JP2569218B2 - ＭｅｔーアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ - Google Patents

ＭｅｔーアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ

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JP2569218B2
JP2569218B2 JP2330876A JP33087690A JP2569218B2 JP 2569218 B2 JP2569218 B2 JP 2569218B2 JP 2330876 A JP2330876 A JP 2330876A JP 33087690 A JP33087690 A JP 33087690A JP 2569218 B2 JP2569218 B2 JP 2569218B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換え技法を用いて、Ｎ−末端のメチオニ
ンを欠失するタンパク質、特に外来性タンパク質の細菌
系における製造に関する。さらに詳しくは、それは、イ
ン ビトロで使用され又はこれらのシステムにおいて成
熟タンパク質の完全なプロセシングのために高いレベル
のペプチダーゼを含む卓越した細菌宿主を製造するため
に使用され得る、Ｎ−末端のメチオニンに対して特異的
なペプチダーゼに関する。
〔従来の技術〕
細菌宿主での外来性タンパク質の製造は、現在十分に
確立されている。比較的に標準の方法においては、目的
とするタンパク質をコードする遺伝子配列が、宿主生来
の又は宿主と適合する調節配列の制御下に配置され、そ
して宿主細菌中に形質転換される。一般的に、これを達
成できる３つの主な方法が存在する： （１）目的とするタンパク質をコードするDNAが、細菌
の調節配列の制御下ですでに細菌の遺伝子と読み枠を合
わせて融合され、“融合タンパク質”を得ることがで
き； （２）目的とするコード配列が、分泌タンパク質をもた
らす作用可能なリーダー配列と読み枠を合わせて融合さ
れ；又は （３）目的とするコード配列が、“直接的な”発現をも
たらすATG開始コドンのすぐ下流に配置され、“成熟”
タンパク質を得ることができる。この最後の場合におい
ては、成熟タンパク質は分泌されないが、しかししばし
ば封入体として細胞内域に見出される。
ATG−先行のコード配列の直接的な発現によって形成
される成熟タンパク質が、ATGの翻訳生成物であるＮ−
末端のメチオニンを担持することは、言明されていない
が、しかし当業者によっては良く認識されている。特定
の組換え体タンパク質及びその生成の状況に依存して、
このＮ−末端のMet残基を除くことが多少、細胞内でプ
ロセシングされるが、しかし、一般的にほんのいくらか
であり、そして普通、生成された組換え体タンパク質の
実質的な部分は、この所望としない外来性残基を担持す
る。その存在は完全無害である。この得られるタンパク
質が治療上、使用される場合、通常、受容体に対する自
己由来のタンパク質〔たとえば、ヒトに投与されるよう
なヒト成長ホルモン（hGH）〕であろうものが、該受容
体に対してよく知られていないペプチド配列を含んでい
る。その結果は予想できる。免疫反応は、そのよく知ら
れていない配列に対して生まれることができ、そして治
療上重要なペプチドが、今、免疫原になる。
外来性タンパク質の他に、成熟した生来のタンパク質
及び他の属又は種からの細菌性タンパク質もまた、しば
しば、不完全にプロセシングされる。この現象の例は、
E.コリのアスパラギン酸トランスカルバミラーゼ（Ｒ−
鎖）、E.コリのトリプトファンシンテターゼＡプロテイ
ン及びE.コリのバクテリオファージT4リゾチームを含む
（Fasman,G.O.,Ed.,CRC Handbook of Biochemistry ＆
Molecular Biology,III:308〜313）。
他の人は、Ｎ−未満のメチオニンを分解するために及
びＮ−末端の“Met−欠失性”ペプチド又はタンパク質
を生成するために種々の方法で試みて来た。Baxter（ア
メリカ特許第4,350,764号）は、交互の切断部位を保護
した後、前駆体タンパク質を切断するためにプロテアー
ゼトリプシンによる処置をイン ビトロで行なう。融合
タンパク質もまた合成され、ここで、目的とするコード
配列がATGによって先行され、従ってCNBrによって切断
できる“内部”メチオニンをその融合体中に提供する。
これは、余分な製造段階を含むのみならず、またタンパ
ク質又はペプチドがその残存する配列中のいずれのメチ
オニン残基で切断されるという一層重大な欠点を有す
る。ジェネンテックにより1984年12月５日に出版された
EPO出願第127,305号は、得られるhGHの分泌をもたらす
ためにある細菌宿主中において明らかに作用する生来の
hGHリーダーペプチドを含むコード配列を用いることに
よってMet欠失性のhGHの生成を開示する。Gilbert（ア
メリカ特許第4,338,397号）は、多分、Ｎ−末端のMet欠
失性のβ−グロビンの分泌をもたらすためにペニシリナ
ーゼのリーダー配列を用いている。同じ譲受人に譲渡さ
れ、そしてこの開示を引用によりこの明細書中に組み込
まれた、1986年３月25日に出願された、日本特許出願第
64995/86は、いくらかの（但しすべてではない）組換え
体ペプチドの分泌をもたらすために、細菌のホスホリパ
ーゼＡ（phoA）についてのリーダー配列の使用を開示す
る。
前記の解決法は、その問題に対する普遍的な解決を提
供しない。Ｎ−末端のMet欠失性形で特定の組換え体タ
ンパク質を産生するための必要性に直面している当業者
は、産生されるべき特定のペプチドのために適切な方法
を、可能性あるレパートリーから選択する必要がある。
下記の発明の方法は、もう１つのパターンの適応性を提
供するためにこのレパートリーを広げる。
〔発明の開示〕
本発明は、細菌的に産生された組換え体タンパク質又
は他のタンパク質からＮ−末端のメチオニン残基のプロ
セシングを保証するための便利な酵素を提供する。ま
た、別の段階を要しないでインビボで目的とするプロセ
シングをもたらすために、組換え宿主生物の遺伝子操作
を可能にする、この酵素をコードするDNAが提供され
る。従って、本発明のペプチダーゼ酵素の有効性が、治
療的に使用される場合、免疫原性を減じている組換え体
タンパク質の細菌宿主において産生を可能にする。
１つの観点においては、本発明は、あるタンパク質配
列からＮ−末端のメチオニン残基を切断するペプチダー
ゼ、すなわち、メチオニンアミノペプチダーゼ又はＮ−
末端エキソペプチダーゼに関する。その酵素はこの明細
書でMet−アミノペプチダーゼとして言及されるであろ
う。そのMet−アミノペプチダーゼ酵素は、定義された
特異性の活性（下を参照のこと）を有し、そして第２図
に示されているアミノ酸配列のタンパク質に対して生成
された抗体と免疫沈殿するタンパク質を含む。そのMet
−アミノペプチダーゼ酵素はさらに、この活性を有し、
そしてそれは、推定されるアミノ酸配列をコードする、
第２図に例示されるDNAに対して、特定の条件下でハイ
ブリッド形成するDNAによってコードされているタンパ
ク質を含む。本発明はまた、第２図に示されているアミ
ノ酸配列のタンパク質と免疫反応性の抗体に関し、そし
て脊椎動物中にこのタンパク質を注入することによって
高められた抗体を含む。
他の観点においては、本発明は、Met−アミノペプチ
ダーゼをコードする組換え体DNA配列、この配列を担持
するプラスミド及びこれらのプラスミドにより形質転換
された微生物宿主、並びに本発明の物質を用いて、細菌
宿主又はイン ビトロでＮ−末端のMet欠失性の組換え
体タンパク質を産生するための方法に関する。さらにも
う１つの観点においては、本発明は、一般的にペプチダ
ーゼ−欠失（但し、Met−アミノペプチダーゼ欠失では
ない）の形質転換宿主（ここで該形質転換体はそれ自体
のゲノムの一部を導入している）をスクリーニングする
ことを含んで成る、高いMet−アミノペプチダーゼ活性
を有する細菌株を得るための方法に関する。
〔発明を実施するための態様〕
A.定義 本明細書に使用される場合、“Met−アミノペプチダ
ーゼ”はペプチド配列からＮ−末端のメチオニン残基を
特異的に切断し、そして内部のメチオニン残基又はメチ
オニンよりも他のＮ−末端残基で切断しない酵素に関す
る。本発明のMet−アミノペプチダーゼは、位置２を占
める残基及び基質タンパク質又はペプチドの二次又は三
次構造に依存して、特定のペプチド配列に対して特異的
であるように思える。この事に関する酵素の正確な特異
性は、無数の基質をほとんど試験しないでは測定され得
ない；しかしながら、大ざっぱなやり方が、Sherman,
F.,など、Bio.Essays（1985）３:27〜31によって示され
ている。Shermanなどは、Met−アミノペプチダーゼの特
異性についての彼らの考えを、酵母からのイソ−１−チ
トクローム−Ｃの突然変異体の観察形及び82の成熟の細
胞内タンパク質の公開された一次配列に置いた。彼ら
は、メチオニンは普通、1.29Å又はそれよりも小さなら
せん状の半径を有する側鎖を含む残基から切断される
が、しかし一般的に、1.43Åよりも大きならせん状の半
径を有する残基からは切断されないと推定する。原核及
び真核系からの他の公開されたタンパク質の配列を考慮
して得られた、突然特異的に変えられたイソ−１−チト
