JPH0511958B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はブレビバクテリウム属又はコリネバク
テリウム属細菌とバチルス属細菌の効率的な細胞
融合方法に関する。 紫外線照射が変異誘発剤処理による人工変異法
は時間と多くの労力を要するものの発酵工業で使
用される微生物の実用的な育種方法として従来採
用されてきているが、近年、このような従来の育
種法に対して、遺伝子操作による組み換えDNA
技術、プロトプラスト融合法あるいは遺伝子増幅
法等一連の新しい育種方法が急速に開発され、イ
ンターフエロン、インシユリン、ホルモン等従来
発酵法では生産できなかつた有用な物質が微生物
によつて生産されるようになつて来ている。これ
ら育種法の応用微生物工業に及ぼす影響ははかり
知れないものである。この内、組み換えDNA法
によつて微生物を育種するためには正確な遺伝子
地図、ベクター、あるいは宿主の開発がなされて
いることが前提条件となる。ところが、アミノ
酸、核酸あるいは抗生物質生産菌については宿
主、ベクターの開発が遅れているため直ちに適用
できない。 これに対し、プロトプラスト融合法は微生物の
持つ自然の遺伝子組み換え能を利用する方法で遺
伝子地図が不明であり、ベクター、宿主が開発さ
れていなくても比較的簡単に適用できるものであ
り、別々に高生産性の菌株を人工変異法で誘導
し、生産性の高い菌株をプロトプラスト融合させ
て更に生産性の高い菌株を育種することが可能と
なるので、この方法も実用的な育種方法として大
いに期待されている。 今日までに、細菌のプロトプラスト融合法とし
てはブレビバクテリウム属細菌間の融合方法が報
告され、（Agr、Biol、Chem.、43(5)、1007〜
1013、1979）又コリネバクテリウム属細菌間の融
合方法（特開昭56−109587）が開発されている。
一方、酵母についてはすでに品種改良法が知られ
ている（特開昭54−163883）。 しかしながら、これら従来の方法では同種間、
あるいは同属間の細菌間のプロトプラスト融合に
とどまり、異つた属の細菌の融合法は開発されて
いない。 そこで本発明者等は同属間のみならず異つた属
の細菌の融合法、特に発酵工業に於て重要な微生
物であるブレビバクテリウム属あるいはコリネバ
クテリウム属の細菌とバチルス属細菌の融合法を
効率的に行う方法を開発することを目的として鋭
意研究を重ねた結果、夫々の細菌のプロトプラス
トをポリエチレングルコール及びカルシウムイオ
ンを10ｍＭ以上含むPH8.0〜12.0の高張液中で融
合せしめれば、異つた属の細菌間に於ても10^-3〜
10^-6の高頻度で融合が起ることを発見し本発明を
完成するに至つた。 以下、本発明の方法について説明する。 本発明は次の４つの工程を含むプロトプラスト
の融合方法であり、第２工程のプロトプラスト融
合を、ポリエチレングリコール及びカルシウムイ
オンを10ｍＭ以上含有するPH8.0〜12.0のアルカ
リ性高張液を使用する点が特徴である。 (1) 栄養細胞からプロトプラストの形成 (2) プロトプラストの融合 (3) 融合プロトプラストの細胞への復帰再生 (4) 目的とする組み換え株の選択。 栄養細胞からプロトプラストの形成方法は公知
（Agr、Biol.Chem.、43(5)、1007〜1013、1979）
の方法に従つて行われる。 栄養細胞を得るために使用する培地は菌が増殖
できる液体培地であればよく、例えば完全栄養培
地（CM培地：酵母エキス10ｇ、ポリペプトン10
ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコーズ５ｇを純水
１に含み、PH7.2に調製した培地）などが用い
られる。この培地にブレビバクテリウム、コリネ
バクテリウム又はバチルス属の微生物を接種、培
養し、リゾチーム感受性の細胞を得るため対数増
殖期にペニシリン等細胞壁合成阻害剤を微生物の
生育を抑制しないか又は半抑制する程度添加す
る。例えばペニシリンの場合では１〜20Unit／
10ml添加し、更に90分以上培養を続けて数世代増
殖せしめてリゾチーム感受性の栄養細胞を得る。 培養液から夫々細胞を分離し、これを高張液で
洗浄後、それぞれの高張最少培地に懸濁する。こ
こで使用される高張液としては公知のものを使用
すれば良く、例えば0.25Mシユークローズ、
0.25Mコハク酸２ナトリウム、20ｍＭリン酸１カ
リウム、100ｍＭリン酸２カリウム、５ｍＭ
EDTAを含みPH７〜10.5に調整したHP液等が使
用され、又、高張最少培地としては0.41Mのシユ
