JP2595205B2 - 発現カセット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、発現のための制御系、遺伝的形質転換のた
めの標識、および前記制御系および形質転換の成功を同
時に評価する手段を提供することに関する組み換えDNA
技法の観点に関する。さらに詳しくは、本発明は、便利
な温度感受性制御カセット（cassette）、原核生物およ
び真核生物の両者における使用に適する優性選択可能な
遺伝標識系（dominant selectable marker system）、
および融通性のある優性選択可能な融合フラッグ（fusi
on flag）に関する。

背景の技術 宿主細胞の遺伝的構成の変更は、現代のバイオテクノ
ロジーのやり方である。適当な修飾により、このような
宿主細胞を通常大量に入手できない蛋白質の配列、例え
ば、線維芽細胞または白血球インターフェロンを生産で
きるようにさせることができる。あるいは、それらの代
謝を変更して、ある普通でない機能、例えば、でんぷん
の単純糖への転化をなすようにそれらを誘導することが
できる。

これらの新しい蛋白質合成を実施するために、細胞は
１）所望のコード配列を取るようにさせ、そして２）コ
ード配列に作用可能に結合した、宿主と適合性である制
御配列をもつようにさせなくてはならない。これらの要
件の両者の成功を評価するための手段を設けなくてはな
らない。本発明は第１を評価するための優性選択可能な
標識、両者を同時に評価するための優性選択可能な融合
フラッグ、およびこのような評価に従う改良された制御
配列カセットを提供する。

選択可能な標識 第１に、宿主生物の遺伝的構成を変更するための多数
の技術、例えば、形質導入および突然変異が知られてい
る。しかしながら、これまで、このような遺伝的変更の
特異的な制御において最も有用な技術は、適当な組み換
えベクター、典型的にはプラスミドを用いる宿主細胞の
形質転換である。使用する宿主細胞に依存して、種々の
形質転換条件が用いられる。このような条件は形質転換
された細胞をもたらすが、しかしながら、形質転換の頻
度は比較的低い。すなわち、原核生物について約1/10³
の細胞であり、そして真核生物について約1/10⁷〜約1/1
0²の細胞である。したがって、宿主細胞の集団を比較的
わずかの形質転換体についてスクリーニングするための
選択的手順が存在しうるということが必須である。典型
的には、これは形質転換性ベクター上に１または２以上
の標識をコードする配列を含めることによって達成され
る。このような標識は、形質転換しない細胞の増殖を支
持することができない条件下で、好結果の形質転換体を
増殖させる表現型特性を与える。

原核生物系において有用な標識はよく知られており、
そしてその使用は実質的に日常的になってきた。このよ
うな標識は、次のものを含包する：アンピシリンを分解
できる酵素であるβ−ラクタマーゼをコードし、こうし
てその抗生物質を含有する培地中で生物を増殖せしめる
DNA配列であるAmp^R；テトラサイクリンに対する保護の
ための類似配列であるTet^R；並びにクロラムフェニコー
ル、ネオマイシン、およびある種の他の抗生物質に対す
る耐性を付与する蛋白質をコードする遺伝子配列。植物
細胞の形質転換は、形質転換体に選択可能な（しかし望
ましくない）形質を付与するアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に関連す
るベクターのようなベクターで感染させることにしばし
ば基く。これらの形質は植物ホルモンの過剰の生産およ
び早期の生産を包含し、それゆえ腫瘍が生ずる。

他の原核生物において有用な選択可能な標識は、それ
ほどよく確立されていない。いくつかのよく知られてい
た標識は、次のものを包含する:LEU2遺伝子〔これはタ
ンパク質であるβ−イソプロピルマレートデヒドロゲナ
ーゼをコードし、こうして正常にロイシンを合成できな
い宿主生物（最も普通には（LEU2^-）酵母菌突然変異
体）をロイシンの不存在で生長させる〕；ヘルペスウイ
ルスチミジンキナーゼ標識（TK）〔これはDNA合成に必
須のこの酵素をコードする配列であり、こうしてそうで
なければそれを欠損する突然変異体（tk^-生物を増殖さ
せる〕；ジヒドロフォレートリダクターゼ（DHFR）をコ
ードし、DHFRを欠損する株において増殖を可能にする配
列；およびキサンチン−グアノシンリボシルトランスフ
ェラーゼ（XGRT）（これは同様にこの酵素の欠損を代替
する）。このような遺伝標識は、米国特許第4,399,216
号（アクセルら）中に開示される真核生物の細胞の形質
転換法において用いられた。

真核生物の標識は、典型的には、哺乳動物または酵母
の細胞の場合において、宿主における欠損を代替するこ
とにより、あるいは植物の場合において望ましくない特
性を付与することによって、それらの作用を発揮するこ
とは直ちに理解されるであろう。こうして、それらの遺
伝標識は野生型真核生物の細胞の集団の形質転換体を選
択するためには不適当である。これは明らかに不利であ
る。

この欠点は、酵母菌の工業的株において組み換え技術
を利用する試みに関して特に影響力を有する。これらの
株の取扱いにおいて商業的経験の蓄積が存在し、そして
それは所望の発酵性、例えば、高いレベルのエタノール
発酵性、所望の二次代謝生産物の形成性を有し、所望の
物理的性質、例えば、凝集性を有し、かつ安価な最小栄
養素で増殖するように開発されてきた。細胞中で作用可
能な優性の（野生型に対して）選択可能な標識が存在し
ないことが酵母組み換え技術をいっそう感受性のかつ栄
養条件のめんどうな実験室用菌株に限定し、そして組み
換え酵母菌の商業的利用に対する障害を構成した。

要約すると、過去10年において、所望の蛋白質生産物
または所望の代謝特性のための発現系を用いる原核生物
の宿主の形質転換に首尾よく使用され、そして同時形質
転換性標識（co−transforming marker）を用いる形質
転換体の選択に頼った組み換え技術は、首尾よく形質転
換された野生型宿主の選択を可能とする標識が入手でき
た場合、植物、哺乳動物および工業用酵母菌を包含する
真核生物に拡張することができるであろう。

最近、形質転換された野生型細胞を形質転換されない
野生型細胞と区別するために有用な表現型を与えるため
に有効な、選択可能な遺伝標識が研究されてきている。
アミノグリコシド抗生物質であるG418はバクテリアに対
してばかりでなく、かつまた酵母、植物および哺乳動物
の細胞に対して毒性である。こうして、広い範囲の細胞
は、保護酵素が存在しないと、G418の存在下に増殖する
ことができない。この抗生物質は、アミノグリコシドホ
スホトランスフェラーゼ（APH）と称される酵素の活性
により不活性化〔ホスホリル化（phosphorylation）を
経て〕する。この活性をもつ２種の異る酵素、APH−Ｉ
およびAPH−IIが知られている。これらの酵素のための
コード配列は、それぞれ、トランスポゾンTn 601（Tn 9
03としても知られている）〔シャープ（Sharp）,P.A.
ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J Mol Biol）（1973）75:235〕およびTn5〔ジョルゲ
ンセン（Jorgensen）,R.A.,ら，モレキュラー・アンド
・ジェネラル・ジェネチックス（Mol Gen Genet）（197
9）177:65〕の上に位置する。これらの２種類の酵素
は、実際に異る効率でG418を不活性化する能力を除いて
無関係である。APH−ＩはAPH−IIのほぼ４倍有効であ
る。G418の広範な種類の細胞に対する毒性にかんがみ
て、これらのいずれかのためのコード配列は、広範な種
類の宿主において使用される優性選択可能な候補遺伝標
識となる。APH−Ｉのためのコード配列は、事実、知ら
れており、そして前記酵素のための271アミノ酸配列が
それから推定された〔オカ（Oka）,A.,ら，ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J Mol Biol）
（1981）147:217〕。

事実、多数の研究者らは、バクテリア以外の宿主中で
これらの配列を発現させる系をクローニングした〔例え
ば、ホール（Hall）,C.V.,ら，ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・アンド・アプライド・ジェネティックス（J
Mol Appl Gen）（1983）2:101参照〕。サウザーン（Sou
thern）,P.J.,ら，ジャーナル・オブ・モレキュラー・
アンド・アプライド・ジェネティックス（J Mol Appl G
enetics）（1982）1:327は、多分SV 40ウイルスプロモ
ーターの制御のもとにAPH−IIのためのコード配列を含
有するベクターで形質転換された哺乳動物がG418に対す
る耐性を獲得したことを示した。コルベレーガラピン
（Colbere Garapin）,F.ら，ジャーナル・オブ・バイオ
ロジー（J Mol Biol）（1981）150:1は、tk^-中およびサ
ルおよびヒト細胞系中でのAPH−IIコード配列の発現を
開示した。形質転換に使用されたベクターは、多分発現
レベルを実行するための位置に、TKプロモーターを含有
した。しかしながら、tk^-細胞を宿主として使用したと
き（正常細胞を使用したときではないが）バクテリアの
プロモーターも保持され、形質転換の効率は非−tk^-細
胞においてきわめて低かった。

ジメネズ（Jimenez）,A.,ら，ネイチャー（Nature）
（1980）287:869は、多分Col EIまたはこの酵素のコー
ドセグメントのいずれかについて固有の配列の制御のも
とで、LEU2遺伝標識を含有するpYE13と所望のAPH−Ｉ遺
伝子配列を有するコリシンEI誘導体プラスミドとの混合
物で、Leu^-宿主サッカロミセス・セレビサエ（Saccharo
myced cerevisae）を同時形質転換することにより、多
分酵母菌中でAPH−Ｉ遺伝子の多少の発見を達成した。
発現はLeu⁺についての選択の後にはじめて示された。こ
うして、ジミネス（Jiminez）はAPH−Ｉ遺伝子を選択手
段として利用する方法を開示しなかった。規準としてG4
18耐性を用いて選択がなされ得たか否かは明らかでな
い。酵母プロモーターの制御のもとにコード配列を配置
する努力は、ジメネズ（Jimenez）によってなされなか
った。こうして、遺伝子の発現レベルは選択圧力に対し
て有効な量の蛋白質を提供するために十分であったと思
われない（G418耐性を示す選択された培養物の能力と対
して）。

フレイレイ（Fraley）,R.T.,ら，プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc Natl Acad Sci）（USA）（1982）：80:4803は、
植物を感染できるバクテリアに由来するプロモーターの
制御のもとにあるAPH−Ｉ遺伝子からやはり植物中で活
性な３′非翻訳停止配列で終るコード配列を利用するこ
とを記載している。多分、このような制御のもとで、こ
の酵素について、およびまた関連するAPH−II類似体に
ついて、この遺伝子の発現はペチュニア細胞中で達成さ
れた。最後に、1983年１月６日に発行された英国特許出
願GB2100738Aは、APH−Ｉをコードする遺伝子と、SV40
プロモーターの制御下にハイグロマイシンＢに対する耐
性を付与する蛋白質をコードする遺伝子とを開示してい
る。発現は、酵母と哺乳動物であるマウスLtk^-細胞との
両者において達成された。

ウエブスター（Webster）,T.D.,ら、ジーン（Gene）
（1983）26:243は、天然APH−Ｉを、実験室酵母菌株に
おいて、形質転換から18時間後に使用可能な選択遺伝標
識として使用することを開示している。

上の場合のすべてにおいて、所望のG418耐性遺伝子の
ためのコード配列の前には、天然ATG出発コドンと制御
配列との間の制御されない数のヌクレオチドが存在しそ
して、事実、このような制御配列に関する操作を可能と
しうる最も近い上流の便利な制限部位が存在した。結
局、この先行する配列における種々のリーディングレー
ム中のATGコドンおよびTGA,TAAまたはTAG停止コドの不
規則な存在は、所望の配列の正確な再現可能な翻訳を妨
害する。本発明の選択可能なG418耐性遺伝子は、これら
の問題を克服するように修飾されかつ截断され、そして
また融合フラッグとして適合する。

選択および発現の同時的評価 所望のペプチドをコードする配列は、好ましくは最適
なレベルで所望の発現を行う配置において、形質転換さ
れた宿主と適合性である制御配列をもたなくてはならな
いので、このような配置の作用可能性を正確に測り、そ
して好結果の形質転換体を選択する手段に接近すること
がまた非常に望ましい。これらの可能性は別々に得ら
れ、１つの例外lacZ融合フラッグを除いて、組み合わせ
で得ることはできない。しかしながら、lacZ融合フラッ
グはlacY⁺，lacZ^-宿主においてのみ効果のこのような組
み合わせを提供するように機能することができる。この
要件は、それらの持続可能性に関するそれらの有用性
を、もっぱら非常に狭い範囲のバクテリア宿主に限定す
る。

この限定された範囲のもの以外の好結果に安定に形質
転換された宿主のための優性選択可能な遺伝標識とし
て、同時に機能する容易にアッセイできる「フラッグ」
を提供することは非常に望ましいであろう。このような
フラッグは、所望の配列へ融合した場合、所望の細胞を
選択し、かつその中での所望配列の生産についての制御
配列の活性を評価することが同時に可能であろう。ま
た、フラッグが基質について高い親和性をもつ酵素をコ
ードするとき、それは融合タンパク質配列の精製のため
のすぐれた手段を提供するという追加の利点をもつ。