クローム−Ｃは、Ｎ−末端のメチオニンがアラニン、シ
ステイン、グリシン、プロリン、セリン、トレオニン又
はバリンの残基を先行するがしかし、それがアラギニ
ン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グル
タミン酸、イソロイシン、ロイシン、リシン又はメチオ
ニンの残基を先行しない場合、Ｎ−末端のメチオニンが
切断されることを示し、そしてこの事は観察と一致す
る。これらの結果は、一般的に、下の例示に示されてい
る結果と一致する。しかしながら、第２アミノ酸につい
てのらせん状の半径が1.29Åより大きく、そして第二及
び第三構造体又は他の条件が特に好ましい場合、いくつ
かの例外が存在する。従って、この特異性の観点は、一
般的なガイドラインとして意図され、そして本発明を例
示するために使用されるアミノペプチターダの特異性さ
え正確に測定されないことが心に留められるべきであ
り、すなわち、すべての可能な第三構造体は必ずしも試
験されていない。従って、“Met−アミノペプチダー
ゼ”の定義内に存在するためには、内部のメチオニン残
基の切断及びいずれかのペプチドからメチオニン以外の
Ｎ−末端残基の切断を伴わないでＮ−末端のメチオニン
の特異的な切断の必要条件を満たすのみ酵素が必要であ
る。
本発明の好ましいMet−アミノペプチダーゼは、第１
図に示されているものに実質的に等しいＮ−末端のアミ
ノ酸配列及び第２図に例示されているDNAによってコー
ドされているものに実質的に等しい全アミノ酸配列を有
する。“実質的に等しい”とは、たとえば小さな変化が
アミノ酸配列に存在したとしても、タンパク質が第二及
び第三構造体又はその次のアミノ酸残基に関して、同じ
根本的な特異性を基本的に有する特定のペプチド配列又
はタンパク質配列からＮ−末端のメチオニン残基を特異
的に切断することにおいて同じ活性を保持することを意
味する。少しも活性を変えない、配列中の１又は複数の
アミノ酸の変化、交換、付加又は欠失は、この定義から
特定のタンパク質を除外しない。
たとえば、保存性アミノ酸置換、たとえば位置45,59,
78,126又は245で１又は複数のシステインの代りにセリ
ン又はアラニンの置換は、Met−アミノペプチダーゼ活
性を保持することができるペプチドをもたらす。さら
に、ロイシン、イソロイシン及びバリン残基の互換性が
存在することができる。また、Ｎ−末端で始めの７個の
アミノ酸までを欠失することができ、そしてアミノ酸22
8で始まるペプチドの下流領域の部分は、活性のために
必須でない。なお、特許請求の範囲において、「１もし
くは複数のアミノ酸の変更、付加もしくは欠失している
アミノ酸配列を有するMet−アミノペプチダーゼ」と
は、例えば部位特定変異誘発のごとく、本件出願前に自
体周知であった手法により可能な程度に、生来のMet−
アミノペプチダーゼのアミノ酸配列がアミノ酸の変更、
付加又は欠失により修飾されており、且つMet−アミノ
ペプチダーゼの活性を維持しているものを意味する。
もちろん、さらにMet−アミノペプチダーゼの中性形
及び塩形、並びに付加の非タンパク質成分、たとえばグ
リコシル化、脂質残基又はアセチル化を含む形が含まれ
る。
“ペプチダーゼ欠失”の菌株は、Met−アミノペプチ
ダーゼよりも他の少なくとも４個のペプチダーゼ（該ペ
プチダーゼは通常、野生型に見出される）を欠いている
菌株とみなす。
この明細書に使用される“Ｎ−末端のMet欠失性”タ
ンパク質は、Ｎ−末端のメチオンを欠いているが、しか
しその一次構造においてどこかよそにメチオニン残基を
含むかも知れないタンパク質と言及する。そのタンパク
質のためのコード配列は、読み枠において、すぐ先行す
るATG開始コドンを有するであろう。“Ｎ−末端のMet欠
失性”は、この状態をとりまく条件がくり返し与えられ
る必要がないように、便利な速記語として使用される。
特に、“Ｎ−末端のMet欠失性”は、タンパク質配列中
に必ずしもメチオニン残基が必要でなく、最初にＮ−末
端のメチオニンの可能性を持たないタンパク質、たとえ
ば融合タンパク質として又は分泌されるタンパク質とし
て産生されるタンパク質を含むことも意図されないこと
を、本発明において意味する。従って、本明細書に使用
されるような“Ｎ−末端のMet欠失性タンパク質”は、D
NA配列によってコードされているタンパク質として見な
され、ここで該成熟タンパク質は、読み枠のATG開始コ
ドンによってすぐ先行され、そしてCNBr、トリプシン又
は他の試薬によって実質的に切断されるべき融合体の一
部でない。組換え体タンパク質の場合、その構成体は、
明らかに記されていて；生来の又は天然に組換られたDN
A配列のための構成体は、容易に定義され得ない。
“Met−先行のタンパク質”は、特定の成熟タンパク
質に通常、見出される第１アミノ酸をすぐ先行するＮ−
末端のメチオニン残基を含むタンパク質である。
“細胞”、“細胞培養物”、“宿主細胞”及び同様の
ものは、組換え体DNA操作のための主細胞として見なさ
れる。本文から明らかであるように、これらの細胞は、
組換え技法に従って、新規DNA配列の形質転換のための
候補者であることができる。細胞によるDNA取り込みの
ために適切な技法は、イン ビトロでの形質転換を含
む。しかしながら、他の技法、たとえばトランスダクシ
ョン又は接合もまた使用され得る。その定義はさらに、
直接的に関連する細胞の子孫を含む。そのような子孫
は、それらの親とDNA含有において、正確に同一でない
が、しかしたとえば突然の又は意図的な突然変異による
修飾が、それらの親によって示される性質に幾分か類似
する方法で、導入されたDNAによって与えられる性質を
示すように細胞の能力を破壊しない限り、そのような子
孫は定義に含まれることが理解される。
B.一般的な説明 本発明は、Met−アミノペプチダーゼの使用によっ
て、細菌宿主中にＮ−末端のMet欠失性の組換え体タン
パク質の産生を達成する。最も好ましい態様において
は、そのMet−アミノペプチダーゼは、高レベルでその
場で生成され、そして細胞宿主中においてイン ビボで
組換え体又は他のタンパク質を処理する。しかしなが
ら、宿主細胞から目的とする組換え体又は他のタンパク
質を単離又は抽出し、そして細菌源から独立して得られ
るMet−アミノペプチダーゼによりイン ビトロで該抽
出物を処理することがまた可能である。
Met−アミノペプチダーゼそれ自体に関して、この酵
素は生成され、そしてそれをコードするDNAは、E.コリ
株をスクリーニングすることで容易に回収され、そして
これは、一般的に、それら自体のゲノム中にコードされ
ているMet−アミノペプチダーゼの増強された産生につ
いて不完全なペプチダーゼである。この方法において、
Met−アミノペプチダーゼをコードする、プラスミドに
担持され、且つ増幅されたDNA源を得、そして次に、そ
の酵素がそれらの細胞から直接的に調製され、そして精
製され得る。さらに、このプラスミドDNA及び目的とす
る組換え体タンパク質のための発現ベクターを含む組換
え体宿主の同時−形質転換が、Ｎ−末端のMet欠失性形
の組換え体タンパク質の産生を、その場でもたらす。
通常、野生型の細菌中に見出される多数のペプチダー
ゼを欠いている多数のE.コリ株が知られている。たとえ
ば、Miller,C.G.,などJ.Bacteriol．（1978）135:603〜
611は、ペプチダーゼ欠失である多数の細菌株を開示す
る。これらの菌株の１つ、すなわちCM89（これは、ペプ
チダーゼＮ、ペプチダーゼＡ、ペプチダーゼＢ、ペプチ
ダーゼＤ及びペプチダーゼＱを欠いている）が下の例示
に使用された。しかしながら、細菌株の他のペプチダー
ゼ欠失の突然変異体も同じように使用され得た。
多分、これらの菌株のゲノムは、Met−アミノペプチ
ダーゼ活性をコードする配列をまだ含み、そして従っ
て、そのゲノムDNAが、適切な制限酵素により消化され
そして担体ベクター中にそのフラグメントをクローニン
グすることによってライブラリィを構成するために使用
される。pUCシリーズ及びpBR322を含む、種々のそのよ
うな担体ベクターが使用できる。次に、所望により、プ
ラスミドDNAは、プラスミドDNAの単離及びスクリーニン
グのためにペプチダーゼ欠失の菌株中への形質転換の前
に、いずれか便利な野生型宿主を用いて増幅され得る。
次に、形質転換されたペプチダーゼ欠失の細菌は、適
切な基質を切断するためのそれらの能力のために、粗抽
出物を検定することによって、目的とするMet−アミノ
ペプチダーゼの産生についてスクリーンされる。次に、
高レベルのMet−アミノペプチダーゼを示す菌株は、組
換え体タンパク質のための発現ベクターによる同時−形
質転換のために、この酵素源として、又はプラスミドDN
A源として便利に使用される。
さらに、この菌株からのプラスミドDNAを使用し、適
切なMet−アミノペプチダーゼをコードする配列のため
に野生型細菌のゲノムをプローブすることができる。適
切な方法は、特に下に記載されているハイブリッド形成
条件の特徴のものである。これらの特定条件は、使用さ
れる必要はないが、しかしそれらは相同する必要条件を
有する。もちろん、これらの回収された配列はまた、そ
れら自身のプロモーターの制御下で又は当業界に知られ
ている他のプロモーター、たとえばtrpプロモーター又
はペニシリナーゼプロモーターを用いて、発現され得
る。
本発明で産生されるMet−アミノペプチダーゼタンパ
ク質を精製し、そしてその精製されたタンパク質及び適
