JPH0529437B2 - - Google Patents

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JPH0529437B2
JPH0529437B2 JP58175710A JP17571083A JPH0529437B2 JP H0529437 B2 JPH0529437 B2 JP H0529437B2 JP 58175710 A JP58175710 A JP 58175710A JP 17571083 A JP17571083 A JP 17571083A JP H0529437 B2 JPH0529437 B2 JP H0529437B2
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JP
Japan
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phenylalanine
dna
coryneform
gene
bacterium
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JP58175710A
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JPS6066984A (ja
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Shigeru Nakamori
Kazuhiko Matsui
Kyoshi Miwa
Takanosuke Sano
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Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
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Publication date
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Priority to CA000463704A priority patent/CA1283070C/en
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Priority to EP19840111301 priority patent/EP0137387B1/en
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Publication of JPH0529437B2 publication Critical patent/JPH0529437B2/ja
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/222Phenylalanine

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  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
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  • Biomedical Technology (AREA)
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】 本発明は発酵法による−プニルアラニンの
補造法に関する。 発酵法により−プニルアラニンを補造しよ
うずする堎合、野性株は殆んど菌䜓倖に−プ
ニルアラニンを生産しないので、野性株に人工的
に突然倉異を生起せしめお−プニルアラニン
生産胜を付䞎する方法がずられおいる。埓来知ら
れおいる−プニルアラニン生産胜を有する人
工倉異株ずしおは、プレピバクテリりム又はコリ
ネバクテリりム属のプニルアラニンアンタゎニ
ストに耐性を有する倉異株米囜特蚱3660235、
コリネバクテリりム属のチロシンを芁求し、プ
ニルアラニンアンタゎニストに耐性を有する倉異
株米囜特蚱3759790、ゎレビバクテリム属、コ
リネバクテリりム属のプニルアラニンアンタゎ
ニストに耐性を有し、デコむニンに感受性を有す
