JPS58134994A - 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法Info
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- JPS58134994A JPS58134994A JP57017089A JP1708982A JPS58134994A JP S58134994 A JPS58134994 A JP S58134994A JP 57017089 A JP57017089 A JP 57017089A JP 1708982 A JP1708982 A JP 1708982A JP S58134994 A JPS58134994 A JP S58134994A
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- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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- C12P13/222—Phenylalanine
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は発酵法によるし一フェニルアラニンの製造法
に関する。
に関する。
従来、発酵法によるし一フェニルアラニンの製造法につ
いては、バチルス属（特開昭４８〜６７４８８）、ブレ
ビバクテリウム属又はミクロフッカスＲ（特公昭ａ ７
−ａ ３４５、同シｌ−２１０７９、同５１−２８７１
２、同５６−６４７９３）等の変異株を用いる方法が知
られている。
いては、バチルス属（特開昭４８〜６７４８８）、ブレ
ビバクテリウム属又はミクロフッカスＲ（特公昭ａ ７
−ａ ３４５、同シｌ−２１０７９、同５１−２８７１
２、同５６−６４７９３）等の変異株を用いる方法が知
られている。
本発明者らは上述の様な従来のし一フェニルアラニンの
製造法に対しフェニルアラニ／７ンタゴンストに耐性を
有するバチルス属の変異株の染色体より得た少くともｐ
ｈｅ Ａ遺伝子を含む遺伝子領域が組み込まれているベ
クターを含有しているバチルス属の細菌が、高い収率で
Ｌ−フェニルアラニンを生産することを知った。本発明
はこの知見に基づいて完成されたものである。
製造法に対しフェニルアラニ／７ンタゴンストに耐性を
有するバチルス属の変異株の染色体より得た少くともｐ
ｈｅ Ａ遺伝子を含む遺伝子領域が組み込まれているベ
クターを含有しているバチルス属の細菌が、高い収率で
Ｌ−フェニルアラニンを生産することを知った。本発明
はこの知見に基づいて完成されたものである。
本発明でいうフェニル７ラニン７ンタゴニストとはバチ
ルス属の微生物の増殖を抑制するようなものであるがそ
の抑制はＬ−フェニルアラニンが培地中に共存すれば全
体的にまたは部分的に解除されるようなものである。例
えば、０−＋ｍ−又はｐ−フルオルフェニルアラニン、
ｏ−＋ｍ−又はｐ−７ミノフエニルアラニン、β−フェ
ニルセリン、シクロヘキシルアラニン、α−７ミノーβ
−フエニルエタンスルホン酸、０−ｌｍ−又はｐ−ブロ
モフェニルアラニン、β−２−チェニルアラニン、β−
３−チェニルアラニン、ｌ−シクロペンテン−１−アラ
ニン、１−シクロヘキセン−１−７ラニン、２−アミノ
−４−メチル−ヘキセン酸、５−（１，２−ジクロロビ
ニル）−システィン、β−４−ピリジルアラニン、β−
２−ピリジルアラニン、β−４−Ｊ４”（ｇ’ｙ”ゾル
アラニン、ｐ−二トローフェニルアラニン等ヲいう。
ルス属の微生物の増殖を抑制するようなものであるがそ
の抑制はＬ−フェニルアラニンが培地中に共存すれば全
体的にまたは部分的に解除されるようなものである。例
えば、０−＋ｍ−又はｐ−フルオルフェニルアラニン、
ｏ−＋ｍ−又はｐ−７ミノフエニルアラニン、β−フェ
ニルセリン、シクロヘキシルアラニン、α−７ミノーβ
