JPH05284970A - ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
からジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、この遺伝子の塩基配
列を決定した。 【効果】 このジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子ＤＮＡを導入したコリネ型細菌内で複
製増殖可能なプラスミドで形質転換されたブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ２３３−ｄａｐＹのＬ−リジン産
生能は著しく増加した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ジアミノピメリン酸デ
ヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．１６．）をコー
ドする遺伝子を含むブレビバクテリウム属細菌由来の遺
伝子ＤＮＡ、該遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラスミド、
該プラスミドで形質転換されたコリネ型細菌、及び該コ
リネ型細菌を用いるＬ−リジンの製造法に関する。

【０００２】Ｌ−リジンは、必須アミノ酸として蛋白質
中にその存在が知られ、医薬や食品添加物として用いら
れている。

【０００３】

【従来の技術】従来、Ｌ−リジンの工業的製造法として
は、グルタミン生産菌であるコリネ型細菌の各種栄養要
求株、各種製剤耐性株、各種薬剤感受性株を用いてＬ−
リジンを製造する方法が知られている（例えば、特公昭
５１−２１０７８号公報、特公昭５３−１８３３号公
報、特公昭６２−８６９２号公報等参照）。また、組換
え菌を用いた製造法も提案されている（特開昭５６−１
６０９９７号公報、特開昭６０−６２９９４号公報、特
開昭６２−７９７８８号公報等参照）。しかしながら、
従来提案されている方法によるＬ−リジンの製造法で
は、対糖収率が低く及び／又はＬ−リジンの蓄積に限界
があり、新たな観点から、遺伝子工学的手法による菌株
の改良等を含め、Ｌ−リジンをより効率的に生成させる
方法の提供が強く求められている。

【０００４】一方、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．１６．）をコードする遺伝子
としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由
来のものが知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５，ｐ３９１７，１９８７参
照）。しかしながら、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のジアミノピメリン酸デヒ
ドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．１６．）をコード
する遺伝子については従来の報告例は見当らない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ブレ
ビバクテリウム属細菌由来のジアミノピメリン酸デヒド
ロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．１６．）をコードす
る遺伝子を単離し、該遺伝子を同種であるブレビバクテ
リウム属細菌に導入し、該ブレビバクテリウム属細菌を
用いて、新たな観点から効率的にＬ−リジンを製造する
ことである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ブレビバクテリウ
ム属細菌染色体よりジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子を単離し、該遺伝子を適当なベクタープラスミ
ドに導入して、コリネ型細菌を形質転換し、該形質転換
されたコリネ型細菌を用いると、効率的にＬ−リジンを
製造しうることを見い出し本発明を完成するに至った。

【０００７】かくして本発明によれば （１）ブレビバクテリウム属細菌由来のジアミノピメリ
ン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ＤＮＡ； （２）該遺伝子ＤＮＡが導入された組換えプラスミド； （３）該組換えプラスミドで形質転換されたコリネ型細
菌；及び （４）該形質転換されたコリネ型細菌を用い、グルコー
スを原料としてＬ−リジンを製造する方法が提供され
る。

【０００８】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明の「ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子ＤＮＡ」とは、ジアミノピメリン酸よ
りアンモニアを解離させ水を付加する酵素、すなわちジ
アミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．
１．１６．）をコードする遺伝子ＤＮＡを意味するもの
である。

【０００９】ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ断
片」と略称することがある）は、その塩基配列が決定さ
れた後においては合成することも可能であるが、通常は
ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ生産性微生物から
クローニングされる場合が多く、その供給源となる微生
物としては、ブレビバクテリウム属細菌、殊にブレビバ
クテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）およびその由来株が有利に使用される。

【００１０】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本的操作の一例を述べれば次のとおりであ
る：Ａ断片は、上記ブレビバクテリウム属細菌、例えば
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）株の染色体上に存在し、この染色体
を適当な制限酵素で切断することにより生ずる切断断片
の中から以下に述べる方法で分離、取得することができ
る。

【００１１】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＫｐｎＩ，Ｘｈ
ｏＩを用いて染色体ＤＮＡを完全に分解する。得られる
ＤＮＡ断片をクローニングベクター、例えばｐＨＳＧ３
９９（宝酒造製）に挿入し、このベクターを用いて、サ
クシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ
遺伝子が欠損したＬ−リジン要求性大腸菌（エシェリヒ
ア・コリ）変異株ＣＧＳＣ４５４５〔エシェリヒア・コ
リ ジエネテック・ストックセンター（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＳｔｏｃｋＣｅ
ｎｔｅｒ）、デパートメントオブバイオロジー、エール
ユニバーシィティ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｐ．
Ｏ．Ｂｏｘ６６６６ Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ ０６
５１１−７４４、Ｕ．Ｓ．Ａ．保存菌株〕を形質転換
し、選択培地に塗抹することにより、形質転換株を取得
する。さらに形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出
し、サクシニルジアミノピメリン酸アシラーゼ遺伝子が
欠損したＬ−リジン要求性大腸菌変異株ＣＧＳＣ４５５
８〔エシェリヒア・コリ ジエネテック・ストック セ
ンター（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、デパートメント
オブバイオロジー、エールユニバーシィティ（Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｙａｌｅ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ６６６６ Ｎｅｗ
Ｈａｖｅｎ，ＣＴ ０６５１１−７４４、Ｕ．Ｓ．
Ａ．保存菌株〕を形質転換し、選択培地に塗抹すること
により、形質転換株を取得することができる。

