JPH0889249A - ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】コリネ型細菌由来のジヒドロキシ酸デヒドラタ
ーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。 【効果】 本発明のＤＮＡ断片は、生体内においてＬ
−イソロイシン、Ｌ−バリンの生合成に関与するジヒド
ロキシ酸デヒドラターゼをコードするコリネ型細菌由来
のＤＮＡ断片であり、これらのアミノ酸の製造に利用可
能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コリネ型細菌由来のジ
ヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．
９）をコードする遺伝子ＤＮＡに関する。ジヒドロキシ
酸デヒドラターゼは生体内においてＬ−イソロイシン、
Ｌ−バリンの生合成に関与しており、これらのアミノ酸
の製造に利用可能である。

【０００２】

【従来の技術】ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Ｅ．
Ｃ．４．２．１．９）は、イソロイシン及びバリンの生
合成遺伝子の一つとして、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてよく研究されて
おり〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２６１、２４４１〜２４５０（１
９８６）〕、その他にも、ラクトコッカス・ラクティス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）〔ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１７４、６５８０〜６５８
９（１９９２）〕、の一次構造が決定されている。しか
しながら、産業上重要な細菌であるコリネ型細菌由来の
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．
９）遺伝子の一次構造について、従来の報告例はない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、コリネ型細
菌由来のジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．
２．１．９）をコードする遺伝子の提供を目的として成
されたものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌に属
するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３染色体
よりジヒドロキシ酸デヒドラターゼ遺伝子が単離可能で
あることを見出し、本発明を完成するに至った。かくし
て、本発明によれば、コリネ型細菌由来のジヒドロキシ
酸デヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ断片が提供
される。

【０００５】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明の「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片」とは、２，３−ジヒドロ
キシ−３−メチル吉草酸から２−ケト−３−メチル吉草
酸を合成する酵素、あるいは、２，３−ジヒドロキシイ
ソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸を合成する酵素、すな
わちジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．
１．９）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を意味す
る。

【０００６】ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ断片」と
略称することがある）は、その塩基配列が決定された後
は合成することも可能であるが、一般にはジヒドロキシ
酸デヒドラターゼ生産性を有する微生物からクローニン
グすることができ、その供給源となる微生物としては、
コリネ型細菌、殊にブレビバクテリウム・フラバム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２
３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）およびその由来株が
有利に使用される。

【０００７】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本的操作の一例を述べれば次のとおりであ
る：Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）株の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限
酵素で切断することにより生ずる切断断片の中から以下
に述べる方法で分離、取得することができる。

【０００８】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＫｐｎＩを用い
て染色体ＤＮＡを完全に分解する。得られるＤＮＡ断片
を、大腸菌における発現ベクター、例えばｐＵＣ１１８
（宝酒造製）に挿入し、このベクターを用いてジヒドロ
キシ酸デヒドラターゼ遺伝子が欠損したイソロイシン及
びバリン要求性大腸菌変異株エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＥ５３６１〔国立遺
伝学研究所、遺伝実験生物保存研究センター；〒４１
１、静岡県三島市谷田１１１１番地保存株であり、同研
究所より入手可能。〕を形質転換し、選択培地に塗抹す
ることにより、形質転換株を取得する。得られる形質転
換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で解析す
ることにより挿入されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３株染色体由来のＡ断片を確認・取得するこ
とができる。

【０００９】かくして得られるＡ断片をさらに適当な制
限酵素を用いて切断し、得られるＤＮＡ断片を、大腸菌
で複製可能なベクターブラスミドに挿入し、このベクタ
ープラスミドを通常用いられる形質転換法、例えば、塩
化カルシウム法、電気パルス法等による形質転換により
前記イソロイシン及びバリン要求性大腸菌変異株に導入
し、選択培地に塗抹する。

【００１０】得られる形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより、挿入された
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由
来のＡ断片を確認・取得することができる。このように
して得られるＡ断片の一つは、上記ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｋ
ｐｎＩで切断することによって得られる大きさが約６．
０ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。

【００１１】この約６．０ｋｂのジヒドロキシ酸デヒド
ラターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、各種
の制限酵素で切断したときの認識部位数及び切断断片の
大きさを下記第１表に示す。また該ＤＮＡ断片の制限酵
素切断点地図を図１に示す。

【００１２】

【表１】 第１表 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ ２ １．７、２．０、２．３ ＢａｍＨＩ ０ ６．０ ＰｓｔＩ １ ５．０、１．０