る倉異株特開昭56−64793等が知られおいる。 䞀方、最近䞊述のような人工倉異による育皮ず
異なるずころの遺䌝子組換え技術を−プニル
アラニン生産菌の育皮に利甚する詊みが報告され
おいる。即ち、特開昭56−1890には、プニルア
ラニン合成に関䞎する゚シ゚リヒア属のクロモゟ
ヌムDNAフラグメントを組蟌んだプラスミドを
含有する゚シ゚リヒア・コリの倉異株が−プ
ニルアラニンを生産したこずが蚘茉されおいる。 本願発明者らは、叙䞊のような埓来の発酵法に
よる−プニルアラニンの補造法に察し、コリ
ネホルム・グルタミン酞生産菌に属するDNA䟛
䞎菌より埗られるコリスミン酞ムタヌれβサブナ
ニツト遺䌝子をコヌドするDNA断片が、コリネ
ホルム・グルタミン酞生産菌の菌䜓内で自埋耇補
できるペクタヌプラスミドに接続されお、コリネ
ホルム・グルタミン酞生産菌に属し、メチオニン
及びチロシン芁求性、−フルオロプニルアラ
ニン耐性であるDNA受容菌に導入されお埗られ
る−プニルアラニン生産胜を有する埮生物を
培逊するこずにより、培逊液䞭に−プニルア
ラニンを高蓄積できるこずを知り、本願発明を完
成させた。 すなわち本願発明は、コリネホルム・グルタミ
ン酞生産菌に属するDNA䟛䞎菌より埗られるコ
リスミン酞ムタヌれβサブナニツト遺䌝子をコヌ
ドするDNA断片が、コリネホルム・グルタミン
酞生産菌の菌䜓内で自埋耇補できるベクタヌプラ
スミドに接続されお、コリネホルム・グルタミン
酞生産菌に属し、メチオニン及びチロシン芁求
性、−フルオロプニルアラニン耐性である
DNA受容菌に導入されお埗られる−プニル
アラニン生産胜を有する埮生物を培逊し、培逊液
䞭に蓄積された−プニルアラニンを採取する
こずを特城ずする−プニルアラニンの補造法
であり、たた、本願発明は前蚘遺䌝子がプニル
アラニンアンタゎニストに耐性を有するコリネホ
ルム・グルタミン酞生産菌より埗られたものであ
る䞊蚘の補造法である。 コリスミン酞ムタヌれβ−サブナニツト遺䌝子
を含むDNA断片はコリネホルム・グルタミン酞
生産菌の染色䜓DNAより埗るこずができるフ
゚ニルアラニン生合成系遺䌝子を含むDNA断片
を䞎えるものをDNA䟛䞎菌ず称する コリネホルム・バクテリアは奜気性、グラム陜
性桿菌であり、非抗酞性でバヌヂヌス・マニナア
ル・オブ・デタヌミネむテむブバクテオロゞヌ第
版599頁1974に蚘茉されおいる。 本発明の宿䞻菌ずしお利甚しうるコリネホル
ム・グルタミン酞生産菌の野性株の䟋ずしおは次
のようなものがあげれる。 ブレビバクテリりム・デむバリカタム
ATCC 14020 ブレビバクテリりム・サツカロリテむクム
ATCC 14066 ブレビバクテリりム・むンマリオフむルム
ATCC 14068 ブレビバクテリりム・ラクトフアヌメンタム
ATCC 13869 ブレビバクテリりム・ロれりム ATCC 13825 ブレビバクテリりム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリりム・チオゲニタリス
ATCC 19240 コリネバクテリりム・アセトアシドフむルム
ATCC 13870 コリネバクテリりム・アセトグルタミクム
ATCC 15806 コリネバクデリりム・カルナ゚ ATCC 15991 コリネバクテリりム・グルタミりム
ATCC 13032、13060 コリネバクテリりム・リリりム ATCC 15990 コリネバクテリりム・メラセコヌラ ATCC 17965 コリネバクテリりム・アンモニアフむラム
ATCC 15354 コリネホルム・グルタミン酞生産菌にはグルタミ
ン酞生産性を倱な぀た倉異株、あるいはその他の
生産物を生産する倉異株も含たれる。 DNA䟛䞎菌ずしおは、プニルアラニンアン
タゎニスト耐性などの倉異を付䞎するこずによ
り、プニルアラニンたたはその前駆䜓の生合成
掻性が高た぀たような倉異株を甚いれば曎によ
い。 プニルアラニンアンタゎニストの䟋ずしおは
−フルオロプニルアラニン、−フルオロフ
゚ニルアラニン、−フルオロプニルアラニ
ン、β−−プニルアラニン、−メチルトリ
プトフアン等がある。ここにいうプニルアラニ
ンの前駆䜓ずは−デヒドロキシ−−アラビノ
ヌヘペプツロン酞−−リン酞、−デヒドロキ
ナ酞、−デヒドロシキミ酞、シキミ酞、シキミ
酞−−リン酞、−゚ノヌルピルビルシキミ
酞、−リン酞、コリズミン酞、プレプン酞、
