがｐＫＫ２２３−３のｔａｃ
プロモーターと同じ方向となるように挿入されているこ
とが確認された。そこで、本プラスミドをｐＫＫ２２３
−３−ＭＪｇｌｙＡと命名した。得られたプラスミドｐ
ＫＫ２２３−３−ＭＪｇｌｙＡ溶液を、常法に従ってエ
シエリヒア・コリＫ−１２株（ＡＴＣＣ２７３２５）
を形質転換し、アンピシリンを５０μｇ含む前記のＬ培
地に塗抹した。上記培地に生育した菌株を常法に従い液
体培養し、得られた培養物よりプラスミドＤＮＡを抽出
し、該プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ
とで切断した。その結果、本形質転換株は、ｐＫＫ２２
３−３−ＭＪｇｌｙＡを含有することが確認された。そ
こで、本菌株をエシェリヒア・コリＫ−１２ＳＨ１
００１株と命名した。

【００３５】（２）セリンヒドロキシメチルトランスフ
ェラーゼを含有する微生物の調整ＭＴＰ培地［組成；Ｋ₂ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄
２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏ０．１ｇ、アデニン塩酸塩５０ｍｇ、酵母エキ
ス１ｇ、トリプトン１ｇ、グルコース１．０ｇ、
蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．２］５０ｍｌを５００ｍｌ容三
角フラスコ４本に分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理
したものにエシェリヒア・コリＫ−１２ＳＨ１００
１株を植菌し、３７℃にて１日振とう培養後、同様にし
て調製したＭＴＰ培地１．０Ｌを分注した５Ｌ容三角フ
ラスコ１５本に、１０ｍｌの培養液を接種し、３７℃に
て１２時間振とう培養した。また、培養開始３時間後に
培地中にインドールアクリル酸１００ｍｇを添加した。
遠心分離を用いて菌体を回収し、−２０℃で２日間凍結
し保存後、以下の実験に用いた。

【００３６】（３）トリプトファンシンターゼを含有す
る微生物の調整ＭＴＰ培地［組成；Ｋ₂ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄
２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏ０．１ｇ、アデニン塩酸塩５０ｍｇ、酵母エキ
ス１ｇ、トリプトン１ｇ、グルコース１．０ｇ、
蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．２］５０ｍｌを５００ｍｌ容三
角フラスコ４本に分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理
したものにエシェリヒア・コリＫ−１２ＹＫ２００
９（ＦＥＲＭＢＰ−３２４４）株を植菌し、３７℃に
て１日振とう培養後、同様にして調製したＭＴＰ培地
１．０Ｌを分注した５Ｌ容三角フラスコ１５本に、１０
ｍｌの培養液を接種し、３７℃にて１２時間振とう培養
した。また、培養開始３時間後に培地中にインドールア
クリル酸１００ｍｇを添加した。遠心分離を用いて菌体
を回収し、−２０℃で２日間凍結し保存後、以下の実験
に用いた。

【００３７】（４）Ｌ−トリプトファン生成反応実施例１の（１）および（２）で調製したエシェリヒア
・コリＫ−１２ＳＨ１００１の凍結菌体１００ｇお
よびエシェリヒア・コリＫ−１２ＹＫ２００９（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−３２４４）株の凍結菌体の１００ｇを、
インドール０．１ｇ、グリシン７．５ｇ、ホルマリ
ン（ホルムアルデヒド含量３７％）１．６ｇ、ＰＬＰ
１００ｍｇ、ＴＨＦ１．０ｇ、ＮａＣｌ２．３ｇ
を含有する反応液５００ｍｌ（ｐＨ９．５に２５％アン
モニアで調整）に懸濁した後、全体の体積を水で１００
０ｍｌに調整した。本懸濁液をそれぞれ３Ｌジャーファ
ーメンター（エイブル社製）に仕込み、３０℃で撹拌し
ながら反応を行った。反応中、反応液のｐＨを２５％ア
ンモニアで９．５に調整した。また、反応液中のインド
ール濃度を高速液体クロマトグラフィー（島津製作所
製）を用いてモニターしながらインドールの濃度が２ｍ
Ｍを越えないようにインドールを連続的あるいは断続的
に添加した。さらに、反応液中のＬ−セリン濃度を高速
液体クロマトグラフィー（島津製作所製）を用いてモニ
ターしながら第１表に示す各実験区の指定Ｌ−セリン濃
度を超えることなくＬ−セリン濃度を保てるようにグリ
シンおよびホルムアルデヒドを連続的あるいは断続的に
添加し、総量として２２．５ｇのグリシンを添加した。
反応液中のＬ−トリプトファン濃度は高速液体クロマト
グラフィー（島津製作所製）を用いてモニターした。そ
の結果、反応終了後のＬ−トリプトファンの、反応液中
に添加したグリシンに対する収率（ｍｏｌ％）を第１表
に示す。

