JPS61202686A - ビオチン生産性微生物 - Google Patents
ビオチン生産性微生物Info
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- JPS61202686A JPS61202686A JP60042928A JP4292885A JPS61202686A JP S61202686 A JPS61202686 A JP S61202686A JP 60042928 A JP60042928 A JP 60042928A JP 4292885 A JP4292885 A JP 4292885A JP S61202686 A JPS61202686 A JP S61202686A
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- Japan
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- biotin
- dna
- synthetase
- desthiobiotin
- escherichia coli
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- Granted
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
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- Biotechnology (AREA)
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- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は新規微生物及びそれを用いるビオチンの製造法
に関する。
に関する。
［従来の技術］
ビオチンは動植物、微生物にとって重要なビタミンの一
種である。
種である。
従来微生物を用いたビオチンの製造法としては、パシル
ス属、クロモバクテリウム属、シュードモナス属、アー
スロバフタ−属等の微生物を用いる方法が知られている
。またこれら野生株に人工的に突然変異を生起せしめて
ビオチン生産能を付与する方法も提案されている。（特
開昭５８−６０９９６号報） ［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら微生物を用いてビオチンを製造しようとす
る場合、野生株はビオチンによる強力なフィードバック
阻害機構の為（Ｙ、 Ｉｚｕｍｉ、に、Ｏｇａｔａ、Ａ
ｄｖ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、 ２２，１５５
−１５７．１９７７）ビオチンは極少量しか生成されな
い。また変異株を用いる方法でも生成量は必ずしも満足
し得るものではなかった。
ス属、クロモバクテリウム属、シュードモナス属、アー
スロバフタ−属等の微生物を用いる方法が知られている
。またこれら野生株に人工的に突然変異を生起せしめて
ビオチン生産能を付与する方法も提案されている。（特
開昭５８−６０９９６号報） ［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら微生物を用いてビオチンを製造しようとす
る場合、野生株はビオチンによる強力なフィードバック
阻害機構の為（Ｙ、 Ｉｚｕｍｉ、に、Ｏｇａｔａ、Ａ
ｄｖ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、 ２２，１５５
−１５７．１９７７）ビオチンは極少量しか生成されな
い。また変異株を用いる方法でも生成量は必ずしも満足
し得るものではなかった。
［問題点を解決するための手段］
上記の事情に鑑み、本発明者等はこれらの手法とは異な
る遺伝子操作による胃種に着目し、ビオチン生産能の優
れた微生物を得るべく鋭意研究を重ねた結果、エシェリ
ヒア・コリ野生株を人工的に変異させることによりビオ
チンによるフィードバック阻害が解除された変異株を取
得し、該変異株よりビオチンの生合成に関与する酵素の
遺伝情報を担うＤＮＡを単離し、次いで該ＤＮＡをベク
ターＤＮＡに組み込ませた組換えＤＮＡを得、該組換え
ＤＮＡを前記変異株に導入することに成功するとともに
、かくして得られた微生物が優れたビオチン生産能を有
することを見い出し、この・知見にもとすいて本発明を
完成するに至った。
る遺伝子操作による胃種に着目し、ビオチン生産能の優
れた微生物を得るべく鋭意研究を重ねた結果、エシェリ
ヒア・コリ野生株を人工的に変異させることによりビオ
チンによるフィードバック阻害が解除された変異株を取
得し、該変異株よりビオチンの生合成に関与する酵素の
遺伝情報を担うＤＮＡを単離し、次いで該ＤＮＡをベク
ターＤＮＡに組み込ませた組換えＤＮＡを得、該組換え
ＤＮＡを前記変異株に導入することに成功するとともに
、かくして得られた微生物が優れたビオチン生産能を有
することを見い出し、この・知見にもとすいて本発明を
完成するに至った。
すなわち本発明は、（１）ピメリルＣｏＡシンテターゼ
活性、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼ
活性、７．８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフ
ェラーゼ活性、デスチオビオチンシンテターゼ活性、お
よびデスチオビオチンからビオチンへの変換に関与する
酵素活性を有し、かつビオチンによるフィードバック阻
害が解除されたエシェリヒア・コリから取得したピメリ
ルＣｏＡシンテターゼ、７−ケト−８−アミノペラルゴ
ン酸シンテターゼ、７．８−ジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフェラーゼ、デスチオビオチンシンテターゼ
、およびデスチオビオチンからビオチンへの変換に関与
する酵素（以下、これらの酵素を単にビオチン生合成酵
素と略す。）の遺伝情報を担うデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）をベクターＤＮＡに組み込んだ組換えＤＮＡを、当
該エシェリヒア・コリに含有せしめた微生物、および（
２）該微生物を培養し、培地中に生成蓄積されたビオチ
ンを採取することを特徴とするビオチンの製造法である
。
活性、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼ
活性、７．８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフ
ェラーゼ活性、デスチオビオチンシンテターゼ活性、お