切な免疫方法を用いて抗体を得ることができる。その精
製は、細胞を破壊し、そして溶菌を含む上清液から酵素
を単離することによって行なわれる。この単離は、タン
パク質が吸着され、次に適切な緩衝液による溶出を含む
条件下で、陰イオン交換樹脂による処置を含む。適切な
陰イオン交換樹脂は、種々の炭化水素支持体に接合され
ているDEAEを含む。当業界で良く知られている、他の陰
イオン交換樹脂もまた使用され得る。
ウサギ、ラット又は他の哺乳類中で精製されたタンパ
ク質に応じて生まれる抗体は、種々の微生物からのMet
−アミノペプチダーゼタンパク質を同定することに有用
である。
多数の組換え体タンパク質は、本発明の方法を用い
て、Ｎ−末端のメチオニンを含まない成熟タンパク質と
して生成するための候補者である。たとえば、リンフォ
カイン、たとえばIL−2,IL−1;α−及びγ−インターフ
ェロン（β−インターフェロンは通常、その成熟形中Ｎ
−末端のメチオニンを含む）；腫瘍壊死因子；及びリン
パ系に関連する他のタンパク質が産生される。また種々
のホルモン、たとえば成長ホルモン、インシュリン、AC
TH、エンドルフィン及び他のペプチドホルモンが組換え
体により産生され得る。組換え体産生のための他の候補
者は、酵素、たとえば組織プラスミノーゲン活性化因
子、ウロキナーゼ及び工業的用途に有用な酵素、たとえ
ばアルコールデヒドロゲナーゼを含む。他のタンパク質
は、毒素、たとえばジフテリア及びリシン毒素及び種々
の因子、たとえば上皮成長因子及び形質転換成長因子を
含む。前記のものは、単に典型的なものであり、そして
いったんその遺伝子が得られた後、大体、目的とするタ
ンパク質が、すぐ上流のATG開始コドンに読み枠を整合
してそれに結合し、そして必要な制御配列を提供するこ
とによって成熟タンパク質として発現され得る。本発明
の方法は、これらのタンプク質のすべてが、Ｎ−末端の
メチオニンを含まないで便利に産生されることを可能に
する。
上に述べたように、Met−アミノペプチダーゼは、２
つの一般的な方法で使用され得る。たとえば、酵素は、
プラスミド担持のDNAから比較的多量に酵素を産生する
特定の細胞から単離され、そしてイン ビトロの反応混
合物に添加し、Ｎ−末端のメチオニン プロセシングを
もたらし、又はイン ビボ プロセシングを可能にする
ために、Met−アミノペプチダーゼをコードするプラス
ミドを、組換え体細菌宿主中に目的とするタンパク質の
ための発現ベクターと一緒に同時形質転換することがで
きる。
イン ビトロ アプローチにおいては、精製されたMe
t−アミノペプチダーゼを、プロセシングされていない
タンパク質、適切な塩及び緩衝液を含む反応混合物に添
加する。その反応混合物を、約30℃の温度で一晩インキ
ュベートし、そのプロセシングを可能にする。その酵素
はコバルト イオンを必要とする。典型的な反応混合物
は、約1mg/mlの基質タンパク質、pH＝７〜８のリン酸緩
衝液中、約80μg/mlの酵素及び約0.2mMのコバルトイオ
ンを含むことができる。もちろん、前記の典型的な混合
物は単に例示的であり、そしてその成分の濃度は、基質
の性質及び使用される時間及び温度の条件に依存して連
続的に変化することができる。完全なプロセシングは、
切り離されるメチオリン残基の量を測定し、プロセシン
グされた及びプロセシングされていないタンパク質をSD
S PAGE上でその移動度を比較し、又は混合物中に含まれ
る基質材料を配列決定することによって確かめられ得
る。
イン ビボ アプローチにおいては、プラスミドDNA
を、Met−アミノペプチダーゼ源の菌株から単離し、そ
してそれを用いて、すでに含む又はタンパク質のための
発現系を含むために付随的に又は続いて形質転換される
細胞を形質転換する。細菌性酵素のための細菌源に用い
られる場合、プロセシングされていない基質を、微生物
によって通常、生成されるタンパク質の補体の一部とし
て産生することができる。より一般的には、その場で生
成されるペプチダーゼを用いて、組換え体により生成さ
れたタンパク質をプロセシングし、そしてその細胞は、
形質転換されるある点で、目的とするタンパク質のため
の発現系を含むべきである。
C.標準的な技法 細菌の形質転換のための標準的な方法、マーカーを用
いての好結果をもたらす形質転換体の選択、プラスミド
ベクターの製造及び遺伝子又はcDNAバンクのスクリーニ
ングが技術的に良く理解されている。便宜上、下に示さ
れている例において特に有用な方法の選択がここに示さ
れる。ほとんどのそのような方法、又は他の可能な方法
が、Maniaitis、など、Molecular Cloning−A Laborato
ry Manual（1982）,Cold Spring Harbor Rressに見出さ
れる。
C.1.宿主及び制御配列 Met−アミノペプチダーゼを担持するベクターによる
同時形質転換のために適切な細胞及びタンパク質のため
の発現系は細菌である。最も頻繁に使用される宿主は、
種々のE.コリ株である。しかしながら、他の細菌株、た
とえばバチルス（たとえば枯草菌）、種々のプソイドモ
ナス又は他の細菌株もまた使用され得る。そのような原
核系においては、宿主と適合できる種に由来する複製部
位及び制御配列を含むプラスミドベクターが使用され
る。たとえば、E.コリは、Bolivar,など、Gene（1977）
２:95によるE.コリ種に由来するプラスミド、すなわちp
BR322の誘導体を用いて典型的には形質転換される。pBR
322は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のため
の遺伝子を含み、そして従って、目的とするベクターを
構成することにおいて、保持され又は破壊され得る付加
マーカーを提供する。転写開始のためのプロモーター、
場合によってはオペレーター及びリボゾーム結合部位配
列を含むようにこの明細書で定義されている、通常使用
される原核生物の制御配列は、β−ラクタマーゼ（ペニ
シリナーゼ）及びラクトース（lac）プロモーター系〔C
hang,など、Nature（1977）198:1056〕及びトリプトフ
ァン（trp）プロモーター系〔Goeddel,など、Nucleic A
cids Res.（1980）８:4057〕並びにλ由来のPLプロモー
ターのような通常用いられるプロモーター及びＮ−遺伝
子のリボゾーム結合部位〔Shimatake,など、Nature（19
81）292:128〕を含み、そしてこのカセットは、1984年
２月８日出願された同時係属出願第578,133号に示され
ている。しかしながら、原核生物と適合する、いずれか
有効なプロモーター系が使用され得る。
C.2.形質転換 Cohen,S.N.,Proc.Natl.Acad.Sci．（USA）（1972）6
9:2110によって記載されているような塩化カルシウムを
用いるカルシウム処理方又はMariatis,など、（前記）
に記載しているRbCl2法を用いて、細胞を形質転換す
る。
C.3.ベクター構成 目的とするコード配列及び制御配列を含む適切なベク
ターの構成は、当業界において良く理解されている標準
の連結及び制限技法を用いる。単離されたプラスミド、
DNA配列又は合成されたオリゴヌクレオチドを、目的と
する形に切断し、合わせ、そして再連結する。
部位特異的なDNA切断を、当業界において一般的に理
解されている条件及び商業的に入手可能な制限酵素の製
造業者によって記されている詳報下で適切な制限酵素
（又は複数の制限酵素）により処理することによって行
なう。たとえばNew England Biolabs,Product Catalog
を参照のこと。一般的に、約１μｇのプラスミド又はDN
A配列を、約20μの緩衝溶液中１ユニットの酵素によ
って切断し；本明細書での例においては、典型的には過
剰の制限酵素を用いて、DNA基質の完全な消化を確実に
する。変動は寛大に見られ得るが、約37℃で約１〜２時
間のインキュベーション時間が用いられる。おのおのの
インキュベーションの後、フェノール／クロロホルムに
よる抽出によってタンパク質を取り除き、そしてその後
エーテル抽出を行ない、そしてエタノールによる沈殿、
次にSephadex G−50のスピン カラムを通すことによる
水性画分から核酸を回収する。所望により、切断された
フラグメントのサイズ分離を、標準技法を用いてポリア
クリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動によって
行なうことができる。一般的なサイズ分離の説明は、Me
thods in Enzymology（1980）60:499〜560に見出され
る。
制限することにより切断されたフラグメントを、50mM
のTris（pH＝7.6）、50mMのNaCl、6mMのMgCl2、6mMのDT
T及び５〜10μＭのdNTP中において20〜25℃で約15〜25
分間のインキュベーション時間を用いて、４種のデオキ
シヌクレオチド トリホスフェート（dNTP）の存在下で
E.コリのDNAポリマラーゼＩの大フラグメント（Kleno
w）により処理することによって平滑末端にすることが
できる。たとえ４種のdNTPが存在しても、Klenowフラグ
メントは５′付着端でフィルインし、そして突出する
３′の単一鎖をチュバックスする。所望により、選択的
な修復を、付着端の性質によって受ける範囲内でたった
１つの又は選択されたdNTPを供給することによって行な
うことができる。Klenowによる処理の後、その混合物