【００１２】得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のＡ断片を確認・取得することができる。かくして得ら
れるＡ断片をさらに適当な制限酵素を用いて切断し、得
られるＤＮＡ断片を、大腸菌で複製可能なベクタープラ
スミドに挿入し、このベクタープラミスドを、通常用い
られる形質転換法、例えば、塩化カルシウム法、電気パ
ルス法等による形質転換により、前記Ｌ−リジン要求性
大腸菌変異株ＣＧＳＣ４５４５又はＣＧＳＣ４５５８に
導入し、選択培地に塗抹する。

【００１３】得られる形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のＡ断片を確認・取得することができる。このようにし
て得られるＡ断片の一つは、上記ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｋｐ
ｎＩの完全分解により切り出し、さらにそれを制限酵素
ＸｈｏＩで切断することによって得られる大きさが約
１．６ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。

【００１４】この約１．６ｋｂのジアミノピメリン酸デ
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片
を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位数及び切
断断片の大きさを下記第１表に示す。

【００１５】

【表１】 第 １ 表 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ １ ０．６、 １．０ ＳｐｈＩ １ ０．２、 １．４ Ｈｉｎｄ III １ ０．７、 ０．９ ＮａｅＩ ２ ０．８、 ０．３、 ０．５

【００１６】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。

【００１７】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇ
ｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ III で切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ IIIで切断し
て得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリル
アミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、
切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさ
を算出した。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれ
の大きさを加算して求めた。なお、各ＤＮＡ断片の大き
さの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。

【００１８】一方、上記のブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩおよ
びＸｈｏＩによって切断することにより得られる大きさ
が約１．６ｋｂのＤＮＡ断片については、その塩基配列
をプラスミドｐＵＣ１１８および／またはｐＵＣ１１９
（宝酒造製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
法、Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，ｐ５４６３，
１９７７）により決定することができる。このようにし
て決定した上記約１．６ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列の
オープンリーディングフレームの存在から決定したジア
ミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
は、後記配列表の配列番号：１に示す配列を有するもの
であり、３２０個のアミノ酸をコードする９６０の塩基
対から構成されている。

【００１９】上記した後記配列表の配列番号：１に示す
塩基配列を包含する本発明のジアミノピメリン酸デヒド
ロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天
然のブレビバクテリウム属細菌染色体ＤＮＡから分離さ
れたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、
例えばベックマン社製Ｓｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕｓを用
いて合成されたものであってもよい。

【００２０】また、上記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のＤＮＡ断片は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼをコードする機能を実質的に損なうことがない限り、
塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよ
く又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入
されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されて
いるものであってもよく、これらの誘導体のいずれも
が、本発明のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片に包含されるものであ
る。

【００２１】以上に詳述した大きさが約１．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片の制限酵素による切断点地図を図１に示す。本
発明のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ（Ａ断片）は、適当なプラスミ
ド、例えば、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機
能を司る遺伝子を少くとも含むプラスミドベクターに導
入することにより、コリネ型細菌内でジアミノピメリン
酸デヒドロゲナーゼの高発現可能な組換えプラスミドを
得ることができる。

【００２２】また、本発明のジアミノピメリン酸デヒド
ロゲナーゼをコードする遺伝子を発現させるためのプロ
モーターはコリネ型細菌が保有する該遺伝子自身のプロ
モーターであることができるが、それに限られるもので
はなく、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の
転写を開始させるための原核生物由来の塩基配列であれ
ばいかなるプロモーターであってもよい。

【００２３】本発明のＡ断片を導入することができる、
コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少くと
も含むプラスミドベクターとしては、例えば、特開平３
−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３
０；特開平２−２７６５７５号公報に記載のプラスミド
ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣ
ＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平
１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２
及びｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載
のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載
のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に
記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４
４；特開昭５７−１３４５００号に記載のｐＣＧ１；特
開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭
５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ
１１等を挙げることができる。

【００２４】中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で
用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌
内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型
細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とをもつ
ものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐ
ＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲ
Ｙ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ
３ＫＸ等が好適に使用される。

【００２５】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉ
ｓ）ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）か
らプラスミドｐＢＹ５０３（このプラスミドの詳細につ
いては特開平１−９５７８５号公報参照）ＤＮＡを抽出
し、制限酵素ＸｈｏＩで大きさが約４．０ｋｂのプラス
ミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を切
り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが
約２．１ｋｂのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を
含むＤＮＡ断片を切り出す。これらの両断片をプラスミ
ドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ
部位及びＳａｌＩ部位に組み込むことにより、プラスミ
ドベクターｐＣＲＹ３０を調製することができる。