１つの好結果をもたらす、この分野でよく知られてい
る融合フラッグはlacZ融合体である。ベーターガラクト
シダーゼのアミノ末端部分は酵素活性に必須ではないこ
とが長い間知られている。〔例えば、ミラー（Mille
r）,J.H.,ら、ジ・オペロン（The Operon）（1980）コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー,245ペー
ジ参照〕。さらに、入手可能な便利なインデケーター培
地、例えば、加水分解されると、青色の色素を生成する
ベーターガラクトシダーゼの基質である５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−ベーターＤ−ガラクトシド
（Ｘ−gal）を含有する培地が存在する。こうして、酵
素活性は培地上の青色コロニーの存在により検出するこ
とができ（ある場合において）あるいは抽出により生成
された青色の濃度により定量的に評価することができ
る。この融合フラッグはバクテリア、酵母〔グアレンテ
（Guarente）,L.メソッド・オブ・エンジモロジー（Met
h Enzymol．）（1983）101,181ページ；ローズ（Ros
e）,M.,ら、（同上）167ページ〕、および哺乳動物の細
胞〔ホール（Hall）,C.V.,ら、上を参照〕における発現
の研究に広く使用されてきている。事実、この方法はマ
ニアチス（Maniatis）,T.らのスタンダード・モレキュ
ラー・ラボラトリー・マニュアル（コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリーズ，（1982）431ページ）
において示唆されている。

lacZ融合物を所望の発現についての診断に用いるとき
の困難は、ほとんどの細胞内で優性選択可能なマーカー
として同時に挙動できないことにある。ある種の限定さ
れた条件下でのみ、この機能は発揮されうる。ラクトー
スを加水分解できる細胞のみ、すなわちlacZ遺伝子を発
現できる細胞のみが生存しうるように、炭素源としてラ
クトースのみを含有する培地を用いることにより、選択
が機能する。これは宿主細胞がlacZであるときにのみ、
形質転換体の選択を提供する。事実、lacZ^-であるバク
テリア（これはハプロイドである）を得ることは容易で
あり、そしてこれは原核生物における使用のためにこの
融合フラッグがよく用いられていることを説明してい
る。細胞はまたラクトースを取り込むこともできなくて
はならず、これはある種のグラム陰性バクテリア、とく
にE.coli中のlacY遺伝子によりコードされる追加の酵素
を必要とする。この酵素およびそれを暗号化する配列
は、真核生物の細胞およびストレプトマイセス（Strept
omyces）のある種の株のような他のバクテリアにおいて
欠損している。通常ラクトースを代謝することができる
ハプロイド細胞のlacZ遺伝子の発現能力を破壊すること
は簡単であるが、他のバクテリア株においてさえこの遺
伝子を欠損する細胞にlacY⁺突然変異を与えることは困
難でまたは不可能である。したがって、そうでなければ
宿主として使用できるほとんどの細胞について、lacZ融
合を優性選択可能な遺伝標識として使用することはでき
ない。なぜなら、パーミアーゼを欠損する首尾よく形質
転換された細胞でさえ、ラクトース含有培地上で生長で
きないであろう。

さらに、lacZ融合フラッグは精製における使用のため
の他の酵素活性よりも適合性に劣る。アフィニティーク
ロマトグラフィーにおいてこの融合を使用する他の技術
は知られている〔スティーアズ（Steers）ら、メソッド
・イン・エンジモロジー（Meth Enz）34:350）が、酵素
へ結合するが、加水分解されない競争的基質（Competit
ive substrate）を必要とする。この酵素のための通常
の基質はラクトースおよび水のみであり、それゆえ、ラ
クトースを含有するアフィニティーカラムにβ−gal蛋
白質が緊密に結合し、次いで後に解放される条件を見い
出すことは困難である。追加の基質（水）を差し控え、
こうしてカラム上の結合部分の破壊を防止するための便
利な方法は存在しない。また、このタンパク質の大きさ
は大きく（本発明を例示する実質的に小さい261アミノ
酸mtAPH−Ｉ配列に比較して1015〜1020アミノ酸残
基）、この方法におけるその使用は比較的めんどうであ
る。

カスター（Kaster）,K.R.,ら、ニュクレイック・アシ
ズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）11:6895は、
ハイグロマイシンＢ（Hm）をコードする配列を融合フラ
ッグとして使用して、形質転換されたE.coli中のlacプ
ロモーター／オペレーターの調節を評価することを試み
た。ハイグロマイシンＢは、前述のように、真核生物を
包含する多くの宿主細胞に対して毒性の抗生物質を破壊
するので、広いスペクトルの宿主細胞において優性選択
可能な遺伝標識として多分使用できるであろう。このカ
スターの参考文献が示すように、laZ配列の５′部分に
結合したハイグロマイシンＢ配列はIPTG（lacプロモー
ターの標準的誘導物質）の不存在よりもその存在におい
てより高いプレート効率を示す。しかしながら、このよ
うな結果の意味は不明瞭である。なぜなら、IPTGの存在
下で増殖したときでさえ、この抗生物質の存在で100％
のプレート効率を有する前もって選択された細胞は0.1
％以下の平板効率を与えたからである。事実、ただ１種
の特殊化された構成が、バクテリア宿主中においてさえ
Hm^Rの選択可能な標識の能力を使用することができた。
さらに、ある融合蛋白質が合成されたという証拠は提供
されなかった。

本発明は、前述のG418付与性を付与する遺伝標識を使
用して、lacZ様の優性選択可能な融合フラッグの便利さ
および利用を広いスペクトルの宿主細胞に拡張し、所望
の融合配列のための精製手段を提供するという追加の利
点を達成する。

制御配列 本発明の主要な選択可能な遺伝標識は、また、高度に
効率よい温度感受性制御カセットを得るための有用な手
段を提供した。このカセットもまた本発明一部分を形成
する。

制御配列は、タンパク質をコードする配列に先行する
ようにプラスミド間を任意に移動することができるポー
タブルカセットとして便利に提供される。このようなポ
ータブル配列は、事実、この分野において知られてい
る。例えば、trpプロモータ／オペレータ系（そのリボ
ソーム結合部位およびいくつかのリーダー配列コドンを
含む）は詳述されている〔ゲッデル（Geddel）ら、ヌク
レイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids Res）（1
980）8:40 57〕。

しかしながら、ポータブルな系の便利さに加えて、制
御系は外部のパラメーターの制御により調節可能である
ことがまた要求される。内生でない蛋白質の生産にバク
テリア宿主がしばしば必要とされるので、培養物の増殖
期間中のこれらの蛋白質の早期の生産は宿主細胞の健康
に悪影響を及ぼすことがある。健康的増殖ならびにすぐ
れた定量的蛋白質の生産を得るためには、培養物の増殖
期間に所望の遺伝子の発現を抑制すること、および次い
で増殖期が実質的に完結した後、発現を可能とすること
が必要であろう。

現在入手可能なポータブルプロモーター系は、このよ
うな制御に従うが、その達成される程度が不完全であ
る。例えば、前述のtrpプロモーターは培地中のトリプ
トファンの存在または不存在に応答して調節される。こ
のプロモーターはトリプトファンの不存在下でターンオ
フされるが、その存在において抑制される。しかしなが
ら、このようなプロモーターを用いて完全な「オン」ま
たは「オフ」の位置は達成されない。ほとんどのバクテ
リアについて、固有のリプレッサー遺伝子は、細胞内の
多コピーのプラスミド上に存在する所望のいっそう高い
レベルのプロモーターコード配列構成体と完全に相互作
用するために十分なリプレッサーを提供しない。逆に、
合成しようとする多くの蛋白質はそれら自体トリプトフ
ァンを含有するので、それらを生産すべきとき、培地か
らトリプトファンを完全に欠失させることは不可能であ
る。トリプトファンのレベルを十分に変化させるために
培地の交換がしばしば必要とされるので、おおよその制
御でさえめんどうである。

しかしながら、λファージプロモーター、P_L、はいっ
そう繊細に調整されかつ便利に制御される。なぜなら、
そのオペレーター配列に結合するリプレッサーは温度感
受性であることができるからである。P_Lオペレーターは
低温においてリプレッサー蛋白質、例えば、適当な突然
変異体宿主細胞により合成されるCI857により抑制され
る。しかしながら、高温において、このリプレッサー蛋
白質は失活され、そしてプロモーターはオンにスイッチ
ングされる。こうして、培養物の温度を単に上昇させる
ことにより、所望のタンパク質配列の合成をオンにする
ことができる。P_Lプロモーターは、その自然の環境にお
いて、なかでも翻訳がN_RBSリポソーム結合部位により制
御される「Ｎ−遺伝子」蛋白質を合成するようにはたら
く。ファージにおいて、Ｎ−遺伝子はP_Lプロモーターの
制御のもとでポリシストロンのメッセージ中の最初のコ
ード配列である。P_Lプロモーター単独、およびN_RBS（こ
れは機能的に利用されない）をもつ配列上のP_Lプロモー
ターは、事実、バクテリア系中でE.コリ（E.coli）また
は外来性蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御するた
めに従来使用されてきた。シマタケら、ネイチャー（Na
ture）（1981）292:128;レイマウト（Remaut）,E.,ら、
ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids Re
s）（1983）11:4677;レマウト,E,ら、ジーン（Gene）
（1983）22:103参照。しかしながら、この制御系は、１
つの発現ベクターから他への移動を容易に行うことがで
きる転置容易なセグメント中にパッケージされてきてい
ない。事実、E.コリ（E.coli）ラムダファージ中のN_RBS
配列の位置、それゆえ開示された配列の組成の開示は全
体として誤りであった〔シェラー（Scherer）,G.F.E.,
ら、ヌクレイック、アシズ、リサーチ（Nucleic Acids
Res）〕（（1980）8:3895−3898〕。

選択可能なG418耐性遺伝標識を使用することにより、
繊細に調節可能なP_LN_RBS制御配列を適当なソースベクタ
ー中の便利に切り出されるセグメント中にパーケージ
し、こうしてそれをATG出発コドンの前にP_LN_RBS配列を
配置することにより使用でき、あるいはP_LN_RBSに、Ｎ−
末端平滑末端で終るコード配列上への結合のためそれに
平滑３′末端ATGをもたせることができる。

発明の開示 本発明は、出発コドンの直ぐ上流に便利な制限部位を
有するAPH−Ｉ（以後Kan遺伝子と呼ぶことがある）のた
めの截断（truncated）コード配列を提供する。この遺
伝標識のコード配列は、カセットとして使用することが
でき、そして所望の宿主生物中で有効であるプロモータ
ーおよび転写停止配列のような制御配列を含有するプラ
スミド中に組み込むことができる。こうして、このコー
ド配列は、キャリャーベクターから、酵母中での複製お
よび発現に適合するベクターの中へ、あるいは多数の他
の型の生物、例えば、原核生物、植物および哺乳動物の
細胞中の発現および複製に適合するものの中へ移し換え
ることができる。

このカセットを提供するとき、本発明は、また、所望
のペプチド配列のＣ末端へ接合する（conjugate）G418
耐性付与配列を含有する融合フラッグの蛋白質の造成を
可能とする。この所望の配列は特定の抗原成分を含有す
ることができ、あるいはその大きさのために細胞媒質中
で不安定であることがあり、融合タンパク質としてのそ
の合成はそれぞれ必要な免疫原性または安定性を提供す
るであろう。このような融合フラッグ蛋白質は追加の実
用性を有する:1）それらは所望のペプチドへ作用可能に
結合することのできる発現制御配列の有効性を評価する
ことができ、そして２）それらは精製のためのアフィニ
ティ認識配列として使用できる。

本発明の遺伝標識のカセットは、また、よりすぐれて
制御可能なポータブルな原核生物制御カセットの構成に
おける道具として使用された。

こうして、１つの面において、本発明は、修飾（modi
fied）截断Kan遺伝子をコードするDNA配列に関し、そし
てこのDNA配列は前記修飾截断Kan遺伝子のATG出発コド
ンより上流でありかつそれに近接する少なくとも１つの
カセット−ユニーク制限部位を有する。２つの好ましい
態様において、截断Kan遺伝子はそれぞれコドン２−９
および２−10を欠失しており、そして截断されていない
遺伝子配列のコドン位置184/185および102/103において
Hind IIIおよびXma I部位を破壊するように修飾されて
いる。こうして、本発明のこの観点は、種々の用途に適
合させうる修飾され截断されたKan遺伝子（mtkanまたは
mtAPH−Ｉ）を提供する。

mtAPH−Ｉカセットは、また、形質転換された細胞の
選択および所望の発現系の新しい環境における性能の円
滑な診断の両者を可能とする、優性選択可能な融合フラ
ッグを構成するために使用される。融合フラッグは１工
程方法を提供し、この方法により、限定された群のグラ
ム陰性宿主へlacZの融合によりそのように便利に提供さ
れる選択および定量が、必要なラクトースパーミアーゼ
を欠損する他のバクテリア系に、および一般に真核生物
の細胞に拡張される。所望のコード配列の効率よい発現
のために有効な宿主細胞の選択は、E.コリ（E.coli）お
よびある種の他のバクテリアのパーミアーゼ含有株の限
定された領域を越えて拡張され、哺乳動物の細胞、酵母
細胞、植物細胞および他の型のバクテリア、例えば、抗
生物質およびアミノ酸の生産に広く使用されているスト
レプトマイセス（Streptomyces）属の株を包含するよう
にすることができる。

こうして、他の面において、本発明は、ラクトースパ
ーミアーゼ欠損（lacY^-）細胞中で優性選択可能遺伝子
として機能することができ、かつ定量可能な酵素活性を
有する融合タンパク質に関する。（もちろん、それはla
cY⁺細胞中で同じようによく機能することができる。）l
acY^-細胞は、前節において記載した前記の他の宿主のす
べてを包含する。酵素活性は、生産される生物学的に活
性な蛋白質の量を評価する手段を提供する。

mtAPH−Ｉカセットは、また、よりすぐれた原核生物
の制御カセットを構成する方法において、遺伝標識とし
て使用された。本発明のこの観点は、N_RBSの6bp下流内
に制限切離し部位を有するN_RBSに作用可能に結合したP_L
プロモーターからなるDNA配列に関し、そしてこの配列
を含有するベクターに関する。得られるベクターは、も
ちろん、制限切離し部位をもはや含有しないことができ
る。

さらに、N_RBSおよび出発コドンに作用可能に結合した
P_LプロモーターからなるDNA配列（この配列はATGの6bp
下流内に制限部位を有する）ならびにこの配列を含有す
るベクターは、本発明の一部である。ここで再び、ベク
ター内に制限部位は存在しないことができる。