よびデスチオビオチンからビオチンへの変換に関与する
酵素活性を有し、かつビオチンによるフィードバック阻
害が解除されたエシェリヒア・コリから取得したピメリ
ルＣｏＡシンテターゼ、７−ケト−８−アミノペラルゴ
ン酸シンテターゼ、７．８−ジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフェラーゼ、デスチオビオチンシンテターゼ
、およびデスチオビオチンからビオチンへの変換に関与
する酵素（以下、これらの酵素を単にビオチン生合成酵
素と略す。）の遺伝情報を担うデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）をベクターＤＮＡに組み込んだ組換えＤＮＡを、当
該エシェリヒア・コリに含有せしめた微生物、および（
２）該微生物を培養し、培地中に生成蓄積されたビオチ
ンを採取することを特徴とするビオチンの製造法である
。
以下に本発明の詳細な説明する。
に る′生 の・、整
まず、ビオチン生合成酵素活性を有するエシェリヒア・
コリ野生株（例えばエシェリヒア・コリＪＡ２２１）に
変異を誘起せしめて、ビオチン要求株（以下、ＢＲ変異
株と称す。）およびビオチンによるフィードバック阻害
が解除された変異株（以下、ＤＲ変異株と称す。）を取
得する。変異の誘起は通常の変異誘起処理により行うこ
とができ、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジンのごとき変異誘起剤で処理することによ
り実施することができる。ＢＲ変異株の取得は変異誘起
処理して得られた菌体を緩衝液で適当に希釈後、ビオチ
ンを含む最小培地寒天平板で培養し、適当数（約５０−
２００個）のコロニーが出現した平板を選び、ビオチン
無添加の最小培地平板にレプリカして培養後、レプリカ
平板をマスター平板と比較し、レプリカ平板では生育し
ないコロニーをマスター平板より釣菌分離することによ
り行う。
コリ野生株（例えばエシェリヒア・コリＪＡ２２１）に
変異を誘起せしめて、ビオチン要求株（以下、ＢＲ変異
株と称す。）およびビオチンによるフィードバック阻害
が解除された変異株（以下、ＤＲ変異株と称す。）を取
得する。変異の誘起は通常の変異誘起処理により行うこ
とができ、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジンのごとき変異誘起剤で処理することによ
り実施することができる。ＢＲ変異株の取得は変異誘起
処理して得られた菌体を緩衝液で適当に希釈後、ビオチ
ンを含む最小培地寒天平板で培養し、適当数（約５０−
２００個）のコロニーが出現した平板を選び、ビオチン
無添加の最小培地平板にレプリカして培養後、レプリカ
平板をマスター平板と比較し、レプリカ平板では生育し
ないコロニーをマスター平板より釣菌分離することによ
り行う。
このようにして得られたＢＲ変異株には例えばエシェリ
ヒア・コリＢＲ−４があげられる。本ＢＲ変異株はデス
チオビオチン添加最小培地でも生育できないことより、
デスチオビオチンからビオチンへの変換に関与する酵素
が欠損したことがわかる。
ヒア・コリＢＲ−４があげられる。本ＢＲ変異株はデス
チオビオチン添加最小培地でも生育できないことより、
デスチオビオチンからビオチンへの変換に関与する酵素
が欠損したことがわかる。
また公知のＢＲ変異株としては、例えばＪ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、 、 １１２ 、８３０−８３９ （１９
７２）に記載のＲ８７６株、Ｒ８７４株、Ｒ８７３株、
Ｒ８７７株、Ｒ８７５株（それぞれピメリルＣｏＡシン
テターゼ、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シンテタ
ーゼ、７゜８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフ
ェラーゼ、デスチオビオチンシンテターゼ、デスチオビ
オチンからビオチンへの変換に関与する酵素、が欠損し
た株）があげられる。
ｅｒｉｏｌ、 、 １１２ 、８３０−８３９ （１９
７２）に記載のＲ８７６株、Ｒ８７４株、Ｒ８７３株、
Ｒ８７７株、Ｒ８７５株（それぞれピメリルＣｏＡシン
テターゼ、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シンテタ
ーゼ、７゜８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフ
ェラーゼ、デスチオビオチンシンテターゼ、デスチオビ
オチンからビオチンへの変換に関与する酵素、が欠損し
た株）があげられる。
一方ＤＲ変異株の取得は変異誘起処理して得られた菌体
を、緩衝液で適当に希釈後、上記のようにして得たＢＲ
変異株と２．３．５−トリフェニルテトラゾリウムクロ
リドとを含むビオチン無添加の最少培地寒天平板に、一
定量のビオチン無添加の最少寒天培地を重層して作成し
た平板上で培養し、生じた小コロニーの下層がピンク色
のゾーンを呈した時、生じた小コロニーを釣菌分離する
ことによりおこなう。この原理はＤＲ変異株はビオチン
を多量に生産し、下層のＢＲ要求株の生育を助け、その
増殖に伴い２，３．５−トリフェニルテトラゾリウムク
ロリドが還元されピンク色のゾーンを呈することにあり
、従って変異が誘発されなかった野生株ではこのような
現象は観察されない。このようにして得られたＤＲ変異
株としては、例えばエシェリヒア・コリＤＲ−８５（ｆ
ｆｉ工研菌寄第８０９６号）があげられる。
を、緩衝液で適当に希釈後、上記のようにして得たＢＲ
変異株と２．３．５−トリフェニルテトラゾリウムクロ
リドとを含むビオチン無添加の最少培地寒天平板に、一
定量のビオチン無添加の最少寒天培地を重層して作成し
た平板上で培養し、生じた小コロニーの下層がピンク色
のゾーンを呈した時、生じた小コロニーを釣菌分離する
ことによりおこなう。この原理はＤＲ変異株はビオチン
を多量に生産し、下層のＢＲ要求株の生育を助け、その
増殖に伴い２，３．５−トリフェニルテトラゾリウムク
ロリドが還元されピンク色のゾーンを呈することにあり
、従って変異が誘発されなかった野生株ではこのような
現象は観察されない。このようにして得られたＤＲ変異
株としては、例えばエシェリヒア・コリＤＲ−８５（ｆ
ｆｉ工研菌寄第８０９６号）があげられる。
次いでビオチン生合成酵素の遺伝情報を担うＤＮＡ（以
下、染色体ＤＮＡと称す。）を上記ＤＲ変異株から単離
精製するには、例えばＢｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉ。
下、染色体ＤＮＡと称す。）を上記ＤＲ変異株から単離