【００１３】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。

【００１４】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λ ｐｈａ
ｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断して
得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル
上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェ
リヒア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ
１７４ ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ ＩＩ
Ｉで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポ
リアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線
に基づき、切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断
片の大きさを算出する。プラスミドの大きさは、切断断
片それぞれの大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ
断片の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大き
さについては、１％アガロースゲル電気泳動によって得
られる結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断
片の大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって得られる結果を採用した。

【００１５】一方、上記したブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩに
よって切断することにより得られる大きさが約６．０ｋ
ｂのＤＮＡ断片については、その塩基配列をプラスミド
ｐＵＣ１１８及び／またはｐＵＣ１１９（宝酒造製）を
用いるジデオキシヌクレオチド酵素法〔ｄｉｄｅｏｘｙ
ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法、Ｓａｎｇｅ
ｒ、Ｆ．ｅｔ．ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３（１９７７）〕に
より決定することができる。このようにして決定した上
記約６．０ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列のオープンリー
ディングフレームの存在から決定したジヒドロキシ酸デ
ヒドラターゼをコードする遺伝子は、後記する配列表の
配列番号：１に記載の配列を有するものであり、６１２
個のアミノ酸をコードする１８３６塩基対から構成され
ている。

【００１６】上記した、後記配列表の配列番号：１に記
載の塩基配列を包含して成る本発明のジヒドロキシ酸デ
ヒドラターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、
天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたものの
みならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプ
ライド・バイオシステムズ社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシ
ンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。

【００１７】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のＤＮＡ断片は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコ
ードする機能を実質的に損なうことがない限り、塩基配
列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく又は
削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されて
いてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されているも
のであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発
明のジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子
を含むＤＮＡ断片に包含されるものである。

【００１８】本発明のジヒドロキシ酸デヒドラターゼを
コードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）は、適当
なプラスミドベクター、例えば、コリネ型細菌内でプラ
スミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少くとも含むプラ
スミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内
でジヒドロキシ酸デヒドラターゼの高発現可能な組換え
プラスミドを得ることができる。

【００１９】また、本発明のジヒドロキシ酸デヒドラタ
ーゼをコードする遺伝子を発現させるためのプロモータ
ーは、コリネ型細菌が保有する該遺伝子自身のプロモー
ターであることができるが、それに限られるものではな
く、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ遺伝子の転写を開始
させるための原核生物由来の塩基配列であれば、いかな
るプロモーターであってもよい。

【００２０】本発明のＡ断片を導入することができる、
コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少くと
も含むプラスミドベクターとしては、例えば、特開平３
−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３
０；特開平２−２７６５７５号公報に記載のプラスミド
ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣ
ＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平
１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２
及びｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載
のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載
のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に
記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４
４；特開昭５７−１３４５００号に記載のｐＣＧ１；特
開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭
５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ
１１等を挙げることができる。

【００２１】中でもコリネ型細菌の宿主ベクター系で用
いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内
でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細
菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を有するも
のが好ましく、例えばプラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲ
Ｙ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２
ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３Ｋ
Ｘ等が好適に使用される。

【００２２】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉ
ｓ）ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）か
らプラスミドｐＢＹ５０３（このプラスミドの詳細につ
いては特開平１−９５７８５号公報参照）ＤＮＡを抽出
し、制限酵素ＸｈｏＩで大きさが約４．０ｋｂのプラス
ミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片（以
下これを「複製領域」と言うことがある。）を切り出
し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約
２．１ｋｂのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含
むＤＮＡ断片（以下これを「安定化領域」と言うことが
ある。）を切り出す。これらの両断片をプラスミドｐＨ
ＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位及
びＳａｌＩ部位に組み込むことにより、プラスミドベク
ターｐＣＲＹ３０を調製することができる。

【００２３】次に、上記プラスミドベクターへの本発明
のＡ断片の導入は、例えば、プラスミドベクター中に１
個所だけ存在する制限酵素部位を該制限酵素で開裂し、
前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを、必要
に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とするか
または適当なアダプターＤＮＡの存在下に、ＤＮＡリガ
ーゼ処理で連結させることにより行うことができる。

【００２４】プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のＡ断
片の導入は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素Ｋｐｎ
Ｉで開裂させ、そこに前記ジヒドロキシ酸デヒドラター
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）をＤ
ＮＡリガーゼで連結させることにより行うことができ
る。このようにして造成されるプラスミドｐＣＲＹ３０
に本発明の大きさが約６．０ｋｂのＡ断片を導入した組
換えプラスミドを、本発明者らはプラスミドｐＣＲＹ３
０−ＤＨと命名した。プラスミドｐＣＲＹ３０−ＤＨの
作製方法の詳細については、後記実施例で説明する。