他の面において、本発明は、特定の宿主に適する制御
配列に作用可能に結合した本発明の修飾され截断された
Kan遺伝子カセットを含有する、クローニングおよび発
現ベクターに関する。このようなベクターは所望のペプ
チドのための発現配列を含むこともできる。効果的に発
現されうるmtAPH−Ｉの存在は、こうして所望の蛋白質
を提供できる細胞のための選択道具を提供する役目をす
る。本発明の他のベクターにおいて、所望の蛋白質をコ
ードするDNA配列は、修飾截断Kan遺伝子のコード配列と
リーディングフレームを合わせて配置され、そして適当
な制御配列に作用可能に結合されているので、これらの
配列の発現は選択可能な融合フラッグをもたらす。

他の観点は、前述のベクターにより形質転換された宿
主細胞、これらのベクターから誘導された形質転換体の
新規な蛋白質生成物、並びにこのようなベクター、形質
転換体および融合蛋白質を得る方法に関する。なお他の
観点において、本発明は、mtKan遺伝子カセットを原核
生物および真核生物の両者の細胞中で優性選択可能な遺
伝標識として使用すること、および生産された融合蛋白
質を、所望の含有されるペプチド配列の安定化または精
製のための道具として、所望配列に免疫原性を付与する
ために、あるいは優性選択可能な融合フラッグとして使
用することに関する。

図面の簡単な説明 第１図はpMCK4.1及びpMCK1.4の造成を示す。

第２図はpFC19の造成を示す。

第３図はpFC11の造成を示す。

第４図はpDG144の造成を示す。

第５図は、pNG56、pMCK4.1及びpMCK1.4中のKan遺伝子
の５′端コード配列、及び対応するＮ−末端アミノ酸配
列、並びにこれらのベクターによる形質転換によってE.
コリ（E.coli）に付与されるKan耐性のレベルを示す。

第６図は、pNG56、pMCK4.1及びpMCK1.4により形質転
換されそして³⁵S−メチオニンで標識されたE.コリ（E.c
oli）の蛋白質抽出物の２−Ｄ電気泳動分析の結果を示
す。

第７図はpDG148、PDG149及びpDG151の様子を模式的に
示す。

第８図は、種々のmtAPH−１発現プラスミドにより形
質転換された実験室酵母菌株のG418直接選択の結果を示
す。

第９図は、pDG149 mtAPH−１発現プラスミドにより形
質転換された工業用酵母菌株のG418直接選択の結果を示
す。

第10図は、³⁵S−メチオニンで標識された形質転換酵
母抽出物について行われた2Dゲル電気泳動のラジオオー
トグラフを示す。

第11図は、種々の融合蛋白質を含有する酵母抽出物の
一次元ウエスタン分析の結果を与える。

第12図はpFC54の造成を示す。

発明を実施する態様 A.定義 ここで使用するとき、「Kan遺伝子」（またはAPH−Ｉ
遺伝子）は、APH−Ｉの機能的特性を示すことのできる
蛋白質をコードするDNA配列を意味する。これらの機能
的特性は一連の抗生物質を不活性化することを包含し、
そしてAPH−Ｉはそれが示す活性のスペクトルによってA
PH−IIからおよびハイグロマイシンＢを不活性化する酵
素から区別されうる。こうして、ここにおける「Kan遺
伝子」は簡潔および便宜上の理由で名命されているが、
この遺伝子によってコードされる蛋白質は、関連する蛋
白質APH−IIよりもカナマイシンの不活性化における作
用がかなり劣る。しかしながら、それはその類似する対
応物が完全に不活性であるネオマイシンの不活性化にお
いて多少有効であり、そしてリビドマイシンの不活性化
においてかなりいっそう有効である。しかしながら、こ
の遺伝子によりコードされる蛋白質はAPH−II酵素より
もG418に対してほぼ４倍有効である。これは、真核生物
細胞を包含する広い範囲の細胞に対してG418が毒性であ
るので、とくに有利である。

「截断（truncated）Kan遺伝子」またはtAPH−Ｉは、
多少省略されたKan遺伝子のコード配列を意味する。一
般に、この用語は本発明が開示する截断された形態、す
なわち、「▽２−９」および「▽２−10」欠失に関して
用いられる。しかしながら、生ずる蛋白質の機能性を保
持する他の欠失も本発明の範囲内に含まれる。

「修飾（modified）Kan遺伝子」またはmAPH−Ｉ遺伝
子は、Kan遺伝子、あるいはその文脈において適当なら
ば、コードされるアミノ酸配列は同一にとどまるが遺伝
子内の制限部位のパターンを変更するように塩基配列が
変更されている截断Kan遺伝子を意味する。詳しくは、
それは遺伝子内の制限部位を排除するような修飾を意味
し、そして前記部位はそうでなければカセットユニーク
部位（下において定義する）の独特な性質を破壊する。

「修飾截断Kan遺伝子」またはmtAPH−Ｉは、前の２つ
の節において説明したように修飾されかつ截断されたKa
n遺伝子を意味する。

「カセットユニーク（cassette−unique）」制限部位
は、切り出されるべきDNA配列中にただ１つだけ現われ
る特異的エンドヌクレアーゼ消化のための部位を意味す
る。こうして、例えば、本発明に関連して、Kan遺伝子
のコード配列は、カセットを切り出しまたは操作するた
めに有効なものと同一である認識部位を除去するように
修飾される。

「近接する（proximal to）」は、所望のコード配列
のためのATG出発コドンに関してカセットユニーク制限
部位の位置を記載するために使用されるとき、この部位
と所望のATG出発コドンとの間に介在ATGコドンまたは停
止コドンの配列が存在しないような態様で、この部位が
ATG出発コドンに関して位置することを意味する。さら
に、それがプロモーター配列および、適用可能ならば、
前記部位の上流のリボソーム結合部位の配列への作用可
能な結合（下に定義する）を可能とするように、前記部
位は所望のATG出発コドンへ十分に接近していなくては
ならない。こうして、２の基準を満足しなくてはならな
い誤まった出発または停止のシグナルのいずれか欠損お
よび適当な発現ベクター中への再結合のとき、所望のコ
ード配列を発現させる合理的な間隔。もちろん、制限部
位はこのようなベクター中への結合のとき失なわれう
る。

「定量可能な酵素活性」は、反応過程が測定可能であ
る反応を触媒するその能力のために、定量的にアッセイ
できる蛋白質配列の能力を意味する。これは、原理的に
は、酵素を包含し、そして活性が次の手段によりアッセ
イされるのものを特に包含することを意図する。すなわ
ち、例えば、色を発生する基質を使用すること、放射標
識基質を分離容易な放射性生成物に転化すること、なら
びに変化するレベルの抗生物質に対する耐を付与する能
力によりアッセイされるものを使用すること。蛋白質を
定量する手段を利用できることは、よりめんどうな手
順、例えば、標識抗体との反応またはゲル上での正しい
分子量の着色濃度により量を測定する必要性を排除す
る。また、酵素活性に依存する方法によるアッセイは、
生産される蛋白質が生物学的に活性な形態であることを
保証する。期待する分子量に相互関係をもつ蛋白質の存
在を示す着色およびイムノアッセイは、そのような保証
をしない。

「優性選択可能遺伝標識（dominant selectable mark
er）」は、好結果の質転換体（successful transformen
t）を選択する（スクリーニングと反対に）ことのでき
る表現型特性を付与することを意味する。この特性は、
形質転換されない細胞の増殖を支持できない培地上の増
殖および再生産を可能とする。このような遺伝標識は陽
性または陰性の方法で機能することができる。すなわ
ち、特定の代謝物を利用することができ、あるいは増殖
阻害物質に対する耐性を付与することができる。例え
ば、lacZ遺伝子はlacY⁺細胞に唯一の炭素源としてのラ
クトース上で増殖できる能力を付与し、そしてTet^R遺伝
子はこれらの抗生物質の存在下で増殖する能力を付与す
る。

「LacZ」および「lacY」は、それらを発現する細胞に
それぞれ機能的なベーターガラクトシダーゼおよびラク
トースパーミアーゼ活性を付与する遺伝子またはその部
分を意味する。

「融合（fusion）」は、「所望のタンパク質部分」お
よび融合フラッグ部分を有するアミノ酸の又はヌクレオ
チドの中断されない配列を意味する。「融合フラッグ部
分（fusion flag portion）」は、優性選択可能遺伝子
標識として挙動する能力の性質および定量可能な酵素活
性を全体の配列へ付与する。こうして、それはさらに
「酵素／遺伝標識」部分と称することができる。一般
に、融合フラッグ部分を含んでなる配列は、宿主へ選択
可能な性質を付与する酵素、例えば、前述のアミノグリ
コシドホスホトランスフェラーゼの完全なあるいは部分
的な配列に相当する。

遺伝子中のヌクレオチド配列と蛋白質中の生ずるアミ
ノ酸配列との間に１対１の対応が存在するので、遺伝子
およびコードされた蛋白質の両者を説明するとき使用す
る用語はしばしば互換的に使用される。こうして「選択
可能遺伝子」、「融合」、「融合フラッグ」、「融合さ
れた配列」などは、文脈に依存して、ペプチドあるいは
遺伝子のいずれかに関する。

「P_LN_RBSカセット」は、N_RBSへ作用可能に結合したP_L
プロモーター配列を含有するDNA配列を意味し、前記カ
セットはP_Lプロモーター配列の上流およびN_RBS配列から
下流の制限部位によって境界をつけられている。上流の
制限部位の正確な位置は重要でないが、下流の部位の位
置は、作用可能な並置を可能にするように、ATG「出
発」コドンに対して十分に接近していなくてはならな
い。こうして、カセット全体が所望の蛋白質のためのAT
G出発コドンの機能可能な距離内に便利にそう入されう
るように、下流の制限部位はRBSの最後の塩基対の6bp内
での切離し（cleavage）を可能としなくてはならない。

「P_LN_RBS ATG−カセット」は、N_RBSコード配列とATG
出発コドンとに作用可能に結合したP_Lプロモーターを含
有するDNA配列を意味するこのカセットは、ATG出発コド
ンのＧの6bp3′内の切離しを可能にする下流の制限部位
を含有する。これは、所望のコード配列をもつリーディ
ングフレーム中への平滑末端カセットの便利な結合を可
能とする。

所定の位置の「¹n¹bp内の」切離しは、２本鎖の少な
くとも一方がそのように切離されることを必要とする。
知られているように、ほとんどの制限酵素はぎさぎざの
パターンの切離しを触媒し、１本鎖中の切離し部位は相
補的鎖中の切離し部位から2bpだけ分離されている。こ
この定義に適合させるためには、このような部位の１つ
のみが要求される「ｎ」bp内に存在することを必要とす
る。

本発明のカセットを含有するベクターは、前述の切離
し部位を含有するかあるいは含有しないことができる。
受容体ベクター中へのカセットの結合のためのプロトコ
ール（protocol）に依存して、この部位は欠失されてい
るかあるいは欠失されていないことができる。「N_RBS」
および「N_RBS対応配列（corresponding sequence）」、
または「リボソーム結合部位」および「リボソーム結合
部位対応配列」を、意図する態様がその文脈から明らか
となるとき、また互換的に使用する。こうして、N_RBSを
使用してDNAの部分を説明するとき、明らかに「N_RBS対
応配列」を意味する。

「IL−２」は、インターロイキン（interleukin）−
２と相同性の配列を有しかつその機能を有する蛋白質を
意味する。天然IL−２の正確な配列をもつ蛋白質、なら
びに活性を破壊しない配列の修飾を含有する配列が包含
される。以下の説明において、位置125にシスティンで
はなくむしろセリン残基を有する修飾体または「ムティ
ン（mutein）」を使用する。

「作用可能に結合した（operably linked）」は、そ
のように記載する成分が、互いに合対してそれらの意図
される態様でそれらが機能できるように、並置されてい
る構成を意味する。こうして、コード配列へ作用可能に
結合したプロモーターは、所望のコード配列の転写を行
うことができるプロモーターを意味する。

真核生物または他の細胞に「適する」または「適当で
ある」は、天然に存在する場合に特定の型の細胞におけ
るコード配列の発現を通常に制御するかあるいはそのよ
うにする場合に限界的以上に有効である制御配列を意味
する。例えば、真核生物に適するプロモーターは、実際
に、ウィルスのプロモーターであるSV40の早期（earl
y）プロモーターを包含する。しかしながら、ウィルス
のために機能する態様は、哺乳動物の細胞の機構を用い
てこのプロモーターにより転写を起こさせることであ
る。同様に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンセター
ゼプロモーターはそれが感染する真核植物細胞中で効果
的に機能する。種々の酵母のプロモーター、例えば、LE
U 2またはENO 1は、酵母中で蛋白質を発現させることが
見出され、それゆえ「酵母に適当」である。特定の制御
配列が宿主内の作用可能に結合した配列を首尾よく発現
する限りにおいて、このような配列はこの定義内に入る
と考えられるであろう。

「制御配列（control sequence）」は、特定の宿主に
関連してコード配列を発現させようとするすべてのもの
を意味する。原核生物および真核生物の両者の系におい
て、オペレーターの存在または不存在で、適当なプロモ
ーターが必要なことが明らかである。原核生物はさら
に、リボゾーム結合部位の存在を必要とする。真核細胞
は、有効な発現のために、遺伝子配列から転写されるmR
NAが核の中から外に輸送されそして翻訳されることを確
実にするために、ポリアデニル化シグナルを必要とする
と思われる。この過程の性質はよく理解されえないが、
ポリアデニル化シグナルを含むある種のターミネーター
配列が真核生物の宿主中の所望蛋白質の効果的な生産に
必要であることが知られている。適当な「シグナル」配
列は、ENO 1遺伝子からのENO 1 3′非翻訳領域、および
植物の細胞の宿主中で通常機能する、アグロバクテリウ
ム（Agrobacterium）プラスミドから得ることができる
ノパリンシンターゼ（nopaline synthase）配列を包含
する。