ークロースと0.01Mの硫酸マグネシウムを含む最
少培地が使用される。この栄養細胞懸濁液にリゾ
チーム（0.1〜10mg／ml）を加え、30−37℃に放
置する。プロトプラストの形成は、反応時間と共
に進行し光学顕微鏡で観察できる。栄養細胞がプ
ロトプラスト化されるのに要する時間は、用いた
菌株の種類、細胞培養時の添加ペニシリン濃度お
よびプロトプラスト形成に用いるリゾチーム濃度
によつて変化するが、前記条件にて約0.3〜24時
間である。 このようにして調製したプロトプラストは、適
当な高張寒天培地上でコロニーを形成し、栄養細
胞に再生する。この寒天培地は、0.3〜0.8Mコハ
ク酸２ナトリウムを含むものならば、完全栄養培
地（CM）および最少培地でもよい。 (1) プロトプラストの細胞融合工程 それぞれの親株のプロトプラストを混合して
遠心分離に付し、これをカルシウムイオンを
100ｍＭ以上含んだPH8.0〜12.0のアルカリ性高
張液に再懸濁し、これに融合促進効果のあるポ
リエチレングリコール（PEG）溶液を加え、
10ｍＭ以上のカルシウムイオン及びPEG10〜
50％の共存下、PH８〜12の条件下で細胞融合を
誘発させる。 カルシウムイオンの供給源としては溶解性の
良いカルシウム塩であれば良く、通常塩化カル
シウムを使用する。カルシウムイオンの濃度は
10ｍＭ以上、望ましくは10ｍＭ〜100ｍＭの範
囲が良く、10ｍＭ以下では融合頻度が低くて本
発明の目的を達成することはできない。 (2) 融合プロトプラストの栄養細胞への再生 再生は前記のプロトプラストの再生同様、コ
ハク酸２ナトリウム含有高張寒天培地（例えば
完全栄養培地または最少培地）上に融合プロト
プラストを接種し、その上に0.4〜1.0％寒天を
含んだ同培地を重層し、親株の栄養細胞が生育
できる温度で培養することによつて行なわれ
る。 (3) 組換え株の選択 組換え株は、再生細胞中から、両親株の特徴
的形質が検査できる標準的方法で遺伝的検査を
行い、両親株からの遺伝子を有するものを選択
することによつて同定される。 本発明のプロトプラスト融合法によるDNAの
交換または組み換えの頻度は10^-3〜10^-6と高く、
同種間、同属間の微生物の遺伝子交換をはじめと
してブレビバクテリウム属とバチルス属、コリネ
バクテリウム属とバチルス属間の異つた属の微生
物の遺伝子交換法として利用できるものである。 このように異つた属の微生物の遺伝子交換を可
能ならしめる本発明の方法は従来不可能であつた
新しい形の育種法として利用される。 例えば、澱粉資化能を有しないブレビバクテリ
ウム又はコリネバクテリウム属のアミノ酸生産菌
と澱粉資化能を有するバチルス属微生物をプロト
プラスト融合せしめ、澱粉資化能を有するアミノ
酸生産菌を育種する方法、あるいは、コリネバク
テリウム属のイノシン酸生産菌とバチルス属のデ
コイニン耐性、又は／及びサイコフラニン耐性株
をプロトプラスト融合させて、デコイニン又は／
及びサイコフラニン耐性を有する高イノシン酸生
産菌の育種等に利用することができる。 以下、実施例にて詳細に説明する。 実施例 １ ペプトン1.0ｇ／dl、酵母エキス1.0ｇ／dl、塩
化ナトリウム0.5ｇ／dlアデニン10mg／dl、キサ
ンチン10mg／dl及びシユークローズ0.5ｇ／dlを
含むPH7.2の完全栄養培地（CM培地）を大型試験
管に10ml宛分注し加熱滅菌した。この培地に同
CM寒天スラント上に生育したバチルス・ズブチ
リスAJ11790FERM−P6413（アデニン要求性、
Ｌ−アルギニン要求性、８アザグアニン耐性、サ
イコフラニン耐性、デコイニン耐性）を接種し、
31.5℃で振盪培養し、対数増殖期（菌体量10⁸
個／ml）にてペニシリンＧを３単位／10ml添加
し、更に90分間培養した。培養液から菌体を集
め、高張希釈液（HP液）で洗浄した。これをリ
ゾチーム1000μｇ／ml、シユークロース14ｇ／dl
硫酸マグネシウム0.24ｇ／dlを含む第１表の最少
培地に懸濁し、31.5℃に保持した。プロトプラス
トの形成を光学顕微鏡で観察した。プロトプラス
ト化は30分間で完了した。 同様の方法で、コリネバクテリウム・エキイ
AJ11789FERM−P6412（アデニン要求性、スル
フアグアニジン耐性、リフアンピシン耐性）を培
養し、菌体を集めた。この菌体をリゾチーム
5000μｇ／ml、シユークロース14.0ｇ／dl、硫酸
マグネシウム0.24ｇ／dlを含む第１表の高張最少
培地に懸濁し、31.5℃に保持してプロトプラスト
化を行つた。プロトプラスト化は20時間で完了し
た。