プニルピルピン酞などをいう。 このような倉異株の䟋ずしおは先に述べた米囜
特蚱3660235、米囜特蚱3759970、特開昭56−
64793等に蚘茉されおいる。 コリスミン酞ムタヌれβ−サブナニツト遺䌝子
をコリネホルム・グルタミン酞生産菌の菌䜓内で
自埋耇補できるベクタ−プラスミド䞊に挿入しお
コリネホルム・グルタミン酞生産菌に属する
DNA受容菌、奜たしくはコリネホルム・グルタ
ミン酞生産菌に属し、メチオニン及びチロシン芁
求性、−フルオロプニルアラニン耐性である
DNA受容菌に導入すれば、プニルアラニン生
産胜の向䞊した株を埗るこずができる。甚いる遺
䌝子ずしおは野性型のものの他前述のようなプ
ニルアラニンアンタゎニスト耐性などにより誘導
された倉異型の遺䌝子を甚いるず曎によい。野生
型遺䌝子を取埗埌、これが導入されたDNA受容
菌に倉異凊理を斜しおベクタヌ䞊の遺䌝子を改良
するか、野生型遺䌝子を含むプラスミドDNAに
詊隓管内で、修食しお遺䌝子を改良するこずは圓
然良奜な結果を生む堎合がある。ここにいう遺䌝
子の改良ずは、遺䌝子産物であるコリスミン酞ム
タヌれβサブナニツトの合成量が増匷される分
子圓りの比掻性が䞊昇する、生成物、最終産物に
よる酵玠阻害が軜枛たたは解陀されるなどプニ
ルアラニン生産を促進するような望たしい圱響を
䞎える遺䌝子の修食をいう。 具䜓的にはプロモヌタヌ領域の倉異たたは倉換
あるいは構造遺䌝子の倉異、修食によりこれらは
達せられる。コリスミン酞ムタヌれβサブナニツ
ト遺䌝子に加え、プニルアラニン生合成系遺䌝
子の耇数の遺䌝子を同䞀のベクタヌプラスミド䞊
に挿入するか、共存しうる耇数のベクタヌ䞊に
別々に挿入したのち受容菌に導入すればよりよい
結果を䞎える堎合がある。 DNA受容菌ずしお甚いるコリネホルム・グル
タミン酞生産菌に属する菌ずしおは、前述したよ
うな各皮の菌株を甚いうる。受容菌ずしおプニ
ルアラニン芁求性をも぀菌株を甚いればその芁求
性の消倱により容易に、プニルアラニン生合成
系遺䌝子の導入された圢質転換株を遞択するこず
ができる。たたプニルアラニンアンタゎニスト
に感受性の株を受容菌ずしお甚いた堎合、プニ
ルアラニンアンタゎニスト耐性に関䞎するプニ
ルアラニン生合成系遺䌝子の導入された圢質転換
株をプニルアラニンアンタゎニスト耐性株ずし
お容易に遞択するこずができる。より高いプニ
ルアラニン生産胜をも぀圢質転換株を埗るために
は、プニルアラニンアンタゎニスト耐性、栄逊
芁求性などの倉異を付䞎するこずによ぀おプニ
ルアラニンたたはその前駆䜓の生合成掻性が高た
぀たような倉異株を受容菌ずしお甚いるずよりよ
い結果を䞎える。曎に、プニルアラニンの菌䜓
倖ぞの透過性が改善された倉異様、プニルアラ
ニンの分解性の䜎䞋した倉異株、グルタミン、ホ
スポノヌルピルビン酞などプニルアラニン生
合成に玠材ずしお䟛絊される代謝産物の生合成胜
が高た぀たような倉異株たたは組換え䜓も圓然良
い結果を生む堎合がある。 䜿甚するベクタヌずしおはコリネホルム・グル
タミン酞生産菌の䞭で自埋耇補できるプラスミド
であればいかなるものでもよい。 䟋ずしお以䞋のものがあげられる。 (1) PAM330特開昭58−67699参照 (2) pHM1519特開昭58−77895参照 (3) pAJ655 (a) 宿䞻菌゚シ゚リヒア・コリAJ11882 FERM−P6571FERM−
BP136など (b) 分子量 6.6メガダルトン (c) 制限酵玠切断地図 第図参照 (d) 性 質pAM330ずpBR325Gene 121
1978の耇合プラスミド。 クロラムプニコヌル耐性に䞎
る。 (4) pAJ611 (a) 宿䞻菌 ゚シ゚リヒア・コリAJ11884 FERM−P6519FERM−
BP138など (b) 分子量 6.6メガダルトン (c) 制限酵玠切断地図 第図参照 (d) 性 質pAM281ずpBR325の耇合プラス
ミド。 クロラムプニコヌル耐性に䞎
る。 (5) pAJ440 (a) 宿䞻菌バチルスズブチリス AJ 11901 FERM−BP140ATCC39139
など (b) 分子量 6.0メガダルトン (c) 制限酵玠切断地図 第図参照 (d) 性 質pAM330ずpUB110 J. Bacteriol.、134 318 1978の耇合プラスミド。 カナマむシン耐性に䞎る。 (6) pAJ1844 (a) 宿䞻菌゚シ゚リヒア・コリ AJ11883 FERM −6518FERM BP