「ポリアデニル化シグナル（polyadenylation signa
l）」または「ターミネーター（terminator）」は、単
にこの特定の機能に限定されず、これらの配列において
要求されるものはなんでも包含することを意図する。こ
の定義は、ポリアデニル化シグナルに加えて関連する配
列が不明瞭である、この技術の知識現状において必要と
される。

「組み換え宿主細胞」は、組み換え技術により操作さ
れたDNA配列で形質転換された細胞を意味する。

「細胞」および「細胞培養物」は、文脈が許す場合に
おいて互換的に使用され、そしてこれらの用語は、言及
される特定の細胞の子孫を包含する。こうして、これら
の用語は分離された形態の細胞または培地中に分散され
た細胞および生きている細胞または死んだ細胞を包含す
る。こうして、これらの用語はもとの形質転換された細
胞の子孫を包含し、前記子孫は突然変異により親細胞と
異ることができる。

B.一般的説明 本発明の修飾截断Kan遺伝子カセットは、種々の関係
および構成で使用できる。その利点は、前述のように、
広範な種類の形質転換宿主における遺伝標識としての汎
用性、１つの発現ベクターから他への輸送性、およびＣ
−末端配列融合蛋白質としてそれを包含することまたは
適当な制御配列への作用可能な結合を可能とするための
近接５′制限カセット−ユニークエンドヌクレアーゼ認
識部位の設置である。こうして、それを次のように使用
できる： 1.それを種々の宿主細胞に適するプロモーター（および
／またはターミネーター）に、発現ベクターの部分とし
て、作用可能な結合において連結することができ、そし
て次に、アンピシリン耐性が普通に用いられている原核
生物の形質転換体中でそのように使用され得るのと同じ
意味において、広く適応する形質転換体の直接的選択の
ための優性選択可能遺伝標識として使用できる。このよ
うな発現ベクターは、例えば、pFC19およびpDG151を包
含し、ここでは遺伝子はtrpプロモーター系の制御下に
ある。これらは、また、他の発現配列の挿入のための制
限部位を含有し、こうして所望の蛋白質のためのコード
配列および制御配列をそれらの中に挿入することもで
き、そしてmtAPH−Ｉ遺伝子により付与される表現型の
性質を好結果の形質転換体のための選択可能遺伝標識と
して使用できる。これらのベクターは、ここに説明する
pP_LKanと同様に、原核生物の発現に適する。（pP_LKanは
また、本発明の制御カセットの調製における有用な道具
である。） 同様に、真核生物について、pDG148はSV40プロモータ
ーの制御下に修飾截断Kanカセット、および追加の発現
配列の挿入のための便利な部位を含有する。同様に、pD
G151::RSVはラウス肉種ウイルス「LTR」プロモーターを
含有する。プラスミドpDG149は、エノラーゼプロモータ
ーの制御下に修飾截断Kanカセットおよび酵母からのタ
ーミネーターを含有する。pDG150はpDG149のわずかに小
さい形態であり、ここで酵母エノラーゼプロモーター配
列に先行するバクテリア由来配列は欠失している。これ
らのプラスミド類およびそれらに似た他のものは、もち
ろん、単なる例示であり、そしてそれらは種々の宿主に
おける好結果の形質転換の単純指標（simple index）を
含有する主要発現ベクター（backbone expression vect
or）として使用することができ、次いで前記ベクターを
形質転換において使用して、これらのベクターについて
なされた挿入部中の適当な制御のもとにコードされた所
望の蛋白質配列を生成することができる。このように機
能するために、ベクターは宿主と適合性の複製開始点ま
たは複製のための他の手段（例えば、ゲノム中への組み
込み）、宿種に適する制御配列に作用可能に結合したmt
APH−Ｉ配列、およびmtAPH−Ｉ発現配列中に存在しない
少なくとも１つのユニーク制限部位を有するだけでよ
い。

2.截断Kan配列は、適当な発現配列がその５′末端の上
流に結合されるとき、融合フラッグとして使用できる。
それはそのATG出発コドンの直前に便利な制限部位を有
することができる（そして、事実、有している）ので、
このような融合蛋白質の構成は可能である。こうして、
例えば、プラスミド、pDG144およびpDG151は、例えばLE
U 2遺伝子（これはE.コリ（E.coli）および酵母の両者
中で発現されうる）の部分のための開始制御およびコー
ド配列のそう入を可能とし、そして酵素β−イソプロピ
ルマレートデヒドロゲナーゼをコードする制御配列〔LE
U2^-（酵母）およびlauB^-（E.coli）の宿主においてロイ
シン独立性とする〕と修飾截断Kan配列との間の融合を
生ずる。次いで、LEU 2遺伝子のための制御系における
変化の効果を、インジケーター（indicator）としてKan
遺伝子の発現を用いて研究することができる。なぜな
ら、G418耐性のレベルを融合されたペプチド配列をコー
ドする遺伝子の発現レベルの指標（index）として使用
できるからである。再び、これらの実施態様は単なる例
示である。宿主ベクターについての要件は、クローニン
グ（必ずしも所望ではない）宿主中においてmtAPH−
Ｉ、およびmtAPH−I ATG出発コドンの上流のそしてそれ
に近接するカセットユニーク制限部位を複製し、発現す
る能力である。これは融合タンパク質のための発現ベク
ターの構成を可能とし、ここで意図する宿主に適するＮ
−末端配列および５′制御配列はmtAPH−Ｉコード配列
にＣ−末端において結合される。真核生物の宿主につい
て、mtAPH−Ｉコドンから下流に３′制御配列を含める
ことはまた必要であることがありかつ多分望ましい。し
かしながら、これは現在明らかではない。生ずる融合タ
ンパク質の追加の利用は下の節３〜５において示唆され
ている。

「融合フラッグ」として使用するため、融合タンパク
質は重要な特性をもたなくてはならない：それは優性選
択可能遺伝標識として挙動しなくてはならず、そして酵
素アッセイにより定量可能でなくてはならない。追加の
アミノ酸配列へ融合したmtAPH−Ｉは真核生物の宿主細
胞にG418耐性を付与できる。こうして、mtAPH−Ｉ配列
はそれらのアッセイ可能な酵素活性を保持し（培地中に
存在するG418のレベルを増加することにより、存在する
酵素のレベルを容易にアッセイすることができる）そし
てG418の毒性に感受性の細胞中の優性選択可能遺伝標識
として挙動し、これによりそれは広い範囲の宿主におい
て適用可能となる。

（もちろん、他の適当な融合パートナー配列を使用す
ることもできる。例えば、ハイグロマイシンＢは真核細
胞を包含する広い範囲の細胞に対して毒性の抗生物質で
あり、そしてこの抗生物質を不活性化できるアミノグリ
コシドホスホトランスフェラーゼをコードする配列は広
い範囲の細胞において優性選択可能遺伝標識として挙動
することもできる。この同じ活性は蛋白質に定量可能な
酵素活性を付与する。真核生物ならびに原核生物にG418
耐性を付与することができる追加のAPH酵素は、Tn5に由
来するAPH−II（上を参照）である。他の例はEcoGPT遺
伝子を包含し、これは、真核生物の宿主中に形質転換さ
れたとき、マイコフェノール酸によるDNA合成のための
サルベージ経路の阻害を克服する能力を付与する。した
がって、正常のDNA合成の経路が遮断されるある種の選
択的培地（例えば、HAT培地）中でマイコフェノール酸
の存在下に増殖できない哺乳動物の宿主細胞は、マイコ
フェノール酸の存在下にこのような選択的培地中で増殖
できる能力によりEcoGPT形質転換体について選択するこ
とができる。発現するとき、選択を付与できる表現型特
性を宿主lacY−細胞に付与するDNA配列のいずれも使用
可能である。しかしながら、これらのうちで、野生型細
胞中で選択するように作動するものは、より広い適用可
能性をもつため、選択された欠損をもつ宿主細胞中での
み作動するものよりも好ましい。） 前述および他の特定した融合フラッグ部分のすべてに
ついて、配列（遺伝子または生ずるペプチド中の）を示
される酵素活性のタイプにより言及する。配列は活性が
保持される限り天然配列に正確に対応する必要はない。

酵素活性はこの分野において知られている手段により
アッセイできる。抗生物質耐性に関し、これは抗生物質
の種々のレベルにおいて増殖する細胞の能力により予備
的にアッセイすることができる。しかしながら、定量の
別のかつより直接的な手段が一般に使用可能である。例
えば、アミノグリコシド修飾酵素のアッセイ法の要約
は、ハース（Haas）,M.J.,ら、メソッズ・イン・エジモ
ロジー（Meth Enz）（1975）43:611により与えられてい
る。下に例示するmtAPH−Ｉ配列について、活性の評価
は、標識基質を利用しそして標識生産物の形成を測定す
ることによってなすことができる。APH−Ｉを生産する
細胞の抽出物を、適当な基質、例えば、ネオマイシン、
カナマイシン、リビドマイシン、またはG418および32P
−ATPとともにインキュベーションする。次いで、ATPか
ら抗生物質へのＰ−32の転移を、ホスホセルロースへ結
合した放射性ホスフェートの測定によりアッセイするこ
とができる。（ホスホセルロースは抗生物質に結合する
が、ATPに結合しない。）この方法は、抽出物または全
細胞に直接使用するとき、コールドATPの存在または細
胞抽出物中のATPaseの存在のため複雑化するが、この欠
点はセファロースまたは共有結合した抗生物質の基質を
含有する他の適当な支持体カラム、例えば、ネオマイシ
ン−セファロースカラム上へ抽出物を吸着することによ
り便利な方法で改善することができる。次いで32P−ATP
を、固定化されたネオマイシン／酵素複合体に加え、そ
して結合した放射性ネオマイシンのレベルを単にアッセ
イすることにより酵素活性のレベルを決定することがで
きる。あるいは、特異的に結合した酵素または融合タン
パク質をネオマイシンを含有する（例えば、0.3ミリモ
ル）を高いイオン強度の緩衝液（例えば、1.5モルのKCl
を含有する）で溶離し、引き続いて慣用法（ハース。
M.,J.上を参照）によりアッセイすることができる。別
のアプローチは標識付けしたカナマイシン、ネオマイシ
ンなどを準備し、そして標識付けされたホスホリル化基
質を測定することである。このアプローチの実施はこの
分野においてよく知られており、適当に標識付けされた
抗生物質が与えられ、そしてこのような基質が商業的に
入手できないためにのみ、現在不利である。

3.N−末端融合相手として、抗原配列のためのコドンを
使用することにより、免疫原性融合タンパク質が生じ、
こうして修飾截断Kan配列は形質転換体へ選択可能な特
性を付与しかつ付加された免疫原性を抗原に付与するは
たらきをすることができる。これはことに意味がある。
なぜなら、抗原決定因子は免疫原性でないしばしば非常
に短いアミノ酸配列である。このような免疫原性タンパ
ク質は、診断および治療（ワクチン接種）の目的にとく
に有用である。こうして、例えば、pLK11、17、pLK51、
57およびここに例示する他の融合タンパク質をコードす
るベクターに加えて、他のＮ−末端融合パートナーのた
めの制御およびコード配列を含有する別のベクター、例
えば、ウイルスコート蛋白質の抗原決定ペプチド部分を
この分野において知られている手段を用いて構成するこ
とができる。

4.本発明の修飾截断Kanカセットによりつくることがで
きる融合蛋白質は、また、種々の宿主中でＮ−末端とし
ての短かいポリペプチドのセグメントの安定化された形
態として生産することができる。

5.融合タンパク質は、ペプチドのmtAPH−Ｉ部分の特異
的アミノグリコシド結合能力を利用することにより、ア
ミノグリコシドアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製することができる。このような酵素基質の結合に
基づくアフィニティークロマトグラフィーの条件は、抗
原／抗体アフィニティー分離に関連する条件よりも、非
常におだやかにすることができ、こうしてそれを担体か
ら溶離するとき、所望の蛋白質の分解の危険を最小とす
ることができる。このアプローチは、mtAPH−Ｉ融合に
ついて、酵素的に触媒される反応に１種より多い基質が
必要なことを利用する。精製しようとする酵素をただ１
種の基質が結合されている担体を用いて混合物から吸着
させ、次いで追加または同一の基質を適用して酵素を解
放することによりそれを取り出すことができる。このア
プローチは「伝統的な」lacフラッグよりも本発明の融
合フラッグについて実際的である。なぜなら、ベーター
ガラクトシダーゼは基質としてラクトースおよび水を有
するからである。非水性媒質中でラクトースを用いて研
究することは困難であるので、第２基質（水）は自動的
に存在し、そしてラクトースが結合した固体の担体から
なるカラムは水性媒質からベーターガラクトシダーゼを
選択的に結合することができない。しかしながら、本発
明の融合物について、２種の非水性基質を必要とし、そ
して第２基質を使用してカラムから酵素を溶離できる。
こうして、結合した抗生物質、例えば、ネオマイシンま
たはカナマイシンを含有する担体、例えば、ポリアクリ
ルアミドまたはセファロースを使用して媒質からmtAPH
−Ｉを吸着することができる。酵素は、反応のための他
の基質、ATP、を供給することにより、あるいは高濃度
（例えば、0.3ミリモル）のネオマイシンで溶離するこ
とにより、特異的に溶離することができる。また、mtAP
H−Ｉは比較的小さいタンパク質（261アミノ酸）であり
かつその融合物は重層ゲルへの進入に抵抗しないので、
融合物の精製はいっそう容易である。