【００２６】次に、上記プラスミドベクターへの本発明
のＡ断片の導入は、例えばプラスミドベクター中に１個
所だけ存在する制限酵素部位を、該制限酵素で開裂し、
そこに前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下にＤＮＡ
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。

【００２７】プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のＡ断
片の導入は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで開裂させ、そこに前記ジアミノピメリン酸デヒド
ロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断
片）をＤＮＡリガーゼで連結させることにより行うこと
ができる。かくして造成されるプラスミドｐＣＲＹ３０
に本発明の大きさが約１．６ｋｂのＡ断片を導入した組
換えプラスミドは、Ｌ−リジンの製造に好適に用いるこ
とができる組換えプラスミドの一つであり、本発明者ら
はこれをプラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＹと命名し
た。プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＹの作成方法の詳
細については、後記実施例４で説明する。

【００２８】このようにして造成されるジアミノピメリ
ン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むコリネ型細菌内で複
製増殖可能なプラスミドを、宿主微生物に導入して該微
生物の培養物を用いてＬ−リジンを安定に効率よく生産
することが可能となる。本発明によるプラスミドで形質
転換しうる宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えば
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
８）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−Ａ
ＢＴ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９９）等が挙げられる。

【００２９】なお、上記のＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８の
菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株として
ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
ール資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公
報参照）。また、ＦＥＲＭＢＰ−１５００の菌株は、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株としたＬ−α−ア
ミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株である（特開
昭６２−５１９９８号公報参照）。さらに、ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌
株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活性
変異株である（特開昭６１−１７７９９３号公報参
照）。

【００３０】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同Ａ
ＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６；ブレビバク
テリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）Ａ
ＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用いる
こともできる。

【００３１】なお、宿主としてブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７
８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
ｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
〔Ｂａｃｔ．Ｒｅｖ．３６ ｐ．３６１〜４０５（１９
７２）参照〕。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的に
除去する方法の一例を示せば次のとおりである。

【００３２】宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムブロミド（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら約２４時間約３５℃で培養
する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３５℃で約
２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラス
ミド抽出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去さ
れている株を選択する。この操作によりプラスミドｐＢ
Ｙ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３由来菌株が得られる。

【００３３】このようにして得られるブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシェリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように〔Ｃａｌ
ｖｉｎ，Ｎ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｎａｗａｌｔ，Ｐ．
Ｃ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ，１７０，２７９６（１９８８）；Ｉｔｏ，Ｋ．，Ｎ
ｉｓｈｉｄａ，Ｔ．ａｎｄＩｚａｋｉ．Ｋ．，Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２，２９３（１９８８）参照〕、
ＤＮＡ受容菌へのパルス波通電〔Ｓａｔｏｈ，Ｙ．ｅｔ
ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１５９（１９９
０）参照〕によりプラスミドを導入することが可能であ
る。

【００３４】かくして得られる、本発明の、ジアミノピ
メリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ＤＮＡが
導入されたプラスミドで形質転換されたコリネ型細菌
は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ高産生能を有
しており、Ｌ−リジンの製造に好適に用いることができ
る。これらのコリネ型細菌の好適具体例としては、例え
ば前記プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＹを保有するブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ｄａｐＹ（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１２８５９）を挙げることができる。

【００３５】上記の方法で形質転換して得られるジアミ
ノピメリン酸デヒドロゲナーゼ産生能を有するコリネ型
細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３由来株の培養方法を以下に述べる。培養は炭素源、窒
素源、無機塩等を含む通常の栄養培地で行うことがで
き、炭素源としては、例えばグルコース、エタノール、
メタノール、廃糖蜜等が、そして窒素源としては、例え
ばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合
して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸
−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシ
ウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵
母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオ
チン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加すること
ができる。

【００３６】培養は、通常、通気撹拌、振盪等の好気条
件下に、約２０〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３
５℃の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜
１０、好ましくは７〜８付近とすることができ、培養中
のｐＨ調整は酸又はアルカリを添加して行うことができ
る。培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１〜５容量
％、更に好ましくは２〜３容量％である。また、培養期
間は通常１〜７日間とすることができ、最適期間は３日
間である。

【００３７】このようにして得られる培養物又は培養物
から得られる菌体はＬ−リジンの製造に使用することが
できる。Ｌ−リジン生成反応においては、これらの培養
物又は菌体をそのまま用いることができ、あるいは菌体
に超音波処理等を加えた菌体破砕物、さらにそれから分
離回収した粗酵素又は精製酵素として、あるいはそれら
を適当な担体に固定化して用いることができる。以上に
述べた如き菌体の破砕物や粗または精製酵素、固定化物
等を本明細書ではまとめて「菌体処理物」という。

