JPS61149091A - ビオチン合成酵素をコ−ドする二重鎖ｄｎａ、それを含む微生物及びビオチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 崖Ｗた訪 本発明は、ビオチンの製造方法であり、デチオビオチン
（ＤＴＢ）からのビオチン合成に関与する酵素（ビオチ
ン合成酵素）をコードする環状二重１ＩＤＮＡ及び１Ｄ
ＮＡをプラスミドとして含む形質転換された大腸菌変異
株に関するものである。

ｌ米坐蓋逐 ビオチンは動物、植物、微生物などにとって必須なビタ
ミンであり、飼料添加物として使用され、また輸液用と
しても期待される。然し、現在の化学合成による製造で
は高価であり、微生物特に遺伝子工学的技術等により改
良された大腸菌等によるｆＪｈ率的な新しい４−彦方法
の間をが望まれている。

ビオチンの生合成経路の大部分は微生物を用いて解明さ
れ、次の経路が提示されている。

７−ケドー８−アミノペラルゴン酸 ↓ ７．８−ジアミノペラルゴン酸 ↓ 特開昭５６−１６０９９８号公報には、野生形のバチル
ス・スフエリカスＩＦＯ３５２５を使用しピメリン酸を
ビオチンに変換する方法が記載されているが、ＤＴＢか
らビオチンへの生成量が低い欠点を有している。

又、ジャーナル　オブ　モレキユラー　バイオロジー　
第１４８＠　１９８１年　６３〜７６頁（Ｊ、　Ｍｏ１
．　　Ｂｉｏｌ、　１４８．６３〜７６、１９８１）に
はＤＴＢからビオチンへの反応に関与するビオチン合成
酵素が大腸＠Ｃ３Ｒ６０３で特殊実験状態では、あるが
微量発現することが記載されている。しかしこの実験系
における該菌は増殖機能を有しておらず、工業的方法に
採用することは困難なものである。

増殖可能な生育細胞でのビオチン合成酵素の発現につい
ては全く知られておらず、又、ビオチン合成酵素をコー
ドする遺伝子の構造についても知られていない。

が　′しようと　る−　占 本発明者らは、ビオチン合成酵素を高発現にかつ安定に
生成せしめる菌を取得するべく検討した結果、ビオチン
合成酵素をコードする遺伝子を究明し、該遺伝子を大腸
菌に導入し本発明を完成した。

−占を　゛　るための 本発明はビオチン合一酵素をコードする部分とその上流
領域にｐＬプロモーターオペレーターを含み、微生物中
でビオチン合成酵素を発現させることのできる環状二重
ｌＤＮＡであり、該ｂＮＡをプラスミドとして含む形質
転換された大腸菌変異株であり、該変異株を用いたビオ
チンの製造方法である。

本発明の大腸菌染色体由来のビオチン合成酵素をコード
するＤＮＡ（７）塩基配列と対応するアミノ酸配列、及
び、その上流と下流域のｔ）ＮＡの塩基配列は、次の如
くである。

５　”　ＡＣＡＣＣＧ、ＡＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡ
ＡＡＣＡＣＧＴＴＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＴＧＧ
ＣＴＣＡＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＴＧＭｅｔＡｌａＨｉｓ
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ＬＶａ　　ＩＧｌｎＧＩｙＶａ　　１ＡＡＡＧＣＧＡＴ
ＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣＬｙｓＡｌａＭｅｔＧ１ｙＬ
ｅｕＧ１ｕＡＩＧＴＧＴＡＴＧＡＣＧＣＴＧＧＧＣＡＣ
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ＣＣＧＧＧＣＴＡｒｇＬｅｕＡ１ａＡｓｎＡ１ａＧ１ｙ
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ｐＴｙｒＴｙｒＡｓｎＨｉｓＡｓｎＬＴＧＧＡＣＡＣＣ
ＴＣＧＣＣＧＧＡＣＴＴＴ＠ｕＡｓｐＴｈｒｓｅｒＰｒ
ｏＧ１ｕＰｈｅＴＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＣＡＴＣＡＣＣ
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　ＩＰｒ。

ＡＴＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴ１　１　　
ｓＡｓｎＭａ　　ｔＬｅｕＶａ　　Ｉ　　ＬｙｓＶａ７
３１　　　　、　　　　　　　７４１ＧＡＡＡＧＧＣＡ
ＣＧＣＣＧＣＴＴＧＣＣＧＩＬｙｓＧ１ｙＴｈｒＰｒｏ
ＬｅｕＡ１ｍＡＡＴＡＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＣＧＡＴＧ
ＣＣｓｐＡｓｎＡｓｐＡｓｐＶａｌＡｓｐＡ１ａＴＴＴ
ＧＡＴＴＴＴＡＴＴＣＧＣＡＣＣＡＴＰｈｅＡｓｐＰｈ
ｅ　Ｉ　　１　ａＡｒｇＴｈｒ　Ｉ　　１ＴＧＣＧＧＴ
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ＧＴＧＣＧＣｓｔＰｒｏＴｈｒｓｅｒＴｙｒＶａ　　ｌ
Ａｒｇ８３１　　　　　　　　　　　　Ｂ４１ＣＴＴＴ
ＣＴＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＡＧＣＡＬｅｕＳｅｒＡ１ａ
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ＴＧＡＡＣＡＧＧＣＧＣＴＧＡＴＧＡ　　　　　　　　
　　１０６１ＣＣＣＣＧＧＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＡＴＡ
ＴｈｒＰｒｏＡｓｐＴｈｒＡｓｐＧ１ｕＴｙｒＴＡＣＡ
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Ａ１ａＡＩａＬｅｕＡＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＡＡ
ＴＣＡＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＣＧＡＴＧＣＧＣＧＧＣ３
（但し、前記の塩基配列は二重鎖［ＤＮＡのアンチセン
スストランドを示し、Ａはアデニンを、Ｇはグアニンを
、Ｃはシトシンを、Ｔはチミンを示す。

前記の塩基配列の中でビオチン合成酵素をコードするＤ
ＮＡの塩基配列は、第４２番のＡより第１０８２番のＡ
に至る１０４１塩基である。尚、この内置後の３塩基は
終止コドンである。

ビオチン合成酵素をコードするＤＮＡ部分（以下ｂｉｏ
Ｂ遺伝子という）は、微生物の染色体ＤＮＡ或いは、化
学合成によるＤＮＡまたはこれらの組合わせによるＤＮ
Ａなどいづれでもよい。

本発明のｂｉｏＢ遺伝子は種々のプロモーターを用いて
発現させることが可能であるが、その上流領域にｐＬプ
ロモーターオペレーターを設けるのが適切である。プロ
モータに連結されたｂｉ。

Ｂ遺伝子を含むプラスミドは、大腸菌に導入され、形質
転換された大腸菌変異株としてビオチン生産のために使
用される。

以下ｂｉｏＢ遺伝子が大腸菌由来の染色体ＤＮＡである
例を用いて本発明を説明する。

大腸菌のビオチン遺伝子群を保持するプラスミドｐＬＣ
２５−２３を出発材料とし、ｂｉｏＢ遺伝子領域を含む
ＤＮＡ断片を制限酵素を用いて切断し、制限酵素により
切断されたＥＫ系プラスミドベクター（リラックスド型
）の例えば、ｐＢＲ３２２に連結する。切断されたベク
ターＤＮＡと染色体ＤＮＡ断片の連結方法は、リガーゼ
を用いる通常の方法が使用できる。かくして得られたｂ
ｉｏＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入したベクターＤＮ
Ａを大腸菌に１２に導入する。受容菌への導入は通常の
形質転換法が使用できる。なおりｉｏＢ遺伝子に対応す
るＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法及びＭ−
１３フアージを用いたチェイン・ターミネータ−法によ
り前記の通り決定した。　次いでｂｉｏ１３遺伝子を含
むＤＮＡ断片を制限酵素で切出し、プロモーターをもつ
ベクターに組込んだ後、大腸菌、好ましくは、α−デヒ
ドロビオチン（α−ＤＨＢ＞耐性株に導入し、得られた
形質転換体を用いてＤＴＢからビオチンの変換を行うこ
とができる。

大腸菌のα−ＤＨＢ耐性株は特定のものを使用する必要
はないが、耐性のより高いものが望ましい、このような
大腸菌のα−ＤＨＢ耐性株は既に知られている（ジャー
ナル　オブ　バクテリオロジー第１２３＝ｌ！　　１９
７５年　２４８〜２５４頁（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、　１２３．２４８〜２５４．１９７５）　）　、例え
ばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）により大腸菌を変異せしめ、α−ＤＨＢの生
育阻害に対して耐性を獲得した変異株を分離する方法で
得ることができる。

本発明の大腸菌のうち、形質転換体として最も好ましい
ものは、Ｎ５ＩＯＩであり、この様な微生物の典型的な
菌株は、昭和５９年１２月１９日付で通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されており、以下の寄
託番号が付されている。