−137など (b) 分子量 5.4メガダルトン (c) 制限酵玠切断地図 第図参照 (d) 性 質pHM1519ずpBR325の耇合プラ
スミド。 クロラムプニコヌル耐性に䞎
る。 (7) pAJ3148 (a) 宿䞻菌コリネバクテリりム・グルタミカ
ム SR8203 ATCC39137など (b) 分子量 6.6メガダルトン (c) 制限酵玠切断地図 第図参照 (d) 性 質pHM1519ずpUB110ずの耇合プ
ラスミド。 カナマむシン耐性に䞎る。 コリネホルム・グルタミン酞生産菌现胞内で増
殖可胜なプラスミドのその他の䟋ずしおはpCG1
特開昭57−134500、pCG2特開昭58−35197、
pCG4、pCG11特開昭57−183799があり、これ
らはいずれも圓然䜿甚可胜であろう。 DNA䟛䞎菌の染色䜓DNA及び、ベクタヌ
DNAは通垞の方法により抜出するこずができる。 染色䜓DNA及びベクタヌDNAはそれぞれ制限
酵玠を甚いお切断する。ベクタヌDNAの開裂は
圓該ベクタヌDNAを䞀ケ所で切断する制限酵玠
を甚いお切断するか、耇数郚䜍切断する制限酵玠
を郚分的に䜜甚させるこずにより達せられる。染
色䜓DNAに぀いおは、制限゚ンドヌクレアヌれ
による切断が郚分的に行われるように、反応条件
を調節すれば倚くの皮類の制限酵玠が䜿甚でき
る。 かくしお埗られた染色䜓DNA断片ず、切断さ
れたベクタヌDNAずを連結せしめる方法は、リ
ガヌれを甚いる通垞の方法が䜿甚できる。䞀方、
タヌミナルトランスプラヌれを甚いお、染色䜓
DNA断片ず開裂したベクタヌDNAずにデオキシ
アデニル酞ずデオキシチシゞル酞、たたは、デオ
キシグアニル酞ずデオキシチシゞル酞をそれぞれ
付加し、混合したのち、アニヌリングしお連結せ
しめる方法も利甚しうる。 このようにしお埗られた、染色䜓DNAずベク
タヌプラスミドずの連結物のコリネホルム・グル
タミン酞生産菌に属する受容菌ぞの導入は、゚シ
゚リヒア・コリ−12に぀いお報告されおいる様
なMandeland HigaA.J.Mol.Biol.、
53、1591970受容菌现胞を塩化カルシりムで
凊理しおDNAの透過性を増す方法、たたはバチ
ルス・ズブチリスに぀いお報告されおいる様に
DuncanH.WilsonG.A.and Young
F.E.Gene、1531977现胞がDNAを取
り蟌み埗る様になる増殖段階いわゆるコンビテ
ントセルに導入する方法により可胜である。あ
るいは、バチルス・ズブチリス、攟線菌類および
酵母に぀いお知られおいる様にChang
and ChoenS.N.Molec.Gen.Genet.168111
1979BibbM.J.WardJ.M.and
HopwoodO.A.Nature、224、3981978
HinnenA.HicksJ.B.and FinkG.R.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA、75 19291978、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り蟌
むプロトプラストたたはスププラストにしおプ
ラスミドをDNA受容菌に導入するこずも可胜で
ある。 プロトプラスト法では䞊蚘のバチルス・ブブチ
リスの方法でも充分高い頻床を埗るこずができる
し、特開昭57−183799に蚘茉されたコリネバクテ
リりム属たたはブレビバクテリりム属のプロトポ
ラストにプリ゚チレングリコヌルたたはポリビニ
ルアルコヌルず二䟡金属むオンずの存圚䞋に
DNAをずり蟌たせる方法も圓然利甚できる。ポ
リ゚チレングリコヌルたたはポリビニルアルコヌ
ルのかわりに、カルボキシメチルセルロヌス、デ
キストラン、フむコヌル、、プルロニツクF68セ
ルバ瀟などの添加によ぀おDNAのずり蟌みを
促進させる方法でも同等の結果が埗られる。 プニルアラニン生合成系遺䌝子がベクタヌプ
ラスミドに接続されお、導入された圢質転換株を
遞択は、プニルアラニン芁求株を受容菌ずした
堎合にはプニルアラニン芁求性を倱な぀た株を
遞ぶこずにより、プニルアラニンアンタゎニス
ト感受性菌を受容菌ずしおプニルアラニンアン
タゎニスト耐性に䞎るプニルアラニン生合成系
遺䌝子を導入する堎合は該アンタゎニスト耐性ず
な぀た株を遞ぶこずにより、容易に達せられる