を、フェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてエ
タノールによる沈殿せしめた後、Sephadex G−50スピン
カラムを通す。S1ヌクレアーゼによる適切な条件下での
処理は、単一鎖部分の加水分解をもたらす。
Matteucci,など、J.Am.Chem.Soc.（1981）103:3185の
トリエステル法又は商業的に入手可能な自動オリゴヌク
レオチド合成機を用いて、合成オリゴヌクレオチドを調
製する。アニーリングの前又はラベリングのための単一
鎖のキナーゼ処理を、50mMのTris（pH＝7.6）、10mMのM
gCl2、5mMのジチオトレイトール、１〜2mMのATP、1.7p
モルのγ32P−ATP（2.9mCi/mモル）、0.1mMのスペルミ
ジン及び0.1mMのEDTAの存在下において0.1nモルの基質
に対しておよそ10ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて達成する。
次の標準条件及び温度:20mMのTris−C1（pH＝7.5）、
10mMのMgCl2、10mMのDTT、33μg/μのBSA、10mM〜50m
MのNaCl及び14℃で40μＭのATP、0.01〜0.02（Weiss）
ユニットのT4のDNAリガーゼ（“付着端”の連結のため
の）又は14℃で1mMのATP、0.3〜0.6（Weiss）のユニッ
トのT4のDNAリガーゼ（“平滑端”の連結のための）の
いずれか下で、連結を15〜30μの体積で行なう。分子
間の“付着端”連結は、普通、合計のDNA濃度のml当り3
3〜100μｇ（５〜100nMの合計最終濃度）で行なわれ
る。分子間の平滑端連結（普通10〜30倍のモル過剰のリ
ンカーを用いる）を、１μＭの合計最終濃度で行なう。
“ベクターフラグメント”を用いるベクター構成にお
いては、５′のリン酸を取り除き、そしてベクターの再
連結を妨げるために、細菌性アルカリホスファターゼ
（BAP）によりベクターフラグメントを通常、処理す
る。BAPによる消化は、ベクターのμｇ当り約１ユニッ
トのBAPを用いて60℃で約１時間、Na+及びMg2+の存在下
でおよそ150mMのTrip（pH＝８）中において行なわれ
る。核酸フラグメントを回収するために、調製物をフェ
ノール／クロロホルムにより抽出し、そしてエタノール
により沈殿せしめ、そしてSephadex G−50スピン カラ
ムに適用することによって脱塩化する。他方、所望とし
ないフラグメントの追加の制限酵素による消化によって
二重消化されているベクターにおいて、再連結を妨げる
ことができる。
配列の修飾を必要とする、cDNA又はゲノムDNAに由来
するベクターの部分のために、部位特異的プライマーに
より指図された突然変異誘発を、Zoller,M.J.,など、Nu
cleic Acids Res.（1982）10:6487〜6500の方法に従っ
て用いる。これは、突然変異誘発されるべき（但し、ミ
スマッチングを限定する）単一鎖のファージのDNAに相
補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行わ
れる。手短に言えば、合成オリゴヌクレオチドは、その
ファーシに相補的な鎖の合成を指示するプライマーとし
て用いられ、そしてその得られる二重鎖DNAは、ファー
ジ支持の宿主細菌に形質転換される。形質転換された細
菌の培養物をカンテン上にプレートし、ファージを含む
単一の細胞からプラーク形成を可能にする。
理論上、新プラークの50％が、単一鎖として突然変異
形を有するファージを含み；他の50％が元の配列を有す
るであろう。得られるプラークは、正確なマッチのハイ
ブリッド形成を可能にする温度で、キナーゼ処理された
合成プライマーによりハイブリッド形成されるが、しか
しここで、元の鎖とのミスマッチは、十分にハイブリッ
ド形成を妨げる。次に、そのプローブと共にハイブリッ
ド形成するプラークを得、培養し、そしてそのDNAを回
収する。部位特異的な突然変異方法は下の特定の例に詳
しく説明される。
C.4.構成の確認 プラスミド構成のための正しい連結を、E.コリGeneti
c Stock Center,CGSC＃6135から得られたE.コリ株MM 29
4又はその連結混合物を有する他の適切な宿主をまず形
質転換することによって確かめる。好結果をもたらす形
質転換体を、当業界に知られているようなアンピシリ
ン、テトラサイクリン又は他の抗生物質耐性により又は
プラスミド構成の態様に依存して他のマーカーを用いる
ことによって選択する。次に、その形質転換体からのプ
ラスミドを、Clewell,D.B.,など、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）（1969）62:1159の方法、場合によっては続い
て、クロラムフェニコール増幅〔Clewell,D.B.,J.Bacte
riol.（1972）110:667〕に従って調製する。その単離さ
れたDNAを制限処理によって分析し、そして／又はSange
r,F.,など、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1977）74:54
63、さらにMessing、など、Nucleic Acids Res.（198
1）９:309又はMaxam,など、Methods in Enzymology（19
80）65:499のジデオキシ法によって配列決定する。
C.5.例示された宿主 本発明でクローニング及び発現に使用される宿主株は
次のとおりである： クローニング及び配列決定のためには、及びほとんど
の細菌プロモーターの制御下で構成体の発現のために
は、E.コリ株MM294（前記）を宿主として使用したTalma
dge,K.,など、Gene（1980）12:235;Meselson,M.,など、
Nature（1968）217:1110oPNNRBSプロモーターの制御下
での発現のためには、E.コリ株K12 MC1000λ溶原菌、N7
N53cI857upP80,ATCC3951（この後、特々MC1000−39531
として言及する）を用いる。挿入体の存在を確かめるた
めに、その挿入体の領域における主鎖ベクターの特徴を
相足する菌株を使用する。たとえば、pUCシリーズのた
めには、挿入体の不在下でメーゲル指示培地上で青色の
コロニィー及び挿入体の存在下で白色のコロニティーを
生成するE.コリ株DG99を用いる。
D.例 次の例は本発明を例示するものであって、限定するも
のではない。
D.1.プラスミドMet−アミノペプチダーゼをコードするD
NA源の製造 Silhavy,T.J.,など、Experiments with Gere Fusions
（1984）、Cold Spring Haibor Laboratory、New Yor
k、137〜139の方法によって、E.コリ株CM89（前記）か
ら染色体DNAを抽出し、そして10mMのTris及び1mMのEDTA
（TE）緩衝液（pH＝8.0）中に保存した。そのDNAを、0.
1U/μｇ及び0.2U/μｇで１時間37℃でSau 3A Iにより消
化した。反応を停止し、そしてエタノールによる沈殿せ
しめた後、一部消化されたDNAをプールし、そしてBeckm
ann SW28ローターを用いて26,000rpmで24時間、15℃で1
0〜40％のスクロース グラジエント上で画分した。４
〜8kbのフラグメントを含む画分をプールし、DE52カラ
ム上で精製し、溶離剤からエタノールにより沈殿し、そ
してTE緩衝液中に保存した。
次に、染色体DNAの４μｇ部分を、BamH Iにより消化
された、BAP処理されてpUC18ベクターフラグメント0.5
μｇと共に連結した。その連結混合物を用いて、E.コリ
DG99を形質転換し、そしてラクトース指示器プレート上
に置き、プラスミド中に挿入体の存在を確めた。更に、
形質転換体のおよそ94％がおよそ4kbのDNA挿入体を含ん
だ。
従って、18uの連結混合物を用いて、AmpRに対して
E.コリMM294を形質転換し、その遺伝子ライブラリィを
得た。好結果をもたらす形質転換体を得、そしてそれを
用いて、プラスミドDNA調製のためにアンピシリン含有
の培養基700mlに接種した。
上のC.4.〔Clewell,D.B.,Proc.Natl.Acad.Sci.（US
A）（1969）〕に記載しているようにして、プラスミドD
NAを細胞から得、そしてそれを用いてE.コリCM89を形質
転換した。AmpRに対して選択された、好結果の形質転換
体は、スクリーニングのためにマイクロタイタートレイ
中に置き、そしておよそ1,000コロニィをスクリーンし
た。2XのＬ−Broth（DIFCO）＋１％のNaCl、10％のカサ
ミノ酸及び10Xの酵母窒素塩基のそれぞれを５％v/vで補
足された最小培地（たとえばアメリカ特許第4,518,584
号を参照のこと、そしてこの開示を引用によりこの明細
書中に組み入れる）200μ中に、単一のコロニィーを
取った。37℃で１晩、増殖した後、細胞を0.1MのTris−
HCl（pH＝7.4）で２度洗浄した。その細胞を、同じ緩衝
液中1mg/mlのリゾチーム溶液20mlを添加することによっ
て細胞溶解し、次に凍結融解を３度くり返した。次に、
72μｇのMet−Gly−Met−Met、36μｇのＬ−アミノ酸オ
キサダーゼ、４〜５μｇのホースラディシュペルオキシ
ダーゼ、及び18μｇのＯ−ジアニシジンジヒドロクロリ
ドを含む、0.1Mリン酸カリウム緩衝液（KPO4）（pH＝7.