【００３８】

【表１】第１表反応液中のＬ−セリン濃度Ｌ−トリプトファンの対グリシン収率（ｍＭ）（％）１０９５２０９６３０９５５０９５７０８５１００８０

【００３９】次に、Ｌ−セリン濃度３０ｍＭで反応した
反応終了液５００ｍｌにＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ１
０にしたのち、アンモニア型強酸性イオン交換樹脂（ダ
イヤイオンＳＫ−１Ｂ、三菱化成製）のカラムを通して
Ｌ−トリプトファンの粗結晶を析出させたのち、これを
アセトンで洗浄し乾燥してＬ−トリプトファンの結晶１
６．５ｇを得た。

【００４０】実施例２セリンヒドロキシメチルトラン
スフェラーゼおよびトリプトファナーゼによるＬ−トリ
プトファン生成反応（１）トリプトファナーゼ含有菌の調整実施例１の（３）と同様にしてエシェリヒア・コリＫ
−１２ＹＫ３００５（ＦＥＲＭＢＰ−１７３６）株
を培養した後、遠心分離を用いて菌体を回収し、−２０
℃で２日間凍結し保存後、以下の実験に用いた。

【００４１】（２）Ｌ−トリプトファン生成反応実施例１の（２）および実施例２の（１）で調製したエ
シェリヒア・コリＫ−１２ＳＨ１００１の凍結菌体
１００ｇおよびエシェリヒア・コリＫ−１２ＹＫ３０
０５（ＦＥＲＭＢＰ−１７３６）株の凍結菌体の１０
０ｇを、インドール０．１ｇ、グリシン７．５ｇ、
ホルマリン（ホルムアルデヒド含量３７％）１．６
ｇ、ＰＬＰ１００ｍｇ、ＴＨＦ１．０ｇ、ＫＣｌ
３．８ｇを含有する反応液５００ｍｌ（ｐＨ９．５に２
５％アンモニアで調整）に懸濁した後、全体の体積を水
で１０００ｍｌに調整した。本懸濁液をそれぞれ３Ｌジ
ャーファーメンター（エイブル社製）に仕込み、３０℃
で撹拌しながら反応を行った。反応中、反応液のｐＨを
２５％アンモニアで９．５に調整した。また、反応液中
のインドール濃度を高速液体クロマトグラフィー（島津
製作所製）を用いてモニターしながらインドールの濃度
が２ｍＭを越えないようにインドールを連続的あるいは
断続的に添加した。さらに、反応液中のＬ−セリン濃度
を高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）を用い
てモニターしながら第２表に示す各実験区の指定Ｌ−セ
リン濃度を超えることなくＬ−セリン濃度を保てるよう
にグリシンおよびホルムアルデヒドを連続的あるいは断
続的に添加し、総量として２２．５ｇのグリシンを添加
した。反応液中のＬ−トリプトファン濃度は高速液体ク
ロマトグラフィー（島津製作所製）を用いてモニター
し、Ｌ−トリプトファンの対グリシン収率を求めた結果
を第２表に示す。

【００４２】

【表２】第２表反応液中のＬ−セリン濃度Ｌ−トリプトファンの対グリシン収率（ｍＭ）（％）１０９５２０９６３０９５５０９５７０８５１００８０

【００４３】Ｌ−セリン濃度３０ｍＭで反応した反応終
了液５００ｍｌにＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ１０にし
たのち、アンモニア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイ
オンＳＫ−１Ｂ、三菱化成製）のカラムを通してＬ−ト
リプトファンの粗結晶を析出させたのち、これをアセト
ンで洗浄し乾燥してＬ−トリプトファンの結晶１６．７
ｇを得た。

【００４４】

【発明の効果】本発明の製造方法により、Ｌ−トリプト
ファンを高効率で安価に製造することが可能になる。

【００４５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２１０４鎖の数：二本鎖配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源：生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum）株名：ＭＪ−２３３配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：５５６−１８５７特徴を決定した方法：Ｅ