後に記載する特定の具体例は前記の用途に有用なベク
ターの造成を示す。pFC19は原核宿主中の調節系の診断
にとくに有用である。それはHind III部位から直ぐ下流
にかつATGコドンに近接して修飾截断Kan配列を含有す
る。Hind III部位は、EcoRI/Hind IIItrpプロモーター
／オペレーターカセットの３′末端でありそしてATG出
発コドンに近接する。（天然Kanコード配列は、Hind II
I部位をコドン184/184において破壊するように修飾され
る。）こうして、修飾截断Kan遺伝子配列の発現を用い
て、trpカセットのための置換制御系の力を示すことが
できる。

pDG144は本発明の修飾截断Kanカセットのための多能
な手入源を提供する。V2−10截断Kanコード配列のATG出
発コドンの５′の直ぐ近くのDNA配列中に、便利なHind
III、BamH I、Sma I、およびEcoRIの切断部位が存在す
る。天然コード配列中のHind III（コドン184/185）お
よびSma I（コドン102/103）部位は破壊されている。こ
うして、プロモーターに加えて、種々の３′制限部位を
有する融合タンパク質のための所望のコード配列を、AT
G出発コドンの先行させてリーディングフレーム中に配
置することができる。

pDG148およびpDG151::RSVは、哺乳動物複製開始点（S
V40から）、およびSV40またはRSV由来の転写制御配列を
含有するベクター中への修飾截断Kanカセットのそう入
を例示する。追加の真核生物のプロモーターの制御下に
所望のコード配列を配置し、そしてpDG148またはpDG15
1::RSVプラスミド中のどこかにパッケージ（package）
をそう入することにより、pDG148またはpDG151::RSVを
優性選択可能遺伝標識を含有する適当な主要断片として
使用できる。また、プロモーターとそれ自身のプロモー
ターをもつあるいはもたない截断修飾Kan遺伝子のATGコ
ドンとの間の便利なカセットユニークHind III部位中に
所望の蛋白質コード配列を挿入することにより、所望の
蛋白質配列を融合蛋白質として真核生物の細胞内で生産
することができ、そして融合フラッグとしてKan遺伝子
を使用することにより、配列の成功した発現を検出でき
る。いずれの場合においても、細胞を増殖させる培地中
のG418の濃度を増加させることにより、Kan遺伝子生産
物の生産にとくに有効であり、それゆえ所望の蛋白質配
列の生成にとくに有効であるものを選択することができ
る。

pDG149およびpDG150は、酵母の形質転換にとくに適当
な類似の構成を例示する。これらのプラスミドはエノラ
ーゼＩプロモーターおよび停止配列の制御のもとに修飾
截断Kan配列を含有する。これらのプラスミド中の他の
制限部位の１つにおいて追加の酵母プロモーターの制御
下への所望のコード配列の挿入を用いて、培地中のG418
濃度の増加を利用して、成功した高いコピー数の形質転
換体についての選択の助けをかりて、所望の蛋白質を生
産することができる。

前述のプラスミドは、もちろん、原核生物の宿主に適
するベクターの単なる例示であり、そしてこのものは追
加の発現カセットまたはコード配列を受容し、原核生物
中での複製能力を提供し、そして優性選択可能標識の生
産を行う。類似のプラスミドは、例えば、MCK4、１から
のV2−10蛋白質をコードするmtAPH−Ｉカセットの構成
においてももちいた方法に正確に類似する方法で、MCK
1、４から構成されたV2−９蛋白質をコードするmtAPH−
Ｉカセット（下を参照）を使用することによって構成で
きる。

pDG151は、Ｃ末端にmtAPH−Ｉ配列を有する融合タン
パク質の構成にさらにいっそう便利であるpDG149の修飾
体である。mtAPH−Ｉ遺伝子５′に多数のカセットユニ
ーク部位を設けることにより、適当なプロモーターの制
御下の部分的または完全コード配列をmtAPH−Ｉコード
配列に融合して、カナマイシン/G418抵抗性融合フラッ
グを生成することができる。前記mtAPH−Ｉコード配列
には、pDG151においては、酵母中で作用可能なターミネ
ーターが設けられている。

さらに、ATGから直ぐ上流のカセットの挿入に適する
制限部位を含有するP_LN_RBSカセットのための便利な入手
源を提供する３種類のベクタープラスミドについて説明
する。他のプラスミドは、適切な部位を含有する他の宿
主プラスミドにカセットを移行させることにより容易に
構成できる。このような部位は宿主プラスミド中のその
中に通常存在する同一または匹敵する制限部位の位置に
おいて、あるいは新しく構成された匹敵する部位におい
てそう入することができ、前記部位は宿主プラスミドを
利用可能な部位において消化し、そして適当な商業的に
入手できるリンカー（linker）を挿入することにより操
作することができる。P_LN_RBS−ATGカセット、すなわ
ち、リボソーム結合部位に作用可能に結合したATG出発
コドンを含有するカセットを提供する追加のプラスミド
について説明する。このカセットのクローニングに適す
る他のプラスミドは、先行技術において知られている方
法に従い構成できる。

C.用いる方法 所望の配列のためのクローニングベクターおよび発現
ベクターは、後述する普通に用いられている制限処理お
よび結合手順に従い構成した。例示したものに類似する
追加のプラスミドもまた、この分野においてよく知られ
ているこれらの方法を用いて、別のレプリコン、ベクタ
ー断片、制御配列、コード配列、ポリリンカーおよび発
現カセットを利用することに構成できる。

一般に、DNAの有効量は、所望の断片をクローニング
し、すなわち、適当なクローニングビヒクル（vehicl
e）、例えば、pBR322中に挿入し、E.コリ（E.coli）中
で、形質転換および複製し、必要に応じて、クロラムフ
ェニコールによる増幅により増強する（enhance）かあ
るいはファージ複製を行うことによって増加させること
ができる。発現のため、次いで所望の断片をクローニン
グベクターまたはファージから取り出し、そして遺伝子
の発現において使用しようとする宿主と適合性の適当な
制御配列に結合する。次いでこのような宿主をこれらの
発現ベクターで形質転換し、そしてプラスミドの安定化
および所望の蛋白質の断片の安全な生産に好適な条件下
で培養する。このような条件は、対数期のほとんどが完
了するまでのプロモーターの発現の制御および引き続く
ペプチドの合成に好適であるような条件への変更を包含
する。

C.1制御配列および宿主 本発明の遺伝標識カセットおよび融合フラッグは、種
々の宿主中で利用することが意図されるので、プロモー
ターと適当な宿主細胞に適する他の要求される制御配列
とを含有する発現ベクター中に組み込まれる。原核生物
と適合し、かつこれらの宿主細胞中へのこのようなベク
ターの形質転換に適するベクターは、E.コリ（E.coli）
K12株、MM294あるいはある場合において、E.コリ（E.co
li）株MC1000のラムダ溶原株（lambda lysogen）の使用
に関して説明されかつ詳しく記載される。しかしなが
ら、他の微生物株、例えば、捍菌、例えば、バシルス・
スブチルス（Bacillus subtilis）、シュードモナス（P
seudomonas）の種々の種、または他のバクテリア株を使
用することもできる。このような原核生物系において、
複製部位および宿主細胞と適合性の種から誘導された制
御配列を含有するプラスミドベクターを使用する。例え
ば、E.コリ（E.coli）は、典型的には、ボリバー（Boli
var）ら、ジーン（Gene）（1972）2:95によりE.コリ
（E.coli）から誘導されたプラスミドであるpBR322の誘
導体を用いて形質転換される。pBR322はアンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有し、こ
うして追加の遺伝標識を提供し、これらの遺伝標識は所
望のベクターを構成するとき保持されうるかあるいは破
壊されうる。ここにおいて転写開始、必要に応じてオペ
レーター、ならびにリボソーム結合部位を含むと定義さ
れる、普通に使用される原核生物の制御部位は、次のも
のを包含する：普通に使用されているプロモーター、例
えば、ベーターラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）および
ラクトース（lac）プロモーター系〔チャング（Chang）
ら、ネイチャー（Nature）（1977）198:1056〕およびト
リプトファン（trp）プロモーター系〔ゲッデル（Goedd
el）ら、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Ac
ids Res）（1980）8:4057〕およびラムダ由来P_Lプロモ
ーターおよびＮ−遺伝子ソボソーム結合部位〔シマタケ
ら、ネイチャー（Nature）（1981）292:128〕（これは
本出願人に係る1984年２月８日提出の同時係属出願第57
8,133号に記載されるように、移動可能な制御カセット
として有用とされた）。しかしながら、原核生物と適合
性の任意の入手可能なプロモーター系を使用できる。

バクテリアに加えて、真核生物の微生物、例えば、酵
母を宿主として使用できる。サッカロミセス・セレビシ
アエ（Saccharmyces cerevisiae）の実験用株、パン酵
母（Baker's yeast）が最も使用されるが、多数の他の
株が商業的に入手可能である。２ミクロン複製開始点を
用いるベクターが例示されている〔ブローチ（Broac
h）,J.R.,メソッド・イン・エンジモロジー（Meth.En
z.）（1983）101:307〕が、酵母菌の発現に適する他の
プラスミドベクターが知られている〔例えば、スチンチ
コンブ（Stinchcomb）ら、ネイチャー（Nature）（197
9）282:39、チェンペ（Tschempe）ら、ジーン（Gene）
（1980）10:157およびクラーケ（Clarke）、L.ら、メソ
ッズ・イン・エンジモロジー（Meth.Enz.）（1983）10
1:300参照〕。酵母ベクターのための制御配列は、グリ
コース分解酵素の合成のためのプロモーターを包含する
〔ヘス（Hess）ら、ジャーナル・オブ・アドバンスド・
エンザイム・レギュレーション（J.Adv.Enzyme.Reg.）
（1968）7:149;ホランド（Holland）ら、バイオケミス
トリー（Biochemistry）（1978）17:4900〕。この分野
において知られている他のプロモーターは、次のものを
包含する:3−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロ
モーター〔ヒッセマン（Hitzeman）ら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）
（1980）255:2073〕、および他のグリコース分解酵素、
例えば、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒ
ドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキ
シラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−
ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートム
ターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホスフェートイ
ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグル
コキナーゼのためのプロモーター。増殖因子により制御
される転写の追加の利点を有する他のプロモーターは、
アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソサイトクローム
Ｃ、酸性ホスファターゼ、窒素の代謝に関連する分解酵
素、およびマルトースおよびガラクトースの利用に寄与
する酵素（ホランド、上を参照）のためのプロモーター
領域である。また、ターミネーター配列はコード配列の
３′末端において望ましいと信じられる。このようなタ
ーミネーターは、酵母由来遺伝子中のコード配列の後の
３′非翻訳領域中に見い出される。下の構成において、
エノラセル（enolasel）遺伝子の３′非翻訳領域を使用
する。このような配列の別の入手源はこの分野において
入手可能である。例示するベクターの多くは、エノラー
ゼ遺伝子含有プラスミドpeno46〔ホランド（Holland）,
M.J.ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J.Biol.Chem.）（1981）、又はpYE13から得られ
るLEU 2遺伝子〔ブローチ（Broach）,J.ら，ジーン（Ge
ne）（1979）8:121〕を含有するが、酵母適合性プロモ
ーター、複製開始点および他の制御配列を含有する他の
ベクターも適する。

また、多細胞生物から誘導される真核生物の宿主細胞
培養物中で、ポリペプチドをコードする遺伝子を発現す
ることは、もちろん、可能である。例えば、ティシュ・
カルチュアース（Tissue Cultures）アカデミック・プ
レス、クルズ（Cruz）およびパターソン（Patterson）
編（1973）参照。有用な宿主細胞系は、VEROおよびヒー
ラー（HeLa）細胞、およびチャイニーズ・ハムスターの
卵巣（CHO）細胞を包含する。このような細胞のための
発現ベクターは、通常、哺乳動物の細胞と適合性のプロ
モーターおよび制御配列、例えばシミアン（Simian）ウ
イルス40からの普通に使用される前期および後期のプロ
モーター〕フィアーズ（Fiers）ら，ネイチャー（Natur
e）（1978）273:113〕、またはポリオーマ、アデノウイ
ルス２、ウシ乳頭腫ウイルス、またはトリ肉種ウイルス
から誘導されたもののような他のウイルスプロモーター
を包含する。複製開始点は、必要に応じて、同様な入手
源から得られる。しかしながら、染色体中への組み込み
（integration）は真核生物におけるDNA複製の普通の機
構である。植物細胞は現在宿主としてまた入手可能であ
り、そして植物細胞と適合性の制御配列、例えば、ノパ
リンシンセターゼプロモーターおよびポリアデニル化シ
グナル配列〔デピッカー（Depicker）,A.ら，ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・アプライド・ジェネティック
ス（J.Mol.Sppl.Gen.）（1982）1:561〕が入手可能であ
る。

C.2形質転換 使用する宿主に依存して、そのような細胞に適当な標
準的技法に従い形質転換を実施する。コーヘン（Cohe
n）,S.N.プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Nath.Sead.Sci.)(U
SA)（1972）69:2110に記載されるような塩化カルシウム
を用いるカルシウム処理を、実質的な細胞壁のバリヤー
を含有する原核生物または他の細胞に使用する。アグロ
バクテリウム・ツメファシエンス（Agro-bacterium tum
efaciens）を用いる感染〔シャウ（Shaw）,C.H.ら，ジ
ーン（Gene）（1983）23:315〕をある種の植物細胞につ
いて使用する。このような細胞壁をもたない哺乳動物の
細胞について、グラハム（Graham）およびファン・デル
・エブ（van der Eb），バイロロジー（Virology）（19
78）52:546のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。酵母
中への転写は、バン・ゾリンゲン（Van Solingen）,P.
ら，ジャーナル・オブ・バクテリオジー（J.Bact.）（1
977）130:946およびシアオ（Hsiao）,C.L.ら，プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）（USA）（1979）7
9:3829の方法に従って実施する。簡単に述べると、YEPD
富培地（酵母エキス、ペプトンおよび４％のグルコー
ス）中で中期の対数期に増殖した酵母培養物を洗浄し、
そしてソルビトールホスフェート緩衝液中でチモリアー
ゼ（zymolyase）500（マイルス・ラボラトリー）でプロ
トプラスト（protoplast）化した。プロトプラストを洗
浄し、１モルのソルビールを含有する67％のYEPD中で室
温において１時間放置し、次いで平板培養し、そしてト
リス（Tris）−ソルビトール−塩化カルシウム緩衝液中
に２×10⁹プロトプラスト/mlに懸濁した。プロトプラス
トを100μｌの反応混合物中で形質転換のための10μｇ
のDNAと混合し、次いで1mlの44％のPEGを加え、そして
この混合物を室温において40分間放置した。