4）＋0.2mM CoCl2の溶液180μを、おのおののウェル
に添加し;Met−アミノペプチダーゼ含有の細胞溶解物に
おいて、色の形成は明らかであった。スクリーンされた
およそ1,000のコロニィーのうち10のコロニィーが、Met
−Gly−Met−MetからMetを放す速度を上昇することを示
し、そしてさらに、同じ条件下でLeu−Gly−GlyからLeu
を放すことができないものについてスクリーンした。１
つの好結果をもたらすコロニティーを、pSYC1174と名づ
けた。E.コリのpSYC1174を、1985年８月27日、American
Type Culture Collectionに寄託し、そして寄託番号53
245を得た。
D.2.Met−アミノペプチダーゼをコードする配列の回収 pSYC1174を有するE.コリ株（また18E7と名づけられ
た）は、上に記載しているようにして一般的に行なわれ
た。Met−Gly−Met−Met基質介在のイン ビトロ検定に
おいて、およそ100倍の高い活性を与えた。
プラスミドDNAを、菌株18E7から単離し、そしてMet−
アミノペプチダーゼをコードするプラスミドpSYC1174を
単離した。pSYC1174は、BamH I部位で、pUC18ベクター
中に3.2kbの挿入体を担持した。1.2kbのフラグメント
を、EcoR I/Cla Iによる消化によって該挿入体の５′末
端から切り出し、そしてpUC18及びpUC19中に挿入し:pSY
C1174を、Cla Iにより消化し、Klenowにより平滑にし、
そして次にEcoR Iにより消化し、1.2kbのEcoR I/平滑フ
ラグメントを切り出した。このフラグメントを、EcoR I
/Sma Iにより消化されたpUC18又はpUC19中に挿入し、そ
してこれは宿主プラスミド上でlacプロモーターに対し
て反対の方向をもたらす。CM89中にトランスフェクトさ
れる場合、得られるベクターpSYC1187及びpSYC1188の両
者は、pSYC1174によって示されるレベルに匹敵するアミ
ノペプチダーゼ生成のレベルを示した。これらの結果
は、Met−アミノペプチダーゼの遺伝子及びそのプロモ
ーターの両者が1.2kbのフラグメント内に位置している
ことを示す。
第２図は、ジデオキシ配列決定によって決定された1.
2kbのフラグメントの完全なヌクレオチド配列を示す。A
TGから開始する読み取り枠（open reading frame）は、
位置219〜1010であり、そして29,333の計算分子量を有
する264個のアミノ酸の推定タンパク質をコードする。
推定される最初の64個のアミノ酸は、下のD.3に記載さ
れているような精製タンパク質のアミノ酸配列決定を用
いて得られるアミノ酸に対応する。この読み取り枠に関
連する２つの並んだプロモーターの位置がまた示され、
そしてP1及びP2としてラベルされている。（左のカラム
の数字はヌクレオチドを示し、右のカラムの数字はアミ
ノ酸を示す。） 上の1.2kbのフラグメントを、サザン法によってE.コ
リのゲノムDNAをプローブするために使用し、そしてそ
れぞれPst I,EcoR I及びBssH IIによる消化によって生
成された3.6,5.2及び1.35kbのバンドに対してハイブリ
ッド形成し（但し、染色体の他の領域に対してはハイブ
リッド形成しない）、従って、その遺伝子は、E.コリ中
において単純複写として存在することを示す。その遺伝
子の３′未満での配列の測定はまた、Met−アミノペプ
チダーゼから下流に同時転写された遺伝子がたぶん存在
しないという結論を導びく。５′末端での配列の測定
は、並列のプロモーターの存在を示す。
推定されるアミノ酸配列１〜264（又はその補体）を
コードする、第２図に示されるヌクレオチド配列は、一
般的に、追加のMet−アミノペプチダーゼをコードする
配列のために細菌性ゲノムDNAをプローブするのに有用
である。従って、この挿入体は、たとえばバシラス サ
ブチリス、プソイドモナス又は酵母からこの目的とする
DNAを得るための便利な道具である。ハイブリッド形成
に関連する適切な方法は、６×SSC、0.01MのEDTA、５×
Denhardts、0.5％のSDSを含む緩衝液中において、65℃
で反応を完結するのに十分な時間反応せしめ、次に65℃
で３×SSCにより洗浄することである。すなわち、これ
らの条件下で上のニックトランスレーションされたプロ
ーブに対してハイブリッド形成し、そして本明細書に定
義されているようなMet−アミノペプチダーゼ活性を有
するタンパク質をコードするDNAが、本発明内に含ま
れ、そして本発明内のMet−アミノペプチダーゼ タン
パク質をコードする。
D.3.E.コリのpSYC1174からのMet−アミノペプチダーゼ
の特徴 Met−アミノペプチダーゼを、E.コリのpSYC1174の粗
抽出物から精製し、そしてその精製されたタンパク質
を、種々のペプチド基質を用いてアミノ酸を放す能力に
ついて分析した。
精製のためには、Brain Heat Infusionブイヨン中で
のE.コリのpSYC1174の一晩の培養物を、0.2mMのCoCl2を
含むKPO4緩衝液（20mM、pH＝7.4）で２度洗浄し、そし
て音波処理した。PMSF（0.1mM）を、その音波処理物に
添加した。その音波処理物を、遠心分離し、そしてその
上清液を、DEAE−セファロース ファースト フローに
通した。酵素を、同じ緩衝液中、NaClグラジエント（０
〜0.25M）により溶離した。Met−アミノペプチダーゼ活
性を有する画分をプールし、分子量30,000のCentricon
フィルターを用いて濃縮し、そして同じ緩衝液＋1mMの
メチオニンを含むＳ−200セファクリルカラムを通し
た。活性画分をプールし、そして前のようにして濃縮し
た。
サブユニットの分子量が、SDS PAGE（SDSポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動）によっておよそ32,000であるこ
とが測定され〔Laemmli,J.Mol.Biol.（1973）80:575〜5
99〕そして酵素純度は95％であることが推定された。従
って、そのタンパク質は、264のアミノ酸のタンパク質
についてこのおよその予定サイズである。染色されたゲ
ルのデンシナメーターに基づく量の推定値は、Met−ア
ミノペプチダーゼが約15〜20％の細胞タンパク質である
ことを示した。
Ｎ−末端の配列決定を、精製されたペプチダーゼに対
して行なった。初めの65個のアミノ酸についての結果は
第１表に与えられている。
変形されたＬ−アミノ酸オキシダーゼ−HRP−ODAD検
定を用いて、一般的には、上に記載しているように及び
TLC法によって、精製されたMet−アミノペプチダーゼが
種々のペプチド基質からアミノ酸を放す能力について分
析された。初めにふれた検定のためには、タンパク質溶
液（この場合、細胞溶解物）10μを、4mMのMet−Gly
−Met−Met、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液（pH＝7.5及
び0.2mMのCoCl2を含む基質溶液90μ中に添加した。そ
の反応混合物を含むチューブを、30℃で10分間インキュ
ベートし、そして熱湯槽中に２分間、そのチューブを置
くことによって、その反応を停止せしめた。0.9mlの発
色混合物〔Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ0.2mg、ホースラ
ディッシュ ペルオキシダーゼ0.03mg及びＯ−ジアニシ
ヂン ジヒドロクロリド0.2mgを含む0.1MのTris−HCl
（pH＝7.4）〕を添加した後、そのチューブを、30℃で3
0〜60分間インキュベートし、そしてその光学密度を440
nmで読取った。
TLC法は、ｎ−ブタノール−酢酸−水（120:50:30v/
v）溶媒混合物を含むシリカゲルプレートを使用した。
ニンヒドリン試薬によりそのプレートをスプレーした
後、放出されたアミノ酸を検出し、そして同定した。
メチオニンは、次のペプチドから放された： Met−Ala−Met; Met−Gly−Met−Met; Met−Gly−Met; Met−Ala−Ser; Met−Gly−Gly; Met−Ala−Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−Thr−Lys−Lys−
Thr−Gly−Leu;及び Met−Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−Thr−Lys−Lys−Gln−
Leu−Gys。
アミノ酸は、次のペプチドからは放されなかった： Met−Phe−Gly; Met−Phe−Ala−Gly; Met−Leu−Phe; Met−Met−Met; Leu−Leu−Leu; Leu−Gly−Gly; Met−Ala; Leu−Gly; Leu−Ala−Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−Thr−Lys−Lys−
Thr−Gly−Leu; Ｎ−ホルミル−Met−Met−Met; Met−Phe; Met−Ser; Val−Gly−Gly; Thr−Gly−Gly; Trp−Gly−Gly; Phe−Gly−Gly; Met−Glu−His−Phe−Arg−Try−Gly; Met−Lys−Arg−Pro−Pro−Gly−Phe−Ser−Pro−Phe−
Arg; Gly−（Gly）３−Gly; Phe−Gly−Gly; Ser−Ser−Ser; Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−Thr−Lys−Lys−Gln−Leu−
Cys; Ala−Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−Thr−Lys−Lys−Gln−
Leu; Thr−Val−Leu; Arg−Gly−Gly; Ala−（Ala）２−Ala; Ala−Ala−Ala; Glu−Gly−Phe; Leu−Leu−Leu; Tyr−Gly−Gly; Ile−Gly−Gly; Met−Arg−Pheアセテート． そのペプチダーゼ活性は、1mMのEDTAによって完全に
抑制され、そして最大の活性のためには、約１〜200mM
のリン酸イオン及び0.02〜2.0mMのCo+2を要する。
Co+2を、Mn+2,Cu+2,Zn+2又はMg+2イオンと取り替える
ことはできなかった。リン酸カリウム緩衝液の代りにTr
isが用いられる場合、その活性はまた、激しく減少する
が、しかしこの活性は、ナトリウム又はカリウム塩の添
加によってもとに戻され得る。
前記結果から、ペプチダーゼは、Ｎ−末端のメチオニ
ンのみを切断し、そして他の特異的必要条件もまた有す
ることが明らかである。配列中の第２及び第３アミノ酸
の性質は、重要であるように思え、そしてペプチド中に
最少の３個のアミノ酸が必要とされるように思える。し
かしながら、短鎖ペプチドに基づく結果は、大きなタン
パク質の折りたたみが、残基２及び３に関しての特異性
を変える二次及び三次構造を提供することができる場
合、続くアミノ酸のための必要条件の点から完全に決定
的であることができない。さらに、その特異性は、条件
に依存し、そして使用される特定の条件下で加水分解を
受けていないペプチドは、もしその条件が変えられるな
ら、まだ加水分解され得る。
第二残基が1.29Åよりも小さならせん半径を有する側
鎖を持つ場合、一般的にMet−アミノペプチダーゼがＮ
−未満のメチオニンを切断し、そしてその側鎖のサイズ
が1.43Åよりも大きな場合、一般的に切断が起こらない
であろうと思われるが、下に記載されているリシンＡに
おいて著しい例外が存在し、ここでIle、すなわち第二
アミノ酸についてのらせん半径が1.56Åである。従っ