【００２５】かくして造成されるジヒドロキシ酸デヒド
ラターゼをコードする遺伝子を含むコリネ型細菌内で複
製増殖可能なプラスミドを、宿主微生物に導入して該微
生物の培養物を用いてＬ−イソロイシン又はＬ−バリン
を安定に効率よく生産することが可能となる。本発明に
よるプラスミドで形質転換しうる宿主微生物としては、
コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、ブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５０
０）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−Ａ
ＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９）等が挙げられ
る。

【００２６】なお、上記のＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８の
菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株として
ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
ール資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公
報第３〜４蘭参照）。また、ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００
の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株とし
たＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株
である（特開昭６２−５１９９８号公報参照）。さら
に、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲＭＢＰ−
１４９７の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナーゼ高活性変異株である（特開昭６１−１７７９９３
号公報参照）。

【００２７】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同Ａ
ＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６；ブレビバク
テリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０；ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）Ａ
ＴＣＣ１３８６９；コリネバクテリウム・グルタミカム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用いる
こともできる。

【００２８】なお、宿主としてブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７
８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
ｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
〔Ｂａｃｔ．Ｒｅｖ．、３６、３６１〜４０５（１９７
２）参照〕。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的に除
去する方法の一例を示せば次のとおりである。

【００２９】宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムブロミド（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら、約２４時間約３３℃で培
養する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３３℃で
約２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラ
スミド抽出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去
されている株を選択する。この操作によりプラスミドｐ
ＢＹ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来菌株が得られる。

【００３０】上記宿主微生物の前記組換えプラスミドに
よる形質転換は、それ自体既知の方法、例えばＣａｌｖ
ｉｎ、Ｎ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｎａｗａｌｔ、Ｐ．Ｃ．，
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１
７０、２７９６（１９８８）；Ｉｔｏ、Ｋ．、Ｎｉｓｈ
ｉｄａ、Ｔ．ａｎｄ Ｉｚａｋｉ．Ｋ．、Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、５２、２９３（１９８８）等の文献に記
載の方法により、例えば宿主微生物にパルス波を通電
〔Ｓａｔｏｈ、Ｙ．ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ、５、１５９（１９９０）参照〕することにより行う
ことができる。

【００３１】上記の方法で形質転換して得られるジヒド
ロキシ酸デヒドラターゼ産生能を有するコリネ型細菌、
例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来
株の培養方法を以下に述べる。培養は炭素源、窒素源、
無機塩等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素
源としては、例えばグルコース、エタノール、メタノー
ル、廃糖蜜等が、そして窒素源としては、例えばアンモ
ニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アン
モニウム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用い
られる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カ
リウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が
用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン等
の各種ビタミン等の栄養源を培地に添加することができ
る。

【００３２】培養は、通常、通気攪拌、振盪等の好気条
件下に、約２０〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３
５℃の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜
１０、好ましくは７〜８付近とすることができ、培養中
のｐＨ調整は酸又はアルカリを添加して行うことができ
る。培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１〜５容量
％、更に好ましくは２〜３容量％である。また、培養期
間は通常１〜７日間とすることができ、最高期間は３日
間である。

【００３３】このようにして得られる培養物から各々菌
体を集めて、水又は適当な緩衝液で洗浄し、Ｌ−イソロ
イシン又はＬ−バリン生成反応に使用することができ
る。Ｌ−イソロイシン又はＬ−バリン生成反応において
は、これらの菌体をそのまま用いることができ、あるい
は超音波処理等を加えた菌体破砕物又はそれから分離さ
れた粗酵素もしくは精製酵素として、あるいは適当な担
体に固定化して用いることができる。以上に述べた如き
菌体の破砕物、粗もしくは精製酵素、固定化物等を本明
細書ではまとめて「菌体処理物」という。

【００３４】しかして本発明に従えば、上記培養菌体又
は菌体処理物の存在下に、少くとも炭素源と窒素源を含
有する水性反応液中にて酵素反応させてＬ−イソロイシ
ン又はＬ−バリンを生成せしめることを特徴とするＬ−
イソロイシン又はＬ−バリンの製造法が提供される。上
記の酵素反応は、通常約２０〜約４０℃、好ましくは約
２５〜約３５℃の範囲内で行うことができる。