【００３８】しかして本発明に従えば、グルコースを、
上記培養菌体又は菌体処理物と接触させて、Ｌ−リジン
を生成せしめることからなるＬ−リジンの製造法が提供
される。グルコースと上記培養菌体又は菌体処理物との
接触は、通常の酵素反応と同様に、水性反応液中におい
て、行なうことができる。

【００３９】特に、本発明のプラスミドで形質転換しう
る宿主微生物がビオチン要求性のコリネ型細菌である場
合は、上記の如く調製された培養菌体またはその固定化
物と、少なくともグルコースを含有しかつビオチンを含
有しない水性反応液中で、グルコースを接触させてＬ−
リジンを生成せしめるのが好適である。この場合、ビオ
チン要求性のコリネ型細菌はビオチンを実質的に含有し
ない水性反応液中では菌体増殖せずに、該菌体の保有す
る代謝系においてグルコースがエネルギー共役を伴う酵
素反応を介して反応せしめられ、Ｌ−リジンが製造され
る。

【００４０】上記水性反応液中のグルコース濃度は、通
常０．１〜５．０重量％の範囲内とすることができる。
グルコースは反応中上記範囲内の濃度に維持されるよう
に連続的または間欠的に水性反応液に添加するのが好ま
しい。該水性反応液は、上記のように、グルコースを含
有し且つビオチンを実質的に含有しない水あるいはリン
酸またはトリス塩酸等の緩衝液であることもできるが、
好ましくはグルコースを含有し且つビオチンを含有しな
い合成培地が用いられる。この合成培地には、酵母エキ
ス、ペプトン、コーンスティープリカー等の天然栄養物
質を含まない化学構造が既知の無機窒素源及び／又は無
機物を含有する水溶液が包含される。本発明において用
いうる合成培地の無機窒素源としては、例えばアンモニ
ア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等を例示することができ、
また、無機物としては、例えば、リン酸−水素カリウ
ム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マ
ンガン、硫酸鉄等を例示することができる。これらの無
機窒素源および無機塩はそれぞれ、単独でまたは２種以
上混合して用いることができる。

【００４１】本発明に従うＬ−リジン製造法において用
いられる合成培地の一例を示すと次のとおりである：
（ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ ２ｇ／１；ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ／
１；Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ／１；ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ
０．５ｇ／１；ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ ₂ Ｏ２０ｐｐｍ；Ｍｎ
ＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ２０ｐｐｍ含有するｐＨ７．６の
水溶液。

【００４２】本発明のＬ−リジン製造法において使用さ
れる前記のようにして調製された培養菌体又は菌体処理
物の使用量は、特に制限されるものではないが、培地の
容量を基準にして一般に１〜５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）、
好ましくは２〜２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の範囲内の濃度
で使用することができる。上記したとおりの組成を有す
る水性反応液中における培養菌体又は菌体処理物を用い
る酵素反応は、一般に約２０〜約５０℃、好ましくは約
３０〜約４０℃の温度で通常約１０〜約７２時間行うこ
とができる。

【００４３】上記の如く酵素反応によって生成するＬ−
リジンの水性反応液からの分離、精製は、それ自体既知
の通常用いられる方法に従って行なうことができ、例え
ば、イオン交換樹脂処理法、晶析法等の方法を適宜組合
せて行うことができる。

【００４４】また、本発明のコリネ型細菌は、通常の酵
素法及び菌体増殖を伴う通常の発酵法によるＬ−リジン
の製造法にも用いることができる。

【００４５】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。実施例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のジア
ミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を
含むＤＮＡ（Ａ断片）のクローン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄
７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ、
ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ６ｍｇ、Ｍ
ｎＳＯ₄ ４〜６Ｈ₂ Ｏ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カ
ザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２０
０μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１ｌ〕１ｌにブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集め
た。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチーム
を含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ溶液１５ｍｌに
懸濁した。次にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μ
ｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温し
た。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５
％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌し
た。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶
液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全
量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２
℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍ
となるように添加した後、２倍量のエタノールをゆっく
りと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡ
をガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した
後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌ
に加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。

【００４６】（Ｂ）組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＫｐｎＩ
５０ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１時間反応させ完全分
解した。このＫｐｎＩ分解ＤＮＡにクローニングベクタ
ーｐＨＳＧ３９９（宝酒造より市販）を制限酵素Ｋｐｎ
Ｉで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合し、５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオス
レイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 及
びＴ₄ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各
成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応さ
せ、結合させた。

【００４７】（Ｃ）ジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼをコードする遺伝子を含むプラスミドの選択 ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝
子が導入されたプラスミドの選択は、Ｌ−リジン要求性
大腸菌変異株、すなわちエシェリヒア・コリＣＧＳＣ４
５４５〔サシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフ
ェラーゼ遺伝子欠損株；遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐ
ｅ）：ｄａｐＤ〕およびエシェリヒア・コリＣＧＳＣ４
５４８〔サクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ遺
伝子欠損株；遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）：ｄａｐ
Ｅ〕を用いて行った。