【表】 プロトプラスト化した後、AJ11789及び
AJ11790のプロトプラストを混合した後遠心分離
し、これを０〜200ｍＭの塩化カルシウムを含ん
だ高張液（HP液）に懸濁し、これに33％のポリ
エチレングリコール（PEG）溶液（PEG−6000、
純正化学製）水溶液を９倍量加え36℃に30分間保
持してプロトプラストの融合を行つた。次いで、
ポリエチレングリコール液を遠心分離してプロト
プラストを集め、上記高張液に再懸濁し、スルフ
アグアニジン１mg／ml、リフアンピシン5μｇ／
ml、８アザグアニン１mg／ml、サイコフラニン２
mg／ml、デコイニン100μｇ／dl及びコハク酸ナ
トリウムを含む高張最少寒天培地に接種し、その
上面に同寒天培地を薄層上に重層した後、31.5℃
で10日間培養して、組み換え株（アデニン要求
性、スルフアグアニジン耐性、リフアンピシン耐
性、８アザグアニン耐性、サイコフラニン耐性、
デコイニン耐性）の出現頻度を調べた。プロトプ
ラスト融合反応液のカルシウムイオンの濃度（塩
化カルシユウム）及びPHと出現頻度との関係を第
２表及び第３表に示す。

【表】

【表】 このようにして得られた組み換え株の内から
AJ11791FERM−P6414を選びその薬剤耐性を次
のようにして調べた。 Ｌ−アルギニン、グアニンそして所定の量の薬
剤を含むAV11789の最少培地を試験管に4.0ml宛
分注し、これに一定量の試験菌を接種し31.5℃で
24時間振盪培養し、培養液の562nｍに於る吸光
度を測定し生育度を調べ、相対生育度を求めた。
その結果を第４表に示す。