ＮＳ　１０１　　徽工研菌寄　第８０１２号本発明にお
いて生成されるビオチンは、ラクトバルチス・プランタ
ラムＡＴＣＣ８０１４を用いた微生物定量法で容易に定
量できる。

以下実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、
本発明はこの例によって制限されるものではない。

実施例 １、プ・ラスミドｐＫＩＢＬ１の構築 ■　プラスミドｐＢＲＬｃ１の構築 ｐＢＲ３２２（２μｇ）をＴＡバフファー（３３ｍＭ）
リス酢酸ｐ　Ｈ７，９，６６ｍＭ！）：＃カリウム、１
０ｍＭ＃酸マグネシウム、０．５ｍＭジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ））１００ｕＪに溶解し、制限酵素１３ａｍ
ＨＩとＨｉｎｄｌｌ［各１２単位を加えて３７℃、２時
間反応させた後、反応液を０．７％アガロースゲルを用
いて電気泳動しＤＮＡ断片を分離した。ＤＮＡ断片は０
．５μｇ　／　ｍ　ｊ！のエチジウムブロマイドで染色
することにより確認した。

ゲルから目的とする４ＫｂｐのＤＮＡ断片を溶出し、フ
ェノールで抽出した後、２．５倍容量のエタノールを加
えてＤＮＡを沈殿させた。

ｐＬｃｚｓ−ｚａ　（マイクロバイオロジカルレビュー
ズ　第４７＠　　１９Ｂ３年　１８０頁（Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　４’Ｌ　　１８
（Ｌｉ２Ｏ２）　）　２μｇを、ＴＡバッフブー１００
μｌに溶解し、Ｂｇｌｌ［と）ｉｉｎｄｌ［各１２単位
を加えて３７℃にて２時間反応させた後、アガロースゲ
ル電気泳動法により４．６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を
分離溶出し、その後、フェノール抽出し、エタノールを
加えて沈殿させた。

得られた４Ｋｂｐと４．６　Ｋ　ｂ　ｐの両ＤＮＡ沈殿
を、リガーゼバッフｙ−（２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７，
６，１０ｍＭ　　ＭｇＣ１ｍ　、０．４ｍＭアデノシン
三リン酸（ＡＴＰ）　、１０ｍＭ　　ＤＴＴ）２０μｌ
に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０単位を加え１０℃、
２００時間反応せた。この反応液を用いて大腸菌ＨＢＩ
ＯＩを形質転換した。形質転換は標準的なＣａ　Ｃｌ　
を処理方法（モレキュラークローニング（（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）著者：マニアチス等、発
行所：コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−
１１９８２年発行）に記載）で行い、アンピシリン（Ａ
ｐ）５０μｇ／ｍｌを含む寒天平板上で出現したコロニ
ーからプラスミドＤＮＡを分離しＴＡバッファーに溶解
した後、Ｎｃｏｌで消化し、期待される８、　６　Ｋ　
ｂ　ｐのＤＮＡ断片を確認した。（第１図参照） ■　プラスミドｐｐＬ−λ！ｌの構築ｐｐＬ−λ（ジー
ン　第１６＠　１９８１年２６１頁（ｆｌｅｎｅ　　１
６，２６１．１９８１））　５　、ＩＪ　ｇをＴＡバッ
ファー２００μｌに溶解し、３ｍｍＨＩ４単位を加えて
３７℃、３０分間部分消化させた後、フェノールで抽出
し、エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈
殿をポリメラーゼバッファー（７ＧｍＭ）リス塩＠ｐＨ
７，６，１０ｍＭＭｇＣ１ｇ　、１０ｍＭ　　２−メル
カプトエタノール、各０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
ＳｄＧＴＰ、ＴＴＰ）４０μｌに溶解しＤＮＡポリメラ
ーゼＩの大型断片１０単位を加え２５℃、３０分間反応
させた後フェノール抽出とエタノール沈殿を行った０次
にＤＮＡ沈殿をＥｃｏバッファー（５ＱｍＭ）リス塩酸
ｐＨ７，８，５ｍＭ　　ＭｇＣｌ、、６ｍＭ２−メルカ
プトエタノール、７０ｍＭ　　ＮａＣｌ）２００２ｆｊ
！に溶解し、Ｅｃ　ｏＲ１２０単位を加えて３７℃、２
時間反応させた後、０、７％アガロースゲル上でＤＮＡ
を分離し、５ＫｂｐのＤＮＡ断片を溶出した後フェノー
ル抽出とエタノール沈殿を行った。

Ｃ１ａ　ＩとＢｇｌｌＩ切断部位をもつＤＮＡオリゴマ
ー ５′＾＾ＴＴＣＡＴＣＧＡＴＡＧＡＴＣＴ　３゜３°Ｇ
ＴＡＧＣＴＡＴＣＴＡＧ＾５゜ ６００ピコモルをリン酸化した後、５ＫｂｐのＤＮＡ断
片とともにリガーゼバフファー２０μｉに溶解し、Ｔ、
ＤＮＡリガーゼｌＯ単位を加えて８℃、２００時間反応
せた。この反応液を使って大腸菌Ｎ９９上■°を形質転
換し、プラスミドｐＰＬ−λＳを得た。

バクテリオファージλ　（ｃ１８５７ｓａｍ７）、ファ
ー１００μｌの混合液に熔解し、ＢａｍＨＩとＥＣ０Ｒ
Ｉ各２０単位を加えて３７℃、２時間反応させた後０．
７％アガロースゲル上でＤＮＡを分離し、４．７　Ｋ　
ｂ　ｐのＤＮＡ断片を溶出しフェノール抽出とエタノー
ル沈殿を行った。

ｐＢＲ３２２（５，ｕｇ）を同様にＢａｍＨＩとＥｃｏ
ＲＩで二重消化し、４ＫｂｐのＤＮＡ断片を単離した。

４Ｋｂｐとｃ１８５７ｆ＋１域を含む４゜７ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片をリガーゼバッファー２０μｌに溶解し、Ｔ、
ＤＮＡリガーゼ１０単位を加え、１０℃、２００時間反
応せた。この反応液を使ってＨＢＩＯＩを形質転換した
。Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドを調製しＥｃｏ
ＲＩで消化して、期待した８、　６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮ
Ａ断片を確認、することにより、プラスミドｐＢＲ３２
２−λが構成できたと判断した。

ｐＢＲ３２２−λ（５μｇ）をＴＡバッファー２０（ｌ
ｕＪに溶解しＣ１ａｌとＢｇｌ■各２０単位を加えて３
７℃、２時間反応後６％ポリアクリルアミドゲル上でＤ
ＮＡを分離し、１１３８ｂｐのＤＮＡ断片を溶出しフェ
ノール抽出とエタノール沈殿を行った。

ｐＰＬ−λＳ（１０ＩＪｇ）を同様にＣ１ａｌとＢｇｌ
ｌＩで二重消化し反応液４００μｌを２つに分けた。夫
々２００μｌの反応液について０．７％アガロースゲル
又は６％ポリアクリルアミドゲル上でＤＮＡを分離し、
アガロースゲルからは４．ＩＫｂｐの、又ポリアクリル
アミドゲルからは６６０ｂｐのＤＮＡ断片を溶出し、フ
ェノール抽出とエタノール沈殿を行った。４．ＩＫｂｐ
のＤＮＡ断片を５０ｍＭ）リス塩酸ＰＨ９，１ｍＭＭｇ
ｃ１ｇ　、０．１ｍＭ　　ＺｎＣ１ｇ　、１ｍＭスペル
ミジンを含む溶液５０μ２に溶解しバクテリアのアルカ
リホスファターゼ５単位を加え３７℃、３０分間反応さ
せた後、フェノール抽出を３回行い、次いでエタノール
を加えてＤＮＡを沈殿させた。

１１３８ｂｐ、６６０ｂｐ及び４．　Ｉ　Ｋ　ｂ　ｐの
ＤＮＡ断片をリガーゼバッファー４０μｌに溶解し、Ｔ
、ＤＮＡリガーゼ１０単位を加えて１゛０℃、２００時
間反応せた。この反応液を使ってＨＢＩＯｌを形質転換
した。Ａｐ耐性の形質転地体からプラスミドを調製しＥ
ｃｏＲＩで消化することにより、期待される５、　９　
Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を確認した。（第２図） ■　プラスミドｐＢＲＬＣ５の構築 ｐＢＲＬｃ１　（５μｇ）をＮ１００バフフアー（１０
ｍＭトリス塩酸ｐ　Ｈ７，８，７ｍＭ　　ＭｇＣ１ｇ、
６ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００ｍＭ　　Ｎａ
Ｃ１）２００μ４！に溶解しＡｃｃｌとＳａｌ■、各３
０単位を加えて３７℃、２時間反応させた後、フェノー
ル抽出しエタノールでＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈殿
をポリメラーゼバッファー２００μｌに溶解し、大腸菌
のＤＮＡポリメラーゼＩの大型断片１０単位を加えて２
５℃、２時間反応させた後、０．７％アガロースゲル上
でＤＮＡを分離した。ｚ、５ＫｂｐのＤＮＡ断片を溶出
しフェノールで抽出した後、エタノールを加えてＤＮＡ
を沈殿させた。