【００３５】水性反応液中に添加することができる炭素
源、窒素源は、前記した通常の栄養培地に用いられるも
のを挙げることができる。また該水性反応液には、前記
した通常の栄養培地に用いることができる無機塩等を添
加することもできる。特に、本発明のプラスミドで形質
転換しうる宿主微生物がビオチン要求性のコリネ型細菌
である場合は、上記の如く調製された培養菌体またはそ
の固定化物と、少なくとも炭素源と窒素源とを含有しか
つビオチンを含有しない水性反応液中で、酵素反応させ
てＬ−イソロイシン又はＬ−バリンを生成せしめるのが
好適である。この場合、ビオチン要求性のコリネ型細菌
はビオチンを実質的に含有しない水性反応液中では菌体
増殖せずに、該菌体の保有する代謝系において炭素源及
び窒素源がエネルギー共役を伴う酵素反応を介して反応
せしめられ、Ｌ−イソロイシン又はＬ−バリンが製造さ
れる。

【００３６】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。

【００３７】実施例１ ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来のジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）のクローン
化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＨＮ₄ ）₂ ＳＯ
₄ ７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄
０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂
Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、酵母
エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留
水１リットル〕１リットルに、ブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対
数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体
を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ
ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ−２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプ
ロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよ
うに添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル
硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加
し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、
等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で
１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，
０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を
分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加し
た後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層と
エタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきと
り、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られ
たＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静
置し、以後の実験に用いた。

【００３８】（Ｂ）組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＫｐｎＩ
５０ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１時間反応させ完全
分解した。このＫｐｎＩ分解ＤＮＡを、クローニングベ
クターｐＵＣ１１８（宝酒造より市販）を制限酵素Ｋｐ
ｎＩで切断したものと混合し、５０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 及びＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終
濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。

【００３９】（Ｃ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドの選択 上記遺伝子の選択は、前記大腸菌変異株エシェリヒア・
コリＭＥ５３６１を用いて行った。上記（Ｂ）項で得ら
れたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、５３、１５９（１９７０）〕により前記エシェリヒ
ア・コリＭＥ５３６１を形質転換し、アンピシリン５０
ｍｇを含む選択培地〔Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ
₄ ２ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７
Ｈ₂ Ｏ ０．１ｇ、グルコース２０ｇ、ロイシン２０ｍ
ｇ、チアミン１ｍｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リットル
に溶解〕に塗抹した。

【００４０】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素ＫｐｎＩにより切断し、アガロースゲル電
気泳動を用いて調べたところ、プラスミドｐＵＣ１１８
の長さ３．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約６．０ｋ
ｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。該ＤＮＡ断片を各種
の制限酵素で切断したときの制限酵素認識部位数及び切
断断片の大きさは前記第１表に示したとおりであった。
このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に示す。

【００４１】実施例２ ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ
をコードする遺伝子の塩基配列の決定 実施例１の（Ｃ）項で得られたジヒドロキシ酸デヒドラ
ターゼをコードする遺伝子を含む長さ約６．０ｋｂのＤ
ＮＡ断片について、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１
１８及びｐＵＣ１１９を用いるジデオキシヌクレオチド
酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ法）〔Ｓａｈｇｅｒ、Ｆ．ｅｔａｌ．、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４、５４６
３（１９７７）〕により図１に示した戦略図に従って決
定した。

【００４２】その塩基配列中のオープンリーディングフ
レームの存在から、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコ
ードする遺伝子は、後記配列表の配列番号：１に示す塩
基配列を有する６１２個のアミノ酸をコードする１８３
６の塩基対より構成されていた。

【００４３】実施例３ コリネ型細菌内で複製し安定な
プラスミドベクターｐＣＲＹ３０の作製 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。

【００４４】半合成培地Ａ培地〔尿素２ｇ、（ＮＨ₄ ）
₂ ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ
₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７
Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、
酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビチオン２００
μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ及び
蒸留水１リットル〕１リットルに、ブレビバクテリウム
・スタチオニスＩＦＯ１２１４４を対数増殖期後期まで
培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌ
の濃度にリゾチームを含む緩衝液〔２５ｍＭトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン、１０ｍＭのＥＤＴＡ、
５０ｍＭグルコース〕２０ｍｌに懸濁し、３７℃で１時
間反応させた。反応液にアルカリ−ＳＤＳ液〔０．２Ｎ
ＮａＯＨ、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ〕４０ｍｌを添加
し、緩やかに混和して室温にて１５分間静置した。次
に、この反応液に酢酸カリウム溶液〔５Ｍ酢酸カリウム
溶液６０ｍｌ、酢酸１１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌ
の混合液〕３０ｍｌを添加し、充分混和してから氷水中
に１５分間静置した。