C.3G418耐性についての選択 直接的G418耐性選択のため、形質転換混合物の希釈物
を宿主に適当な栄養寒天ペトリ皿（酵母菌のための１モ
ルのソルビトールおよび３％の寒天を含有するYEPD）上
へピペットで移し、そして同じ栄養寒天（50℃）の13ml
で覆った。30℃において２〜６時間インキュベーション
した後、ペトリ皿を4mlの同様な培地（酵母菌のためのY
EPD（２％の寒天））およびG418で覆った。ペトリ皿上
の寒天の合計体積（30ml）についてのG418の濃度は100
〜250μg/mlであった。

C.4ベクターの構成 所望のコード配列および制御配列を含有する適当なベ
クターの構成は、この分野においてよく知られている標
準的な結合および制限処理技術を用いる。単離されたプ
ラスミド、DNA配列または合成されたオリゴヌクレオチ
ドを切離し、調製（tailor）し、そして望む形態に結合
する。

部位特異的なDNA切離しは、この分野において一般に
理解されている条件下で適当な制限酵素（または複数の
制限酵素）で処理することにより実施され、そしてこれ
らの詳細はこれらの商業的に入手可能な制限酵素の製造
業者によって特定されている。例えば、ニュー・イング
ランド・バイオラブス（New England Biolabs）の製品
のカタログを参照。一般に、約１μｇのプラスミドまた
はDNA配列を約20μｌの緩衝溶液中の１単位の酵素によ
り切離す。ここにおける実施例において、典型的には、
過剰の制限酵素を使用してDNA基質を完全に消化する。
約37℃における約１〜約２時間のインキュベーション時
間が有効であるが、種々の変更を行うことができる。各
インキュベーション後、蛋白質をフェノール／クロロホ
ルム抽出により取り出し、次いでエーテル抽出を行うこ
とができ、そして核酸を水性分画からのエタノールによ
る沈殿および引き続くセファデックス（Sephadex）Ｇ−
50スピン・カラム上の展開により回収する。必要に応じ
て、切離した断片のサイズ分離を標準的技法に従いポリ
アクリルアミドゲルまたはアガロースゲルのクロマトグ
ラフィーにより実施することができる。サイズ分離の一
般的説明は、メソッズ・イン・エンジモロジー（Method
s in Enzymology）（1980）65:499−560に記載されてい
る。

制限切離し断片は、E.コリ（E.coli）DNAポリメラー
ゼＩの大断片〔クレナウ（Klenow）〕で４種類のデオキ
シヌクレオチドトリホスフェート（dNTP）の存在下に、
50ミリモルのトリスpH7.6、50ミリモルのNaCl、６ミリ
モルのMgCl₂、６ミリモルのDTTおよび５〜10マイクロモ
ルのdNTP中で20〜25℃において約15〜25分のインキュベ
ーション時間を用いて処理することによって平滑末端化
することができる。クレナウ断片は５′接着末端（Stic
ky end）を満たすが、４種類のdNTPが存在してさえ、突
出する３′−本鎖をチューバック（chew back）する。
必要に応じて、接着末端の性質に依存する限界内で１種
のまたは選択された複数のdNTPを供給することによっ
て、選択的修復を行うことができる。クレナウで処理し
た後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エ
タノール沈殿させ、次いでセファデックスＧ−50スピン
・カラムで展開する。S1ヌクレアーゼを用いる適当な条
件下の処理は、一本鎖部分を加水分解させる。

合成オリゴヌクレオチドは、マッテウシ（Matteucc
i）らの方法〔ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサイアティー（J.Am.Chem.Sci.）（1981）103:31
85−3191〕のトリエステル法により調製される。アニー
リング前の、または標識付けのための一本鎖のキナーゼ
処理（Kinasing）は、過剰、例えば、ほぼ10単位のポリ
ヌクレオチドキナーゼを１ナノモルの基質に対して50ミ
リモルのトリス、pH7.6、10ミリモルのMgCl₂、５ミリモ
ルのジチオスレイトール、１〜２ミリモルのATP、1.7ピ
コモルのγ³²P ATP（2.9mCi/ミリモル）、0.1ミリモル
のスパーミジン、0.1ミリモルのEDTAの存在下に使用し
て達成される。

結合は15〜30 ｌの体積中で次の標準的条件および温
度を用いて実施する:20ミリモルのトリス−ClPh7.5、10
ミリモルのMgCl₂、10ミリモルのDTT、33μg/mlのBSA、1
0〜50ミリモルのNaCl;および０℃において40μモルのAT
P、0.01〜0.02〔ウェイス（Weiss）〕単位のT4 DNAリガ
ーゼ（「接着末端」の結合のため）あるいは14℃におい
て１ミリモルのATP0.3〜0.6（ウェイス）単位のT4 DNA
リガーゼ（“平滑末端”の結合のため）。分子間の「接
着末端」の結合は、通常33〜100μg/mlの合計DNA酵母
（５〜100ナノモルの合計の末端濃度）において実施さ
れる。分子間の平滑末端の結合（通常10〜30倍のモル過
剰のリンカーを用いる）は、１マイクロモルの合計末端
濃度で実施される。

「ベクター断片」を用いるベクターの構成において、
５′ホスフェートを除去しかつベクターの再結合を防止
するために、ベクター断片は普通バクテリアのアルカリ
性ホスファターゼ（BAP）で処理される。BAP消化はpH8
においてほぼ150ミリモルのトリス中で、Na⁺およびMg⁺
の存在下に、ベクターの１μｇにつき約１単位のBAPを
使用して、60℃において約１時間実施される。核酸の断
片を回収するために、調製物をフェノール／クロロホル
ムで抽出し、エタノール沈殿させ、そしてセファデック
スＧ−50スピン・カラムへの適用により脱塩する。ある
いは、望まない断片の追加の制限酵素の消化により、二
重消化されたベクターにおいて再結合を防止することが
できる。

C.5構成の証明 下に記載する構成において、プラスミドの構成の正し
い結合は、E.coliジェネティック・ストック・センター
（Genetic Stock Center）CGSC＃6135から得られるE.co
li株MM294を結合混合物で形質転換することによって確
認される。成功した形質転換体は、この分野において理
解されているように、アンピシリン、テトラサイクリン
または他の抗物質に対する耐性により、あるいはプラス
ミドの構成方法に依存して他の遺伝標識を用いて選択さ
れる。次いで、形質転換体からのプラスミドを、クロラ
ンフェニコール増幅〔クレウェル（Clewell）,D.B.,ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）
（1972）110:667〕後、クレウエル（Clewell）,D.B.
ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）（US
A）（1969）62:1159の方法に従い調製する。単離された
DNAは、サンガー（Sanger）,F.ら，プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サインシズ
（Proc Natl Acad Sci）（USA）75:5463〔さらにメッシ
ング（Messing）ら，ニュークレイック・アシズ・リサ
ーチ（Nucleic Acid Res）（1981）9:309に記載されて
いる〕のジデオキシ法により、あるいはマクサム（Maxa
m）ら，メソッズ・イン・インジモロジー（Methods in
Enzymology）（1980）65:499の方法により、制限処理に
より分析されそして／または配列決定（sepuencing）さ
れる。

C.6宿主 ここにおけるクローニングおよび発現において使用さ
れる宿主菌株は、次の通りである。

クローニングおよび配列決定のため、およびほとんど
のバクテリアのプスモーターの制御下での構成の発現の
ため、E.コリ（E.coli）株MM294（上を参照）、タルマ
ッジ（Talmadge）,K.ら，ジーン（Gene）（1980）12:23
5;メセルソン（Meselson）,M.ら，ネイチャー（Natur
e）（1968）217:1110を宿主として使用した。

しかしながら、発現が原核生物のP_Lプロモーターの制
御下にあるとき、発現宿主としてE.コリ（E.coli）株MC
1000ラムダN₇N₅₃cI857SusP₈₀を使用した（ATCC 39531、
1983年12月21日寄託）。この株を以後MC1000−39531と
呼ぶ。この株は、許容温度（30〜32℃）において活性で
ある、温度感受性CIリプレッサーをコードするラムダフ
ァージを含有する。非許容温度（36〜44℃）において、
リプレッサーは不活性であり、そしてP_Lプロモーターか
らの転写が進行しうる。高温においてファージは誘導不
可能であるということは、この株の他の特性である。

酵母中の発現は、LEU2^-、URA3^-、TRP1^-、HIS4^-であ
る、S173−6Bと表示されるS.セレビシエー（S.cerevisi
ae）の実験室用株を用いた。この株はカリフォルニア大
学（ディビス）のミジメ・ホランド（Midime Holland）
教授から入手できる。使用した工業用酵母菌S.セレビシ
エー（S.cerevisiae）株は、レッド・スター・ディスチ
ラーズ活性化乾燥酵母（Red Star distillers activate
d dry yeast）（カルフォルニア州オークランド所在の
レッド・スター・イースト・カンパニー）；英国バス
（Bath）所在のバス大学のアントニー・ロース（Anthon
y Rose）博士から入手できる株GB4722;およびCBS 6508
〔オランダ国、セントラール・ビューロウ・ブーア・シ
ンメル・カルチュアーズ（Central bureaw Voor Schimm
el cultures）を包含した。

C.7DNA取り込みの証明 酵母を用いる形質転換を、DNAの単離およびサウザー
・ブロット（Southern Blot）により所望の配列の取り
込み（uptake）および複製について試験した。DNAはシ
ャーマン（Shaman）,F.ら，メソッズ・イン・イースト
・ジェネティックス（Methods in Yeast Genetics）（1
979）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
の方法により単離する。簡単に述べると、適当な選択培
地（例えば、YEPDおよび150μg/mlのG418）中で後期の
対数期に増殖させた後、細胞を洗浄し、そして１モルの
ソルビトール、20ミリモルのEDTA中でチモリアーゼ5000
（マイルス・ラボラトリー）でプロトプラスト化した。
次いでプロトプラストを沈殿させ、0.15モルのNaCl、0.
1モルのEDTA中に懸濁させ、前消化したプロナーゼおよ
びSDSを加え、そしてプロトプラストを37℃で１〜３時
間インキュベーションした。この混合物を70℃に15分間
加熱し、氷上に置き、そして酢酸カリウムを0.5モルに
添加した。氷上で30分後、この混合物を遠心し、そして
生ずる上澄みをRNaseで処理し、そしてクロロホルムお
よびイソアミルアルコール（24:1）で抽出する。水相を
遠心し、生ずる上澄みをエタノールで沈殿させ、沈殿物
を洗浄し、再懸濁させ、そしてイソプロパノールでDNA
を沈殿させた。

サザーン・ブロット分析はサザーン（Southern），ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.
Biol.）98:503の方法に従い実施した。簡単に述べる
と、単離したDNAを１種または２種以上の制限エンドヌ
クレアーゼで完全消化し、そして分子量のマーカー（ma
rker）をもつアガロースゲル上に展開させた。DNA断片
を0.075モルのHClでその場で脱プリンし、0.5モルのNaO
H、1.5モルのNaCl中で変性し、そして１モルのトリス−
ClpH7.4、３モルのNaCl中で中和した。ゲル上のDNAを20
×SSC中で一夜拡散ブロッティング（diffusion blottin
g）させてニトロセルロースのフィルターに移した。次
いでフィルターを80℃において真空炉内で２時間ベーキ
ングした。

プローブによりハイブリダイズする前に、ニトロセル
ロースのフィルターを50％のホルムアミド、５×SSC、1
/20 P/Pi（P/Piは0.05モルのピロリン酸ナトリウム、0.
5モルのリン酸ナトリウム、一塩基性、0.5モルのリン酸
ナトリウム、二塩基性である）、0.1％のSDS、５×デン
ハルト（Denhardt's）（Denhardt'sは0.02％のBSA、0.0
2％フィコール、0.02％のPVPである）、および200μg/m
lの剪断変性担体（Sheared denature carrier）DNA中で
42℃において３時間ないし一夜前ハイブリダイゼーショ
ンした。

フィルターを10⁶cpmの（通常）³²P標識付けしたニッ
ク翻訳DNAプローブと50％のホルムアミド、５×SSC、1/
20 P/Pi、0.1％のSDS、２×デンハルトおよび100μg/ml
の剪断変性担体DNAの溶液中で42℃において18〜24時間
ハイブリダイズさせた。

ハイブリダイズさせたフィルターを２×SSC、0.1％の
SDS中で室温において３回洗浄し、乾燥させ、そしてＸ
線フィルムに露光した。

D.好ましい実施態様の詳細な説明 D.1trp制御下に修飾截断Kan遺伝子を含有するベクター
の構成−pFC19およびpFC19^* trp制御下にmtAPH−Ｉを含有するpFC19の構成を第２
図に示す。プラスミドpFC19を収容するE.コリ（E.col
i）K12株MM294は1983年12月22日にATCCに寄託され、そ
してATCC No.39551で表示された。