ＢａｍＨＩリンカ−（５’　　ＣＧＧＡＴＣＣＧ３’）
１５０ピコモルと、２．６　Ｋ　ｂ　１）のＤＮＡ沈殿
をリン酸化バフファー（６６ｍＭトリス塩酸ｐＨ７，６
，５ｍＭ　　ＭｇＣ１ｇ　、５ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭ
　　ＡＴＰ）２０μｍに溶解しＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ１０単位を加えて３７℃、１時間反応させた後、
さらにＴ４　ＤＮＡリガーゼ１０単位を加えて１０℃、
２００時間反応せた０反応液を６５℃、１０分間熱処理
した後、Ｎ１５０バフフｙ−（１０ｍＭ）リス塩酸ｐＨ
７，８，７ｍＭＭｇＣｌ露、６ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール、１５０ｍＭ　　ＮａＣ１）を加えて４００ｕｊ
とし、ＢａｍＨＩリンカ−の連結によって生じた５ａｌ
ｌ切断部位を消化するために、ＢａｍＨＩと５ａ１１各
４０単４０単えて３７℃、２時間消化した後、フェノー
ル抽出とエタノール沈殿を行った。

ｐＢＲ３２２（５ｇｇ）をＢａｍＨＩとＳａｌ■各２０
各校０単 ルを用いて４ＫｂｐのＤＮＡ断片を単離した。

４ＫｂｐのＤＮＡ断片と両端に９ｇｍＨＩ切断部位と５
ａｌｌ切断部位をもつ２．　６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮ４　
ＤＮＡリガーゼ１０単位を加え１０℃、２００時間反応
せた．この反応液を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換した
．Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドを調製し、Ｂａ
ｍＨＩと５ａｉｌで二重消化し、期待される２．　６　
Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を確認した．（第３図参照） ■　プラスミドｐＫＩＢＬ１の構築 ｐＢＲＬＣ５　（１０μｇ）をＮＩＧＯバフファー２０
０μｌとＮ１５Ｇバツフアー２００μｌの混合液に溶解
し１３ａｍＨＩと５ａｌｌ各３０単３０単え３７℃、２
時間反応させた後、０．７％アガロースゲルを用いて２
．６Ｋｂｐの断片を単離した。

ｐｐｔ，−λｃｌ（１Ｏａｇ）を同様にＢａｍＨＩと５
ａｌｌ各３０単３０単いて二重消化し、０。

７％アガロースゲルを用いて５．６Ｋｂｐｆ）ＤＮＡ断
片を単離した。

５、　６　Ｋ　ｂ　Ｉ）と２．　６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮ
Ａ断片をリガーゼバッファー２０μｌに溶解し、Ｔ．Ｄ
ＮＡリガーゼｌＯ単位を加え１０℃、２００時間反応せ
た。

この反応液を用いて大腸菌ＪＡ２　２　１を形質転換し
た．Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドを調製し、１
３ａｍＨ１と５ａｉｌで二重消化し、期待される２．　
６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を確認した．（第３図参照
） ２、α−ＤＩ（Ｂ耐性株の単離 ＪＡ２２　１をＬＢｊ＠地（バクトドリプトン１０ｇ／
ｊ，バクト酵母エキス５ｇ／ｌ，Ｎａ０１５ａｉｌ，ｐ
Ｈ７．５）１０ｍｊで堵養し、ＯＤ．。

＠−１．０のとき集菌し、国体をＰＳバフファー（Ｎａ
＊ＨＰＯｎ　　６　ｇ／ｌ，　　ＫＨ＊ＰＯａ　　３ａ
ｉｌ、ＮａＣ１　　８．５ａｉｌ，ｐＨ７．４）１０ｍ
ｊで２回洗浄した．洗浄画体をＰＳバフファー２　９ｍ
ｊに懸濁しＮＴＧを終濃度５０−２００μｇ　／　ｍ　
１となるように加えて３７℃、３０分間振とうし、ＰＳ
バッファー１０ｍ１で２回洗浄した後、国体をＬＢ培地
１０ｍｊに懸濁し３７℃、２時間培養した．培養液を集
菌し、ｐｓバフファー〇．８ｍｊに懸濁し、その０．　
２　ｍ　ｊずつを寒天１５ｇ／ｊとａ　−　Ｄ　Ｈ　Ｂ
　２　５　／Ｊ　ｇ　／　ｍ　ｊを含むＭ９ＬＴ培地（
０．６％Ｎ　ａ　ｚ　Ｈ　Ｐ　Ｏ　ａ　、Ｏ−　３％Ｋ
ＨＩＰ−０４　　、０．　０　５％Ｎ　ａ　Ｃ　１　、
　　　０．　１％　　ＮＨ．ＣＩ，０．５％グルコース
、２ｍＭ　　Ｍｇ５Ｏａ　、０。

１ｍＭ　　ＣａＣ１ｔ、５０ｔｔｇ／ｍｌロイシン、５
０４ｇ／ｍｊ）リプトファン、ｐＨ７．４＞にプレート
した後３７℃、４４時間培養した．生じた単一のコロニ
ーをストリーク法により検査し、α−ＤＩ（Ｂ耐性であ
ることを再度確認した．ストリーク法に用いたα−ＤＨ
Ｈの濃度は直径１．　５　０１１の円型濾紙１枚当り７
μｇ７２０μｌであり、α−ＤＨＢはＭ９ＬＴ培地に溶
解した。

３、ビオチン合成酵素の発現 上記のようにして得られたＪＡ２２１由来のα−ＤＨＢ
耐性株の１つ（ＴＫＩＯＩ）にｐＫＩＢＬｌを前述と同
様のＣａＣ１オを用いた標準的な形質転換法により導入
し、その形質転換株Ｎ５Ｉ０１を得た．Ｎ５１０１にお
けるビオチン合成酵素の発現をみるために同様を５０μ
ｇ　／　ｍ　ｊのＡｐを含むＭ９ＬＴ培地１　ｍ　ｊに
接種し３７℃、２０時間前培養した後、その０．１　ｍ
　ｌをとり上記の培地２５ｍ１に接種し３７℃にて本培
養した。０Ｄｂｈ。＝０．４になった時、温度を４２°
Ｃに上昇させて酵素の合成を誘導し、さらに２時間培養
を継続した。遠心して集菌し、菌をＱ、ｌ　ｍ　ｌのＳ
ＤＳを含むサンプルバフファー（６２，５ｍＭ）リス塩
酸ｐＨ６，８，２％ｉ　（Ｗ／　Ｖ）　Ｓ　Ｄ　Ｓ、　
５　％　（Ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、１０％
（Ｗ／Ｖ）グリセロール〕に懸濁の後、１００℃で５分
間熱処理した。この細胞全蛋白質を含むサンプルの１部
を用いて、ＳＯＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳
動の後、ゲルを染色し、ビオチン合成酵素に相当する３
８キロダルトンの主要蛋白質帯を見出した。プラスミド
を含まない大腸菌にはこの蛋白質帯は検出されなかった
。

４、ビオチンの蓄積 １００μＭのＤＴＢを含むＭ９ＬＴ培地で大腸菌を培養
し、誘導４時間における培養液２０ｍｌ１を遠心分離し
た。上澄み液の一定量をとり蓄積されたビオチンを、ラ
クトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を用いた
微生物定量法で定量した。