−フエニルエタンスルホン酸、０−ｌｍ−又はｐ−ブロ
モフェニルアラニン、β−２−チェニルアラニン、β−
３−チェニルアラニン、ｌ−シクロペンテン−１−アラ
ニン、１−シクロヘキセン−１−７ラニン、２−アミノ
−４−メチル−ヘキセン酸、５−（１，２−ジクロロビ
ニル）−システィン、β−４−ピリジルアラニン、β−
２−ピリジルアラニン、β−４−Ｊ４”（ｇ’ｙ”ゾル
アラニン、ｐ−二トローフェニルアラニン等ヲいう。
少くともｐｈｅＡ遺伝子を含む遺伝子領域の供学菌はバ
チルス属のフェニルアラニンアンタゴニストに耐性を有
する変異株ならどの様な菌株でもよいが耐性のより高い
ものが望ましい。また多くの場合し一フェニルアラニン
生産能がより高いものを遺伝子供学園として用いればよ
りよい結果が得られる。
チルス属のフェニルアラニンアンタゴニストに耐性を有
する変異株ならどの様な菌株でもよいが耐性のより高い
ものが望ましい。また多くの場合し一フェニルアラニン
生産能がより高いものを遺伝子供学園として用いればよ
りよい結果が得られる。
遺伝子供学園より染色体ＤＮＡを抽出する方法は、例え
ばＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ ８９ ＋ １０
６５（＋９６５）ｔこ記載されているような通常の方法
で行うことかできる。ベクターＤＮＡとしては、どのよ
うなものでもよい。例えばスタフィロコッカス属微生物
由来のｐＴ１２７、ｐｃ１９４、 ｐＣ２２１％ ｐＣ
２２３、ｐＵＢ１１２ （以上 Ｐｒｏｃ 。
ばＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ ８９ ＋ １０
６５（＋９６５）ｔこ記載されているような通常の方法
で行うことかできる。ベクターＤＮＡとしては、どのよ
うなものでもよい。例えばスタフィロコッカス属微生物
由来のｐＴ１２７、ｐｃ１９４、 ｐＣ２２１％ ｐＣ
２２３、ｐＵＢ１１２ （以上 Ｐｒｏｃ 。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳ／’＋ ユ
４． １６８０（１９７７）参照）、ｐＵＢｌ １０
（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ １３４ ＋３１８
（１９７８）参照）、ｐＴＰ４、ｐＴＰ５（以上Ｍｉｃ
ｒｏｂ’ｉｏ１．Ｌｅｔｔｅｒｓ＋ ５＋ ５５’
（１９７８）参照）、枯草菌由来のｐＬｓ１５、ｐＬＳ
２８ （以上Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ エエエ
、 ６９９（１９７？）参照）、ｐＬｓ１３（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、＋、１２９＋ １４８７（１９７
７） 参照）、ｐＰＬｌ、ｐＰＬ２（以上Ｊ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、＋ 上２４． ４８４（１９７５）参
照）等がある。
４． １６８０（１９７７）参照）、ｐＵＢｌ １０
（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ １３４ ＋３１８
（１９７８）参照）、ｐＴＰ４、ｐＴＰ５（以上Ｍｉｃ
ｒｏｂ’ｉｏ１．Ｌｅｔｔｅｒｓ＋ ５＋ ５５’
（１９７８）参照）、枯草菌由来のｐＬｓ１５、ｐＬＳ
２８ （以上Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ エエエ
、 ６９９（１９７？）参照）、ｐＬｓ１３（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、＋、１２９＋ １４８７（１９７
７） 参照）、ｐＰＬｌ、ｐＰＬ２（以上Ｊ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、＋ 上２４． ４８４（１９７５）参