精製するには、例えばＢｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉ。
ｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ７２．６１９−６２９（１９６
３）に記載のフェノール法等常法に従って行うことがで
きる。
３）に記載のフェノール法等常法に従って行うことがで
きる。
次に得られた染色体ＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込ん
で組換えＤＮＡｔ−調整する。染色体ＤＮＡのベクター
ＤＮＡへの組み込みは常法に従って行うことがで営る。
で組換えＤＮＡｔ−調整する。染色体ＤＮＡのベクター
ＤＮＡへの組み込みは常法に従って行うことがで営る。
例えば、染色体ＤＮＡおよびベクターＤＮＡを制限エン
ドヌクレアーゼで切断して染色体ＤＮＡ断片およびベク
ターＤＮＡ断片をＷＲ整したのち、両者の混合物をＤＮ
Ａリガーゼで処理することにより行うことができる。こ
こで用いられるベクターＤＮＡとしてはエシェリヒア・
コリを宿主とするｐＢＲ３２２プラスミド、コリシン（
Ｃｏｄ）Ｅｌプラスミド、ラムダファージなど通常用い
られるものが採用されうる。とりわけｐＢＲ３２２プラ
スミドが好適に用いられる。また制限エンドヌクレアー
ゼとしては、例えば旧ｎｄ １＋１１ ＥＣ０Ｒ１，Ｐ
ｓｔ Ｉ、 Ｂａｎ ＨＩ等があげられるが、制限エン
ドヌクレアーゼの操作を浅く、即ちＤＮＡ＠の切断が部
分切断で止まるようにすれば多くの制限エンドヌクレア
ーゼが本実験に使用できる。
ドヌクレアーゼで切断して染色体ＤＮＡ断片およびベク
ターＤＮＡ断片をＷＲ整したのち、両者の混合物をＤＮ
Ａリガーゼで処理することにより行うことができる。こ
こで用いられるベクターＤＮＡとしてはエシェリヒア・
コリを宿主とするｐＢＲ３２２プラスミド、コリシン（
Ｃｏｄ）Ｅｌプラスミド、ラムダファージなど通常用い
られるものが採用されうる。とりわけｐＢＲ３２２プラ
スミドが好適に用いられる。また制限エンドヌクレアー
ゼとしては、例えば旧ｎｄ １＋１１ ＥＣ０Ｒ１，Ｐ
ｓｔ Ｉ、 Ｂａｎ ＨＩ等があげられるが、制限エン
ドヌクレアーゼの操作を浅く、即ちＤＮＡ＠の切断が部
分切断で止まるようにすれば多くの制限エンドヌクレア
ーゼが本実験に使用できる。
また２１１類の制限エンドヌクレアーゼを併用すること
も可能である。
も可能である。
ＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリ
ガーゼが好適に用いられる。
ガーゼが好適に用いられる。
次、に、上記のごとくして得た組換えＤＮＡを常法例え
ば［Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、、 １２Ｃ
１−１０（１９７３）］に記載のカルシウム処理法によ
りＢＲ変異株（例えばエシェリヒア・コリＢＲ−４）に
導入し、ビオチン無添加の最少寒天培地で培養すること
により生じたコロニーを釣菌分離してビオチン生産能を
有する菌株（即ちビオチン生合成酵素の遺伝情報を担う
ＤＮＡが組み込まれた組換えＤＮＡプラスミドを含有し
ている菌株）を採取する。
ば［Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、、 １２Ｃ
１−１０（１９７３）］に記載のカルシウム処理法によ
りＢＲ変異株（例えばエシェリヒア・コリＢＲ−４）に
導入し、ビオチン無添加の最少寒天培地で培養すること
により生じたコロニーを釣菌分離してビオチン生産能を
有する菌株（即ちビオチン生合成酵素の遺伝情報を担う
ＤＮＡが組み込まれた組換えＤＮＡプラスミドを含有し
ている菌株）を採取する。
次いで、上記方法で得られた組換えＤＮＡプラスミド含
有菌株より組換えＤＮＡプラスミドを単離する。
有菌株より組換えＤＮＡプラスミドを単離する。
組換えＤＮＡの単離は常法に従って行うことがで営る。
例えばＮｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ
、ヱ、１５１３−１５２３ （１９７９）に記載のアル
カリ抽出法があげられる。
、ヱ、１５１３−１５２３ （１９７９）に記載のアル
カリ抽出法があげられる。
このようにして得られた組換えＤＮＡにビオチン生合成
酵素の遺伝情報を担うＤＮＡが含まれることは次のよう
にして確認することができる。
酵素の遺伝情報を担うＤＮＡが含まれることは次のよう
にして確認することができる。
即ち各ビオチン生合成酵素活性の欠損したエシェリヒア
・コリＢＲ変異株に木組換えＤＮＡを導入することによ
りビオチン要求性が解除されることをもって確認するも
のである。なお、組換えＤＮＡプラスミドを得る時に用
いた制限エンドヌクレアーゼの種類によっては、処理を
完全に行った時などは、ビオチン生合成酵素の遺伝情報
の全ては含まない即ち幾つかの遺伝情報が欠落する場合
がある。このような時は、異なる制限エンドヌクレアー
ゼを用いて得られる幾種かの組換えプラスミドからの再
構成行い、結果としてビオチン生合成酵素の全遺伝情報
を組み込んだ組換えＤＮＡプラスミドを得ることができ
る。
・コリＢＲ変異株に木組換えＤＮＡを導入することによ
りビオチン要求性が解除されることをもって確認するも
のである。なお、組換えＤＮＡプラスミドを得る時に用
いた制限エンドヌクレアーゼの種類によっては、処理を
完全に行った時などは、ビオチン生合成酵素の遺伝情報
の全ては含まない即ち幾つかの遺伝情報が欠落する場合
がある。このような時は、異なる制限エンドヌクレアー
ゼを用いて得られる幾種かの組換えプラスミドからの再
構成行い、結果としてビオチン生合成酵素の全遺伝情報
を組み込んだ組換えＤＮＡプラスミドを得ることができ
る。
上記のごとくして得た組換えＤＮＡを前記のＤＲ変異株
に導入すれば、組換えＤＮＡ含有ＤＲ変異株を調整する
ことができる。
に導入すれば、組換えＤＮＡ含有ＤＲ変異株を調整する
ことができる。
組換えＤＮＡ含有ＤＲ変異株はベクターの持つ形質によ
り、組換えＤＮＡを含有する菌のクローンを選択的に生
育せしめる培地にて培養し出現するコロニーとして取得
することがで蒙る。かくして得られたＤＮＡ含有ＤＲ変
異株すなわち本発明の新規微生物の例としては、例えば
エシェリヒア・コリＤＲ−８５（微工研菌寄第８０９７
号）があげられる。
り、組換えＤＮＡを含有する菌のクローンを選択的に生
育せしめる培地にて培養し出現するコロニーとして取得
することがで蒙る。かくして得られたＤＮＡ含有ＤＲ変
異株すなわち本発明の新規微生物の例としては、例えば
エシェリヒア・コリＤＲ−８５（微工研菌寄第８０９７
号）があげられる。
旦エヱ之二圭皇
上記の如くして取得した本発明の微生物を培養すれば培