各々の菌株におけるビオチンの蓄積量を第１表に示す。

この結果からα−ＤＨＢ耐性株にビオチン合成酵素をコ
ードする遺伝子を導入することにより、ビオチンの蓄積
量が向上することがわかる。

第１表 菌　　株　　　ビオチン蓄積量（ｎｇ／ｍｊりＮ５ＩＯ
Ｉ　　　　　　　　　５１０ ＴＫＩＯ１１０ ＪＡ２２１　　　　　　　　　　４

【図面の簡単な説明】

第１．２及び３図は各々ｂｉｏＢ遺伝子を含有する組換
えプラスミドの構成法を示す作成図である。 出願人（４３０）　　日本曹達株式会社代理人　弁理士
　　伊　藤　晴　２ 同　横山吉美 第１図 １　ＢａｍＨＩ　ｐａｒｔｉａｌ 第３図 一一一］＝−−− ｌＢａｍＨＴ／Ｓａ！Ｉ　　ＩＢａｍＨ１／５ａｌＩ手
続補正書（自発） 昭和６０年／−月７（日 特許庁長官　　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第２７２６０５号 ２、発明の名称 ビオチン合成酵素をコードする二重鎖ＤＮＡ。 それを含む微生物及びビオチンの製造法３、補正する者 事件との関係　　特許出願人 ４６１０Ｇ　　東京都千代田区大手町２丁目２番１号（
４３Ｇ）日本曹達株式会社 代表者三宮武夫 ４、代理人 優１００　　東京都千代田区大手町２丁目２番１号日本
曹達株式会社内 同　　　　所 ５、補正の対象 明細書　　特許請求の範囲の欄 発明の詳細な説明の欄 図面の簡単な説明の欄 図面 ６、補正の内容 （１）　　明細書の特許請求の範囲、別紙の通り。 （２）明細書第１頁下行目の ｒｐＬプロモーターオペレーター」を「大腸菌染色体或
は大腸菌バクテリオファージ由来のプロモーターオペレ
ーター」と訂正する。 （３）　　明細書第１７真下から３行目のｒｐＬプロモ
ーターオペレーター」を 「大腸菌染色体或は大腸菌バクテリオファージ由来のプ
ロモーターオペレーター、例えばｐＬ、ｐＲｓ　ｌｐｐ
、ｌａｃ、ｔｒｐ或はｔａｃ等のプロモーターオペレー
ター」と訂正する。 （４）　　明細書第１９頁下から６ないし５行目の「最
も好ましいものは、」を 「代表的−例は、」と訂正する。 （６）　　明細書第１９頁４行目の 「バルチス」を「バチルス」と訂正する。 （６）　　明細書筒２０頁９行目の 「実施例」を「実施例１」と訂正する。 （９明細書第１９頁３行目の 「発行）」を「発行」と訂正する。 （８）　　明細書第２８真下から７行目のｒｃＪを「工
」と訂正する。 （９）　　明細書第３２頁１０行と１１行の間に下記を
挿入する。 「実施例２ １、　プラスミドｐＮＳ２の構築 １ｐｐｌａｃのプロキーターオペレーターにｂｉｏＢ遺
伝子を連結するために、次の操作を行った　　。 ■　プラスミドｐＢＲＬＣ２の構築 ｐＢＲＬｃ１　（５μｇ）をＮ１５０バツフアー１００
４１に溶解し、Ｎｃｏ１５０単位を加えて、３７℃で２
時間反応させた。フェノール抽出とエタノール沈殿を行
った後、ポリメラーゼバッファ−１００μｌに溶解した
。ＤＮＡポリメラーゼＩの大型断片１０単位を加えて室
温で３０分間反応させた後、フェノール抽出しエタノー
ル沈殿を行った・ ＢａｍＨＩリンカ−（５’　ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧ
３’）１．５μｇをリン酸化した後、ＤＮＡ沈殿と共に
リガーゼバッファー２０μｍに溶解し、Ｔ、ＤＮＡリガ
ーゼ２．８単位を加えて、１０℃で２００時間反応せた
。 この反応液を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換し、ＡＩ）
耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離した。プ
ラスミドＤＮＡを１３ａｍＨＩで消化し、アガロースゲ
ル電気泳動法により期待される７、３Ｋｂｐと１．３Ｋ
　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を確認した。 次に、？、３Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル
から溶出し、フェノール抽出とエタノール沈殿の後、リ
ガーゼバッファー２０μｌに溶解しＴ４ＤＮＡリガーゼ
２．８単位を加えて、１０℃で２００時間反応せた。 この反応液を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換した。Ａｐ
耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離しＢａｍ
ＨＩで消化して期待した７、３ＫｂｐのＤＮＡ断片を確
認することにより、プラスミドｐＢＲＬＣ２が構築され
たことを判断した（第４図参照）。 ■　プラスミドｐＮＳ２の構築 ｐ　Ｉ　Ｎｍ　Ｏｍｐ　ＡＩ（３／Ｊ　ｇ）をＮ５０バ
ツフアー（１０ｍＭトリス塩酸ｐ　Ｈ７，８、７ｍＭ塩
化マグネシウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭβ−
メルカプトエタノール）１００μｌに溶解し、３０単位
のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２時間反応させた。エタ
ノールで沈殿させた後、Ｎ１５０バツフアー１００μｌ
に溶解し、３０単位の５ａ１１を加えて３７℃で２時間
反応させた０反応液を０．７％アガロースゲルを用いて
電気泳動した。 泳動後６．３ＫｂｐのＤＮＡ断片をゲルから溶出し、フ
ェノール抽出とエタノール沈殿を行った。 また、ｐＢＲＬＣ２（３μｇ）を同様にＢａｎＨ［と５
ａｌｌ各３０単３０単いて消化し、０．７％アガロース
ゲル電気泳動を行った。泳動後２．６ＫｂｐのＤＮＡ断
片をゲルから溶出し、フェノール抽出とエタノール沈殿
を行った。 両ＤＮＡ沈殿をリガーゼバッファー２０μｍに溶解し、
Ｔ、ＤＮＡリガーゼ２．８単位を加えて１０℃で２００
時間反応せた。この反応液を用いて大腸菌ＤＨＩを形質
転換させ、Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡ
を分離した。これをＢａｍＨＩ（！：５ａｌｌで二重消
化し６．３　Ｋ　ｂ　Ｉ）と２．６ＫｂｐのＤＮＡ断片
を確認することにより、プラスミドｐＮｓ２が構築され
たことを判断した（第５図参照）。 ２、　プラスミドｐＮＳ３の構築 ｔｐｐのプロモーターにｂｉｏＢ遺伝子を連結するため
に、次の操作を行った。 エクスペリメンクル　マニピュレーシヲン　オプ　ジー
ン　エクスプレッション、弁上正順編集、アカデミツク
　プレス　１９８３年（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭａ
ｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　　Ｇｅｎｅ　Ｅ＊ｐｒｅ
Ｓｓｆｏｎ　＋　　Ｅｄｉｔｅｄｂｙ　　Ｍａｓａｙｏ
ｒｉ　　Ｉｎｏｕｙｅ　、　　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ、１９８３）に記載のｐＩＮＩＡｓ（３μｇ）を
Ｎ５０バッフｙ−１００，ｃｒｌに溶解し、３０単位の
ＢａｍＨＩを加えて３７℃で２時間反応させた。エタノ
ールで沈殿させた後Ｎ１５０バフフアー１００μｍに溶
解し、３０単位の５ａｌＩを加えて３７℃で２時間反応
させた０反応液を０．７％アガロースゲルを用いて電気
泳動した。泳動後３．７　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片をゲ
ルから溶出し、フェノール抽出とエタノール沈殿を行っ
た。 また、ｐＢＲＬＣ２（３μｇ）をｐ　Ｉ　Ｎ　Ｉ　Ａｓ
と同様にＢａｍＨＩと５ａｉｌ各３０単３０単化し、０
．７％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。泳動
後、２．５　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片をゲルから溶出し
、フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。 両ＤＮＡ沈殿をリガーゼパンファー２０μｍに溶解し、
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ２．８単位を加えて１０℃で２０
０時間反応せた。この反応液を用いて大腸＠ＤＨ１を形
質転換させ、Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを分離した。これをＢａｍＨＩと５ａｉｌで二重消化
し、３．７　Ｋ　ｂ　ｐと２、６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ
断片を確認することにより、プラスミドｐＮＳ３が構築
されたことを判断した（第６図参照）。 ３、　プラスミドｐＮＳ４の構築 ｐＲｐＬプロモーターオペレーターにｂｉｏＢ遺伝子を
連結するために、次の操作を行った。 ｐｐＬ−λｃ　Ｉ　（２，５μｇ　）をＴＡバッフｙ　
−５０ｐＩに溶解し、ＢａｍＨＩ３０単位を加えて３７
℃で２時間反応させた。フェノール抽出とエタノール沈
殿の後、ポリメラーゼバッファー５０μｌに溶解し、６