が、プニルアラニン生産性の向䞊を指暙ずしお
遞択するこずも可胜である。ベクタヌ薬剀耐性な
どの遺䌝マヌカヌが存圚する堎合にはこの圢質を
䜵せお遞択に甚いれば、より容易に圢質転換株を
遞ぶこずができる。 埗られた−プニルアラニン生産菌を培逊す
る方法は、埓来の−プニルアラニン生産菌の
培逊方法ず特に倉らない。即ち、培地ずしおは、
炭玠源、窒玠源、無機むオン、曎に必芁に応じア
ミノ酞、ビタミン等の有機埮量栄逊玠を含有する
通垞のものである。炭玠源ずしおは、グルコヌヌ
ス、シナクロヌス、ラクトヌス等及びこれらを含
有する柱粉加氎分解液、ポむ、糖蜜等が甚いら
れる。窒玠源ずしおは、アンモニアガス、アンモ
ニア氎、アンモニりム塩その他が䜿甚できる。 培逊は奜気的条件䞋で培地のPH及び枩床を適宜
調節し぀぀、実質的に−プニルアラニンの生
産蓄積が停止するたで行なわれる。 かくしお培逊液䞭には著量の−プニルアラ
ニンが生成蓄積される。培逊液より−プニル
アラニンを採取するには、通垞の方法が適甚でき
る。 実斜䟋  プニルアラニンアナログである−フルオロ
プニルアラニンに察しお抵抗性を有するプニ
ルアラニン生産菌ブレビバクテリりムラクトプ
ルメンタム AJ3437FERM −1914、FERM
BP−1071から調補した染色䜓DNA10ÎŒgを
制限酵玠PstIで郚分分解し、䞀方、同酵玠に察し
おケ所切断郚䜍を有し、クロラムプニコヌル
耐性のベクタヌプラスミドpAJ18445ÎŒgを同酵
玠で完党分解し、65℃、10分の熱凊理により酵玠
を倱掻させた埌、䞡者を混合。リガヌれ反応を22
℃で時間行ない、冷゚タノヌルを加え、沈柱物
をTEN緩衝液に溶解し、プロトプラスト圢質転
換に甚いた。DNA受容菌ずしおはは−フルオ
ロプニルアラニン感受性、メチオニン、スレオ
ニン、リゞン芁求株プレピバクテリりム・ラクト
フアヌメンタムNo.64ATCC39134を䜿甚した。 本菌のプロトプラストの調補は以䞋の通りであ
る。mlのCHG培地で30℃で䞀晩増殖させた埌
再床mlのCMG培地に怍菌し察数増殖期䞭期
562mΌにおける吞光床0.4たで増殖させた。こ
れに最終濃床が0.6ナニツトmlになるようにペ
ニシリンを添加し、さらに1.5時間培逊した。
mlを集菌し、SMMP0.2Mシナヌクロヌス、
10mMマレむン酞、10mM塩化マグネシりム及び
1.75ペナツセむプロスDifcoで掗浄埌、10
mgmlのリゟチヌムを含むSMMP1.0mlに懞濁し、
30℃で20時間静眮した。プロトプラストが圢成さ
れおいるのを確認埌6000rpm10分の遠心分離によ
り菌䜓を集めた。0.2MMgSO4・7H2Oを含む
SMM0.25Mシナヌクロヌス、10mMマレむン酞
及び10mM塩化マグネシりムを含むPH6.51.0ml
で掗浄埌、0.5mlのSMMPに懞濁し、プロトプラ
スト懞濁液ずしお実隓に甚いた。 䞊蚘の方法により調補されたプロトプラスト
5Ό及びDNA10Όの混合液に倍濃床のSMM
0.5Mシナヌクロヌス、20mMマレむン酞及び
20mM塩化マグネシりムを含む、PH6.510Ό及
び1MEDTA 1Όを混合埌、40PEGポリ゚チ
レングリコヌル600075Ό添加し、混合、宀
枩に分間静眮。0.5mlのSMMPを加え、掗浄埌
mlのSMMPに懞濁した。フロラムプニコヌ
ル耐性遺䌝子を発珟させるため30℃で時間振盪
し、再生培地トリスヒドロキシルアミン12g/
、KG10.5g/、グルコヌス10g/、MgCl2・
6H2O8.1g/、CaCl2・2H2O 2.2g/、粉末酵母
゚キスg/、ペプトンg/、カザミノ酞g/
、K2HPO40.2g/、コハク酞ナトリりム ・
2H2O 135g/、クロラムプニコヌル3ÎŒg/ml及
び寒倩末g/を含むPH7.0䞊に塗垃し、30℃
で週間培逊した。生じたクロラムプニコヌル
耐性コロニヌをメチオニン、スレオニン、リゞン
各々10mg/d及び−フルオロプニルアラニ
ン1000ÎŒg/mlを含む最少培地グルコヌス20g/
、NH4DSO410g/、尿玠g/、KH2PO41.0
、MgSO4・7H2O0.4g/、NaCl 0.05g/、
FeSO4・7H2O 10mg/、MnSO410mg/、−
ビオチン50ÎŒg/、チアミン・HCl 200ÎŒg/、
クロラムプニコヌル10mg/及び寒倩20g/を
含むPH7.0䞊に移怍し、このプレヌト䞊で生育