照）等がある。
染色体ＤＮＡ及びベクターＤＮＡはそれぞれ制限エンド
ヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれのベクターに
は、適した制限エンドヌクレアーゼがあるが、それは上
記ベクターについての記載がある文献に示されている。
ヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれのベクターに
は、適した制限エンドヌクレアーゼがあるが、それは上
記ベクターについての記載がある文献に示されている。
染色体ＤＮＡについテハ制限エンドヌクレアーゼによる
切断が部分的に行なわれるようｔこ反応条件を調節すれ
ば多くの種類の制限酵素が使用できる。
切断が部分的に行なわれるようｔこ反応条件を調節すれ
ば多くの種類の制限酵素が使用できる。
かくして得られた染色体ｐＮＡ断片と、切断されたベク
ターＤＮＡとを連結せしめる方法はりガーゼを用いる通
常の方法が使用できる。一方、ターミナルトランスフェ
ラーゼを用いて染色体ＤＮＡ断片と開裂したベクターＤ
ＮＡとに、デオキシアデニル酸とデオキシシチジル酸を
それぞれ付加し、混食した後アニーリングして連結せし
める方法も利用し得る。
ターＤＮＡとを連結せしめる方法はりガーゼを用いる通
常の方法が使用できる。一方、ターミナルトランスフェ
ラーゼを用いて染色体ＤＮＡ断片と開裂したベクターＤ
ＮＡとに、デオキシアデニル酸とデオキシシチジル酸を
それぞれ付加し、混食した後アニーリングして連結せし
める方法も利用し得る。
かくして得られた染色体ＤＮＡ断片とベクターの結合物
の受容菌はバチルス属の微生物ならばどのようなもので
もよいが、Ｌ−フェニルアラニン要求菌を用いれば形質
転換株を選択する際に好都合テする。もちろんよりｔ、
７フエニルアラニン生産能が高い菌株を用いれば、より
好ましい結果が得られる。
の受容菌はバチルス属の微生物ならばどのようなもので
もよいが、Ｌ−フェニルアラニン要求菌を用いれば形質
転換株を選択する際に好都合テする。もちろんよりｔ、
７フエニルアラニン生産能が高い菌株を用いれば、より
好ましい結果が得られる。
組換えＤＮＡを上・記のようなりＮＡ受容面に導入する
には、例えばＭｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、＋
１６８゜ｌ１１（＋９７９）に記載されているような
通常の形質転換法が使用できる。
には、例えばＭｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、＋
１６８゜ｌ１１（＋９７９）に記載されているような
通常の形質転換法が使用できる。
形質転換株のうちよりＬ−７エニルアラニン生産能な有
し、フェニルアラニンアンタゴニスト耐性ｔこ関部する
少くともｐｈｅ Ａ遺伝子を含む遺伝子領域が組み込ま
れているベクターを含有する形質転換株を選択するりこ
け、例えばＤＮＡ受容菌としてＬ−フェニルアラニン要
求＃ｉ（ｐｈｅＡ 遺伝子Ｘ損株）を用い、Ｌ−フェニ
ルアラニンを含有しない培地に生育し得るような菌株を
選択すればよい。
し、フェニルアラニンアンタゴニスト耐性ｔこ関部する
少くともｐｈｅ Ａ遺伝子を含む遺伝子領域が組み込ま
れているベクターを含有する形質転換株を選択するりこ
け、例えばＤＮＡ受容菌としてＬ−フェニルアラニン要
求＃ｉ（ｐｈｅＡ 遺伝子Ｘ損株）を用い、Ｌ−フェニ
ルアラニンを含有しない培地に生育し得るような菌株を
選択すればよい。
また、ベクターＤＮＡのマーカーの性質を併せもつ菌株
を選別できるような培地を用いればより選別が容易であ
る。このようにして一旦選別されたｐｈｅＡ遺伝子領域
が組み込まれている組換えベクターはＤＮＡ受容菌より
抽出後他のＤＮＡ受容菌、例えばＬ−フェニルアラニン
生産能を有する受容菌に導入する事ができる。
を選別できるような培地を用いればより選別が容易であ