【００４８】上記（Ｂ）項で得られたプラスミド混液を
用い、塩化カルシウム（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７
０）により上記エシェリヒア・コリＣＧＳＣ４５４５株
を形質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む選
択培地〔Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ２ｇ、（ＮＨ
₄)₂ ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．１ｇ、グル
コース２０ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗
抹した。さらに形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出
し前記エシェリヒア・コリＣＧＳＣ４５５８株を形質転
換し、選択培地に塗抹し、両変異株を相補する形質転換
株をスクリーニングした。

【００４９】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＨＳＧ３９９の長さ
２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ４．２ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＨＳＧ３９
９−ｄａｐＹと命名した。

【００５０】（Ｄ）ジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）のサ
ブクローニング 上記（Ｃ）項で得たプラスミドｐＨＳＧ３９９−ｄａｐ
Ｙに含まれるＤＮＡ挿入断片を、必要な部分だけに小型
化するために、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造より市
販）へジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片を下記のとおりサブクローニ
ングした。

【００５１】上記（Ｃ）項で得たプラスミドｐＨＳＧ３
９９−ｄａｐＹを制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで切
断したものと、プラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素Ｋｐ
ｎＩ、ＳａｌＩで切断したものを混合し、５０ｍＭトリ
ス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトー
ル、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 及びＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃
度は最終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ、結
合させた。

【００５２】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により前記
エシェリヒア・コリＣＧＳＣ４５５８株を形質転換し、
アンピシリン５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ７
ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ２ｇ、（ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳ
Ｏ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．１ｇ、グルコース２０ｇ及び寒天１
６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗抹した。

【００５３】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＵＣ１１９の長さ
３．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１．６ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限で切断したとき
の、長さ約１．６ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素認識部位
数および切断断片の大きさは前記表１に示したとおりで
あった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に
示す。

【００５４】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記第２表に示す。

【００５５】

【表２】 第２表 プラスミドｐＵＣ１１９−ｄａｐＹ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ １ ４．８ ＳｐｈＩ ２ ３．４、 １．４ Ｈｉｎｄ III ２ ４．１、 ０．７

【００５６】上記の制限酵素により特徴づけられるプラ
スミドをｐＵＣ１１９−ｄａｐＹと命名した。

【００５７】以上によりジアミノピメリン酸デヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子を含む大きさが約１．６ｋｂ
のＤＮＡ断片（ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片）を得ることが
できた。

【００５８】実施例２ ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝
子の塩基配列の決定実施例１の（Ｄ）項で得られたジア
ミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を
含む長さが約１．６ｋｂのＤＮＡ断片について、その塩
基配列をプラスミドｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（宝酒
造製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄ
ｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）
（Ｓａｈｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４，５４６３，１９７
７）により図２に示した戦略図に従って決定した。

【００５９】その塩基配列中のオープンリーディングフ
レームの存在から、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼをコードする遺伝子は、後記配列表の配列番号：１に
示す配列を有する３２０個のアミノ酸をコードする９６
０の塩基対より構成されていることが判明した。

【００６０】実施例３ コリネ型細菌内で複製し安定なプラスミドベクターｐＣ
ＲＹ３０の作成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。

【００６１】半合成培地Ａ培地〔尿素２ｇ、（ＮＨ₄)₂
ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．
５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ６ｍｇ、酵母エキス２．
５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビチオン２００μｇ、塩酸チア
ミン２００μｇ、グルコース２０ｇ及び蒸留水１ｌ〕１
ｌに、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１
４４を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得ら
れた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む緩
衝液〔２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース〕２０ｍ
ｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反応液にアル
カリ−ＳＤＳ液〔０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％（Ｗ／Ｖ）
ＳＤＳ〕４０ｍｌを添加し、緩やかに混和して室温にて
１５分間静置した。次に、この反応液に酢酸カリウム溶
液〔５Ｍ酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１．５ｍ
ｌ、蒸留水２８．５ｍｌの混合液〕３０ｍｌを添加し、
充分混和してから氷水中に１５分間静置した。

【００６２】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノ
ール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸濁した
後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇ
の遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍量のエ
タノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃で１０
分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収
した。

【００６３】沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液〔トリス１
０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８．０に調
整〕２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液〔５
倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液〕１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１．３９２ｇ／
ｍｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６，０００×ｇの遠心分離を行った。

【００６４】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。次いでこ
の分画液を等量のイソアミルアルコールで４回処理して
エチジウムブロマイドを抽出除去し、その後にＴＥ緩衝
液に対して透析を行った。このようにして得られたプラ
スミドｐＢＹ５０３を含む透析液に３Ｍ酢酸ナトリウム
溶液を最終濃度３０ｍＭに添加した後、２倍量エタノー
ルを加え、−２０℃１時間静置した。この溶液を１５，
０００×ｇの遠心分離にかけてＤＮＡを沈降させ、プラ
スミドｐＢＹ５０３を５０μｇ得た。