て、隣接するアミノ酸の影響及び基質の二次及び三次構
造がまた、その変異性に対して影響を及ぼすように思え
る。
さらに、上のようにしてpSYC1174からい精製されたMe
t−アミノペプチダーゼを、標準の方法及びアジュバン
トを用いてウサギに注入し、Met−アミノペプチダーゼ
と特異的に反応する抗血清を得た。
D.4.N−末端のMe欠失性IL−２の製造 pSYC1143を担持するE.ユリMM294、すなわち、trpプロ
モーターの制御下で、成熟タンパク質中においてＮ−末
端配列:Ala−Pro−Thr−Serを有する組換え体IL−２ム
テインのための発現ベクターを、E.コリpSYC1174から調
製されたプラスミドDNA（pSYC1174と名づけられた）と
共に形質転換した。目的とする両プラスミドの存在を示
す、好結果をもたらす形質転換体を、AmpR及びTetRによ
って選択した。
両プラスミドを含む細胞を、トリプトファン50mg/l、
カサミノ酸5g/l、アンピシリン50mg/l及びテトラサイク
リン5mg/lを含む最少培地中で１晩37℃で増殖した。次
に、その培養物を洗浄し、IL−２合成を抑制解除するた
めにトリプトファンを含まない同じ培地中に再懸濁し、
そして37℃で４時間インキュベートした。
このようにして産生されたIL−２は、細胞内のＲ体中
に含まれる。そのＲ体を、くり返し音波処理することに
よって精製し、8mMのEDTAにより洗浄し、そして最後に
５％SDS中に再懸濁した。そのIL−２を、Vydac C4逆相
カラム及び0.1％トリフルオロ酢酸中アセトニトリルに
対する水のグラジエントを用いるHPLCによってさらに精
製した。その精製されたIL−２のためのＮ−末端配列を
決定し、そしてその配列は次の混合物を示した： Met−Ala−Pro− ０〜５％ Ala−Pro− 25〜30％ Pro− 70〜75％。
上のようにして増殖され、そして誘導された対照培養
物（但し、pSYC1143のみを含む）は、生成されたIL−２
を与え、ここでその精製されたタンパク質は、70％のMe
t−Ala−Pro及び30％のAla−Proの組成物を有する。
〔pSYC1143は、trpプロモーター及びcry位置の正のレト
ロレギュレーター配列の制御下でIL−２配列を含む。そ
れはpFC51.T（0.95kbのEcoR Iフラグメントとしてこの
発現系を含み）及びpACYC184（CmRマーカーを担持するp
UC18と適合する宿主ベクターである）から製造される。
その発現系は、pFC51.TのEcoR I消化物として製造さ
れ、そしてEcoR Iにより消化されたpACYC184に連結さ
れ、pSYC1143を得る。pFC51.Tは、1985年８月31日に出
願された日本特許第190976/85号に広く記載され、そし
てこの開示を引用によりこの明細書中に組み入れる。〕 D.5.Met−IL−２のイン ビトロ ピロセシング 精製されたMet−アミノペプチダーゼをまた用いて、
精製されたIL−２をイン ビトロでプロセシングした。
その反応混合物は、0.05％SDS中、上で調製された1.7mg
/mlのIL−２を含む原液50μ;0.2mMのCoCl2を含む0.1M
リン酸カリウム緩衝液（pH＝7.5）40μ；及び8mg/ml
のE.コリpSYC1174から精製されたMet−アミノペプチダ
ーゼの1:10希釈溶液10μを含んだ。その反応混合物
を、30℃で１晩インキュベートし、そしてプロセシング
の度合は、SDS PAGE及びＮ−末端の配列決定を用いて査
定した。第３図は、未反応のIL−２及び酵素の存在にお
けるIL−２に対して行なわれたSDS PAGEの結果を示す。
インキュベーションの後、わずかに低い分子量のタンパ
ク質の存在が、元のMet−先行のタンパク質によって示
されるバンドを補充する。酵素処理の前、その精製され
たIL−２のためのＮ−末端配列は、74％のMet−Ala−Pr
o及び26％のAla−Proであり：酵素処理の後、それは94
％Ala−Pro及び６％のMet−Ala−Proであった。
D.6.リシンＡの発現ベクターの構成 phoAプロモーター、リーダー配列及び該リーダー配列
のＣ−末端でNar I部位を提供するように変性されたコ
ード配列、次にB.スリンジエンシス（B.thuringiensi
s）の正のレトロレギュレーターを含む、リシンＡ配列
のための宿主ベクター、すなわちpSYC1089を次のように
して構成した。
pSYC997:Nar I部位を含むように変性されたPhoAプロモ
ーター及びリーダー プラスミドpEG247、すなわちHind III/Xho Iフラグメ
ントとして2.6kbのphoA構造遺伝子を含む25kbのプラス
ミドを、phoA遺伝子の源として使用した。このプラスミ
ドをM.Casadabanから得、そしてGroisman,E.A.,など、p
roc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1984）81:1840〜1843に示
されている方法に類似する方法により構成した。更に、
前記の文献に示されている方法を適用することによっ
て、phoA遺伝子を、いづれかの目的とする主力ベクター
中に便利にクローンすることができる。
pEG247からのHind III/Xho Iによる2.6kbフラグメン
トを、精製し、そしてpUC18中にクローンした。この2.7
kbプラスミドは、アンピシリン耐性マーカー及び目的と
する配列の便利な挿入を可能にするポリリンカーを含
む。pUC18をHind III/Sal Iにより消化し、そしてその
線状ベクターを、単離されたphoAフラグメントと連結し
た。その連結混合物を用いて、E.コリJM103又はJM105、
に匹敵する株のE.コリDG99をAmpRに対して形質転換し、
そして、pUC18中への挿入体についてスクリーンされ
た、好結果をもたらす形質転換体における中間のプラス
ミドpSYC999の構成を確めた。
目的とするNar I変性を含むpSYC997を、特定部位の突
然変異誘発によってpSYC991から製造した。Pvu II/Pvu
IIによる770個の塩基対フラグメントを、pSYC991から得
た。それはphoAプロモーター及び成熟のアルカリ性ホス
ファターゼの上流のＮ−末端配列の部分、及び従って、
完全なリーダー配列もまた含む。このフラグメントを、
M13mp11のSma I部位に連結し、そして単鎖ファージを、
突然変異誘発のための鋳型として調製した。この突然変
異誘発においては、次の合成の26−mer、 ５′−TTCTGGTGTC▲▼TTTGTCACAG−３′ （上に書いた線はNar I部位を示す）は、プライマー及
びプローブとして使用された。次に、突然変異誘発され
たファージ粒子を用いて、Nar I部位を含む、目的とす
るリーダー配列のための源としてRF−DNAを調製した。
マーカーのバックボーン ベクター クロラムフェニコール耐性を提供するpSYC1015、レプ
リコン及びphoA遺伝子における適切な制限部位をまたpS
YC991から構成する。まずpSYC991を、Hind III/BamH I
により消化し、そしてphoA遺伝子を含むおよそ2.6kbの
フラグメントを精製し、そしてHind III/BamH Iにより
消化されたpACYC184からの、精製された3.65kbのベクタ
ー フラグメントと連結した。pACYC184からATCCから入
手可能であり、そしてクロラムフェニコール遺伝子（Cm
R）、細菌性レプリコン及びテトラサイクル耐性遺伝子
におけるHind III及びBamH I部位を含む。その連結混合
物を用いてCmRに対するE.コリMM294を形質転換し、そし
てpSYC1015の構成を、制限分析及び配列決定によって確
めた。
付加phoA−含有の中間体 ２つの付加中間体プラスミド、pSYC1052及びpSYC1078
が、B.スリンジエンシスの正のレトロレギュレーターの
ための適切な宿主ベクターを提供するために構成され
た。
変性されたリーダーpSYC997からのphoAプロモーター
及びNar I部位を含む、精製された小さなHind III/BssH
IIフラグメントを、Hind III/BssH IIにより消化され
たpSYC1015（従って、これは変性されていない欠失した
phoA配列を有する）に結することによってpSYC1052を構
成した。この得られるベクターpSYC1052を、CmRに対す
るE.コリ形質転換体において確認した。
pSYC1078は、欠失されたphoAプロモーターの前にBamH
I部位を有するpSYC1052の変性された形である。このBa
mH I部位を削除するために、pSYC1052を、部分的なBamH
I消化にゆだね、４個のdNTPの存在下でDNAポリマラー
ゼＩ（Klenow）を用いてフィルインし、そして平滑末端
条件下で再連結した。phoA遺伝子のちょうど３′で唯一
のBamH I部位を含む、この目的とする得られたプラスミ
ドを、好結果をもたらすCmR形質転換体をスクリーニン
グした後、確認した。
pHCW701:レトロレギュレーターの源 上流のコード配列の発現を促進するために、B.スリン
ジエンシスからの結晶タンパク質をコードする遺伝子
（Cry遺伝子）の３′配列の能力は、1984年８月31日に
出願されたアメリカ同時係属出願第646,584号に記載さ
れ、そして特許請求されていて、そしてこの開示を引用
によりこの明細書中に組み入れた。要約すれば、これら
の配列は、約43％のシトシン−グアニン残基含有物を有
するステム及びループ構造を形成することができる、対
応するRNA転写物に転写するDNA配列によって特徴づけら
れている。遺伝子の３′末端からの約30〜300のヌクレ
オチドを連結する場合、正のレトロギュレーター効果が
その遺伝子発現上に示される。その正のレトロレギュレ
ーターは、400bpのEcoR I/BamH I制限フラグメントとし
て製造され、そしてそれは平滑末端化され、そしてpLW
1、すなわちインターロイキン−２のための発現ベクタ
ー中に連結された。
〔pLW1は、E.コリ中で効果的なレプリコン、TetR遺伝
子、E.コリのtrpプロモーター、リボゾーム結合フラグ
メント及び706bpのHind III/Pst I DNAフラグメント
（ヒトIL−２のための遺伝子を含む）を含むpRBR322誘
導体であて、pLW1は、ブダペスト条約下でATCCに寄託さ
れ、そして寄託番号第39405号を得る。〕 Klenow及び２個のdNTPによりcry遺伝子の正のレトロ
レギュレーターを含む400bpのEcoR I/BamH Iフラグメン
トを平滑末端化し、そしてT4リガーゼを用いてStu Iに
より消化されたプラスミドpLW1中にその平滑末端化され
たフラグメントを連結することによってpHCW701を完結
した。制限処理分析によって容易に区別できる、挿入体
の２つの可能な方向を得ることができる。pHCW701と名
付けられた目的とするプラスミドは、IL−２遺伝子の
３′末端の近くに、再構成されたBamH I部位を有する。
このプラスミドは、ブダペスト条約下でATCCに寄託さ
れ、そして寄託番号39757号を得る。
pSYC1089の完結化 pSYC1089を完結化するために、pHCW701をEcoR Iによ
り消化し、Klenow及び４個のdNTPを用いてフィルイン
し、次にBamH Iにより消化し、そして正のレトロレギュ
レーターを含む400bpのフラグメントを回収した。pSYC1
078をAva Iにより消化し、Klenow及び４個のdNTPにより
フィルインし、そして次にBamH Iにより消化した。その
連結混合物を、E.コリMM294中に形質転換し、そして目
的とするプラスミドpSYC1089、すなわちCmRを与える5.5
kbのプラスミドを確認した。pSYC1089は、phoAプロモー
ターのための配列及びリーダー（Nar I部位を有する）