単位のＤＮＡポリメラーゼ■の大型断片を加えて室温で
３０分間反応させた。フェノール抽出とエタノール沈殿
の後５０μｌのＮ１５０パンフアーに溶解し、５ａｌＩ
２５単位を加えて３７℃で２時間反応させた後、０．７
％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。泳動後５
．６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片をゲルからｔ容出し、フ
ェノール抽出とエタノール沈殿を行った。 また、ｐ　Ｎ　Ｓ　２　（２，５μｇ）をＴＡバッファ
ー６０μｌに溶解し、Ｘｂａ１１２．５単位を加えて３
７℃で２時間反応させた。フェノール抽出とエタノール
沈殿の後ポリメラーゼバッファー５０μｌに溶解し、６
単位のＤＮＡポリメラーゼ■の大型断片を加えて室温で
３０分間反応させ、フェノール抽出とエタノール沈殿を
行った。Ｎ１５０バツフアー６０μｌにこの沈殿を溶解
し、２５単位の５ａｌｌを加えて３７℃で２時間反応さ
せた後、０．７％アガロースゲルを用いて電気泳動を行
った。 泳動後２．６Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片をゲルから溶出し
、フェノール抽出とエタノール沈殿を行った。 両ＤＮＡ沈殿をリガーゼバッファー２０μｌに溶解し、
Ｔ、ＤＮＡリガーゼ２．８単位を加えて１０℃で２００
時間反応せた。この反応液を用いて大腸菌ＤＨＩを形質
転換させ、Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡ
を分離した。プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、
８．２６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を確認することによ
り、プラスミドｐＮＳ４が構築されたことを判断した（
第７図参照）。 ４、　プラスミドｐＮＳ５の構築 １ｐｐｌａｃのプロモーターオペレーターにｂｉｏＢ遺
伝子を連結するために、次の操作を行った　　。 ■　プラスミドｐＢＲＬＣ３の構築 プラスミドｐＢＲＬｃｌ　　（２μｇ）をＮ１５０バツ
フアー８０μｌに溶解し、ＢａｍＨＩとＮｃＯＩ各２０
単位を加えて３７℃で２時間反応させ行った。７．３Ｋ
ｂのＤＮＡ断片をゲルから溶出し、フェノール抽出した
後エタノールで沈殿させた。 このＤＮＡ沈殿を４０ｕｌのポリメラーゼバッファーに
溶解し、７．５単位のＤＮＡポリメラーゼＩの大型断片
を加えて室温で３０分間反応させた。 フェノール抽出とエタノール沈殿の後、２０μｌのリガ
ーゼバッファーに溶解し２．８単位のＴａＤＮＡリガー
ゼを加え１０℃で２００時間反応せた。 この反応液を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換させ、Ａｐ
耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡを調整した。プ
ラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＮｃｏｌで消化しそれ
ぞれ？、　３　Ｋ　ｂ　ｐの断片が確認されたことによ
り、プラスミドｐＢＲＬＣ３が構築されたことを判断し
た（第８図参照）。 ■　プラスミドｐＮｓ５の構築 エンボ　ジャーナル　第３巻　１９８４年２４３７−２
４４２頁（Ｔｈｅ　　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　　３　
　＋２４３７−２４４２．１９８４）に記載のｐ　ＩＮ
ｎｌｏｍｐＡ３（１μｇ）をＮ１００バツフアー２００
μｌに溶解し、Ｘｂａ　Ｉ　１２単位を加えて３７℃で
２．５時間反応させ、５Ｍ塩化ナトリウム２μｌと５ａ
ｌ１２０単位を加え、さらに３７℃で２時間反応させた
。この反応液を０．７％アガロースゲル電気泳動にてＤ
ＮＡ断片を分離した後、６．　Ｉ　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ
断片を溶出し、フェノール抽出とエタノール沈殿を行っ
た。 ｐＢＲＬＣ３（１，ｃｒｇ）をＮ１５０バツフアー１０
０μｌに溶解し、Ｎｃｏｌと５ａｌｌ各ｌＯ単位を加え
て３７℃で２時間反応させた。０．７％アガロースゲル
電気泳動により２．６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を単離
し、フェノール抽出とエタノール沈殿を行った。 ｐ１３０ＢＬのｏ　ｍ　ｐ　Ａのシグナルペプチドをな
くし完全なビオチン合成酵素を発現させるため、λファ
ージｐＲプロモーターのシャインダルガーノ配列（ＳＤ
）を持つ下記の配列のオリゴヌクレオチドを固相法で合
成した。 ＴＡＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＴＴＴＧＧＴＡにのオリゴヌ
クレオチドをアニールするため、それぞれ０．４μｇを
５０μｌのアニーリングバッフｙ−（１０ｍＭ）リス−
塩酸（ｐＨ７，８）、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ
　　ＥＤＴＡ）に溶解し、６５℃５分間、４６℃１時間
反応後、室温で３０分間放置しエタノールを加え沈殿さ
せた。 オリゴヌクレオチドをリン酸化し、６．　Ｉ　Ｋ　ｂ　
Ｉ）と２．６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片と共にリガーゼ
バフファー２０μｌに溶解し、Ｔ、ＤＮＡリガーゼ２．
８単位を加え１２℃で２００時間反応せた。 この反応液を用いて大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換した。 Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、
Ｘｂａ　ＩとＮｒｕｌで消化し、４４０ｂｐのＤＮＡ断
片を確認することにより、プラスミドｐＮｓ５が構築さ
れたことを判断した（第９図参照）。 ５゜　プラスミドｐＮＳ６の構築 ｔａｃプロモーターオペレーターにｂｉｏＢ遺伝子を連
結するために、次の操作を行った　。 ｐＤＲ５４０（ファルマシアジャパン株式会社より購入
、＃２７−４９３２−０１）２．５μｇを１００μｍの
Ｎ５０バツフアーに溶解し、５単位のＨｉ　ｎ　６ｍを
加え３７℃で２時間反応させた後、５倍濃度のＮ１００
バツフアー１２μｌと５単位のＢａｍＨＩを加え３７℃
で２時間反応させた。 ５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で９２ｂｐのＤＮ
Ａ断片を単離した。 ｐＢＲＬＣ３（５μｇ）をＮ５０バフフアー１００μｌ
に溶解し、Ｈｉｎｄ！［１１０単位を加え３７℃で２時
間反応させた後、５倍濃度のＮＩＧＯバフファー１２μ
ｌとＢａｍＨ１１０単位を加え３７℃で２時間反応させ
た。０．７アガロースゲルを用いて電気泳動を行い６．
３　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を単離した。 両ＤＮＡ断片をリガーゼバッファー４０μｌに溶解し、
Ｔ、ＤＮＡリガーゼ２．８単位を加え１０℃で２００時
間反応せた。この反応液を用いて大腸菌ＨＢＩＯＩを形
質転換した。Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを調整し、ＰｓｔｌとＢａｍＨＩで二重消化し、期待
されたＤＮＡ断片を確認することにより、プラスミドｐ
ＮＳ６が構築されたことを判断した（第１０図参照）。 ６、　プラスミドｐＮＳ７の構築 ｔｒｐプロモーターオペレーターにｂｉｏＢ遺伝子を連
結するために、次の操作を行った　。 ｐＤＲ７２０（ファルマシアジャパン株式会社より購入
、＃２７−４９３０−０１）２．５μｇをＴＡバッフ７
−１００μｍに溶解し、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄｌｌｒ１
５単位を加えて３７℃で２時間反応させた。これを５％
ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、１１
０ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから溶出し、フェノール抽出
とエタノール沈殿を行った。 また、ｐ　Ｂ　ＲＬ　Ｃ５（２，５μｇ）をｐＤＲ７２
Ｇと同様にＢａｍＨＩとＨｉｎｄｌｌｌで消化し、０．
７％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。ゲルか
ら５．６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を溶出し、フェノー
ル抽出とエタノール沈殿を行った。 両ＤＮＡ断片をリガーゼバッファー２０μｌに溶解し、
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ２．８単位を加えて１０℃で２５
時間反応させた。この反応液を用いて大腸菌ＤＨＩを形