る。このようにして一旦選別されたｐｈｅＡ遺伝子領域
が組み込まれている組換えベクターはＤＮＡ受容菌より
抽出後他のＤＮＡ受容菌、例えばＬ−フェニルアラニン
生産能を有する受容菌に導入する事ができる。
かくして得られたし一フェニルアラニン生産薗を用いて
Ｌ−フェニルアラニンを製造する方法は従来のし一フェ
ニルアラニン生産菌の培養方法と特に変らない。即ち、
培地としては炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に
応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量要素を含有する
通常のものである。炭素源としてはグルコース、シュー
クロース等及びこれらを含有する澱粉加水分解物等が用
いられる。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩その他が使用できる。
Ｌ−フェニルアラニンを製造する方法は従来のし一フェ
ニルアラニン生産菌の培養方法と特に変らない。即ち、
培地としては炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に
応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量要素を含有する
通常のものである。炭素源としてはグルコース、シュー
クロース等及びこれらを含有する澱粉加水分解物等が用
いられる。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩その他が使用できる。
培養は好気的条件下で培地のｐＨ及び温度を適宜調節し
つつ、実質的にＬ−フェニルアラニンの生成蓄積が停止
するまで行なわれる。
つつ、実質的にＬ−フェニルアラニンの生成蓄積が停止
するまで行なわれる。
かくして培養液中には著量のＬ−フェニルアラニンが生
成蓄積される。培養液よりＬ−フェニルアラニンを採取
するには通常の方法が適用できる。
成蓄積される。培養液よりＬ−フェニルアラニンを採取
するには通常の方法が適用できる。
実施例
バチルス・ズブチリスＡＪ１１？１１（アルギニン、ロ
イシン１［要求株）からＮ−メチル−Ｎ’−二トローＮ
−二トロンクアニジン変異処理（ｔｏｏ。
イシン１［要求株）からＮ−メチル−Ｎ’−二トローＮ
−二トロンクアニジン変異処理（ｔｏｏ。
μＶ／渭／、ＯＣ，３０分）によって誘導したし一フェ
ニルアラニン生産菌ＡＪ １１７７３ （ＦＥＲＭ−Ｐ
６３１９ ） （ＤＬ−ｍ−フローフェニルアラニン
耐性ごルギニン、ロイシン複要求性）を原株とし、これ
より次の様な方法で新規ヒスチジン生産菌を造成した。
ニルアラニン生産菌ＡＪ １１７７３ （ＦＥＲＭ−Ｐ
６３１９ ） （ＤＬ−ｍ−フローフェニルアラニン
耐性ごルギニン、ロイシン複要求性）を原株とし、これ
より次の様な方法で新規ヒスチジン生産菌を造成した。
（１１染色体ＤＮＡの調製
ＡＪ１１７７３株をＩｔのｒ Ｂａｃｔ −Ｐｅｎａｓ
ｓａｙＢｒｏｔｈ Ｊ （商品名Ｄｌｌｃｏ製）中３０
ｃで約２時間振盪培養を行ない対数増殖期の菌体を集画
後、通常のＤＮＡ抽出法（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
、 ８９ ＋１０６５ （１９６５））により染色体
ＤＮＡを抽出、精製し最終３．８ｍｇを得た。
ｓａｙＢｒｏｔｈ Ｊ （商品名Ｄｌｌｃｏ製）中３０
ｃで約２時間振盪培養を行ない対数増殖期の菌体を集画
後、通常のＤＮＡ抽出法（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
、 ８９ ＋１０６５ （１９６５））により染色体
ＤＮＡを抽出、精製し最終３．８ｍｇを得た。
（２） 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入少なく
ともｐｈｅＡ ｇｅｎｅを含む遺伝子領域をクローニン