養液中にビオチンを著量生成蓄積する。
養液中にビオチンを著量生成蓄積する。
本発明に係る微生物の培養に際して用いられる培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機物を含有する合成培地、ま
たは天然培地のいずれも使用可能である。炭素源として
は、グルコース、グリセリン、フラクトース、シューク
ロース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解
液、糖蜜などの炭水化物が使用でき、その使用量は０．
５〜５．０％程度が好ましい。また窒素源としては、ア
ンモニア、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムな
どの各種の無機および有機アンモニウム塩類あるいは肉
エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カゼイ
ン加水分解物、脱脂穴豆粕あるいはその消化物などの天
然有機窒素源が使用可能であり、その使用量は０．５〜
２．０％程度が好ましい。
ては、炭素源、窒素源、無機物を含有する合成培地、ま
たは天然培地のいずれも使用可能である。炭素源として
は、グルコース、グリセリン、フラクトース、シューク
ロース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解
液、糖蜜などの炭水化物が使用でき、その使用量は０．
５〜５．０％程度が好ましい。また窒素源としては、ア
ンモニア、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムな
どの各種の無機および有機アンモニウム塩類あるいは肉
エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カゼイ
ン加水分解物、脱脂穴豆粕あるいはその消化物などの天
然有機窒素源が使用可能であり、その使用量は０．５〜
２．０％程度が好ましい。
天然有機窒素源の多くの場合は、窒素源であるとともに
炭素源にもなりうる。
炭素源にもなりうる。
ざらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム、燐酸第
二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム４
．硫酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化亜鉛、硫酸銅、塩
化マンガン、塩化コバルト、モリブデン酸アンモン、硼
酸などが使用でき、その使用量はｏ、ｏｏｓ〜０．５％
程度が好ましい。
二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム４
．硫酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化亜鉛、硫酸銅、塩
化マンガン、塩化コバルト、モリブデン酸アンモン、硼
酸などが使用でき、その使用量はｏ、ｏｏｓ〜０．５％
程度が好ましい。
また、造成された微生物に抗菌薬剤耐性が付与されてい
る場合には、該当する抗菌剤を培地に添加することによ
って汚染面の混入を防ぐことができる。
る場合には、該当する抗菌剤を培地に添加することによ
って汚染面の混入を防ぐことができる。
培養は振盪培養あるいは通気撹拌培養などの好気的条件
下で行うのが好ましい。培養温度は２５−３７℃が好適
であり、培養中の培地のＰ）ｌは中性付近に維持するこ
とが望ましく、培養期間は通常１６−４８時間程度で充
分である。培養を終了した後、培養液からのビオチンの
抽出精製にあたっては、ビオチンの諸性質を利用して一
般の天然物からの抽出精製法が応用できる。すなわち、
培養物から菌体を除き活性炭に吸着させ、しかるのち溶
出きせイオン交換樹脂で精製するか、あるいは培養濾液
を直接イオン交換樹脂で処理して精製し、水またはアル
コールより再結晶することによりビオチンを取得するこ
とができる。
下で行うのが好ましい。培養温度は２５−３７℃が好適
であり、培養中の培地のＰ）ｌは中性付近に維持するこ
とが望ましく、培養期間は通常１６−４８時間程度で充
分である。培養を終了した後、培養液からのビオチンの
抽出精製にあたっては、ビオチンの諸性質を利用して一
般の天然物からの抽出精製法が応用できる。すなわち、
培養物から菌体を除き活性炭に吸着させ、しかるのち溶
出きせイオン交換樹脂で精製するか、あるいは培養濾液
を直接イオン交換樹脂で処理して精製し、水またはアル
コールより再結晶することによりビオチンを取得するこ
とができる。
［実施例］
次に実施例をあげて本発明をざらに詳細に説明するが、
本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
（１）ＤＲ変異株の調整
ビオチン生合成酵素活性を有する野生株エシェリヒア・
コリＪＡ２２１をＬ−培地（ペプトン１０ｇ／ ｌ 、
酵母エキス５ｇ／１．グルコースＩｇ／ｌ、塩化ナトリ
ウム５ｇ／１． ｐＨ７，２に調整）中３７℃で３時間
振盪培養を行い、対数増殖期の菌体を集流後、これをＮ
−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン１０
０ｇｇ／ｍｌを含有する７Ｍ緩衝液（トリス−塩基０６
６１Ｘ、マレイン酸０．！ＩＪＳｐＨ６，ＯＬ＝調整）
ニ！！濁し、３７℃３０分間静置し変異処理を行った。
コリＪＡ２２１をＬ−培地（ペプトン１０ｇ／ ｌ 、
酵母エキス５ｇ／１．グルコースＩｇ／ｌ、塩化ナトリ
ウム５ｇ／１． ｐＨ７，２に調整）中３７℃で３時間
振盪培養を行い、対数増殖期の菌体を集流後、これをＮ
−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン１０
０ｇｇ／ｍｌを含有する７Ｍ緩衝液（トリス−塩基０６
６１Ｘ、マレイン酸０．！ＩＪＳｐＨ６，ＯＬ＝調整）
ニ！！濁し、３７℃３０分間静置し変異処理を行った。
菌体を集流後回懸濁液を、集流された１０５ｃｅｌｌ／
ｍｌのＢＲ変異株エシェリヒア・コリＢＲ−４と５０μ
ｇ／ｍｌの２．３．５− トリフェニルテトラゾリウム
クロリドを含む２０ｍ ｌのビオチン無添加の最少培地
寒天平板（グルコース５ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム４ｇ
／ １ 、燐酸第二水素カリウム２ｇ／］、燐酸第一水
素カリウムＩｇ／１．硫酸マグネシウム・７水和物０．
１ｇ／ｌ、 ＤＬ−）リプトファン０．０２ｇ／ｌ、ビ
タミンフリーのカザミノ酸４ｇ／ １ 、寒天１５ｇ／
ｌ）に１５ｍ１のビオチン無添加最少寒天培地を重層し
ておいた通常の大きざのシャーレ上に出現するコロニー