質転換させ、Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを分離した。これをＢａｍＨＩと）ｌｉｎｄｌｌ［で
二重消化し、０．１１Ｋｂｐと５．６　Ｋ　ｂ　ｐのＤ
ＮＡ断片を確認することにより、プラスミドｐＮＳ７が
構築されたことを判断した第１１図参照）。 ７、　プラスミドｐＮＳ８の構築 プリブノボックスがコンセンサス配列をもつ合成プロモ
ーターオペレーターにｂｉｏＢ遺伝子を連結するために
、次の操作を行った　。 ■　プラスミドｐＢＲＬＣ６の構築 ｐＢＲＬｃｌ　（１０１１ｇ）をＮ１５０ハソファ−１
００＃Ｉに溶解し、５ａｌ１３０単位を加えて３７℃で
２時間反応させた。エタノール沈殿の後Ｎ５０バフフア
ー１００μｌに溶解し、ＡｃｃＩ３０単位を加えて３７
℃で２時間反応させた。 再びエタノールで沈殿させポリメラーゼバッファー１０
０μｍに溶解し、ＤＮＡポリメラーゼにの大型断片１２
単位を加えて室温で３０分間反応させ、その後フェノー
ル抽出とエタノール沈殿を行った。 Ｈ５ｎｄｍリンカ−（５’　ＣＡＡＧＣＴＴＧ３’）１
．５μｇをリン酸化した後、ＤＮＡ断片と共にリガーゼ
バッファー２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２．
８単位を加えて４℃で２００時間反応せた。フェノール
抽出とエタノール沈殿の後、Ｎ１５０バツフアー１００
μｌに溶解し、ＨｉｎｄｌＩＩリンカ−の連結によって
生じた５ａｉｌ切断部位を消化するために、３ａｌ１３
０単位を加えて３７℃２時間反応させた。 再びエタノールで沈殿させた後Ｎ５０バツフアー１００
μｌに溶解し、）ｌｉｎｄＩ［［５０単位を加えて３７
℃で２時間反応させた。０．７％アガロースゲルを用い
て電気泳動を行った後、ゲルから２、６　Ｋ　ｂ　ｐの
ＤＮＡ断片を溶出し、フェノール抽出とエタノール沈殿
を行った。 また、ｐＢＲ３２２（５μｇ）をＮ１５０バッファー１
００．ｃｒｌに溶解し、５ａ１１３０単位を加えて３７
℃で２時間反応させた。エタノール沈殿の後、Ｎ５０バ
ツフアー１００μｌに溶解し、Ｈ４ｎｄｌ１１５０単位
を加えて３７℃で２時間反応させた後、０．７％アガロ
ースゲルを用いて電気泳動を行った。３．７４Ｋｂｐの
ＤＮＡ断片をゲルから溶出し、フェノール抽出とエタノ
ール沈殿を行った。 両ＤＮＡ断片をリガーゼバッファー２μに溶解し、Ｔ、
ＤＮＡリガーゼ２．８単位を加えて１０℃で２００時間
反応せた。この反応液を用いて大腸ＩＩＤＨＩを形質転
換した。Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡを
分離し、Ｈｉ　ｎｄ［［［と５ａｌｌで二重消化し、３
．７４Ｋｂｐと２．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を確認するこ
とにより、ｐＢＲＬＣ６が構築されたことを判断した（
第１２図参照）。 ■　プラスミドｐＮ３８の構築 ｐＹＥＪＯＯｌ　　（ファルマシアジャパン株式会社か
ら購入し、＃２７−４９２８−０１）１．５μｇをＮ５
０バツフアーｉｏｏμｌに溶解し、Ｈｉｎｄｌ［［２０
単位を加えて３７℃で２時間反応させた。 さらに５倍濃度のＮ１００バツフアー　２５μｌと５ａ
ｌ１２０単位を加えて３７℃で２時間反応させた後、０
．７％アガロースゲルを用いて２．８Ｋｂｐの断片を単
離した。 ｐＢＲＬＣ６（３ｔｔｇ）を同様にＨｉｎｄｕと５ａｌ
（で消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動を用いて
２．６　Ｋ　ｂ　ＰのＤＮＡ断片を単離した。 両ＤＮＡ断片をリガーゼバフファー３０μｌに溶解し、
Ｔ　ａ　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ２．８単位を加え１０℃で
２００時間反応せた。この反応液を用いて大腸菌ＪＡ２
２１を形質転換した。Ａｐ耐性の形質転換体からプラス
ミドＤＮＡを調整し、Ｈｉｎｄ■と５ａｌｌで二重消化
しあるいはＨ４ｎｃＩＩで消化し、期待されたＤＮＡ断
片を確認することにより、プラスミドｐＮＳ８が構築さ
れたことを判断した（第１３図参照）。 ８、　プラスミドｐＮＳ９の構築 ｔａｃプロモーターオペレーターにｂｉｏＢ遺伝子を連
結するために、次の操作を行った　。 ｐＫＲ５４０（ファルマシアジャパン株式会社より購入
、＃２７−４９３２−Ｏｆ）５μｇを１００ｕｌのＮ１
００バフフアーに溶解し、ＢａｍＨ１１０単位を加え３
７℃で２時間反応させた後、フェノール抽出しエタノー
ルでＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈殿を５０μｍのポリ
メラーゼバッファーに溶解し、ＤＮＡポリメラーゼＩの
大型断片４単位を加えて１３℃で２時間反応させた後、
フェノール抽出しエタノールでＤＮＡを沈殿させた。さ
らにＤＮＡ沈殿を１００μｌのＰｓｔｌバッファーに溶
解し、ＰｓｔｌｌＯｊ１位を加えて３７℃２時間反応さ
せた後、１．０％アガロースゲルを用いて０．８　Ｋ　
ｂ　ｐのＤＮＡ断片を単離した。ｐＮ３２　（１０１１
ｇ）を１５０μｌのＮ１００バッファーに溶解し、Ｘｂ
ａ　Ｉ　１５単位を加えて３７℃２時間反応させた後、
フェノール抽出しエタノールでＤＮＡを沈殿させた。Ｄ
ＮＡ沈殿を５０μｍのポリメラーゼバッファーに溶解し
、ＤＮＡポリメラーゼ■の大型断片４単位を加えて１３
℃で２時間反応させた後、フェノール抽出とエタノール
沈殿を行った。さらにＤＮＡ沈殿を１００μｌのＰｓｔ
ｌのバッファーに溶解し、Ｐｓｔｌ１５単位を加えて３
７℃で２時間反応させた後、０．７％アガロースゲルを
用いて８．　Ｉ　Ｋ　ｂ　Ｉ）のＤＮＡ断片を単離した
。得られた０、　８　Ｋ　ｂ　ｐと８．　Ｉ　Ｋ　ｂ　
ｐの両ＤＮＡ断片を３５μｌのリガーゼバッファーに溶
解し、Ｔ、ＤＮＡリガーゼ２．８単位を加えて１０℃で
２００時間反応せた。この反応液を用いて大腸菌ＪＡ２
２１を形質転換した。Ａｐ耐性の形質転換体からプラス
ミドＤＮＡを調整し、ＨｉｎｃＩＩで消化したものおよ
びＥｃｏＲＩで消化したものの両方で期待されるＤＮＡ
断片を確認し、プラスミドｐＮＳ９が構築されたことを
判断した（第１４図参照）。 ９、　ｐＮｓｌｏの構築 １）ＲプロモーターオペレーターにｂｉｏＢ遺伝子を連
結するために、次の操作を行った　。 ｐＢＲＬｃｌ　（１０μｇ）をＮ５０バツフアー６０μ
ｌに溶解し、ＡＣＣＩ５０単位を加えて３７℃で２時間
反応させた。フェノール抽出、エタノール沈殿の後、ポ
リメラーゼバッファー５０μｌに溶解し、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩの大型断片１０単位を加えて室温で３０分間反
応させた。フェノール抽出、エタノール沈殿を行った後
、Ｎ１５０バツフアー４０μｉに溶解し、５ｐｈ１５０
単位を加えて３７℃で２時間反応させた。この反応液を
０．７％アガロースゲルを用いて電気泳動し、ゲルから
２．５　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を溶出しフェノール抽
出、エタノール沈殿を行った。 また、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリ
ー　第２５７巻　１９８２年　１３１８１〜１３１８４
　　頁　（Ｊ　、　　Ｂ　ｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　　２５
７．　１３１８１　〜１３１８４．１９８２）　ニ記載
＋７）１）ＣＱＶ２　（１０，ｕｇ）をＮ１００バッフ
ｙ−２００，ｕｌに溶解し、１３　ａ　ｍ　ＨＩ５０単
位を加えて３７℃で２時間反応させた。フェノール抽出
、エタノール沈殿の後、ポリメラーゼバッファー５０μ
ｌに溶解し、ＤＮＡポリメラーゼ■の大型断片１０単位
を加えて室温で３０分間反応させた。フェノール抽出、
エタノール沈殿を行った後Ｎ１５０バツフアー４０μｌ
に溶解し、５ｐｈｒｓｏ単位を加えて３７℃で２時間反
応させた。この反応液を０．７％アガロースゲルを用い
て電気泳動し、ゲルから４．７　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断
片を溶出しフェノール抽出、エタノール沈殿を行った。 両ＤＮＡ断片を３０μｌのリガーゼバフファーに熔解し
、ＴａＤＮＡリガーゼ２．８単位を加えて８℃で２００
時間反応せた。この反応液を用いて大腸菌ＤＨＩを形質
転換した。Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡ
を調整し、Ｎｃｏｌと５ｐｈＩで２重消化し２゜５４Ｋ
ｂｐと４．７５ＫｂｐのＤＮＡ断片を確認することによ
り、プラスミドｐＮｓ１０が構築されたことを判断した
（第１５図参照）。 １０、プラスミドｐＮ３１１の構築 ｐＲｐＬプロモーターオペレーターにｂｉｏＢ遺伝子を
連結するために、次の操作を行った　。 ■　プラスミドｐ　ＣＱＶ　２−ＹＭ２の構築バクテリ
オファージλ（２０μｇ）をＮ５０バフフｙ−５０（Ｊ
ｕ＋に溶解し、ＣＩａｌ１００単位を加えて３７℃で２
時間反応させた。反応液を０．７％アガロースゲルを用
いて電気泳動し、ゲルから　ｌ、　９　Ｋ　ｂ　ｐのＤ
ＮＡ断片を溶出しフェノール抽出、エタノール沈殿を行