グするため、そのベクターとなる自己増殖ＤＮＡとして
カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性プラスミドの１１
１ｐＵＢ１１０を用いた。
ともｐｈｅＡ ｇｅｎｅを含む遺伝子領域をクローニン
グするため、そのベクターとなる自己増殖ＤＮＡとして
カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性プラスミドの１１
１ｐＵＢ１１０を用いた。
（１）で得た染色体ＤＮＡｌ０μ？とベクターＤＮＡ５
μＶをそれぞれとり、各々制限エンドヌクレアーゼの１
種ＥｃｏＲＩを３７Ｃ１時間作用させてＤＮＡ鎖を切断
した。６６Ｃ１１０分間の熱処理後両反応液を混合しＡ
ＴＰ及びジチオスライドール存在下、Ｔ４ファージ由来
のＤＮＡリガーゼにて１Ｏｒにて２４時間、ＤＮＡ鎖の
連結反応を行なった。
μＶをそれぞれとり、各々制限エンドヌクレアーゼの１
種ＥｃｏＲＩを３７Ｃ１時間作用させてＤＮＡ鎖を切断
した。６６Ｃ１１０分間の熱処理後両反応液を混合しＡ
ＴＰ及びジチオスライドール存在下、Ｔ４ファージ由来
のＤＮＡリガーゼにて１Ｏｒにて２４時間、ＤＮＡ鎖の
連結反応を行なった。
＋３１７！ニルアラニン生産遺伝子を担ったプラスミド
ｔこよる形質転換 バチルス拳ズブチリスＡＪ１１７１１（アルギニン、ロ
イシン複要求性）からニトロソグアニジン変異処理ｔこ
よって誘導したし一フェニルアラニン要求株（ｐｈｅＡ
欠損株）ＡＪ１１７？２（ＦＥＲＭ−Ｐ６３１８
’）をｒ Ｐｅｎａｓｓａｙ ＢｒｏｔｈＪ（Ｄｉｌｃ
ｏ ）に接種して３０ｒにて一晩振盪培養を行ない第１
培養培地（グルコースｏ、５ｔ／ｄｌ。
ｔこよる形質転換 バチルス拳ズブチリスＡＪ１１７１１（アルギニン、ロ
イシン複要求性）からニトロソグアニジン変異処理ｔこ
よって誘導したし一フェニルアラニン要求株（ｐｈｅＡ
欠損株）ＡＪ１１７？２（ＦＥＲＭ−Ｐ６３１８
’）をｒ Ｐｅｎａｓｓａｙ ＢｒｏｔｈＪ（Ｄｉｌｃ
ｏ ）に接種して３０ｒにて一晩振盪培養を行ない第１
培養培地（グルコースｏ、５ｔ／ｄｌ。
（ＮＨ４）、５ｏ４０．２ ｔｌｄｉ、 ＫＨ，ＰＯ４
０，６ｆ／ｄｉ。
０，６ｆ／ｄｉ。
Ｋ、ＨＰＯ４１，４ｆ ／ ｄ１１ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
００，０２ｆ／ｄｌ。
００，０２ｆ／ｄｌ。
クエン酸ナトリウムｏ、１ｔ／ｄｉ、酵母エキスｏ、２
ｔ／ｄｌ、Ｌ−フェニルアラニンｓ ｍｇ ／ ｄｉ
、ｔし一アルギニン２５１Ｉｇ／ｄｅ及びＬ−ロイシン
５ｍｇ ／ ｔｔｔを含む）に接種し３７Ｃｒ−て４時
間振盪培養を行なった後、さらに第１培養培地（グルー
ｒ −Ｘ ｏ、ｓ ｔ ７ｔｔｔ、 （ＮＨ４）、ｓ
ｏ、０．２ ｔ ７ｊｔ、。
ｔ／ｄｌ、Ｌ−フェニルアラニンｓ ｍｇ ／ ｄｉ
、ｔし一アルギニン２５１Ｉｇ／ｄｅ及びＬ−ロイシン
５ｍｇ ／ ｔｔｔを含む）に接種し３７Ｃｒ−て４時
間振盪培養を行なった後、さらに第１培養培地（グルー
ｒ −Ｘ ｏ、ｓ ｔ ７ｔｔｔ、 （ＮＨ４）、ｓ
ｏ、０．２ ｔ ７ｊｔ、。
ＫＨ，ＰＯ，Ｑ、６ ｔｌｄｉ、Ｋ、ＨＰＯ４１，４ｆ
／ｄｅ、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，１２ｆ／ｄ７！、ク
エン酸ナトリウム０．１ｔ／ｄｔ、酵母エキス０．０２
ｔｌｄｔ、 Ｌ−アルギニン５ ｍｇ ／ ｄｌ及び
Ｌ−ロイシン０．５ｍｆｌ ／ ｄｌを含む）へ接種し
３７Ｃにて１．６時間振盪培養を行なうことによってい
わゆるコンピテントな（ＤＮＡ取込能を有する）細胞を
調製した（参考文献； Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ：１．＋
８１ ＋ ７４１（１９６１））。このコンピテ
ント細胞懸濁液に（２）で得たＤＮＡの溶液を加えて３
７Ｃでさらに２時間振盪培養を行なって形質転換反応を