が約５０−２００個となるように塗抹した。
ｍｌのＢＲ変異株エシェリヒア・コリＢＲ−４と５０μ
ｇ／ｍｌの２．３．５− トリフェニルテトラゾリウム
クロリドを含む２０ｍ ｌのビオチン無添加の最少培地
寒天平板（グルコース５ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム４ｇ
／ １ 、燐酸第二水素カリウム２ｇ／］、燐酸第一水
素カリウムＩｇ／１．硫酸マグネシウム・７水和物０．
１ｇ／ｌ、 ＤＬ−）リプトファン０．０２ｇ／ｌ、ビ
タミンフリーのカザミノ酸４ｇ／ １ 、寒天１５ｇ／
ｌ）に１５ｍ１のビオチン無添加最少寒天培地を重層し
ておいた通常の大きざのシャーレ上に出現するコロニー
が約５０−２００個となるように塗抹した。
３７℃４８時間培養後、出現した小コロニーの下層がピ
ンク色のゾーンを呈した１株を釣菌分離し、ビオチンに
よるフィードバック阻害が解除されたＤＲ変異株エシェ
リヒア・コリＤＲ−８５（微工研菌寄第８０９６号）を
取得した。
ンク色のゾーンを呈した１株を釣菌分離し、ビオチンに
よるフィードバック阻害が解除されたＤＲ変異株エシェ
リヒア・コリＤＲ−８５（微工研菌寄第８０９６号）を
取得した。
（２）染色体ＤＮＡの調整
上記のごとくして得たエシェリヒア・コリＤＲ−８５を
５００ｍ１のし一培地中３７℃で３時間振盪培養を行い
、対数増殖期の菌体を薬洗後、フェノール法による通常
のＤＮＡ抽出法によって抽出精製し、２．１Ｂの染色体
ＤＮＡを得た。
５００ｍ１のし一培地中３７℃で３時間振盪培養を行い
、対数増殖期の菌体を薬洗後、フェノール法による通常
のＤＮＡ抽出法によって抽出精製し、２．１Ｂの染色体
ＤＮＡを得た。
（３）ベクターＤＮＡの調整
アンシビリン耐性およびテトラサイクリン耐性を有する
ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを次のように調整した。
ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを次のように調整した。
まず、ｐＢＲ３２２をプラスミドとして保有するエシェ
リヒア・コリに一１２株の一種を、アンシビリン１５０
ｕ ｇ／ｍｌ添加したし一培地１０１００Ｏ中で３７
℃で培養し、対数増殖期に１５０μｇ／ｍ ｌのクロラ
ムフェニコールを添加してざらに一夜培養した。この操
作により細胞内にプラスミドＤＮＡが多量に生産される
。
リヒア・コリに一１２株の一種を、アンシビリン１５０
ｕ ｇ／ｍｌ添加したし一培地１０１００Ｏ中で３７
℃で培養し、対数増殖期に１５０μｇ／ｍ ｌのクロラ
ムフェニコールを添加してざらに一夜培養した。この操
作により細胞内にプラスミドＤＮＡが多量に生産される
。
クロラムフェニコール添加後、１５時時間和菌体を集流
し、リゾチウムおよびソジウムドデシルサルフェートで
溶菌させ、ついで３００００ｇで２時間遠心分離して上
溝を得た。この上清液からプラスミドＤＮＡを濃縮後、
リボ核酸分解酵素で３７℃２時間処理し、ついでセシウ
ムクロリド−エチジウムプロミド平衡密度勾配遠心法に
よって最終５２０ ｕ ｇのｐＢＲ３２２プラスミドＤ
ＮＡを分画採取した。
し、リゾチウムおよびソジウムドデシルサルフェートで
溶菌させ、ついで３００００ｇで２時間遠心分離して上
溝を得た。この上清液からプラスミドＤＮＡを濃縮後、
リボ核酸分解酵素で３７℃２時間処理し、ついでセシウ
ムクロリド−エチジウムプロミド平衡密度勾配遠心法に
よって最終５２０ ｕ ｇのｐＢＲ３２２プラスミドＤ
ＮＡを分画採取した。
（４）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（２）で得
たＤＮＡ３ｕｇをとり、制限エンドヌクレアーゼｐｓｔ
Ｉを与え３０℃で３時間反応させた。また（３）テ調整
したベクターＤ Ｎ Ａ１．５ ｕｇをｐｓｔＴで完全
に切断した。両反応液を各々６５℃５分間の加熱処理を
し、゛こ後、両反応液を混合し、ＡＴＰおよびジチオス
レイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ
によって１５℃１６時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行った。
たＤＮＡ３ｕｇをとり、制限エンドヌクレアーゼｐｓｔ
Ｉを与え３０℃で３時間反応させた。また（３）テ調整
したベクターＤ Ｎ Ａ１．５ ｕｇをｐｓｔＴで完全
に切断した。両反応液を各々６５℃５分間の加熱処理を
し、゛こ後、両反応液を混合し、ＡＴＰおよびジチオス
レイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ
によって１５℃１６時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行った。
全く同様の方法で染色体ＤＮＡ３μｇを２つの制限エン
ドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用い、同
時に３７℃３時間反応させ６５℃５分間の熱処理後、Ｅ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで完全に切断したベクターＤ
ＮＡと混合し、ＤＮＡリガーゼ反応を１５℃１６時間行
った。反応後は６５℃５分間の熱処理後、反応液に２倍
容のエタノールを加えて連結反応後のＤＮＡを沈澱採取
した。
ドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用い、同
時に３７℃３時間反応させ６５℃５分間の熱処理後、Ｅ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで完全に切断したベクターＤ
ＮＡと混合し、ＤＮＡリガーゼ反応を１５℃１６時間行
った。反応後は６５℃５分間の熱処理後、反応液に２倍
容のエタノールを加えて連結反応後のＤＮＡを沈澱採取
した。
（５）ビオチン生合成酵素の遺伝情報を担った組換えプ
ラスミドのよる形質転換 エシェリヒア・コリＪＡ２２１より変異誘導したビオチ
ン要求株エシェリヒア・コリＢＲ−４をＬ−培地１０ｍ
１に接種し、３７℃で４時間振盪培養を行い対数増殖期
中期まで生胃させた後集菌し、これを塩化カルシウム５
０ｍＭを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７゜０）で
２回洗浄後、同じ緩衝液１ｍｌに再懸濁させた。
ラスミドのよる形質転換 エシェリヒア・コリＪＡ２２１より変異誘導したビオチ
ン要求株エシェリヒア・コリＢＲ−４をＬ−培地１０ｍ
１に接種し、３７℃で４時間振盪培養を行い対数増殖期
中期まで生胃させた後集菌し、これを塩化カルシウム５