【００４６】配列 GGATCCCGCG ACACCAATGA CAAACGGCAC AGAGGTGGAG GGGGAAGTTC CGAGGAAGGT 60 TTCGGTGGCT GCGGTAAGTT GCTGTCGGGC CGCTACCTGG AGGTGAATCA GACGGGACAG 120 CGGAAGGTAG ACTTCTGCCA CTTCAGCGAG GTCAATGTTT TCTCCGATGC CTCGAAGTTC 180 AATGACTTCT TTTTGGGTCA GCACCTGAGG CATTGAGTTT CTCAGCTCGC GCCATTGTGC 240 GCGGTCGAAA TCAAGGTAGG GGCTGAAATC TGGTGTGCGT GGGGAAGGTT TCACACCAGT 300 TGTGCTTGCA GCGTTTTGCT CTGCCATGAA TCCATTGTGC ACCTTAGCTA CTCCATTAGT 360 GTGATCGGGG TTATTTTTTC ACTTCAATGG GTGGCTAAAA GACGTGGGCA CGTGAGTAAA 420 CTCATGCGCG CGAAACGATG GAAGTGAACC CATACTTTTA TATATGGGTA TCGGCGGTCT 480 ATGCTTGTGG GCGTACCTGT CCCGCGAGTG AGGTCTTACG CGCGGGATTC GTCTTGTGAA 540 AGGTTAGCTG ACCTG ATG ACC GAT GCC CAC CAA GCG GAC GAT GTC CGT TAC 591 Met Thr Asp Ala His Gln Ala Asp Asp Val Arg Tyr 1 5 10 CAG CCA CTG AAC GAG CTT GAA CCT GAG GTG GCT GCT GCC ATC GCT GGG 639 Gln Pro Leu Asn Glu Leu Glu Pro Glu Val Ala Ala Ala Ile Ala Gly 15 20 25 GAA CTT GCC CGT CAA CGC GAT ACA TTA GAG ATG ATC GCG TCT GAG AAC 687 Glu Leu Ala Arg Gln Arg Asp Thr Leu Glu Met Ile Ala Ser Glu Asn 30 35 40 TTC GTT CCC CGT TCT GTT TTG CAG GCG CAG GGT TCT GTT CTT ACC AAT 735 Phe Val Pro Arg Ser Val Leu Gln Ala Gln Gly Ser Val Leu Thr Asn 45 50 55 60 AAG TAT GCC GAG GGT TAC CCT GGC CGC CGT TAC TAC GGT GGT TGC GAA 783 Lys Tyr Ala Glu Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Tyr Tyr Gly Gly Cys Glu 65 70 75 CAA GTT GAC ATC ATT GAG GAT CTT GCA CGT GAT CGT GCG AAG GCT CTC 831 Gln Val Asp Ile Ile Glu Asp Leu Ala Arg Asp Arg Ala Lys Ala Leu 80 85 90 TTC GGT GCA GAG TTC GCC AAT GTT CAG CCT CAC TCC GGC GCG CAG GCT 879 Phe Gly Ala Glu Phe Ala Asn Val Gln Pro His Ser Gly Ala Gln Ala 95 100 105 AAT GCT GCT GTG CTG ATG ACT TTG GCT GAG CCA GGC GAC AAG ATC ATG 927 Asn Ala Ala Val Leu Met Thr Leu Ala Glu Pro Gly Asp Lys Ile Met 110 115 120 GGT CTG TCT TTG GCT CAT GGT GGT CAC TTG ACC CAC GGA ATG AAG TTG 975 Gly Leu Ser Leu Ala His Gly Gly His Leu Thr His Gly Met Lys Leu 125 130 135 140 AAC TTC TCC GGA AAG CTG TAC GAG GTT GTT GCG TAC GGT GTT GAT CCT 1023 Asn Phe Ser Gly Lys Leu Tyr Glu Val Val Ala Tyr Gly Val Asp Pro 145 150 155 GAG ACC ATG CGT GTT GAT ATG GAT CAG GTT CGT GAG ATT GCT CTG AAG 1071 Glu Thr Met Arg Val Asp Met Asp Gln Val Arg Glu Ile Ala Leu Lys 160 165 170 GAG CAG CCA AAG GTA ATT ATC GCT GGC TGG TCT GCA TAC CCT CGC CAC 1119 Glu Gln Pro Lys Val Ile Ile Ala Gly Trp Ser Ala Tyr Pro Arg His 175 180 185 CTT GAT TTC GAG GCT TTC CAG TCT ATT GCT GCG GAA GTT GGC GCG AAG 1167 Leu Asp Phe Glu Ala Phe Gln Ser Ile Ala Ala Glu Val Gly Ala Lys 190 195 200 CTG TGG GTC GAT ATG GCT CAC TTC GCT GGT CTT GTT GCT GCT GGT TTG 1215 Leu Trp Val Asp Met Ala His Phe Ala Gly Leu Val Ala Ala