【００４５】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノ
ール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸濁した
後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇ
の遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍量のエ
タノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃で１０
分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収
した。

【００４６】沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液〔トリス１
０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８．０に調
製〕２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液〔５
倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液〕１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１．３９２ｇ／
ｍｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６，０００×ｇの遠心分離を行った。

【００４７】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。次いでこ
の分画液を等量のイソアミルアルコールで４回処理して
エチジウムブロマイドを抽出除去し、その後にＴＥ緩衝
液に対して透析を行った。このようにして得られたプラ
スミドｐＢＹ５０３を含む透析液に３Ｍ酢酸ナトリウム
溶液を最終濃度３０ｍＭに添加した後、２倍量エタノー
ルを加え、−２０℃１時間静置した。この溶液を１５，
０００×ｇの遠心分離にかけてＤＮＡを沈降させ、プラ
ミスドｐＢＹ５０３を５０μｇ得た。

【００４８】（Ｂ）プラスミドベクターｐＣＲＹ３０の
作製 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０．５μｇに制
限酵素ＳａｌＩ（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃１時間反応さ
せ、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。前記（Ａ）項
で調製したプラスミドｐＢＹ５０３の２μｇに制限酵素
ＸｈｏＩ（１ｕｎｉｔ）を３７℃で３０分間反応させ、
プラスミドＤＮＡを部分分解した。

【００４９】両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、
制限酵素を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処
理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５
０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及
びＴ４ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分
を強化し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用い
てエシェリヒア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝
酒造製）を形質転換した。

【００５０】形質転換株は３０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び蒸留水１リットル、ｐ
Ｈ７．２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として
得られた。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育
してきたものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−Ｓ
ＤＳ法〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏ
ｌｏｎｉｎｇ、９０〜９１（１９８２）参照〕により抽
出した。

【００５１】その結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８のＳ
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４．０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒ
ｉが得られた。次に同様の方法を用い、前記（Ａ）項で
得られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐ
ｎＩ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２．１ｋｂ
のＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉ
のＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラ
スミドベクターｐＣＲＹ３０を調製した。

【００５２】実施例４ プラスミドｐＣＲＹ３０−ＤＨ
の作製及びコリネ型細菌への導入 実施例１の（Ｃ）項で得られたジヒドロキシ酸デヒドラ
ターゼをコードする遺伝子を含むプラスミド５μｇを制
限酵素ＫｐｎＩを５ｕｎｉｔｓ用い、３７℃で１時間反
応させ分解したものと、実施例３の（Ｂ）項で得られた
プラスミドｐＣＲＹ３０ １μｇを制限酵素ＫｐｎＩＩ
１ｕｎｉｔを用い、３７℃で１時間反応させ分解した
ものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂ およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔ
の各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、
１２℃で１５時間反応させ結合させた。このプラスミド
を用いて、前記方法に従い前記エシェリヒア・コリＭＥ
５３６１株を形質転換し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ
を含む選択培地〔Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄
２ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂
Ｏ ０．１ｇ、グルコース２０ｇ、ロイシン２０ｍｇ、
チアミン１ｍｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リットルに溶
解〕に塗抹した。

【００５３】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ
８．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ６．０ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片が認められた。

【００５４】上記の如く調製されたプラスミドＤＮＡ
を、コリネ型細菌へ形質転換した。形質転換は、電気パ
ルス法を用いて次のとおり行った。ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）
プラスミドｐＢＹ５０２除去株を１００ｍｌの前記Ａ培
地で対数増殖初期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニッ
ト／ｍｌになるように添加して、さらに２時間振盪培養
し、遠心分離により菌体を集め、菌体を２０ｍｌのパル
ス用溶液（２７２ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、７ｍＭ ＫＨ
₂ ＰＯ₄ 、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ；ｐＨ７．４）にて洗浄
した。さらに菌体を遠心分離して集め、５ｍｌのパルス
用溶液に懸濁し、０．７５ｍｌの細胞と、前記で得られ
たプラスミドＤＮＡ溶液５０μｌとを混合し、水中にて
２０分間静置した。ジーンパルサー（バイオラド社製）
を用いて、２５００ボルト、２５μＦＤに設定し、パル
スを印加後氷中に２０分間静置した。全量を３ｍｌの前
記Ａ培地に移し３０℃にて１時間培養後、カナマイシン
１５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植
菌し３０℃で２〜３日間培養した。出現したカナマイシ
ン耐性株より、前記実施例３（Ａ）項に記載の方法を用
いてプラスミドを得た。このプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の第２表に示す。