０ｍＭを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７゜０）で
２回洗浄後、同じ緩衝液１ｍｌに再懸濁させた。
この懸濁液０．２ｍｌに（４）で得たそれぞれのＤＮＡ
溶液を加え、０℃に３０分保持した後、直ちに４２℃２
分間のヒートショックを与え、ＤＮＡを細胞内に取り込
ませた。ついでそれぞれの細胞懸濁液の一定量を新たな
し一培地に摂取し、３７℃２時間静置培養を行った。そ
れぞれ菌体を薬洗後、再懸濁液を最少培地寒天平板（グ
ルコース５ｇ／１．硫酸アンモニウム４ｇ／ｌ、燐酸第
二水素カリウム２ｇ／ ｌ 、燐酸第一水素カリウムＩ
ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．１ｇ／ｌ、Ｄ
Ｌ−トリプトファン０．０２ ｇ ／１．ビタミンフ！
Ｊ−１７）力ｆ ミ） ａ４ｇ／１．寒天１５ｇ／ｌ）
ニ塗抹し、３７℃２日間培養した。生じたコロニーを
釣菌し、その性質を調べたところ制限エンドヌクレアー
ゼｐｓｔｒを用いて得られた形質転換株エシェリヒア・
コリＢＲ−４［ｐＯＦＳ３］はテトラサイクリン耐性、
アンピシリン感受性であり、２つの制限エンドヌクレア
ーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて得られた形質
転換株エシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＢＤＨ１７］は
アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性であった。
溶液を加え、０℃に３０分保持した後、直ちに４２℃２
分間のヒートショックを与え、ＤＮＡを細胞内に取り込
ませた。ついでそれぞれの細胞懸濁液の一定量を新たな
し一培地に摂取し、３７℃２時間静置培養を行った。そ
れぞれ菌体を薬洗後、再懸濁液を最少培地寒天平板（グ
ルコース５ｇ／１．硫酸アンモニウム４ｇ／ｌ、燐酸第
二水素カリウム２ｇ／ ｌ 、燐酸第一水素カリウムＩ
ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．１ｇ／ｌ、Ｄ
Ｌ−トリプトファン０．０２ ｇ ／１．ビタミンフ！
Ｊ−１７）力ｆ ミ） ａ４ｇ／１．寒天１５ｇ／ｌ）
ニ塗抹し、３７℃２日間培養した。生じたコロニーを
釣菌し、その性質を調べたところ制限エンドヌクレアー
ゼｐｓｔｒを用いて得られた形質転換株エシェリヒア・
コリＢＲ−４［ｐＯＦＳ３］はテトラサイクリン耐性、
アンピシリン感受性であり、２つの制限エンドヌクレア
ーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて得られた形質
転換株エシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＢＤＨ１７］は
アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性であった。
（６）５つのビオチン生合成酵素全ての遺伝情報を担う
ＤＮＡを組み込んだベクターの造成（５）で得られた形
質転換株エシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＯＦＳ３］お
よびエシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＢＤＨ１７］をそ
れぞれＬ−培地１００ｍ１中で培養し、（３）と同様に
してクロラムフェニコール処理を行った。菌体を薬洗後
、アルカリ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ、ヱ、 １５１３−１５２３ 、１９７９ ）
により、エシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＯＦＳ３］か
ら組換えプラスミドＰＯＦＳ３を、エシェリヒア・コリ
ＢＲ−４［ｐＢＤＨ１７］から組換えプラスミドｐＢＤ
Ｈ１７を多量に得た。これらの組換えプラスミドをＪ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 、 １１２ 、８３０−８３
９、１９７２に記載のＢＲ変異株、Ｒ８７６株、Ｒ８７
４株、Ｒ８７３株、Ｒ８７７株、Ｒ８７５株、（それぞ
れピメリルＣｏＡシンテターゼ、７−ケト−８−アミノ
ペラルゴン酸シンテターゼ、７，８−ジアミノペラルゴ
ン酸アミノトランスフェラーゼ、デスチオビオチンシン
テターゼ、およびデスチオビオチンからビオチンへの変
換に関与する酵素が欠損した株）へ（５）と同様の方法
により形質転換して、ビオチン要求性が回復するかどう
かを調べた。結果を第１表に示した。
ＤＮＡを組み込んだベクターの造成（５）で得られた形
質転換株エシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＯＦＳ３］お
よびエシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＢＤＨ１７］をそ
れぞれＬ−培地１００ｍ１中で培養し、（３）と同様に
してクロラムフェニコール処理を行った。菌体を薬洗後
、アルカリ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ、ヱ、 １５１３−１５２３ 、１９７９ ）
により、エシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＯＦＳ３］か
ら組換えプラスミドＰＯＦＳ３を、エシェリヒア・コリ
ＢＲ−４［ｐＢＤＨ１７］から組換えプラスミドｐＢＤ
Ｈ１７を多量に得た。これらの組換えプラスミドをＪ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 、 １１２ 、８３０−８３
９、１９７２に記載のＢＲ変異株、Ｒ８７６株、Ｒ８７
４株、Ｒ８７３株、Ｒ８７７株、Ｒ８７５株、（それぞ
れピメリルＣｏＡシンテターゼ、７−ケト−８−アミノ
ペラルゴン酸シンテターゼ、７，８−ジアミノペラルゴ
ン酸アミノトランスフェラーゼ、デスチオビオチンシン
テターゼ、およびデスチオビオチンからビオチンへの変
換に関与する酵素が欠損した株）へ（５）と同様の方法
により形質転換して、ビオチン要求性が回復するかどう
かを調べた。結果を第１表に示した。
（以下余白）
第１表
＋：ビオチン要求性の回復が見られた。
−：ビオチン要求性の回復が見られなかった。
（以下余白）
組換えプラスミドｐＯＦｓ３にはデスチオビオチンシン
テターゼの遺伝情報の欠如、ざらに組換えプラスミドｐ
ＢＤＨ１７には７．８−ジアミノペラルゴン酸アミノト
ランスフェラーゼの遺伝情報の欠如が見られた。そこで