第２図に示すように、プラスミドpFC19は、trpプロモ
ーターを含有する５′Pst I/平滑−３′DNA断片、プラ
スミドMCK 4.1からのＮ−末端V2−10APH−Ｉコード配
列、および修飾Ｃ−末端APH−Ｉ配列を含有するプラス
ミドpFC15からの突然変異した５′−平滑Pst I−３′DN
A断片の結合生成物である。pFC19中のpFC15由来断片
は、部位特定突然変異を伴うKan遺伝子のためのコード
配列の大部分を含有し、前期突然変異はコード配列中に
存在するHind III部位を破壊するが、コドンの意味を保
持する。

プラスミドMCK 4.1およびpFC15の両者は、全Kan遺伝
子コード配列を含有するプラスミドであるpNG56から誘
導された。pNG56中のKanコード配列はコドン10/11にXho
I部位をもつことが示され、こうしてそれを使用する適
当な消化によりAPH−ＩのＣ−末端コドン11〜271を供給
できる。pFC15はpNG56から部位特定突然変異誘発により
誘導され、そして天然配列のコドン184/185に修飾を含
む。

pNG56の構成 プラスミドpNG56はpNG20の誘導体である〔グリンドレ
イ（Grindley）,N.D.F.ら，プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Pro.Ma
tl.Acad.Sci.）（USA）（1980）77:7176〕。pNG20はオ
カ,A.ら，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（J.Mol.Biol）（1981）147:217に開示されるTn 60
1からのAPH−１の3kb配列（すなわち、オカ配列のヌク
レオチド1701−3094）のカルボキシ末端部分および下流
の逆転反復（inverted repeat）のみをコードし、こう
してカナマイシンに対する耐を付与できない。

pNG56は全Kan遺伝子コード配列を含有するが、pNG20
と同様に、Tn 601中に存在するほぼ1.04kbの５′（上
流）逆転反復を欠いている。pNG56を得るために、pNG20
をCla I（これはTn 601配列の上流をニューク切断す
る）およびHind III（これはコード配列のコドン184/18
5において切る）で処理した。pNG23のTaq I/Xho Iおよ
びXho I/HindIIIの消化から生ずる適当な断片を単離し
〔グンドレイ（Grindley）,N.D.F.ら、上を参照〕そし
てこれらの２つの断片をベクターと共に３方結合（３−
way ligation）する（Cla IおよびTaq I接着末端は適合
性である）ことによって、所望の制御配列およびＮ−末
端コード配列を付加した。この結合混合物をMM294中に
形質転換させてAmp^R、Kan_Rについて選択し、そして正し
い構成を標準法により確認した。

pFC15の構成 pNG56をHind IIIで線状化し、そしてショートル（Sho
rtle）,D。ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.S
ci.）（USA）（1978）75:2170の手順に従い重亜硫酸ナ
トリウムで突然変異させた。重亜硫酸塩の除去後、突然
変異化したDNAを結合し（Hind IIIで再消化し）、そし
てE.coliK12株MM294の形質転換に使用した。Hind III認
識部位が欠損しているプラスミドについてKan^R形質転換
体をスクリーニングし、そして成功したプラスミド構成
体を精製のためE.coliMM294中に再び形質転換させた。K
an^R形質転換体を再び選択した。正しい構成を制限酵素
の分析および配列決定により明らかにした。コドン184/
185は次のように変化されていることが証明された： AAG CTT AAA CTT Lys Leu→ Lys Leu MCK 4.1の構成 trpプロモーター配列およびKan遺伝子の截断前端を提
供するために使用したMCK 4.1は、下の第１図に示すよ
うに、pNG56およびpDG141から構成した： pNG56をXho Iで完全消化し、すべての４つのdNTPの存
在下にPo Iエクレナウ断片で再修復し、そしてEcoR Iで
消化した。約5kbの大断片を単離した。それは上流の配
列とＯリーディングフレーム内に存在するように、平滑
末端をもつAPH−Ｉ′の最初の10コドン除外したすべて
についてのコード配列を含有する。

pDG141はATG出発コドンに作用可能に結合したtrpプロ
モーターおよびそれに続くSac I部位を収容する。それ
は1984年１月24日にATCCに寄託され、そして受託番号39
588を有する。

pDG141をSal Iで消化し、上のようにPol Iで処理し、そ
してEcoR Iで消化した。小さい116bpプロモーター／リ
ボソーム結合部位およびATG出発コドンの断片（これは
下流の配列とＯリーディングフレーム中に存在するよう
に平滑末端をもつ）を、アクリルアミドゲルの電気泳動
および電気溶離により精製した。

pNG56ベクター断片およびプロモーター含有pDG141誘
導断片を「接着末端」の条件下に約200μg/ml（1:1モル
比）で結合し、４倍に希釈し、そしてDNA断片を平滑末
端の条件下に結合した。この結合混合物を使用してE.co
liMM294を形質転換し、形質転換体はAmp^R（50g/ml）に
ついて選択し、そしてカナマイシン濃度を増加させて
（5,10および15μg/ml）スクリーニングした。プラスミ
ドDNAをAmp^R Kan^Rから単離し（10μg/mlより多い）そ
して制限酵素の消化およびDNA配列の分析により分析し
た。成功した構成（これをMCK 4.1と表示する）は、ユ
ニークHpa IのDNA断片、530bpのHind IIIのDNA断片、お
よび期待される変更されたRsa I消化パターンを生じ
た。

pFC19の完成 次いで、pFC15をXma Iで消化した後に同じ技法により
突然変異誘発させた。pFC15からのXma I消化し、突然変
異させた断片を、dCTP、dGTP、dATPの存在下にE.Coli D
NAポリメラーゼＩ（Pol I）、クレナウ断片で修復し、
次いで平滑末端（flush ended）をもつDNA断片をPst I
で消化し、濃縮した。

MCK 4.1断片を調製するため、pMCK 4.1をXma Iで消化
し、穏和な条件下（１μl S1/150ml反応、20℃,20分
間）でS1ヌクレアーゼにより処理し、そして断片をPst
Iで処理し、そして濃縮した。

pFC15およびMCK 4.1断片を1:1モル比で0.62モルの末
端を用いて40モルのATPの存在下に４℃で５時間結合
し、次いで１ミリモルのATPの存在下に14℃で一夜結合
した。この結合混合物をXho Iで消化して、pFC15のKan
プロモーター断片を不活性化、そしてMM294の形質転換
に使用した。コロニーをアンピシリン（50μg/ml）含有
培地中で選択した。Amp^Rにより濃縮された集団を希釈
し、Amp（50μg/ml）およびKan（20μg/ml）を含有する
培地中で増殖させ、そしてプラスミドDNAをAmp^R Kan^R
形質転換体から精製した。このプラスミド調製物をSma
Iで消化して非突然変異体を排除し、そしてE.coli株MM2
94中に再び形質転換させた。プラスミドDNAをKan^R Amp
^Rコロニーから単離し、そして正しい構成を制限分析お
よびDNA配列決定により確認した。所望の構成体をpFC19
と表示する。pFC19において、V2−10 tAPH−Ｉ配列のコ
ドン93/94におけるXma I/Sma I部位は突然変異化されて
いるので、コドン93/94は次のように変化した： CCC GGG CCT GGG Pro Gly→ Pro Gly。

上に記載する手順に従うが、MCK 4.1の代わりにD.1.
b.1において記載するように調製したMCK 1.4を使用し、
pFC19^*を調製する。pFC19^*は、mtAPH−Ｉが２〜10欠失
ではなく２〜９欠失を有する以外、すべての面において
pFC19と同一である。MCK 1.4は、それがコドン２〜10で
はなくコドン２〜９の欠失を効果的に含有する以外、MC
K 4.1に類似する。コドン10はpDG142により供給され
る。pDG142は、ATGの直ぐ下流にSan 3A部位および引き
続く、フレーム中に、TGTcysコドンを有する以外、pDG1
41に類似するプラスミドである。こうして、プラミドMC
K 1.4は、前述の手順に類似する手順に従うが、pDG141
からの116bpプロモーター/RBS/ATG断片の代わりに、単
離された119bpプロモーター/RBS/ATG TGT断片を用いて
得られた。前期119bp断片は、pDG142をSan 3Aで消化
し、S1ヌクレアーゼで処理し、そしてEcoR Iで再消化す
ることによって得られた。

プラスミドMCK 1.4は、制限酵素分析およびDNA配列決
定により、出発コドンに続く追加の3pb TGT配列を除外
して、プラスミドMCK 4.1と正確に同一であることが証
明された。こうして、MCK 1.4をMCK 4.1と正確に同じ方
法で使用して、V2−9 APH−Ｉ蛋白質をコードするプラ
スミドを得ることができた。

D.2 ５′ポリリンカー配列をもつmtAPH−Ｉベクターの
構成−pDG144およびpFC20 pDG144は、リンカー断片の直ぐ後にEcoRI、Sma I、Ba
mH IおよびHind III制限部位を含有する、修飾截断Kan
遺伝子V2−10のためのコード配列である。pFC20におい
て、このリンカーの前に、また、重複lacオペレータ
ー、このリンカーの逆転反復およびtrpプロモーターが
存在する。両者は、３′翻訳停止コドンに対して末梢
に、便利なStu I、Hae II、BssH II、Mst IおよびPvu I
I部位を含有する。

pDG144はpFC19からいくつかの工程において中間体とし
てpFC20を経て構成された（第４図参照）。pDG144は198
4年１月13日にATCCにATCC No.39579で寄託された。

pFC20の構成 pFC19をまずHpa Iで消化してtrpプロモーターを不活
性化させ、次いでPst IおよびHind IIIで消化した。pFC
11（下を参照）をPst IおよびHindIIIで消化して、trp
プロモーターおよび所望のlacオペレータ／リンカー断
片を遊離させた。これらの断片を接着末端条件下で結合
した（3:1のモル比）。結合したDNAをSac Iで消化して
望まない結合生成物を不活性化し、そしてこの混合物を
使用してE.coli MM294を形質転換させた。成功した形質
転換体をAmp^R、LacO⁺およびKan^Rについて選択し、そし
てプラスミドDNAを単離した。pFC20の正しい構成を制限
分析により確認した。pFC20は、第４図に示すように、t
rpプロモーターが下流に存在するmtAPH−I 5′Hind III
部位の前に所望のリンカー/lacオペレーターを含有す
る。

pFC20中のポリリンカー/lacO配列の源として使用し、
そして究極的にpDG144中のポリリンカー源として使用し
たpFC11は、pDG141（上を参照）から２工程において構
成した。第２工程は第３図に示されている。

まず、慣用手順により、すなわち、pDG141をCla Iで
処理し、クレナウで平滑末端とし、そして商用BamH Iリ
ンカーを平滑末端に結合することにより、trpプロモー
ターの３′末端におけるCla I部位をBamH I部位に転化
することによりpDG141を修飾した。生ずる結合混合物を
使用してMM294をAmp^Rに形質転換し、そしてBamH I部位
の存在は所望のpFC10中において明らかにされた。pFC10
（第３図）をBamH Iで消化し、BamH I消化pSYC111と結
合した。BamH I消化pSYC111は、所望の72bp断片をpBR32
2のBamH I部位にそう入することによって調製された4.4
kbベクターである。〔（この72bp断片は、配列:BamH
I、Sma I、EcoR I、lacO、EcoR I、lacO、EcoR I、Sma
I、BamH Iを有する。）〕。この結合混合物をPvu IIで
消化し、そしてMM294をAmp^R、LacO⁺に形質転換するため
に使用し、そしてTet^Sについてスクリーニングした。pF
C11の正しい構成は、制限酵素の分析により確証され
た。

pDC144の構成 pDC144を得るために、pFC20を第４図に示すように処
理した。pFC20をEcoR Iで完全消化し、結合し、そしてM
M294をlacO^- Kan^Sに形質転換させることによって、trp
プロモーターおよびlacオペレーターをpFC20から除去し
た。正しい構成のpDG144は、mtAPH−Ｉの５′ Hind III
部位のすぐ上流に、EcoR I、Sma IおよびBamH I部位を
有する22bpポリリンカーを含有する。

pDG144をHind IIIおよび、それぞれ、Stu I（dcm^-宿
主中でクローニングしたとき）Hae II、Mst IまたはPvu
IIで消化すると、1.03,1.08,1.15または1.21kbのV2−1
0Ken遺伝子の全コード配列を含有するDNA断片が生成す
る。

前述の手順を用いるが、pFC19の代わりにpFC19^*を使
用すると、ポリリンカー配列が先行するmtAPH−Ｉ（V2
−９）コード配列、pFC20^*およびpDG144^*を含有する対
応するプラスミドが調製される。

D.3真核生物の制御配列をもつmtAPH−Ｉを含有するベク
ター pDG148（SV40制御） 第７図にダイアグラムで示すpDG148は、SV40プロモー
ターの制御下に截断２−10Kan遺伝子を含有する。この
プラスミドは、真核細胞中のKan遺伝子の発現に適し、
そして優性選択可能な遺伝標識としてmtAPH−Ｉを提供
する真核生物の外来性遺伝子の発現のための宿主プラス
ミドとして適するベクターの例である。それはまた融合
フラッグのmtAPH−I C−末端配列を提供する宿主プラス
ミドとして使用できる。pDG148は原核生物〔例えば、E.
コリ（E.coli）〕および真核生物の細胞（例えば、酵母
およぶある種の哺乳動物の細胞系）の両者の宿主中で自
律的に複製するであろう。pDG148は1983年12月22日にAT
CCに寄託され、そして受託番号20695を与えられた。pDG
148中の配列（第７図参照）は次の通りである： 1.pDG148の最初の1.21kbからなる1.21kb断片は、pDG144
からのHind III/Pvu II修飾截断Kan遺伝子カセットであ
る。この配列は、前述のように、コドン93/94（截断遺
伝子の）で突然変異してXma I/Sma I認識部位を排除
し、そしてコドン175/176で突然変異してHind III認識
部位を破壊するが、コードされた蛋白質中に同一アミノ
酸配列を保持する。