Gly Leu 205 210 215 220 CAC CCA AGC CCA GTT CCT TAC TCT GAT GTT GTT TCT TCC ACT GTC CAC 1263 His Pro Ser Pro Val Pro Tyr Ser Asp Val Val Ser Ser Thr Val His 225 230 235 AAG ACT TTG GGT GGA CCT CGT TCC GGC ATC ATT CTG GCT AAG CAG GAG 1311 Lys Thr Leu Gly Gly Pro Arg Ser Gly Ile Ile Leu Ala Lys Gln Glu 240 245 250 TAC GCG AAG AAG CTG AAC TCT TCC GTA TTC CCA GGT CAG CAG GGT GGT 1359 Tyr Ala Lys Lys Leu Asn Ser Ser Val Phe Pro Gly Gln Gln Gly Gly 255 260 265 CCT TTG ATG CAC GCA GTT GCT GCG AAG GCT ACT TCT TTG AAG ATT GCT 1407 Pro Leu Met His Ala Val Ala Ala Lys Ala Thr Ser Leu Lys Ile Ala 270 275 280 GGC AAT GAG CAG TTC CGT GAC CGT CAG GCT CGC ACG TTG GAG GGT GCT 1455 Gly Asn Glu Gln Phe Arg Asp Arg Gln Ala Arg Thr Leu Glu Gly Ala 285 290 295 300 CGC ATT CTT GCC GAG CGT CTG ACT GCT TCT GAT GCG AAG GCC GCT GGC 1503 Arg Ile Leu Ala Glu Arg Leu Thr Ala Ser Asp Ala Lys Ala Ala Gly 305 310 315 GTG GAT GTC TTG ACC GGT GGC ACT GAT GTG CAC TTG GTT TTG GCT GAT 1551 Val Asp Val Leu Thr Gly Gly Thr Asp Val His Leu Val Leu Ala Asp 320 325 330 CTG CGT AAC TCC CAG ATG GAT GGC CAA CAG GCG GAA GAT CTG CTG CAC 1599 Leu Arg Asn Ser Gln Met Asp Gly Gln Gln Ala Glu Asp Leu Leu His 335 340 345 GAG GTT GGT ATC ACT GTG AAC CGT AAC GCG GTT CCT TTC GAT CCT CGT 1647 Glu Val Gly Ile Thr Val Asn Arg Asn Ala Val Pro Phe Asp Pro Arg 350 355 360 CCA CCA ATG GTT ACT TCT GGT CTG CGT ATT GGT ACT CCT GCG CTG GCT 1695 Pro Pro Met Val Thr Ser Gly Leu Arg Ile Gly Thr Pro Ala Leu Ala 365 370 375 380 ACC CGT GGT TTC GAT ATT CCT GCA TTC ACT GAG GTT GCA GAC ATC ATC 1743 Thr Arg Gly Phe Asp Ile Pro Ala Phe Thr Glu Val Ala Asp Ile Ile 385 390 395 GGT ACT GCT TTG GCT AAT GGT AAG TCC GCA GAC ATT GAG TCC CTG CGT 1791 Gly Thr Ala Leu Ala Asn Gly Lys Ser Ala Asp Ile Glu Ser Leu Arg 400 405 410 GGC CGT GTA GCA AAG CTT GCT GCA GAT TAC CCA CTG TAT GAG GGC TTG 1839 Gly Arg Val Ala Lys Leu Ala Ala Asp Tyr Pro Leu Tyr Glu Gly Leu 415 420 425 GAA GAC TGG ACC ATC GTC TAAGCTTTTC TTTGAGTTTT CATATGTAGA 1887 Glu Asp Trp Thr Ile Val 430 434 AGGCATCGTC GGCTTCGGCC TGGCGGTGCT TTTCTCGTTG TTTTGTGGTT TTGTCAGAGG 1947 ATGTCATGCG CGTTTTAATT ATTGATAATT ATGATTCTTT CACGTTTAAT CTCGCCACCT 2007 ATGTGGAAGA GGTTACGGGT CAGGCACCTG TGGTGGTGCC TAATGATCAA GAAATAGATG 2067 AGACGCTTTT CGACGCCGTC ATCCTCTCAC CGGGCCC 2104

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱化学株式会社筑波総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】セリンヒドロキシメチルトランスフェラ
ーゼを含有する微生物菌体又はその処理物とトリプトフ
ァンシンターゼ又はトリプトファナーゼを含有する微生
物菌体又はその処理物との共存下に、グリシン、ホルム
アルデヒド及びインドールからＬ−トリプトファンを生
成せしめ、反応液よりＬ−トリプトファンを採取する製
造方法。
【請求項２】反応液中のｐＨを９〜１０に維持し、反
応液中の生成Ｌ−セリン濃度を５０ｍＭ以下に制御しな
がらＬ−トリプトファンを反応液中に連続的に生成せし
めることを特徴とする請求項１に記載の方法。