第１図に示すごとく、組換えプラスミドｐＯＦｓ３とｐ
ＢＤＨ１７より、５つのビオチン生合成酵素全ての遺伝
情報を担う組換えプラスミドｐＴＭＲ２２の造成を行っ
た。
テターゼの遺伝情報の欠如、ざらに組換えプラスミドｐ
ＢＤＨ１７には７．８−ジアミノペラルゴン酸アミノト
ランスフェラーゼの遺伝情報の欠如が見られた。そこで
第１図に示すごとく、組換えプラスミドｐＯＦｓ３とｐ
ＢＤＨ１７より、５つのビオチン生合成酵素全ての遺伝
情報を担う組換えプラスミドｐＴＭＲ２２の造成を行っ
た。
組換えプラスミドｐＯＦｓ３とｐＢＤＨ１７をそれぞれ
２μｇとり、ｐＯＦｓ３は制限エンドヌクレアーセｐｓ
ｔＩで、ｐＢＤ旧７は２つの制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲＩ。
２μｇとり、ｐＯＦｓ３は制限エンドヌクレアーセｐｓ
ｔＩで、ｐＢＤ旧７は２つの制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲＩ。
ＰｓｔＩで完全に切断後、それぞれアガロース電気泳動
（アガロース１％、７０Ｖ）にかけ、エチジウムプロミ
ドで染色後、ｐＯＦｓ３から約５．ＩＫｂのｐｓｔＩ
Ｄ ＮＡ断片を、ｐＢＤＨ１７からは約１．ＯＫｂのＥ
ｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ Ｄ ＮＡ断片を紫外線照射下で切
り出し、このゲルをそれぞれ透析チューブに入れて再度
電気泳動を行いゲルよりＤＮＡを抽出した。抽出後フェ
ノール処理で残存するアガロースを除去した後、２倍容
のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱採取した。
（アガロース１％、７０Ｖ）にかけ、エチジウムプロミ
ドで染色後、ｐＯＦｓ３から約５．ＩＫｂのｐｓｔＩ
Ｄ ＮＡ断片を、ｐＢＤＨ１７からは約１．ＯＫｂのＥ
ｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ Ｄ ＮＡ断片を紫外線照射下で切
り出し、このゲルをそれぞれ透析チューブに入れて再度
電気泳動を行いゲルよりＤＮＡを抽出した。抽出後フェ
ノール処理で残存するアガロースを除去した後、２倍容
のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱採取した。
得られた約５．ＩＫｂと約１，０にｂのＤＮＡ断片と、
別に２つの制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉで切断しアガロース電気泳動後同様の方法でゲルから
回収して得られた約３．６にｂのｐＢＲ３２２ベクター
ＤＮＡ断片とを混合し、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガ
ーゼで連結反応を行った。
別に２つの制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉで切断しアガロース電気泳動後同様の方法でゲルから
回収して得られた約３．６にｂのｐＢＲ３２２ベクター
ＤＮＡ断片とを混合し、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガ
ーゼで連結反応を行った。
次いで６５℃５分間の熱処理後、反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱採取した
。
ノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱採取した
。
得られた組換えプラスミドをＢＲ変異株エシェリヒア・
コリＢＲ−４株に（５）と同様の方法で形質転換し、ビ
オチン無添加の最少寒天培地上で生じたコロニー即ちエ
シェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＴＭＲ２２］を釣菌し、
その性質を調べたところ、テトラサイクリン耐性、アン
シビリン感受性であった。
コリＢＲ−４株に（５）と同様の方法で形質転換し、ビ
オチン無添加の最少寒天培地上で生じたコロニー即ちエ
シェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＴＭＲ２２］を釣菌し、
その性質を調べたところ、テトラサイクリン耐性、アン
シビリン感受性であった。
この形質転換株エシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＴＭＲ
２２］より前述と同様のアルカリ法で組換えプラスミド
を抽出し、得られた組換えプラスミドｐＴＭＲ２２をざ
らに前述のビオチン生合成酵素の夫々が欠損したＢＲ変
異株に（５）と同様の方法により形質転換した。結果を
第２表に示した。
２２］より前述と同様のアルカリ法で組換えプラスミド
を抽出し、得られた組換えプラスミドｐＴＭＲ２２をざ
らに前述のビオチン生合成酵素の夫々が欠損したＢＲ変
異株に（５）と同様の方法により形質転換した。結果を
第２表に示した。
第２表
表２から明らかなように全てのＢＲ変異株にビオチン要
求性の回復が見られたことより、ここで造成された組換
えプラスミドｐＴＭＲ２２には５つのビオチン生合成酵
素全ての遺伝情報を担うＤＮＡが含有されていることが
わかる。
求性の回復が見られたことより、ここで造成された組換
えプラスミドｐＴＭＲ２２には５つのビオチン生合成酵
素全ての遺伝情報を担うＤＮＡが含有されていることが
わかる。
（７）ビオチン生合成酵素の遺伝情報を担う組換えプラ
スミドのエシェリヒア・コリＩ）Ｒ−８５への形質転換 先に得られた組換えプラスミドｐＴＭＲ２２を（５）と
同様の方法でエシェリヒア・コリＤＲ−８５に形質転換
し、テトラサイクリン１０μｇ／＋＋１を含むし一培地
寒天平板上で生じたコロニーを分離し、エシェリヒア−
ＤすＤＲ−８５［ｐＴＭＲ２２］ （黴工研菌寄第８０
９７号）を取得した。
スミドのエシェリヒア・コリＩ）Ｒ−８５への形質転換 先に得られた組換えプラスミドｐＴＭＲ２２を（５）と
同様の方法でエシェリヒア・コリＤＲ−８５に形質転換
し、テトラサイクリン１０μｇ／＋＋１を含むし一培地
寒天平板上で生じたコロニーを分離し、エシェリヒア−
ＤすＤＲ−８５［ｐＴＭＲ２２］ （黴工研菌寄第８０
９７号）を取得した。
実施例２
（培地組成）
グルコース ｓ、ｏ ｇ硫酸ア
ンモニウム ４．０ ｇカザミノ酸（
ビタミンフリー） ４．０ ｇ燐酸第二水素カリ
ウム ２．０ ｇ燐酸第一水素カリウム
１．０ ｇ硫酸マグネシウム・７水和物
０．１ｇＤＬ−トリプトファン
０．０２ ｇイオン交換水 １
０１００Ｏ上記組成の培地（ｐＨ７，０）に第３表に示
す菌株を接種し、３７℃で２０時間振盪培養した。培養