完了させた後、細胞懸濁液をカナマイシン５μｆｅｄ含
有最小培地プレー） （ＫＨ，ＰＯ４０，６ｆ ／ｄｔ
。
／ｄｅ、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，１２ｆ／ｄ７！、ク
エン酸ナトリウム０．１ｔ／ｄｔ、酵母エキス０．０２
ｔｌｄｔ、 Ｌ−アルギニン５ ｍｇ ／ ｄｌ及び
Ｌ−ロイシン０．５ｍｆｌ ／ ｄｌを含む）へ接種し
３７Ｃにて１．６時間振盪培養を行なうことによってい
わゆるコンピテントな（ＤＮＡ取込能を有する）細胞を
調製した（参考文献； Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ：１．＋
８１ ＋ ７４１（１９６１））。このコンピテ
ント細胞懸濁液に（２）で得たＤＮＡの溶液を加えて３
７Ｃでさらに２時間振盪培養を行なって形質転換反応を
完了させた後、細胞懸濁液をカナマイシン５μｆｅｄ含
有最小培地プレー） （ＫＨ，ＰＯ４０，６ｆ ／ｄｔ
。
Ｋ、ＨＰｏ、 １．４ Ｗ／ｄｉ、（ＮＨ４）、 ５
ｏ４０．２ ｆ ／ｄｌ。
ｏ４０．２ ｆ ／ｄｌ。
クエン酸ナトリウム０．１ ｆ／ｄｉ、 Ｍｇ５Ｏ，Φ
７Ｈ９００，０２ｆ／ｄｌ、及びグルツー；ｘ、０．６
ｔ７ｄｌを含みｐ）（７，２に調節した培地を基本最小
培地とし、これに寒天２％及び使用菌の栄養要求物質り
一アルギニン、Ｌ−ロイシンヲ各々１０ｍｇ／ｄｌさ１
’）ｔｌ：ＤＬ−ｍ−フロロフェニルアラニンを１００
ｍｇ ／ ｄｌ添加した）に塗抹し３７Ｃで培養した。
７Ｈ９００，０２ｆ／ｄｌ、及びグルツー；ｘ、０．６
ｔ７ｄｌを含みｐ）（７，２に調節した培地を基本最小
培地とし、これに寒天２％及び使用菌の栄養要求物質り
一アルギニン、Ｌ−ロイシンヲ各々１０ｍｇ／ｄｌさ１
’）ｔｌ：ＤＬ−ｍ−フロロフェニルアラニンを１００
ｍｇ ／ ｄｌ添加した）に塗抹し３７Ｃで培養した。
３日後に上記培地上に２個のコロニーが出現したのでこ
れを釣菌し各クローンをそれぞれ純粋１こ分離した。
れを釣菌し各クローンをそれぞれ純粋１こ分離した。
得られた形質転換株はいずれも用いた受容菌ＡＪ＋１７
７２と異なってフェニルアラニン非要求性かつＤＬ−ｍ
−フロルフェニルアラニンを性である。このことは染色
体ＤＮＡ上のフェ＝ ルア ５ニン生合成及ヒフェニル
アラニンアンタゴニスト耐性に開学する少なくともｐｈ
ｅＡ遺伝子を含む遺伝子領域がｐＵＢ１１０プラスミド
上のＤＮＡに挿入されて生じた新規プラスミドＤＮＡを
取込んだ細胞のみがコロニーとして選択されてきたこと
を意味する。
７２と異なってフェニルアラニン非要求性かつＤＬ−ｍ
−フロルフェニルアラニンを性である。このことは染色
体ＤＮＡ上のフェ＝ ルア ５ニン生合成及ヒフェニル
アラニンアンタゴニスト耐性に開学する少なくともｐｈ
ｅＡ遺伝子を含む遺伝子領域がｐＵＢ１１０プラスミド
上のＤＮＡに挿入されて生じた新規プラスミドＤＮＡを
取込んだ細胞のみがコロニーとして選択されてきたこと
を意味する。
（４） フェニルアラニン生合成系遺伝子領域を担う
ｐＵＢｌｌｏの抽出（３１で得られたクローンのうちＡ
Ｊ１１７７４（ＦＥＲＭ−Ｐ６３２０ ）を用いてＣ
，１，Ｋａｄｏらの方法（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
＋１４５、 １３６５（１９８１））に基づいたフェノ
ールによるＤＮＡ抽出法により菌体のＤＮＡを抽出しア
ガロースゲル電気泳動によりプラスミドＤＮＡと染色体
ＤＮＡを分離し、プラスミドＤＮＡを含むアガロースゲ
ルよりフェニルアラニン生合成系遺伝子領域を担うｐＵ
Ｂｌｌｏを抽出した後、透析して精製ビた。
ｐＵＢｌｌｏの抽出（３１で得られたクローンのうちＡ
Ｊ１１７７４（ＦＥＲＭ−Ｐ６３２０ ）を用いてＣ
，１，Ｋａｄｏらの方法（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
＋１４５、 １３６５（１９８１））に基づいたフェノ