【００６５】（Ｂ）プラスミドベクターｐＣＲＹ３０の
作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０．５μｇを制
限酵素ＳａｌＩ（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃１時間反応さ
せ、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。上記（Ａ）項
で調製したプラスミドｐＢＹ５０３の２μｇに制限酵素
ＸｈｏＩ（１ｕｎｉｔ）を３７℃で３０分間反応させ、
プラスミドＤＮＡを部分分解した。

【００６６】両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、
制限酵素を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処
理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５
０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及
びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を
強化し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いて
エシェリヒア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒
造製）を形質転換した。

【００６７】形質転換株は３０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び蒸留水１ｌ、ｐＨ７．
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育してき
たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法
〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”（１９８２）ｐ９０〜９１参照〕により抽出
した。

【００６８】その結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８のＳ
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４．０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒ
ｉが得られた。次に同様の方法を用い、前記（Ａ）項で
得られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐ
ｎＩ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２．１ｋｂ
のＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉ
のＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラ
スミドベクターｐＣＲＹ３０を調製した。

【００６９】実施例４ プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＹの作成及びコリネ型
細菌の導入 実施例１の（Ｃ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ３９
９−ｄａｐＹ５μｇを制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ
を各５ｕｎｉｔｓ用い、３７℃で１時間反応させ分解し
たものと、ＥｃｏＲＩリンカー（宝酒造より市販）１μ
ｌを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１
０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各
成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１２
℃で１５時間反応させ結合させた。

【００７０】このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ ３ｕｎ
ｉｔｓを用い３７℃で１時間反応させ分解したものと、
実施例３の（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＣＲＹ３０
１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ １ｕｎｉｔを用い、３
７℃で１時間反応させ分解したものを混合し、５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ およびＴ
４ＤＡＮリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分
の濃度は最終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ
結合させた。このプラスミドを用いて、前記方法に従い
前記エシェリヒア・コリＣＧＳＣ４５５８株を形質転換
し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む選択培地〔Ｋ₂
ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ２ｇ、（ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ １
ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．１ｇ、グルコース２０ｇ
及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗抹した。

【００７１】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ
８．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ１．６ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片が認められた。上記の如く調製されたプラ
スミドＤＮＡを、電気パルス法を用いてコリネ型細菌へ
次のとおり形質転換した。

【００７２】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０
２除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで
培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌになるように
添加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分離により菌
体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭ
Ｓｕｃｒｏｓｅ、７ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、１ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂ ；ｐＨ７．４）にて洗浄した。さらに菌体を遠
心分離して集め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０．
７５ｍｌの細胞と、前記で得られたプラスミドＤＮＡ溶
液５０μｌとを混合し、水中にて２０分間静置した。ジ
ーンパルサー（バイオラド社製）を用いて、２５００ボ
ルト、２５μＦＤに設定し、パルスを印加後氷中に２０
分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し３０℃
にて１時間培養後、カナマイシン１５μｇ／ｍｌ（最終
濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で２〜３日
間培養した。出現したカナマイシン耐性株より、前記実
施例３（Ａ）項に記載の方法を用いてプラスミドを得
た。このプラスミドを各種制限酵素で切断して、切断断
片の大きさを測定した。その結果を下記第３表に示す。

【００７３】

【表３】 第３表 プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＹ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ ２ ８．７、 １．６ ＢａｍＨＩ ２ ７．２、 ３．１ ＫｐｎＩ １ １０．３ ＸｈｏＩ １ １０．３

【００７４】上記制限酵素により特徴づけられるプラス
ミドをｐＣＲＹ３０−ｄａｐＹと命名した。このプラス
ミドの制限酵素による切断点地図を図３に示す。

【００７５】なお、プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＹ
により形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ｄａｐＹは、茨城県つくば市東１丁目１番３
号の工業技術院微生物工業技術研究所に、平成４年３月
１０日付で：微工研菌寄第１２８５９号（ＦＥＲＭ Ｐ
−１２８５９）として寄託されている。

【００７６】実施例５ プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＹの安定性 前記のＡ培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実施
例４で得た形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ｄａｐＹを植菌し、３０℃にて２４時間振盪
培養を行った後、同様にして調製したＡ培地１００ｍｌ
を５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５
分間滅菌したものに、１ｍｌ当たり５０ｃｅｌｌｓの割
合になるように植継し、同じく３０℃にて２４時間振盪
培養を行った。次に遠心分離して集菌し、菌体を洗浄
後、カナマイシンを１５μｇ／ｍｌの割合で添加したＡ
培地及び無添加のＡ培地を用いて調製した平板培地に一
定量塗抹し、３０℃にて１日培養後生育コロニーをカウ
ントした。

【００７７】この結果、カナマイシン添加および無添加
培地に生育したコロニーは同数であること、さらにＡ培
地生育コロニーは全てカナマイシン添加培地に生育する
こと、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認し
た。