配列並びにBamH I部位のすぐ上流に構造遺伝子、次にcr
y遺伝子の正のレトロレギュレーター配列を含む。
リシンＡ リシンＡのコード配列を、pRA123から、より詳しく
は、pRAT1の構成を通して、下記のpRA123のM13サブクロ
ーンから得た。pRA123は1984年８月17日にATCCに寄託さ
れ、そして寄託番号第39799号を得た。pRA123からのpRA
T1の構成は、1984年９月20日に出願されたアメリカ特許
第653,515号に広く記載され、そしてその開示を引用に
よりこの明細書に組み入れた。要約すれば、完全なリシ
ンＡのコード配列（第４図を参照のこと）を含むpRA123
を変性し、アミノ酸265の後の正しい位置に終止コドン
及び成熟配列のすぐ先の位置に開始コドンを有するHind
III/BamH Iカセットとしてこの配列を提供する。pRA12
3をBamH Iにより消化し、およそ896bpのBamH I/BamH I
フラグメントを単離し、そしてM13ベクターにおけるlac
プロモーターに関してアンチ−センス方向においてM13m
p18中にサブクローンした。そのファージの単鎖DNAを、
プライマーとして、次の配列： ５′−CACAGTTTTAATTGCTTATAAGG−３′、 （ここで、リシンＡ鎖のＣ−末端のser−gln−phe配列
の末端で正しく読み枠を合せてTAA終止コドンを配置
し）、次に、次の配列： ５′−CTTTCACATTAGAGAAGCTTATGATATTCCCCAAAC−３′、
（ここで、リシンＡのＮ−末端のile−phe−pro−lys配
列のすぐ上流に目的とするHind III/ATG開始コドンの２
回対称軸を配置している）を用いて２段階のプライマー
指示の突然変異誘発にゆだねた。プローブとして適切な
上のプライマーを用いておのおのの突然変異誘発の後、
変性されたファージを同定した。次に、目的とする構成
体を、Hind III及びBamH Iにより二重消化し、そして適
切なリジンＡをコードするフラグメントを単離した。Hi
nd III/BamH Iにより消化された。pTRP3とHind III/Bam
H Iフラグメントとの連結によりpRAT1を完結した。pTRP
3は、下流のHind III部位と共にtrpプロモーターを含
む、pBR322基礎のベクターであり;pTRPは1984年12月18
日にATCCに寄託され、そして寄託番号第39946号を得
た。
pRAT1から完全に由来したコード配列を用いて、pRAP2
29を構成した。それは、（１）順に、B.スリンジエンシ
ス−正のレトロレギュレーター配列、スクラムフェニル
コール耐性マーカー、適合可能なレプリコン及びphoAプ
ロモーター及びリーダー配列を提供する、Nar I/BamH I
レプリコン含有のpSYC1089のフラグメント；（２）適切
に終結されたリシンＡのＣ−末端部分をコードする500b
pフラグメントを提供する、Cla I/BamH Iにより消化さ
れたpRAT1;及び（３）pRAT1からのおよそ350bpのCla I/
Cla Iフラグメントによって提供されるようなＮ−末端
配列の３通りの連結によって得られた。リシンＡ配列は
また、pRAT1からのCla I（一部）/BamH Iにより切断さ
れたフラグメントとして製造され得る（そして好ましく
は製造それ得るころが明らかである。
その得られる融合体は、（１）イソロイシン残基を先
行するリシンＡ鎖の開始コドンを保持し；（２）7bpづ
つ及び従って、リーダー配列に対する読み枠から分離さ
れ；（３）トイペプチドのIle−Ser−LeuによってphoA
リーダを延長し；そして（４）リシン４の開始コドンを
有するフレームの外にあるが但し、すぐ近くのTGAコド
ンでリーダー配列の終結を可能にする。pRAP229は1985
年３月８日にATCCに寄託され、そして寄託番号第53408
号に得る。
D.7.E.コリにおけるリシンＡの製造及びプロセシング E.コリMM294を、pRAP229のみにより形質転換し、又
は、pRAP229及びpSYC1174により同時形質転換した。そ
の形質転換培養物を、Michaelis.など、J.Bact（1983）
154:356〜365に記載されている条件に類似する条件下で
増殖せしめた。外因性リン酸塩濃度を低め、そしてその
培養物を16〜17時間維持することによって、その細胞を
誘発する。
その細胞を収穫し、そして界面活性剤の不在中で音波
処理によって調製された全細胞抽出物を、天然のリシン
Ａに対するウサギ抗血清を用いるウエスターン法を用い
て、発現について検定した。Ｎ−末端のメチル化を査定
するために、そのリシンＡを精製し、そして定量分析の
ためにエドマン分解にゆだねた。その細胞を、pRAP229
により形質転換する場合、リシンＡの40％がＮ−末端の
メチオニンを含んだ。同時形質転換された細胞は、メチ
ル化された鎖の９％のみを有するリシンＡを産生した。
D.8.Met−リシンＡのイン ビトロ プロセシング pRAP229により形質転換された細胞溶解物からの精製
されたリシンＡ（600μｇ）を、0.2mMの塩化コバルト及
び0.1mMのリン酸カリシウム緩衝液（pH＝7.5）（0.3ml
の合計体積を有する）中において、E.コリpSYC1174から
精製されたMet−アミノペプチダーゼ24μｇと共に混合
した。その反応混合物を30℃で１晩インキュベートし、
そして熱湯槽中で加熱することによって停止した。その
反応混合物を脱塩化した後、Ｎ−末端配列をエドマン分
解によって決定した。Met−アミノペプチダーゼを含ま
ない対照混合物は、Ｎ−末端のメチオニンを有するリシ
ンＡの40％を示し、その同じ画分は、上に記載されてい
るように、細胞溶解物中に通常見出された。Met−アミ
ノペプチダーゼ酵素を含む反応混合物は、タンパク質の
８％のみがＮ−末端のメチオニンを含んでいるリシンＡ
を含み、そしてpRAP229/pSYC1174により形質転換された
細胞から得られる画分と実質的に同じであった。
1985年８月27日、E.コリ株pSYC1174を、特許手続上の
微生物寄託の国際的承認に関するベダペスト条約及びそ
れに基づく規則（ブダペスト条約）に基づいてAmerican
Type Calture Cellectonに寄託し、ATCC番号53245を得
た。これは寄託の日から30年間保証される。微生物はブ
タペスト条約の元で、そして適切なアメリカ特許の発行
後には無制限の入手可能性を保証する出願人とATCCの間
の契約に基づいて、寄託された菌株はATCCにより入手可
能にされるであろう。特許法に従って、いずれかの政府
の権威下で与えられた権利に反してこの発明を実施する
許諾であると解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のMet−アミノペプチダーゼのタンパ
ク質から決定されたＮ−末端のアミノ酸配列を示す。 第１図中の１〜４は次の意味を有する。 1:同量のPTU−Metが、その製造における遊離メチオニン
のために、サイクル１に観察された。 2:サイクル36及び37の生成物は、サンプル調製の間、偶
然に混合された。サイクル38へのキャリーオーバー（Ca
rryover）の定量分析は、アミノ酸の順序がThr−Serよ
りかむしろSer−Thrであることを提案する。 3:サイクル43においては確認され得なかった。しかしな
がら、PTM−デヒドロアラニンの実質量が観察された。
この誘導体は、セリン及びシステインの両者から形成さ
れる。 4:配列決定機（sequencer）におけるフラクションコレ
クター問題を、誘導されるべき複数のサンプル引き起こ
した。 第２図は、第１図に例示されているMet−アミノペプチ
ダーゼをコードするpSYC1174の1.2kb挿入体を示す。 第３図は、本発明の酵素によりプロセシングされる前及
びプロセシングされた後の精製された組換え体IL−２の
SDSゲルを示し、そしてこれは図面に代わる写真であ
る。 第４図は、リシンＡについての遺伝子を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 キース アラン ボーアー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94610，オークランド，ベイビュー ア ベニュー 954 (72)発明者 シェン―ユン チャン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611，オークランド，マンザニタ ド ライブ 2289

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記アミノ酸配列： 又は前記配列中の１もしくは複数のアミノ酸の変更、付
    加もしくは欠失しているアミノ酸配列を有するMet−ア
    ミノペプチダーゼをコードするプラスミドDNA。
  2. 【請求項２】下記配列： を含んで成る特許請求の範囲第１項記載のDNA。
  3. 【請求項３】アミノ酸配列Met−アミノペプチダーゼを
    コードする単一のクローン化された組換え体細胞から調
    製された特許請求の範囲第１項記載のDNA。
  4. 【請求項４】前記Met−アミノペプチダーゼをコードす
    る部分がE.コリに由来することを特徴とする特許請求の
    範囲第３項記載のDNA。
  5. 【請求項５】プラスミド上に配列されていることを特徴
    とする特許請求の範囲第４項記載のDNA。
  6. 【請求項６】前記プラスミドがE.コリpSYC1174に由来す
    ることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載のDNA。
  7. 【請求項７】下記アミノ酸配列： 又は前記配列中の１もしくは複数のアミノ酸の変更、付
    加もしくは欠失しているアミノ酸配列を有するMet−ア
    ミノペプチダーゼをコードするDNAにより形質転換され
    た組換え体細胞。
  8. 【請求項８】Ｎ−末端配列Ala−Ile−Ser−Ile−Lys−T
    hr−Proを有するMet−アミノペプチダーゼをコードする
    DNAを得るための方法であって： 下記のDNA又はその相補体： を含んで成るラベルされたDNAによりE.コリ ゲノムラ
    イブラリィをスクリーニングすることを含んで成る方
    法。
  9. 【請求項９】６×SSC,0.01MのEDTA,5×Denhardt及び0.5
    ％のSDSを含む緩衝液中において、65℃でハイブリダイ
    ゼーション反応を完結するのに十分な時間ハイブリダイ
    ズし、次に65℃で３×SSCにより洗浄することに相当す
    るハイブリダイゼーション条件下で、下記DNA（又はそ
    の相補体）： にハイブリダイズすることを特徴とするMet−アミノペ
    プチダーゼをコードするDNA。
  10. 【請求項１０】前記Met−アミノペプチダーゼをコード
    するDNAがE.コリに由来することを特徴とする特許請求
    の範囲第９項記載のDNA。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US5013662A (en) * 1985-09-20 1991-05-07 Cetus Corporation Bacterial methionine n-terminal peptidase
DE3541856A1 (de) * 1985-11-27 1987-06-04 Hoechst Ag Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens
GB8703015D0 (en) * 1987-02-10 1987-03-18 Biogen Nv Aminopeptidase