したコロニヌを釣り䞊げた。かくしお埗られた
−フルオロプニルアラニン、クロラムプニコ
ヌル耐性を瀺すコロニヌAJ12081FERM −
7248、FERRM BP−580により単離したプラ
スミドを制限酵玠PstIで完党分解し、アガロヌス
ゲル電気泳動を行な぀た結果プニルアラニン生
産菌の染色䜓DNAに由来する1.2Mdず1.4Mdの
PstI断片がpAJ1844のPstI切断郚䜍に搜入された
プラスミドpAJ11を有しおいた。 次にプニルアラニン、チロシンを生育に芁求
するコリスミン酞ムタヌれβサブナニツト欠損株
ブレビバクテリりム・ラクトフアヌメンタム
AJ12082FERM −7249、FERM BP−581
を受容菌ずしお本プラスミドを甚いお䞊蚘の方法
により圢質転換したずころ埗られたクロラムプ
ニコヌル耐性株はすべおがプニルアラニン、チ
ロシン芁求性を回埩しおおり、か぀プニルアラ
ニン芁求株を指暙ずした堎合にプニルアラニン
の生産が認められた。この結果本プラスミド䞊に
はは少なくずもコリスミン酞ムタヌれβサブナニ
ツトをコヌドする遺䌝子が存圚するこずが刀明し
た。 実斜䟋  実斜䟋で瀺したプロトプラスト圢質転換法を
甚いお、ブレビバクテリりム・ラクトプルメン
タムNo.64ATCC39134、メチオニン、チロシン
芁求性のプニルアラニン生産菌ブレビバクテリ
りム・ラクトプルメンタムAJ3437FERM 
−−1914、FERM BP−1071及びコリネバク
テリりム・グルタムミカムATCC113060を
pJ11を甚いお圢質転換した埌、クロラムプニ
コヌル耐性で遞択し、AJ3437よりAJ12084
FERM −7251、FERM BP−583を
ATCC13060よりAJ12083FERM −7250、
FERM BP−582を埗た。各圢質転換株が
pAJ11を有しおいるのをアガロヌスゲル電気泳動
により確認埌、プニルアラニン生産培地グル
コヌス130g/、NH42SO420g/、KH2PO41
、MgSO4・7H2O1g/、MnSO4・7H210
mg、ビオチン50ÎŒg/ml、チアミン・HC12mg/
、倧豆蛋癜酞加氎分解液、「味液」50ml/。酢
酞ml/、フマル酞12g/及び炭酞カルシりム
50g/を含む、ただしATCC39134及びAJ12081
の培逊の際にはリゞン、スレオニン、メチオニン
を各15mg/d、AJ3437FERM −1914、
FERM BP−1071及びAJ12084にはメチオニ
ン、チロシンを各40mg/dを添加した。PH7.0
20mlに怍菌し、30℃で日間、あるいは日間振
盪培逊した。結果を第衚に瀺した。 第  è¡š 菌 æ ª −プニルアラニン 蓄積量 (mg/d) ATCC39134 0.0 AJ 12081 41 ATCC13060 2.0 AJ 12083 15 AJ 3437 1700 AJ 12084 1900
【図面の簡単な説明】
第図耇合プラスミドpAI655の制限酵玠切
断地図、第図耇合プラスミドpAJ611の制限
酵玠切断地図、第図耇合プラスミドpAJ1844
の制限酵玠切断地図、第図耇合プラスミド
pAJ440の制限酵玠切断地図、第図耇合プラ
スミドpAJ3148の制限酵玠切断地図。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  コリネホルム・グルタミン酞生産菌に属する
    DNA䟛䞎菌より埗られるコリスミン酞ムタヌれ
    βサブナニツト遺䌝子をコヌドするDNA断片が、
    コリネホルム・グルタミン酞生産菌の菌䜓内で自
    埋耇補できるベクタヌプラスミドに接続されお、
    コリネホルム・グルタミン酞生産菌に属し、メチ
    オニン及びチロシン芁求性、−フルオロプニ
    ルアラニン耐性であるDNA受容菌に導入されお
    埗られる−プニルアラニン生産胜を有する埮
    生物を培逊し、培逊液䞭に蓄積された−プニ
    ルアラニンを採取するこずを特城ずする−プ
    ニルアラニンの補造法。  遺䌝子がプニルアラニンアンタゎニストに
    耐性を有するコリネホルム・グルタミン酞生産菌
    より埗られたものである特蚱請求の範囲第項蚘
    茉の補造法。
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