【００５５】

【表２】 第２表 プラスミドｐＣＲＹ３０−ＤＨ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ ３ ８．２、４．４、２．０ ＢａｍＨＩ １ １４．６ ＫｐｎＩ ２ ８．６、６．０ 上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＣＲ
Ｙ３０−ＤＨと命名した。

【００５６】実施例５ イソロイシン生成の確認 実施例４で作製したプラスミドｐＣＲＹ３０−ＤＨで形
質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３株を、白金耳にて１０ｍｌの前記Ａ培地（但し、グル
コースの代わりに２％エタノールを添加）に植菌し、３
０〜３３℃で１２〜１６時間振盪培養（前培養）した。
次にＡ培地（但し、グルコースの代わりに２％エタノー
ルを添加）１００ｍｌに前培養液を２％植菌し、３３℃
で１６時間振盪して対数増殖後期まで培養した。この培
養液を遠心分離（３、５００×ｇ、１５分間）し、菌体
を集めた後、下記反応液で１回洗浄した。

【００５７】得られた菌体を０．５ｇ／ｍｌの濃度にな
るよう下記反応液に懸濁し、菌体と同量のグラスビーズ
を添加し氷水中で超音波処理（ｐｏｗｅｒ６、５０％パ
ルス２．５ｍｉｎ×４回）して細胞を破砕した。この細
胞破砕物を遠心分離（８０００ｒｐｍ ６０分間）し、
上清を粗酵素液液とした。該粗酵素液５００μｌと下記
の組成の反応液５００μｌを混合し、３３℃で２．５時
間酵素反応を行った。

【００５８】

【表３】 第３表 反応液 １００ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２） １００ｍＭ ピルビン酸ナトリウム ５０ｍＭ α−ケト酪酸 １００ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム １００ｍＭ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 ２３ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム ０．２ｍＭ チアミン二リン酸 １０ｍｇ／ｌ フラビンアデニンジヌクレオチド ０．２５ｍＭ ピリドキサール５’−リン酸 １０ｍＭ 塩化マグネシウム

【００５９】２．５時間後、１００℃２ｍｉｎの熱処理
により反応を停止させた後反応液を遠心分離（１２，０
００×ｇ １５分間）し、上清中のイソロイシン生成量
を薄層クロマトグラフィーにて測定した。同様にして、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３野性株につ
いてもイソロイシン生成量を測定した。その結果を第４
表に記載する。

【００６０】

【表４】第４表 イソロイシン生成量 形質転換株 ２０ｍＭ 野性株 １０ｍＭ

【００６１】

【発明の効果】本発明により提供されるジヒドロキシ酸
デヒドラターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を
用いて、コリネ型細菌を育種改良することにより、ジヒ
ドロキシ酸デヒドラターゼ高産生株あるいはイソロイシ
ン、バリン高産生株の取得が可能となる。