【００７８】実施例６ Ｌ−リジンの生産 培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％、ＫＨ
₂ ＰＯ₄ ０．０５％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．０５％、ＭｇＳ
Ｏ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０５％、ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ ₂ Ｏ２ｐ
ｐｍ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ２ｐｐｍ、ＭｎＳＯ₄ ・４
〜６Ｈ₂ Ｏ２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ２ｐｐｍ、
ＮａＣｌ ２ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チアミ
ン・ＨＣｌ １００μｇ／ｌ、カザミノ酸０．１％、酵
母エキス０．１％）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラ
スコに分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７．０）した後ブレビバ
クテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ２３３−ｄａｐＹ（ＦＥＲＭ Ｐ−
１２８５９号）を植菌し、無菌的にグルコースを５ｇ／
ｌの濃度になるように加え、３０℃にて２日間振盪培養
を行った。

【００７９】次に、本培養培地（グルコース５％、硫酸
アンモニウム２．３％、ＫＨ₂ ＰＯ ₄ ０．０５％、Ｋ₂
ＨＰＯ₄ ０．０５％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０５
％、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ₄ ・４
〜６Ｈ₂ Ｏ２０ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チア
ミン・ＨＣｌ １００μｇ／ｌ、カザミノ酸０．３％、
酵母エキス０．３％）の１０００ｍｌを２ｌ容通気撹拌
槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、前記前培
養物の２０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ、通
気量１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７．６にて２４時間培
養を行った。

【００８０】培養終了後、培養物５００ｍｌから遠心分
離にて集菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応
液〔（ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ ２ｇ／ｌ；ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ
／ｌ；ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂
Ｏ０．５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂ Ｏ２０ｐｐｍ；Ｍ
ｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ２０ｐｐｍ；チアミン塩酸塩１
００μｇ／ｌ；ｐＨ７．６〕の１０００ｍｌに懸濁後、
該懸濁液を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、グルコース９ｇ
を添加して、回転数３００ｒｐｍ、通気量０．１ｖｖ
ｍ、温度３３℃、ｐＨ７．６にて２４時間反応を行っ
た。

【００８１】反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−リジンを
定量した。その結果、上清液中のＬ−リジン生成量は、
１．０ｇ／ｌであった。この反応終了後の培養液５００
ｍｌを、強酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ⁺ 型）のカラムに
通してＬ−リジンを吸着させ、水洗後、０．５Ｎアンモ
ニア水で溶出させた後、Ｌ−リジン画分を濃縮し、冷エ
タノールでＬ−リジンの結晶を析出させた。その結果、
２６０ｍｇのＬ−リジン結晶を得た。

【００８２】また、比較例として、同様の条件にて、ブ
レビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７）を培養し、同様の条件にて反応させた後上
清液中のＬ−リジンを定量した。その結果、上清液中の
Ｌ−リジン生成量は０．６ｇ／ｌであった。

【００８３】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：963 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名 ：MJ233 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1-963 特徴を決定した方法：p 配列 ATG ACC AAC ATC CGC GTA GCT ATC GTG GGC TAC GGA AAC CTG GGA CGC 48 Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg 1 5 10 15 AGC GTC GAA AAG CTT ATT GCC AAG CAG CCC GAC ATG GAC CTT GTA GGA 96 Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly 20 25 30 ATC TTC TCG CGC CGG GCC ACC CTC GAC ACA AAG ACG CCA GTC TTT GAT 144 Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp 35 40 45 GTC GCC GAC GTG GAC AAG CAC GCC GAC GAC GTG GAC GTG CTG TTC CTG 192 Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu 50 55 60 TGC ATG GGC TCC GCC ACC GAC ATC CCT GAG CAG GCA CCA AAG TTC GCG 240 Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala 65 70 75 80 CAG TTC GCC TGC ACC GTA GAC ACC TAC GAC AAC CAC CGC GAC ATC CCA 288 Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro 85 90 95 CGC CAC CGC CAG GTC ATG AAC GAA GCC GCC ACC GCA GCC GGC AAC GTT 336 Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val 100 105 110 GCA CTG GTC TCT ACC GGC TGG GAT CCA GGA ATG TTC TCC ATC AAC CGC 384 Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg 115 120 125 GTC TAC GCA GCG GCA GTC TTA GCC GAG CAC CAG CAG CAC ACC TTC TGG 432 Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp 130 135 140 GGC CCA GGT TTG TCA CAG GGC CAC TCC GAT GCT TTG CGA CGC ATC CCT 480 Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro 145 150 155 160 GGC GTT CAA AAG GCA GTC CAG TAC ACC CTC CCA TCC GAA GAC GCC CTG 528 Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu 165 170 175 GAA AAG GCC CGC CGC GGC GAA GCC GGC GAC CTT ACC GGA AAG CAA ACC 576 Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr 180 185 190 CAC AAG CGC CAA TGC TTC GTG GTT GCC GAC GCG GCC GAT CAC GAG CGC 624 His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg 195 200 205 ATC GAA AAC GAC ATC CGC ACC ATG CCT GAT TAC TTC GTT GGC TAC GAA 672 Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu 210 215 220 GTC GAA GTC AAC TTC ATC GAC GAA GCA ACC TTC GAC GCC GAG CAC ACC 720 Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ala Glu His Thr 225 230 235 240 GGC ATG CCA CAC GGT GGC CAC GTG ATT ACC ACC GGC GAC ACC GGT GGC 768 Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly 245 250 255 TTC AAC CAC ACC GTG GAA TAC ATC CTC AAG CTG GAC CGA AAC CCA GAT 816 Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp 260 265 270 TTC ACC GCT TCC GCG CAG ATC GCT TTC GGT CGC GCA GCT CAC CGC ATG 864 Phe Thr Ala Ser Ala Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met 275 280 285 AAG CAG CAG GGC CAA AGC GGA GCT TTC ACC GTC CTC GAA GTT GCT CCA 912 Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro 290 295 300 TAC CTG CTC TCC CCA GAG AAC TTG GAC GAT CTG ATC GCA CGC GAC GTC 960 Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val 305 310 315 320 TAA 963