ールによるＤＮＡ抽出法により菌体のＤＮＡを抽出しア
ガロースゲル電気泳動によりプラスミドＤＮＡと染色体
ＤＮＡを分離し、プラスミドＤＮＡを含むアガロースゲ
ルよりフェニルアラニン生合成系遺伝子領域を担うｐＵ
Ｂｌｌｏを抽出した後、透析して精製ビた。
こうして得られた新規プラスミドを（３）で述べたのと
同様の方法によって今度は原株のＡＪ１１７７３（フェ
ニルアラニン非要求性でＬ−フェニルアラニンを生産す
る）へ形質転換法によす挿入し、カナマイシン耐性株Ａ
Ｊ＋１７７５（ＦＥＲＭ−ｐ ６３２１ ）を得た。
同様の方法によって今度は原株のＡＪ１１７７３（フェ
ニルアラニン非要求性でＬ−フェニルアラニンを生産す
る）へ形質転換法によす挿入し、カナマイシン耐性株Ａ
Ｊ＋１７７５（ＦＥＲＭ−ｐ ６３２１ ）を得た。
＋５１ 新規フェニルアラニン／ｌｅｔこよるフェニ
ルアラニン生産 （４）で得られたＡＪ１１７７４、ＡＪ１１７７５株を
培養した結果を第１表に示す。培養は５００ｍ１ 肩付
フラスコ中にフェニルアラニン生産培地（グルコース８
ｆ／ｄｔ、 ＮＨ４Ｃｌ １ ｆ／ｄｉ。
ルアラニン生産 （４）で得られたＡＪ１１７７４、ＡＪ１１７７５株を
培養した結果を第１表に示す。培養は５００ｍ１ 肩付
フラスコ中にフェニルアラニン生産培地（グルコース８
ｆ／ｄｔ、 ＮＨ４Ｃｌ １ ｆ／ｄｉ。
ＫＣＩ Ｏ，２ｔ／ｄｉ、 ＫＨ，ＰＯ４０，１ｔ／
ｄｌ。
ｄｌ。
ＭｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ，０４ｔ／ｄｌ、 ｒカザミ
ノ酸」（Ｄｉｆｃｏ ） ０．４ ｔ ／ｄｔ、 Ｆ
ｅ５０．・４ＨｓＯ１ｍｙ／ｄｔ１ＭｎＳＯ１拳４Ｈ，
１０１１１／／ｄｊ、 Ｌ−フルギニン、Ｌ−ａイシン
各２０＠９／ｄｌ及びＣａＣ０゜４９７ｄｌを含む（ｐ
Ｈ７−０））を２０ｘｌずつ分注し菌体を接種後３０Ｃ
，９６時間振盪培養して行なった。尚、ＡＪ１１７？４
とＡＪ１１７７５のときはカナマイシン５μｆ ７１ｘ
ｌを生産培地に添加しである。対照として原株ＡＪ１１
７７３を同様の条件で発酵を行なった。
ノ酸」（Ｄｉｆｃｏ ） ０．４ ｔ ／ｄｔ、 Ｆ
ｅ５０．・４ＨｓＯ１ｍｙ／ｄｔ１ＭｎＳＯ１拳４Ｈ，
１０１１１／／ｄｊ、 Ｌ−フルギニン、Ｌ−ａイシン
各２０＠９／ｄｌ及びＣａＣ０゜４９７ｄｌを含む（ｐ
Ｈ７−０））を２０ｘｌずつ分注し菌体を接種後３０Ｃ
，９６時間振盪培養して行なった。尚、ＡＪ１１７？４
とＡＪ１１７７５のときはカナマイシン５μｆ ７１ｘ
ｌを生産培地に添加しである。対照として原株ＡＪ１１
７７３を同様の条件で発酵を行なった。
第 １ 表
特許出願人 味の素株式会社
Claims (1)
- バチルス属のフェニルアラニンアンタゴニストに耐性を
有する変異株より得たｐｈｅ Ａ遺伝子を少くとも含む
遺伝子領域が組み込まれているベクターを、バチルス属
の微生物に含有せしめたし一フェニルアラニン生産性微
生物を培養し、培地中に蓄積したし一フェニルアラニン
ヲ採取する事を特徴とするし一フェニルアラニンの製造
法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57017089A JPS58134994A (ja) | 1982-02-05 | 1982-02-05 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
| EP83101033A EP0085958A3 (en) | 1982-02-05 | 1983-02-03 | Method for producing l-phenylalanine by fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57017089A JPS58134994A (ja) | 1982-02-05 | 1982-02-05 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58134994A true JPS58134994A (ja) | 1983-08-11 |