【００６２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１８３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム 株名：ＭＪ−２３３ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１−１８３６ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG ATC CCA CTT CGT TCA AAA GTC ACC ACC GTC GGT CGC AAT GCA GCT 48 Met Ile Pro Leu Arg Ser Lys Val Thr Thr Val Gly Arg Asn Ala Ala 1 5 10 15 GGC GCT CGC GCC CTT TGG CGT GCC ACC GGC ACA AAG GAA AAT GAG TTC 96 Gly Ala Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Thr Lys Glu Asn Glu Phe 20 25 30 GGC AAG CCA ATT GTT GCC ATC GTG AAC TCC TAC ACC CAG TTC GTG CCC 144 Gly Lys Pro Ile Val Ala Ile Val Asn Ser Tyr Thr Gln Phe Val Pro 35 40 45 GGA CAC GTT CAC CTT AAG AAC GTC GGC GAT ATT GTG GCA GAT GCA GTG 192 Gly His Val His Leu Lys Asn Val Gly Asp Ile Val Ala Asp Ala Val 50 55 60 CGC AAA GCC GGT GGC GTT CCA AAA GAA TTC AAC ACC ATC GCC GTC GAT 240 Arg Lys Ala Gly Gly Val Pro Lys Glu Phe Asn Thr Ile Ala Val Asp 65 70 75 80 GAC GGC ATC GCC ATG GGA CAC GGC GGC ATG CTG TAC TCC CTG CCA TCC 288 Asp Gly Ile Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser 85 90 95 CGT GAA ATC ATC GCC GAC TCC GTC GAA TAC ATG GTC AAC GCA CAC ACC 336 Arg Glu Ile Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Thr 100 105 110 GCC GAC GCC ATG GTG TGT ATC TCC AAC TGT GAC AAG ATC ACC CCA GGC 384 Ala Asp Ala Met Val Cys Ile Ser Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly 115 120 125 ATG CTC AAC GCA GCA ATG CGC CTG AAC ATC CCA GTG GTC TTC GTT TCC 432 Met Leu Asn Ala Ala Met Arg Leu Asn Ile Pro Val Val Phe Val Ser 130 135 140 GGT GGC CCA ATG GAA GCT GGC AAG GCT GTC GTC GTT GAC GGC GTT GCA 480 Gly Gly Pro Met Glu Ala Gly Lys Ala Val Val Val Asp Gly Val Ala 145 150 155 160 CAC GCA CCA ACC GAC CTC ATC ACC GCG ATC TCC GCA TCC GCA AGC GAT 528 His Ala Pro Thr Asp Leu Ile Thr Ala Ile Ser Ala Ser Ala Ser Asp 165 170 175 GCA GTC GAC GAC GCA GGC CTT GCA GCC GTT GAA GCA TCC GCA TGC CCA 576 Ala Val Asp Asp Ala Gly Leu Ala Ala Val Glu Ala Ser Ala Cys Pro 180 185 190 ACC TGT GGC TCC TGC TCC GGT ATG TTC ACC GCG AAC TCC ATG AAC TGC 624 Thr Cys Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys 195 200 205 CTC ACC GAA GCT CTG GGA CTT TCT CTC CCA GGC AAC GGC TCC ACC CTG 672 Leu Thr Glu Ala Leu Gly Leu Ser Leu Pro Gly Asn Gly Ser Thr Leu 210 215 220 GCA ACC CAC GCA GCA CGT CGC GCA CTG TTT GAA AAG GCC GGC GAA ACC 720 Ala Thr His Ala Ala Arg Arg Ala Leu Phe Glu Lys Ala Gly Glu Thr 225 230 235 240 GTC GTT GAA CTG TGC CGC CGC TAC TAC GGT GAA GAA GAC GAA TCC GTT 768 Val Val Glu Leu Cys Arg Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Val 245 250 255 CTG CCA CGT GGC ATT GCC ACC AAG AAG GCA TTC GAA AAC GCA ATG GCA 816 Leu Pro Arg Gly Ile Ala Thr Lys Lys Ala Phe Glu Asn Ala Met Ala 260 265 270 CTG GAT ATG GCC ATG GGT GGA TCC ACC AAC ACC ATC CTC CAC ATC CTC 864 Leu Asp Met Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Ile Leu His Ile Leu 275 280 285 GCA GCT GCC CAG GAA GGC GAA GTT GAC TTC GAC CTC GCA GAC ATC GAC 912 Ala Ala Ala Gln Glu Gly Glu Val Asp Phe Asp Leu Ala Asp Ile Asp 290 295 300 GAA CTG TCC AAA AAC GTC CCC TGC CTG TCC AAG GTT GCA CCA AAC TCC 960 Glu Leu Ser Lys Asn Val Pro Cys Leu Ser Lys Val Ala Pro Asn Ser 305 310 315 320 GAC TAC CAC ATG GAA GAC GTC CAC CGC GCC GGT GGC ATT CCA GCA CTG 1008 Asp Tyr His Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Gly Ile Pro Ala Leu 325 330 335 CTC GGC GAG CTC AAC CGC