DE3811921A1 (de) * 1988-04-09 1989-10-19 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von proteinen, die n-terminal mit prolin beginnen
AU4057889A (en) * 1988-08-26 1990-03-23 General Hospital Corporation, The Isolation, purification, and characterization of the methionine-specific aminopeptidases: mas i and mas x
AU4221089A (en) * 1988-09-13 1990-04-02 General Hospital Corporation, The Isolation, purification, and characterization of the aminopeptidases: ap2, ap1, and apx
AU4188189A (en) * 1988-09-13 1990-04-02 General Hospital Corporation, The Isolation, purification, and characterization of the aminopeptidases: mas ii and mas iii
KR900702014A (ko) * 1988-09-13 1990-12-05 원본미기재 아미노펩티다아제 ap1 및 ap122의 단리, 정제 및 특성확인
US5126249A (en) * 1989-05-09 1992-06-30 Eli Lilly And Company Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence
ES2109336T3 (es) 1990-11-26 1998-01-16 Genetics Inst Expresion de pace en celulas huesped y metodos de utilizacion de la misma.
DE69233710T2 (de) * 1991-07-24 2008-06-19 Novartis Ag Expressionsvektor für Prolylendopeptidase von Flavobacterium meningosepticum
GB9225021D0 (en) * 1992-11-30 1993-01-20 Sandoz Ltd Organic compounds
US5616485A (en) * 1993-12-23 1997-04-01 Cangene Corporation Streptomyces proteases and improved streptomyces strains for expression of peptides and polypeptides
US6127144A (en) * 1993-12-23 2000-10-03 Cangene Corporation Method for expression of proteins in bacterial host cells
US5629167A (en) 1994-04-19 1997-05-13 Biocine S.P.A. Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay
US5753465A (en) * 1994-08-30 1998-05-19 Carnegie Mellon University Unmodified recombinant human adult hemoglobin production
NO944411L (no) * 1994-11-17 1996-05-20 Leiv Sigve Haavarstein Endoprotease med en ny spaltningsspesifisitet
US5843888A (en) * 1995-05-01 1998-12-01 Carnegie Mellon University Low oxygen affinity mutant hemoglobin
US5885820A (en) * 1996-01-31 1999-03-23 St. Louis University Clone of a nucleotide sequence encoding a protein having two functions
KR100369839B1 (ko) * 1997-02-28 2003-06-12 주식회사 엘지생명과학 바실러스리케니포미스균주에서유래한아미노펩티다제,그의제조방법및이를이용한천연형단백질의제조방법
CA2308606A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Chiron S.P.A. Neisserial antigens
AU1979599A (en) 1998-01-14 1999-08-02 Chiron S.P.A. (neisseria meningitidis) antigens
GB9808932D0 (en) 1998-04-27 1998-06-24 Chiron Spa Polyepitope carrier protein
BR9910089A (pt) 1998-05-01 2004-06-08 Chiron Corp Composições e antìgenos de neisseria meningitidis
RU2245366C2 (ru) 1999-04-30 2005-01-27 Чирон С.Р.Л. Антиген neisseria, кодирующая его нуклеиновая кислота, их использование
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
EP2275552B1 (en) 1999-10-29 2015-09-09 GlaxoSmithKline Biologicals SA Neisserial antigenic peptides
PT2289545T (pt) 2000-01-17 2016-09-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vacina de omv suplementada contra meningococos
US7816098B2 (en) * 2000-01-31 2010-10-19 Sense Proteomic Limited Methods of making and using a protein array
MXPA03003690A (es) 2000-10-27 2004-05-05 Chiron Spa Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos.
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
WO2003010194A2 (en) 2001-07-27 2003-02-06 Chiron Srl. Meningococcus adhesins nada, app and orf 40
PL206286B1 (pl) * 2001-09-13 2010-07-30 Genentech Incgenentech Inc Komórka Gram-ujemnej bakterii, sposób wytwarzania heterologicznego peptydu, sposób zapobiegania odcinaniu N-końcowego aminokwasu, sposób odcinania N-końcowego aminokwasu i sposób wytwarzania skróconego polipeptydu
ES2312649T3 (es) 2001-12-12 2009-03-01 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Inmunizacion frente a chlamydia trachomatis.
EP2279746B1 (en) 2002-11-15 2013-10-02 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Surface proteins in neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
US20110206692A1 (en) 2006-06-09 2011-08-25 Novartis Ag Conformers of bacterial adhesins
NZ587382A (en) 2008-02-21 2012-01-12 Novartis Ag Meningococcal fhbp polypeptides
KR101041986B1 (ko) 2008-03-06 2011-06-16 (주)한국비엠아이 인간 인터루킨-2의 대량 생산을 위한 신규한 균주
WO2011024072A2 (en) 2009-08-27 2011-03-03 Novartis Ag Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences
BR112012010531A2 (pt) 2009-10-27 2019-09-24 Novartis Ag "polipeptídeos de modificação meningocócica fhbp"

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL60184A (en) * 1979-05-31 1984-05-31 Schering Ag Process for the specific cleavage of protein sequences from proteins
US4350764A (en) * 1980-03-10 1982-09-21 The Regents Of The University Of California Microbiological synthesis of beta endorphin
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
US4755465A (en) * 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
DE3327007A1 (de) * 1983-07-27 1985-02-07 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Herstellung von polypeptiden mit einem saeureamid-carboxyterminus
JPS6041697A (ja) * 1983-08-15 1985-03-05 Asahi Chem Ind Co Ltd 活性蛋白質誘導体の新規合成法
DE122004000009I1 (de) * 1984-08-16 2004-11-18 Savient Pharmaceuticals Inc Methode zur Herstellung von menschlichen Wachstumshormonen.

Also Published As

Publication number Publication date
DK448286A (da) 1987-03-21
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