Family
ID=11934254
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57017089A Pending JPS58134994A (ja) | 1982-02-05 | 1982-02-05 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0085958A3 (ja) |
| JP (1) | JPS58134994A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6078590A (ja) * | 1983-10-07 | 1985-05-04 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4663285A (en) * | 1981-01-06 | 1987-05-05 | The Public Health Laboratory Service Board | Chimeric plasmids |
| JPS6066984A (ja) * | 1983-09-22 | 1985-04-17 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−フェニルアラニンの製造法 |
| JPS63500215A (ja) | 1985-06-24 | 1988-01-28 | ザ ヌトラスウイ−ト カンパニ− | アミノ酸合成用の複合プラスミド |
| US4970157A (en) * | 1986-08-12 | 1990-11-13 | Sagami Chemical Research Center | Isolated phenylalanine dehydrogenase gene and process for production of phenylalanine dehydrogenase |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3660235A (en) * | 1969-08-22 | 1972-05-02 | Ajinomoto Kk | Method for producing phenylalanine by fermentation |
| JPS561890A (en) * | 1979-06-15 | 1981-01-10 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-phenylalanine by fermentation |
-
1982
- 1982-02-05 JP JP57017089A patent/JPS58134994A/ja active Pending
-
1983
- 1983-02-03 EP EP83101033A patent/EP0085958A3/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6078590A (ja) * | 1983-10-07 | 1985-05-04 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
| JPH0347840B2 (ja) * | 1983-10-07 | 1991-07-22 | Ajinomoto Kk |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0085958A3 (en) | 1984-02-22 |
| EP0085958A2 (en) | 1983-08-17 |
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