った。このＤＮＡ沈殿をＮＫＯバッファー（１０ｍＭｌ
−リス塩酸、　　ｐＨ７，２，７ｍＭ塩化マグネシウム
、６ｍＭ　　メルカプトエタノール）２５０μｌに溶解
し、ＦｎｕＤ■１００単位を加えて３７℃で２時間反応
させた。 ＢａｍＨＩリンカ−（５’　ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ　　
３’）１．５μｇをリン酸化した後、ＤＮＡ断片と共に
リガーゼバフファー２０μＩに溶解し、５．６単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを加えて２２℃で６時間反応させた。 フェノール抽出、エタノール沈殿の後２シ０ＩＩｌのＴ
Ａバッファーに溶解し、ＢａｍＨＩとＢｇｌＩｌ各３５
単位を加えて３７℃で２時間反応させた。５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行った後２９０ｂｐのＤＮＡ
断片をゲルから溶出し、フェノール抽出、エタノール沈
殿を行った。 また、ｐ　ＣＱＶ　２　（２ｐ　ｇ）をＮ１００バフ７
アーに溶解し、ＢａｍＨＩ１２単位を加えて、３７℃で
２時間反応させた。エタノールで沈殿させた後４０１１
１のＩＭ　　）リス塩酸、ｐＨ８，０に溶解し、大ＩＪ
！菌アルカリフォスファターゼ２．５単位を加えて３７
℃で１時間反応させた。フェノール抽出、エタノール沈
殿の後、前述の２９０ｂｐのＤＮＡ断片と共にリガーゼ
バッファー２０μｌに溶解し、５．６単位のＴ、ＤＮＡ
リガーゼを加えて２２℃で６時間反応させた。 この反応液を用いて大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換させ、
Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離した
。これをＢａｍＨＩで消化し５．２ＫｂｐのＤＮＡ断片
を確認することにより、また、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄｎ
［で二重消化し７５０ｂｐのＤＮＡ断片を確認すること
により、ｐ　ＣＱＶ　２−ＹＭ２が構築されたことを判
断した（第１６図参照）。 ■　プラスミドｐＮｓ１１の構築 ｐＣＱＶ２−ＹＭ２（１，５μｇ）をＮ１５０バツフア
ー１００μｌに溶解し、各１５単位のＢａｍＨｌと５ａ
ｌｌを加えて３７℃で２時間反応させた後、０．７％ア
ガロースゲルを用いて電気泳動を行った。泳動後ゲルか
ら４．９　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を溶出し、フェノー
ル抽出、エタノール沈殿を行った・ また、ｐ　Ｂ　ＲＬ　Ｃ２（１，５μｇ）をＮ１５０バ
ツフアー１００μｌに溶解し、各１５単位のＢａｎＨｌ
と５ａｌｌを加えて３７℃で２時間反応させた後、０．
７％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。泳動後
ゲルから２．６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を溶出し、フ
ェノール抽出、エタノール沈殿を行った。 リガーゼバッファー２０μｌに両ＤＮＡ沈殿を溶解し、
Ｔ、ＤＮＡリガーゼ２，８単位を加えて４℃で２００時
間反応せた。この反応液を用いて大腸菌ＪＡ２２１を形
質転換させ、Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを分離した。これをＢａｍＨｌと５ａｉｌで二重消化
して、４．９Ｋｂｐと２．６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片
を確認することにより、ｐＮ３１１が構築されたことを
判断した（第１７図参照）。 １１、　プラスミドｐＮｓ１２の構築 ｐＲｐＬのプロモーターオペレーターにｂｉ。 Ｂ遺伝子を連結するために、次の操作を行った。 ｐＣＱＶ２−ＹＭ２（２，５，ｕｇ）をＴＡバッファー
５０μｌに溶解し、ＢａｍＨＩ３０単位を加えて３７℃
で２時間反応させた。フェノール抽出、エタノール沈殿
の後、ポリメラーゼバッファー５０μｍに溶解し、６単
位のＤＮＡポリメラーゼ■の大型断片を加えて室温で３
０分間反応させた後、フェノール抽出、エタノール沈殿
を行った。５０μｌのＮ１５０バツフアーにこの沈殿を
溶解し、５ａｌ１２５単位を加えて３７℃で２時間反応
させた後、０．７％アガロースゲルを用いて電気泳動を
行った。泳動後４．９　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片をゲル
から溶出し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行った
。 また、ｐ　Ｎ　Ｓ　２　（２，５μｇ）をＴＡバッファ
ー６０ｐｌに溶解し、Ｘｂａｌ１２．５単位を加えて３
７℃で２時間反応させた。フェノール抽出、エタノール
沈殿の後、ポリメラーゼバッファー５０μｍに溶解し、
６単位のＤＮＡポリメラーゼｌの大型断片を加えて室温
で３０分間反応させ、フェノール抽出、エタノール沈殿
を行った。Ｎ１５０バツフブー６０μｍにこの沈殿を溶
解し、２５単位の５ａｌｌを加えて３７℃で２時間反応
させた後、０．７％アガロースゲルを用いて電気泳動を
行った。 泳動後、２．７　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片をゲルから抽
出し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。 両ＤＮＡ沈殿をリガーゼバフファー２０μｌに溶解し、
ＴａＤＮＡリガーゼ２．８単位を加えて、４℃で２００
時間反応せた。この反応液を用いて大腸菌ＤＨＩを形質
転換させ、ＡＩ）耐性の形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを分離した。プラスミドＤＮＡｆＢａｍＨＩで消化し
、０．１　Ｋ　ｂ　ｐと？、６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断
片を確認することにより、ｐＮｓ１２が構築されたこと
を判断した（第１８図参照）。 １２、プラスミドｐＮｓ１３構築 ｐＲプロモーターオペレーターにｂｉｏＢ遺伝子を連結
するために、次の操作を行った　。 １）ＣＱＶ２　（３μｇ）をＮ５０バッフ７−１００μ
ｌに溶解し、３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２
時間反応させた。エタノールで沈殿させた後Ｎ１５０バ
ツフアー１００μｌに溶解し、３０単位の５ａｌｌを加
えて３７℃で２時間反応させた０反応液を０．７％アガ
ロースゲルを用いて電気泳動した。泳動後４．６　Ｋ　
ｂ　ｐのＤＮＡ断片をゲルから溶出させ、フェノール抽
出、エタノール沈殿を行った。 また、ｐＢＲＬＣ２（３／Ｊｇ）を同様にＢａｍＨｌと
５ａｌｌで消化し、０．７％アガロースゲルを用いて電
気泳動した。泳動後２．６　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を
ゲルから溶出し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行
った。 両ＤＮＡ沈殿をリガーゼバッファー２０μｌに溶解し、
ＴａＤＮＡリガーゼ２．８単位を加えて４℃で２００時
間反応せた。この反応液を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転
換させ、Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡを
分離した。これをＢａｍＨＩと５ａｉｌで二重消化し４
．６　Ｋ　ｂ　ｐと２．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を確認す
ることにより、ｐＮＳ１３が構築されたことことを判断
した（第１９図参照）。 １３、プラスミドｐＮｓ１４の構築 ｐＲプロモーターオペレーターにｂｉｏＢ遺伝子を連結
するために、次の操作を行った　。 ｐＣＱＶ２　（１０／ｊｇ）をＮ１００バツフアー１０
０ｕｌに溶解し、ＢａｍＨＩ３０単位を加えて３７℃で
２時間反応させた。フェノール抽出、エタノール沈殿の
後、ポリメラーゼバッファー４０μｌに溶解し、ＤＮＡ
ポリメラーゼ■の大型断片１０単位を加えて１３℃で１
時間反応させた。 フェノール抽出、エタノール沈殿を行った後、１８０μ
ｌのＮ１５０バツフアーに溶解し、５ａｌ１５０単位を
加えて３７℃で２時間反応させた。反応液を０．７％ア
ガロースゲルを用いて電気泳動し、ゲルから４．６　Ｋ
　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を溶出しフェノール抽出、エタノ
ール沈殿を行った。 また、ｐＮＳ２　（１０μｇ）をＴＡバッファー１００
μｌに溶解し、Ｘｂａ１５０単位を加えて３７℃で２時
間反応させた。フェノール抽出、エタノール沈殿の後、
ポリメラーゼバッファー４０μｌに溶解し、ＤＮＡポリ
メラーゼＩの大型断片１０単位を加えて１３℃で１時間