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子を含む大きさが約１．６ｋｂのＤＮ
Ａ断片の制限酵素による切断点地図。

【図２】大きさが約１．６ｋｂの本発明ＤＮＡ断片の塩
基配列決定のための戦略図。

【図３】本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＹの
制限酵素による切断点地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ブレビバクテリウム属細菌由来のジアミ
   ノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．
   １６．）をコードする遺伝子ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ブレビバクテリウム属細菌がブレビバク
   テリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
   ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ２３３である請求項１記載の遺伝子
   ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 次のＤＮＡ塩基配列 ATGACCAACA TCCGCGTAGC TATCGTGGGC TACGGAAACC TGGGACGCAG CGTCGAAAAG 60 CTTATTGCCA AGCAGCCCGA CATGGACCTT GTAGGAATCT TCTCGCGCCG GGCCACCCTC 120 GACACAAAGA CGCCAGTCTT TGATGTCGCC GACGTGGACA AGCACGCCGA CGACGTGGAC 180 GTGCTGTTCC TGTGCATGGG CTCCGCCACC GACATCCCTG AGCAGGCACC AAAGTTCGCG 240 CAGTTCGCCT GCACCGTAGA CACCTACGAC AACCACCGCG ACATCCCACG CCACCGCCAG 300 GTCATGAACG AAGCCGCCAC CGCAGCCGGC AACGTTGCAC TGGTCTCTAC CGGCTGGGAT 360 CCAGGAATGT TCTCCATCAA CCGCGTCTAC GCAGCGGCAG TCTTAGCCGA GCACCAGCAG 420 CACACCTTCT GGGGCCCAGG TTTGTCACAG GGCCACTCCG ATGCTTTGCG ACGCATCCCT 480 GGCGTTCAAA AGGCAGTCCA GTACACCCTC CCATCCGAAG ACGCCCTGGA AAAGGCCCGC 540 CGCGGCGAAG CCGGCGACCT TACCGGAAAG CAAACCCACA AGCGCCAATG CTTCGTGGTT 600 GCCGACGCGG CCGATCACGA GCGCATCGAA AACGACATCC GCACCATGCC TGATTACTTC 660 GTTGGCTACG AAGTCGAAGT CAACTTCATC GACGAAGCAA CCTTCGACGC CGAGCACACC 720 GGCATGCCAC ACGGTGGCCA CGTGATTACC ACCGGCGACA CCGGTGGCTT CAACCACACC 780 GTGGAATACA TCCTCAAGCT GGACCGAAAC CCAGATTTCA CCGCTTCCGC GCAGATCGCT 840 TTCGGTCGCG CAGCTCACCG CATGAAGCAG CAGGGCCAAA GCGGAGCTTT CACCGTCCTC 900 GAAGTTGCTC CATACCTGCT CTCCCCAGAG AACTTGGACG ATCTGATCGC ACGCGACGTC 960 TAA 963 で示されるジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．
   Ｃ．１．４．１．１６．）をコードする遺伝子ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 次のアミノ酸配列 Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg 1 5 10 15 Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly 20 25 30 Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp 35 40 45 Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu 50 55 60 Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala 65 70 75 80 Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro 85 90 95 Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val 100 105 110 Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg 115 120 125 Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp 130 135 140 Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro 145 150 155 160 Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu 165 170 175 Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr 180 185 190 His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg 195 200 205 Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu 210 215 220 Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ala Glu His Thr 225 230 235 240 Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly 245 250 255 Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp 260 265 270 Phe Thr Ala Ser Ala Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met 275 280 285 Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro 290 295 300 Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val 305 310 315 320 で示されるジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．
   Ｃ．１．４．１．１６．）をコードする遺伝子ＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子
   ＤＮＡが導入された組換えプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子
   ＤＮＡと、コリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子
   を含むＤＮＡを保有する組換えプラスミド。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組換えプラスミドで形質
   転換されたコリネ型細菌。
8. 【請求項８】 グルコースを、請求項７記載のコリネ型
   細菌の培養菌体又は菌体処理物と接触させてＬ−リジン
   を生成せしめることを特徴とするＬ−リジンの製造法。