GGT GGC CTG CTG AAT AAG GAC GTC CAC TCC 1056 Leu Gly Glu Leu Asn Arg Gly Gly Leu Leu Asn Lys Asp Val His Ser 340 345 350 GTT CAC TCC AAC GAC CTT GAA GGT TGG TTG GAT GAC TGG GAT ATC CGC 1104 Val His Ser Asn Asp Leu Glu Gly Trp Leu Asp Asp Trp Asp Ile Arg 355 360 365 TCT GGC AAG ACC ACC GAA GTA GCA ACC GAA CTC TTC CAC GCA GCC CCA 1152 Ser Gly Lys Thr Thr Glu Val Ala Thr Glu Leu Phe His Ala Ala Pro 370 375 380 GGT GGC ATC CGC ACC ACC GAA GCA TTC TCC ACC GAG AAC CGC TGG GAC 1200 Gly Gly Ile Arg Thr Thr Glu Ala Phe Ser Thr Glu Asn Arg Trp Asp 385 390 395 400 GAA CTC GAC ACC GAC GCT GCC AAG GGC TGC ATC CGC GAC GTT GAA CAC 1248 Glu Leu Asp Thr Asp Ala Ala Lys Gly Cys Ile Arg Asp Val Glu His 405 410 415 GCC TAC ACC GAC GGC GGC CTG GTT GTT CTT CGC GGC AAC ATC TCC CCT 1296 Ala Tyr Thr Asp Gly Gly Leu Val Val Leu Arg Gly Asn Ile Ser Pro 420 425 430 GAC GGC GCA GTG ATC AAG TCC GCA GGT ATC GAA GAA GAG CTG TGG AAC 1344 Asp Gly Ala Val Ile Lys Ser Ala Gly Ile Glu Glu Glu Leu Trp Asn 435 440 445 TTC ACC GGA CCA GCA CGA GTT GTC GAA AGC CAG GAA GAG GCA GTC TCT 1392 Phe Thr Gly Pro Ala Arg Val Val Glu Ser Gln Glu Glu Ala Val Ser 450 455 460 GTC ATC CTG ACC AAG ACC ATC CAA GCT GGC GAA GTT CTG GTC GTC CGC 1440 Val Ile Leu Thr Lys Thr Ile Gln Ala Gly Glu Val Leu Val Val Arg 465 470 475 480 TAC GAA GGC CCA TCA GGT GGA CCA GGC ATG CAG GAA ATG CTT CAC CCA 1488 Tyr Glu Gly Pro Ser Gly Gly Pro Gly Met Gln Glu Met Leu His Pro 485 490 495 ACC GCA TTC CTC AAG GGA TCC GGC CTG GGC AAG AAG TGT GCA CTG ATC 1536 Thr Ala Phe Leu Lys Gly Ser Gly Leu Gly Lys Lys Cys Ala Leu Ile 500 505 510 ACC GAC GGC CGT TTC TCC GGA GGT TCC TCA GGA CTG TCC ATC GGC CAC 1584 Thr Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ser Ile Gly His 515 520 525 GTC TCC CCA GAA GCA GCA CAC GGC GGA GTC ATT GGT CTG ATC GAA AAC 1632 Val Ser Pro Glu Ala Ala His Gly Gly Val Ile Gly Leu Ile Glu Asn 530 535 540 GGC GAC ATC GTT TCC ATC GAC GTT CAC AAC CGC AAG CTC GAA GTT CAG 1680 Gly Asp Ile Val Ser Ile Asp Val His Asn Arg Lys Leu Glu Val Gln 545 550 555 560 GTC TCC AAC GAG GAA CTC CAG CGC CGC CGC GAC GCT ATG AAC GCC TCC 1728 Val Ser Asn Glu Glu Leu Gln Arg Arg Arg Asp Ala Met Asn Ala Ser 565 570 575 GAG AAG CCA TGG CAG CCA GTC AAC CGT AAC CGC GTT GTC ACC AAG GCA 1776 Glu Lys Pro Trp Gln Pro Val Asn Arg Asn Arg Val Val Thr Lys Ala 580 585 590 CTG CGC GCA TAC GCA AAG ATG GCT ACC TCC GCT GAT AAG GGT GCA GTC 1824 Leu Arg Ala Tyr Ala Lys Met Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala Val 595 600 605 CGT CAG GTC GAC 1836 Arg Gln Val Asp 610 612

【００６３】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の大きさが約６．０ｋｂのジヒドロキシ
酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を含む１ＮＡ断片
（Ａ断片）の制限酵素切断点地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コリネ型細菌由来のジヒドロキシ酸デヒ
   ドラターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フ
   ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕ
   ｍ）ＭＪ−２３３である請求項１記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 両端にＫｐｎＩサイトを有し、大きさが
   ６．０ｋｂであり、下記表に記載する制限酵素で切断し
   た場合、下記表に記載する認識部位数と切断断片の大き
   さを示す請求項２記載のＤＮＡ断片。 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ ２ １．７、２．０、２．３ ＢａｍＨＩ ０ ６．０ ＰｓｔＩ １ ５．０、１．０
4. 【請求項４】 配列表１に示されるアミノ酸配列で表さ
   れるジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子
   を含むＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 配列表１に示されるＤＮＡ配列で表され
   るジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を
   含むＤＮＡ断片。