終了後、遠心分離により菌体を除去後、培養液に生成蓄
積されたビオチン量をラクトバシリス・プランタラム（
Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ 、Ａ
ＴＣＣ８０１４）による微生物定量法により行った。そ
の結果を第３表に示した。
ンモニウム ４．０ ｇカザミノ酸（
ビタミンフリー） ４．０ ｇ燐酸第二水素カリ
ウム ２．０ ｇ燐酸第一水素カリウム
１．０ ｇ硫酸マグネシウム・７水和物
０．１ｇＤＬ−トリプトファン
０．０２ ｇイオン交換水 １
０１００Ｏ上記組成の培地（ｐＨ７，０）に第３表に示
す菌株を接種し、３７℃で２０時間振盪培養した。培養
終了後、遠心分離により菌体を除去後、培養液に生成蓄
積されたビオチン量をラクトバシリス・プランタラム（
Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ 、Ａ
ＴＣＣ８０１４）による微生物定量法により行った。そ
の結果を第３表に示した。
第３表
（以下余白）
実施例３
（培地組成）
グルコース ５．０ｇ硫酸アン
モニウム ５．０ｇ酵母エキス
５．Ｏｇプロテオースベブトン（Ｄ
ｉｒｃｏ） ５．０ ｇ塩化ナトリウム
５．０ｇ燐酸第二水素カリウム
４．０ｇ硫酸マグネシウム・７水和物 １．
０ｇイオン交換水 ＩＧＯＯｍｌ
上記組成の培地（ｐＨ７，０）に第４表に示す菌株を接
種し、３７℃で２０時間振盪培養した。培養終了後、遠
心分離により菌体を除去後、培養液に生成蓄積されたビ
オチン量を実施例２と同様の微生物定量法により行った
。その結果を第４表に示した。
モニウム ５．０ｇ酵母エキス
５．Ｏｇプロテオースベブトン（Ｄ
ｉｒｃｏ） ５．０ ｇ塩化ナトリウム
５．０ｇ燐酸第二水素カリウム
４．０ｇ硫酸マグネシウム・７水和物 １．
０ｇイオン交換水 ＩＧＯＯｍｌ
上記組成の培地（ｐＨ７，０）に第４表に示す菌株を接
種し、３７℃で２０時間振盪培養した。培養終了後、遠
心分離により菌体を除去後、培養液に生成蓄積されたビ
オチン量を実施例２と同様の微生物定量法により行った
。その結果を第４表に示した。
（以下余白）
第４表
第１図は実施例１の（６）に示す組換えプラスミドｐＴ
ＭＲ２２の造成方法を示す図面である。
ＭＲ２２の造成方法を示す図面である。
Claims (3)
- （１）ピメリルＣｏＡシンテターゼ活性、７−ケト−８
−アミノペラルゴン酸シンテターゼ活性、７，８−ジア
ミノペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ活性、デス
チオビオチンシンテターゼ活性、およびデスチオビオチ
ンからビオチンへの変換に関与する酵素活性を有し、か
つビオチンによるフィードバック阻害が解除されたエシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
から取得したピメリルＣｏＡシンテターゼ、７−ケト−
８−アミノペラルゴン酸シンテターゼ、７，８−ジアミ
ノペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ、デスチオビ
オチンシンテターゼ、およびデスチオビオチンからビオ
チンへの変換に関与する酵素の遺伝情報を担うデオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）をベクターＤＮＡに組み込んだ組換
えＤＮＡを、当該エシェリヒア・コリに含有せしめてな
る微生物。 - （２）ピメリンＣｏＡシンテターゼ活性、７−ケト−８
−アミノペラルゴン酸シンテターゼ活性、７，８−ジア
ミノペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ活性、デス
チオビオチンシンテターゼ活性、およびデスチオビオチ
ンからビオチンへの変換に関与する酵素活性を有し、か
つビオチンによるフィードバック阻害が解除されたエシ
ェリヒア・コリから取得したピメリルＣｏＡシンテター
ゼ、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼ、
７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフェラー
ゼ、デスチオビオチンシンテターゼ、およびデスチオビ
オチンからビオチンへの変換に関与する酵素の遺伝情報
を担うＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んだ組換えＤＮ
Ａを、当該エシェリヒア・コリに含有せしめて得た微生
物を培養し、培地中に生成蓄積されたビオチンを採取す
ることを特徴とするビオチンの製造法。 - （３）ベクターがエシェリヒア・コリを宿主とするｐＢ
Ｒ３２２プラスミドである特許請求の範囲第一項記載の
微生物または特許請求の範囲第二項記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60042928A JPH0740922B2 (ja) | 1985-03-05 | 1985-03-05 | ビオチン生産性微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60042928A JPH0740922B2 (ja) | 1985-03-05 | 1985-03-05 | ビオチン生産性微生物 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30382494A Division JP2527926B2 (ja) | 1994-12-07 | 1994-12-07 | ビオチンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61202686A true JPS61202686A (ja) | 1986-09-08 |
| JPH0740922B2 JPH0740922B2 (ja) | 1995-05-10 |
Family
ID=12649680
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60042928A Expired - Lifetime JPH0740922B2 (ja) | 1985-03-05 | 1985-03-05 | ビオチン生産性微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0740922B2 (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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