【表】 この結果より、プレートに出現したコロニーは
両親株の表現型を有するコリネバクテリウム属と
バチルス属との組換え株であり、これらの組換え
株はその表現型に関しては全く安定であつた。 組み換え株AJ11791を10mg／dlグアニンを含む
コリネバクテリウム・エキイAJ11789の最少澱粉
培地（グルコースの代りに澱粉を炭素源として使
用）を用いて生育を調べた結果を第５表に示す。

【表】 この結果から、組み換え株AJ11791は両親株の
表現型の他に、再に澱粉資化能を有するものであ
ることが確認された。 次に、組み換え株AJ11791の5′−イノシン酸の
生産性を調べた。 第６表に示した組成の培地（PH6.5）を最終20
mlになるよう肩付フラスコに入れ、115℃にて10
分間加熱殺菌した。

【表】 これに第７表に示す菌株を３白金耳接種し、34
℃で５日間振盪培養（110回／分、７cm振幅）し
た。 培地中に蓄積した5′−イノシン酸の蓄積を第７
表に示す。

【表】 実施例 ２ Ｓ−（２−アミノエチル）−シスチン耐性
（AEC^r）、α−クロロカプロラクタム耐性
（CCL^r）、アラニン要求性（Ala^-）のＬ−リジン
生産菌ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタ
ムAJ11082FERM−P3940及びアデニン要求性
（Ade^-）のバチルス・スブチリスAJ11159FERM
−P4121を夫々実施例１と同様の方法で培養し、
細胞のプロトプラスト化を行つた。尚、AJ11082
をプロトプラスト化する際には第８表の最少培地
を使用した。

【表】 次いで夫々のプロトプラストを混合した後遠心
分離し、100ｍＭの塩化カルシウムを含むPH10.5
のHP高張液に懸濁し、これに33％ポリエチレン
グリコール（PEG−6000）水溶液を９倍量加え、
36℃に30分間保持してプロトプラストの融合を行
つた。 プロトプラストを遠心分離して集め、これを
AEC3000μｇ／ml及び0.5Mコハク酸ナトリウムを
含む澱粉を炭素源とする第８表の最少寒天培地に
接種し、同培地（0.8％寒天培地）を重層し、
31.5℃で14日間培養し、プレート上に出現したコ
ロニーを組み換え株（AEC耐性、澱粉資化能）
として分離した。 その出現頻度は10^-6〜10^-4であつた。尚、塩化
カルシウムを添加しない場合、及びPH6.5でも同
様の実験を行つたが、このような場合には出現頻
度は10^-8以下であつた。 このようにして得られた組み換え株から
AJ11792FERM−P6415株を選びその澱粉資化能
及びAECに対する耐性度を調べた。澱粉を炭素
源とする第８表の最少培地にAECを０〜7500μ
ｇ／ml添加し、4.0ml宛試験管に分注し、試験菌
を一定量宛接種し31.5℃で24時間振盪培養し、26
倍に希釈した後562nｍに於る吸光度を測定した
その結果を第９表に示す。

【表】 次に、AJ11792のＬ−リジン生産性を調べた。 第10表の組成の培地を20ml宛、500ml容振盪フ
ラスコに入れ、110℃で10分間蒸気殺菌した。こ
れにあらかじめ、CM培地（スラント）で生育さ
した第11表に示す菌株を一白金耳づつ接種し、
31.5℃にて72時間振盪培養した。72時間培養後の
培地中のＬ−リジン生成量（Ｌ−リジン塩酸とし
て）は、第11表のごとくであつた。

【表】

【表】

【表】 第11表に示すように、融合株の親株はＬ−リジ
ンを全く生成しないが、融合株は澱粉を炭素源と
してＬ−リジンを著量蓄積することができる。 この性質は少くとも10代継代培養を続けた場合
でも安定に保持されることが確認された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
   ム属の細菌のプロトプラストとバチルス属細菌の
   プロトプラストをポリエチレングリコールと10ｍ
   Ｍ以上のカルシウムイオンを含むPH8.0〜12.0の
   高張液中で細胞融合せしめることを特徴とする細
   菌のプロトプラスト融合法。