反応させた。フェノール抽出、エタノール沈殿を行った
後、１８０ｐｉのＮ１５０バフフアーに溶解し、５ａｉ
１５０単位を加えて３７℃で２時間反応させた。反応液
を０．７％アガロースゲルを用いて電気泳動し、ゲルか
ら２．７　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を溶出しフェノール
抽出、エタノール沈殿を行った。 両ＤＮＡ沈殿を４０μｌのリガーゼバッファー溶解し、
Ｔ、ＤＮＡリガーゼ２．８単位を加えて８℃で２００時
間反応せた。この反応液を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転
換した。Ａｐ耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡ＠
”Ｊ整し、ＢａｍＨＩと５ａｉｌで２重消化し期待した
Ｏ、　ｌ　Ｋ　ｂ　ｐ、４．６ＫＭ、２．７ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片を確認することにより、プラスミドｐＮｓ１４
が構築されたことを判断した（第２０図参照）。 １４、ビオチン合成酵素の発現 前記されているＪＡ２２１由来のα−ＤＨＢ耐性株の１
つ（ＴＫＩＯＩ）に、ビオチン合成酵素をコードする遺
伝子をもつ種々の大腸菌プラスミドを形質転換法により
導入し、その形質転換株を得た。ＴＫＩＯＩに、プラス
ミドｐＮｓ２、ｐＮＳ３、ｐＮＳ４、ｐＮＳ５、ｐＮＳ
６、ｐＮＳ７、ｐＮＳ８、ｐＮＳ９、ｐＮｓｌｏ、ｐＮ
ｓｌｌ、ｐＮｓ１２、ｐＮｓ１３、ｐＮｓ１４を導入し
て得られた形質転換株を、それぞれＮ５１０２、Ｎ５１
０３、Ｎ５１０４、ＮＳ　１０５、ＮＳ　Ｉ　Ｏ６、Ｎ
５１０７、Ｎ５１０Ｂ、Ｎ５１０９、Ｎ５ＩＩＯ１ＮＳ
１１１、Ｎ５１１２、Ｎ５１１３、Ｎ５１１４と命名し
た。Ｎ５１０２−ＮＳ１１４におけるビオチン合成酵素
の発現をみるために同株を５０ｕ　ｇ／ｍ　１のＡｐを
含むＭ９ＬＴ培地１ｍｌに接種し３７℃、２０時間前培
養した後、その０．１ｍｌをとり上記の培地２５ｍ１に
接種し３７℃にて本培養した。ＯＤ＆６゜＝０．４にな
った時、温度を４２℃に上昇させるか、またはイソプロ
ピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｔ　ＰＴＧ）を
２ｍＭになるように添加して酵素の合成を誘導し、さら
に２時間培養を継続した。遠心して集菌し、菌を０．１
ｍｌのＳＤＳを含むサンプルバッファー〔６２，５ｍＭ
トリス塩酸ｐ　Ｈ６，８，２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、５％
（ｖ／■）２−メルカプトエタノール、１０％（Ｗ／Ｖ
）グリセロール〕に懸濁の後、１００℃で５分間熱処理
した。この細胞全蛋白質を含むサンプルの１部を用いて
、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動の後、
ゲルを染色し、ビオチン合成酵素に相当する３８キロダ
ルトンの主要蛋白質帯を見出した。プラスミドを含まな
い大腸菌にはこの蛋白質帯は検出されなかった。 １５、ビオチンの蓄積 ５０　ｍ　ｇ　／　ｌのＡｐを含むＬＢ培地に大腸菌を
一夜前培養し、培養液０．１　ｍ　ｌを、５０ｍｇ／ｌ
のＡｐ、１１００ｕのｄ　Ｉ−ＤＴＢ、２ｍＭのＩＰＴ
Ｇを含むペプトン−カザミノ酸培地（２％グリセリン、
５％プロテオース・ペプトン、２％カザミノ酸、０゜１
％Ｋｇ　ＨＰＯ４，０，０５％ＫＣＩ。 ０゜０５％Ｍｇ　ＳＯ４，０，００１％Ｆｅ５Ｏａ、０
．００１％Ｍｎ５Ｏｎ　）０．９ｍｌに加えて３７℃、
２４時間培養した。培養液を遠心分離し上澄み液の一定
量をとり、蓄積されたビオチンをラクトバチルス・プラ
ンタラムＡＴＣＣ８０１４を用いた微生物定量法で定量
した。 プラスミドｐＮｓ５を含むそれぞれの菌株におけるビオ
チンの蓄積量を第２表に示す、この結果からＪＡ２２１
およびＪＡ２２１のα−ＤＴＢ耐性株にビオチン合成酵
素をコードする遺伝子を導入することにより、ビオチン
の蓄積が著しく向上することがわかる。 次にビオチン蓄積量の最も高かったＪＡ２２１のα−Ｄ
ＴＢ耐性株に、ビオチン合成酵素をコードする遺伝子を
もつ種々の大腸菌プラスミドを導入して、ＤＴＢから変
換したビオチンを定量した。 第３表に示すように、ビオチン蓄積の向上は種々の大腸
菌変異株において見られ、特にｐＮＳ５、ｐＮｓｌｏ、
ｐＮｓ１３を含む形質転換体を用いてビオチンを製造す
ると、ＤＴＢを収率１００％でビオチンに変換すること
ができ、又、培地にはビオチンが１２ｍｇ／Ｉ蓄積され
るものであり、工業的に極めて有利である。 第　　２　表 菌　　株　　　　　　　　ビオチン蓄ａ量（μｇ／ｍ１
） ＪＡ２２　ｉ、”ｐＮｓｓ　　　　　　　　１０．０Ｔ
ＫＩ　Ｏ゛ｌ／ｐＮＳ５　　　　　　　１２．０ＤＨＩ
　　　／ｐＮＳ５　　　　　　　５．０ＲＶ３０８／ｐ
ＮＳ５　　　　　　　４．８第３表 ＪＡ２２１　０．００４　　　　０ Ｔ）［１０１０，０１０ ＮＳＩＯＩ　　Ｏ，２２２，１０３ ＮＳ１０２　０．５７　　　　１Ｏ ＮＳ１０３　２．３２　　　　３ ＮＳ１０４　０．７０　　　　５ ＮＳ１０５１２．００　　　　５ ＮＳ１０６　０．２０　　　　０．５ ＮＳ１０７　０．２３　　　　０．ｌ Ｎ５１０８　４．６０　　　　３ ＮＳ１０９　０．２１　　　　７ ＮＳ１１０　１．２５１２．００　　３ＮＳＩＩＩ　　
Ｏ，１５１，００１ ＮＳ１１２　０．７３　０．７９　　５ＮＳ１１３　０
．６０１２．００　　０．ｌＮ５１１４　０．２０　０
．４０　　２顛　明細書第３２頁１２行の 「第１，２及び３図は」は「第１ないし第２０図は」と
訂正する。 （１１）別添の第４図ないし第２０図を追加する。 ７、添付書類の目録 （１）特許請求の範囲　　　　　　　　　−通（２）図
面（第４図ないし第２０図）　各−通特許請求の範囲 （１）ビオチン合成酵素をコードする二重！！　Ｄ　Ｎ
　Ａ（２）ビオチン合成酵素をコードする二重鎖ＤＮＡ
を含み、それを発現させることのできる環状二重鎖ＤＮ
Ａをプラスミドとして含む形質転換された大腸菌変異株 （３）ビオチン合成酵素をコードする二重鎖ＤＮＡとそ
の上流領域に大腸菌染色体或は大腸菌バクテリオファー
ジ由来のプロモーターオペレーターを含む環状二重鎖Ｄ
ＮＡをプラスミドとして含む特許請求の範囲の第２項記
載の大腸菌変異株（４）ビオチン合成酵素をコードする
二重ＭＤＮＡを含み、それを発現させることのできる環
状二重鎖ＤＮＡをプラスミドとして含む形質転換された
大腸菌変異株を、デチオビオチンを含む培地で培養して
培地中に蓄積されたビオチンを採取することを特徴とす
るビオチンの製造方法。 （５）ビオチン合成酵素をコードする二重鎖ＤＮＡとそ
の上流領域に大腸菌染色体或は大腸菌バクテリオファー
ジ由来のプロモーターオペレーターを含む環状二重鎖Ｄ
ＮＡをプラスミドとして含む形質転換された大腸菌変異
株を使用する特許請求の範囲の第４項記載のビオチンの
製造方法。 第４図 しＮｃｏＩ ＬＰｏｌ、ｙｍｅｒａｓｅ しＢａｍＨＩ　　Ｌｉｎｋｅｒ ＢａｍＨＩ 第５図 ６．３Ｋｂｐ　　　　２．６　Ｋｂｐ ａｍＨＩ 第６図 第７図 しＢａｍＨＩ　　　　　　　　　　　しＸｂａＩＢａｍ
ｔ（Ｉ 第８図 ＬＢ　ａ　ｍＨＩ／　Ｎ　ｏＯＬ ７．２６にｂｐ 第９図 第１０図 第１１図 ａｍＨＩ 第１３図 第１４図 しＢａｍＨＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　しＸ
ｂａｔｌ、ＰｏＬｙｍｅｒａｓｅ　　　　　　　　　　
Ｉ／Ｐｏｔｙｍｅｒａｓｅ第１５図 しＢａｍＨＩ　　　　　　　　　　ｌ、　ＡｃｃＩＲａ
ｍ）ＩＩ 第１６図 しＦｎｕＯＩｆ 第１７図 第１８図 しＢａｍＨＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ｌ’ＸｂａＩしｏＬｙｍｅｒａｓｅ　　　　　　　　
　　しＰｏｔｙｍｅｒａｓｅし５ａｔｌ　　　　　　　
　　　　　　　　　　し５ａＬＩ第１９図 第２０図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ビオチン合成酵素をコードする二重鎖ＤＮＡ（２
   ）ビオチン合成酵素をコードする二重鎖ＤＮＡを含み、
   それを発現させることのできる環状二重鎖ＤＮＡをプラ
   スミドとして含む形質転換された大腸菌変異株 （３）ビオチン合成酵素をコードする二重鎖ＤＮＡとそ
   の上流領域にｐＬプロモーターオペレーターを含む環状
   二重鎖ＤＮＡをプラスミドとして含む特許請求の範囲の
   第２項記載の大腸菌変異株（４）ビオチン合成酵素をコ
   ードする二重鎖ＤＮＡを含み、それを発現させることの
   できる環状二重鎖ＤＮＡをプラスミドとして含む形質転
   換された大腸菌変異株を、デチオビオチンを含む培地で
   培養して培地中に蓄積されたビオチンを採取することを
   特徴とするビオチンの製造方法。 （５）ビオチン合成酵素をコードする二重鎖ＤＮＡとそ
   の上流領域にｐＬプロモーターオペレーターを含む環状
   二重鎖ＤＮＡをプラスミドとして含む形質転換された大
   腸菌変異株を使用する特許請求の範囲の第４項記載のビ
   オチンの製造方法。