2.SV40複製開始点、早期ウイルスプロモーターおよび転
写エンハンサー（transcriptional enhancer）を含有す
るSV40ウイルスプロモーター配列は、単離されたSV40 D
NAをHind IIIおよびPvu IIで消化し、そして平滑末端化
されたPvu II末端をニュー・イングランド・バイオラブ
スから入手したBamH Iリンカーに結合することによって
得る。これはコーディネイト（coordinate）1.21−1.56
を満たす。

3.コーディネイト1.56kb−1.83kbは、BamH IおよびSal
Iの２重消化および276bp断片の単離により得られるpBR3
22からの276bp DNA断片である。

4.酵母からのLEU 2遺伝子は、コーディネイト1.83kb−
4.05kbを満たす。これはpYE13〔ブローチ（Broach）,J
ら，ジーン（Gene）8:121〕からこのプラスミドをXho I
/Sal Iで二重消化することにより誘導される。

5.酵母菌の２ミクロンのプラスミドから誘導される酵母
複製開始点は、コーディネイト4.05kb−7.76kbを満た
す。それはpDB248〔ビーチ（Beach）,D.ら，ネイチャー
（Nature）290:140〕をEcoR I（修復）/Sal Iで消化
し、そしてレプリコンを含有する3.7kb DNA断片を単離
することにより得られる。適当なSal I部位の存在は、
ビーチの開示から推定されない。しかしながら、pDB248
は、ビーチの文献中に記載されるように、示されたLEU
2区域/2μPst Iテイリング部位から約50bp下流にSal I
部位を含有することが示された。

6.最後に、このプラスミドはE.コリ（E.coli）中で複製
することができ、そしてTth111 I（修復）およびEcoR I
で二重消化することによりpBR322から得られる2145bp D
NA断片を含めることによって、Amp耐性を付与すること
ができる。それは9.9kb pDG148のコーディネイト7.7kb
−9.9kbを満たす。

pDG149（エノラーゼ制御） 第７図にダイアグラムで示されるpDG149はpDG148に類
似するが、ただし截断Kan遺伝子（V2−10）はSV40プロ
モーターではなく、エノラーゼプロモーターおよびター
ミネーターの制御下にある。このプラスミドは酵母複製
配列、LEU 2遺伝子、およびAmp^RおよびpBR322から誘導
されるE.コリ（E.coli）複製開始点を保持する。pDG149
は1983年12月22日にATCCに受託され、そして受け入れ番
号20694を与えられた。pDG149のセグメントは次の通り
である： 1.コーディネイト０−1.54kbは、３′非翻訳ENO 1酵母
菌遺伝子ターミネーター配列を含有し、そしてpeno46
〔ホランド（Holland）,M.J.ら、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J Biol Chem）（1981）2
56:1385〕のHind III（修復/EcoR I消化から誘導され
る。得られるEcoR I部位はコーディネイト０に存在し、
そしてENO 1断片の平滑末端のセグメントは後述する修
飾截断Kan遺伝子に結合される。

2.コーディネイト1.54−2.75kbは、上のpDG148に関して
記載するように修飾された截断Kan遺伝子を含有し、そ
してまたHind IIIおよびPvu IIで消化したpDG144から得
られる。遺伝子の３′末端のPvu II部位をエノラーゼタ
ーミネーターのHind III、修復、平滑末端に結合し、こ
うして引き続く結合のためのユニークHind III部位（mt
APH−Ｉに対して５′）を残す。

3.コーディネイト2.75−5.80中に含有されるエノラーゼ
Ｉプロモーターは、Peno46の２種類の中間誘導体（ホラ
ンド,M.J.ら、上を参照）から得られた。最初の中間体
は、Hind IIIで消化し、E.コリ（E.coli）エキソヌクレ
アーゼIII、S1ヌクレアーゼで処理し、そしてニュー・
イングランド・バイオラブスから入手したSal Iリンカ
ーの挿入により得られた。得られる中間体ベクターをSa
l Iで処理し、クレナウで修復し、そしてニュー・イン
グランド・バイオラブスから入手したHind IIIリンカー
と結合した。この第２修飾は、Hind III部位をエノラー
ゼＩタンパク質のためのATG開始コドンの前に配置し
た。この第２中間誘導体プラスミドをXma IおよびHind
IIIで二重消化して3.05kb断片を生成し、この断片は1.7
6kbの酵母菌DNAを含有し、そしてまたコリシンE1タンパ
ク質の一部分をコードする1.29kbのCol E1プラスミドDN
Aを含有する。

4.コーディネイト5.80−5.91kbは112bpのtrp制御DNA断
片を含有し、このDNA断片はpFC11（前述）をEcoR Iで二
重消化し、クレナウで修復し、次いでXma Iで消化し、
そして５′コーディネイト（5.91kb）にE.コリ（EcoR
I）（平滑）および３′コーディネイト（5.8kb）にXma
Iを有する112bp断片を挿入することによって得られた。

5.pBR322のSph I（修復）とSa1 I認識部位との間にDNA
断片を含む90bp結合セグメントは、コーディネイト5.9
−6.0を満たす。

6.Xho I/Sal I断片として酵母から誘導されるLEU 2遺伝
子は、コーディネイト6.0−8.21を満たす。この断片
は、pDG148を構成するために用いたのと同じ方法で得ら
れた。

7.酵母のための２ミクロン複製開始点を含有する3.7kb
のDNA断片は、pDG 148について記載したようにしてpDB2
48から誘導され、そしてコーディネイト8.21−11.93を
満たす。

8.コーディネイト11.93−14.07kbを満たすE.コリ（E.co
li）複製開始点およびAmp^R遺伝子は、前述のようにTth1
11 I（修復）/EcoR I断片としてpBR322から誘導され
た。

pDG150（エノラーゼ制御） pDG150はpDG149から、エノラーゼプロモーターより上
流のバクテリア源の外来の配列、すなわち、peno46誘導
断片と一緒にされたtrpプロモーターおよびコリシン（C
olicin）E1配列、を欠失することにより誘導された。

pDG149をSal I（完全）でtrpプロモーター配列より上
流のユニークSal部位で切断し、次いでXba Iで部分的に
消化して、酵母由来エノラーゼプロモーターの５′付近
のXba部位において切離した。クレナウおよび４種類のd
NTPで修復した後、この混合物を結合し、そしてE.コリ
（E.coli）MM294をAmp^Rに形質転換するために使用し
た。形質転換体を、ユニークXba IおよびSal I部位を含
有する所望の11.62kbプラスミドについてスクリーニン
グした。

D.4融合フラッグの構成に適するベクターの調製−pDG15
1 pDG151は前述のpDG148、pDG149およびpDG150に類似す
る11.12kbプラスミドであるが、ただし修飾截断Kan遺伝
子は、pDG149のtrpプロモーターの前において重複lacオ
ペレーターを含む追加の原核生物制御系に結合してお
り、そしてポリリンカーより後に存在する。mtAPH−Ｉ
に結合した真核生物プスモーター配列は欠失されてい
る。pDG151において、pDG149上のtrpプロモーターとデ
ルタV2−10修飾Kan遺伝子との間に介在するENO I制御配
列は、短い逆転（inverted）反復のポリリンカーがフラ
ンキング（flanking）する重複lacオペレーターを含有
する0.1kb配列と置換されており、こうしてmtBPH−Ｉの
発現はトリプトファンのレベルまたはlacリプレッサー
合成のいずれかにより調節されうる。この断片は、pFC2
0（前述）のHind III/BamH I（部分的）消化により誘導
された。

pDG151の配列は、第７図に概略的に示されており、そ
して次のものから成る： 1.コーディネイト０−1.54は、pEno46（ホランドら、上
を参照）から誘導されるEno I遺伝子の1.54kb Hind III
/EcoR I 3′非翻訳ターミネーター配列であり、そしてp
DG149の対応するコーディネイト中の配列と同一であ
る。

2.コーディネイト1.54−2.75は、前述のように修飾され
た截断Kan遺伝子を含有する。これはpDG149中の対応す
る配列に関連して記載したpDG144の同一のHind III/Pvu
II消化であり、そしてこれはpDG148におけるコーディ
ネイト０−1.21により満たされる配列に相当する。

3.コーディネイト2.75−2.85は、逆転ポリリンカー反復
がフランキングする重複lacオペレーターを含有し、そ
してHind IIIおよびBamH I（部分的）で部分的に消化す
ることにより得られた。lacO重複を含む断片を与える正
しいBamH I消化は、宿主をAmp^Rに形質転換し、次いでE.
コリ（E.coli）K12株MM294中の構成的Lac^Z+発現につい
てスクリーニングすることによって容易に立証された。
ATC出発コドン（2.75）のすぐ前に存在する配列は、次
の通りである： 4.コーディネイト2.85−2.95は、pFC10からの単離され
た107bp 5′−EcoR I（修復）/BamH I−３′断片であ
る。この断片はtrpプロモーター−オペレーターを含有
し、そしてpDG149中のコーディネイト5.80−5.91を満た
す112bpのtrp制御断片に類似する。

5.コーディネイト2.95−3.04kbは、Sph I（修復）部位
とSal I部位との間に90bpのpBR322セグメントを含有す
る。

6.YEp13からのLEU−２遺伝子は、コーディネイト3.04−
5.25を満たす。それはYEp13からのXho I/Sal I消化物と
して得られ、そしてpDG148およびpDG149において同様な
位置を満たすものと同一の断片である。

7.コーディネイト5.25−8.97中の２ミクロンのプラスミ
ドレプリコンは、pDG148およびpDG149中のpDB248由来断
片に類似する。

8.コーディネイト8.97−11.2は、Amp^RおよびE.coli複製
開始点を供給するpBR322のTth111 I（修復）/EcoR I消
化物を含有する。

pDG151はmtAPH−ＩのATG出発コドンに先行するポリリ
ンカーを含有するので、５′融合末端の生成のために、
便利な制限部位が得られる。

D.5 LEU 2 mtAPH−Ｉ 融合のための発現ベクターの構
成 酵母宿主中でのLEU 2融合蛋白質の生産に有効な、４
つの発現ベクターを構成した。これらの融合蛋白質は、
変化する長さのβ−イソプロピルマレートデヒドロゲナ
ーゼのＮ−末端配列、いくつかのリンカーによりコード
されたアミノ配列、およびmtAPH−Ｉ配列を含有する。
構成されたすべての４つのこのようなプラスミドは、次
のようにして、pDG151から誘導された。pDG151をコード
領域の種々の位置においてコーディネイト3.04−5.25の
間に含有されるLEU 2配列に切断し、そしてコード配列
のＮ−末端部分をpDG151中のmtAPH−Ｉコード配列の直
前のポリリンカー中に再結合した。これらの例示的プラ
スミドは、pLK11.17、pLK51.57、pLK82.88およびpLK82.
90と表示された。これらの表示は融合〔Ｌ（LEU）およ
びＫ（Kan）〕を構成するコード配列を示し、そして融
合の性質を示し、最初の数字は含まれるLEU 2配列のコ
ドンの数を示し、そして第２の数字はmtAPH−Ｉのため
の出発コドンに先行する追加のアミノ酸の数を示す。

節D.4において説明したように、mtAPH−Ｉコード配列
のすぐ前のポリリンカーは、次の４つの制限部位を含有
する:EcoR I、Sma I、BamH I、およびHind III。LEU 2
コード配列はBstE II部位、Cla I部位およびKpn I部位
を含有し、BstE II部位はコドン12−14において切断
し、Cla I部位はコドン51−52において切断し、そしてK
pn I部位はコドン83−84において切断する。次の節にお
いて、例示的な融合蛋白質コードプラスミドの構成にお
けるこれらの部位の使用について詳述する。

pLK11.17の構成 pDG151をBstE IIで完全に消化し、S1ヌクレアーゼで
処理し、Pst Iで消化し、そして5.8kbのDNA断片をアガ
ロースゲル電気泳動に従い精製した。BstE II LEU部位
を次に示す： こうして、この5.8kb断片は、LEU 2プロモーター配列お
よびLEU 2配列の最初の11コドンおよびコドン12の最初
のヌクレオチドを含有する。

mtAPH−Ｉ部分を提供するために、pDG151をBamH Iで
完全に消化し、すべての４種類のdNTPの存在下にクレナ
ウで処理し、Pst Iで消化し、そして3.52kbのDNA断片を
精製した。この断片は、ポリリンカーによりコードされ
る52/3アミノ酸のためのコドンと一緒に、mtAPH−Ｉの
コード配列を提供し、そしてまたエノラーゼ停止配列を
提供する。

上のpDG151断片の等モル混合物を60μg/mlの合計のDN
A濃度において接着末端の条件下に12時間結合し、次い
で平滑末端の条件下に20μg/mlのDNA濃度において結合
した。この結合混合物を使用してE.コリ（E.coli）MM29
4をAmp^Rに形質転換し、そしてAmp^Rコロニーを、ユニー
ク再生BamH I部位を含有することが期待される所望の9.
3kbプラスミドの存在についてスクリーニングした。

候補のプラスミドを、さらに、制限酵素分析により、
次いでペンタデカマーのプライマー５′CAGCATCCATGTTG
G−３′（これはmtAPH−Ｉコード配列のヌクレオチド23
−37に対して相補的である）を用いるDNAスクリーニン
グによりスクリーニングした。融合部におけるヌクレオ
チド配列は、次の通りであることが確証された： pLK51.57の構成 pDG151をCla Iで完全に消化し、dCTPおよびdGTPの存
在下にクレナウで処理し、Pst Iで消化し、そして5.92k
bのDNA断片を単離した。Cla IはLEU 2コード配列を次に
示すように切離す： こうして、この断片は、LEU 2プロモーターに加えて、L
EU 2配列のコドン１−51をコドン52の最初のヌクレオチ
ドと一緒に提供する。

mtAPH−Ｉコドンおよびエノラーゼターミネーターを
含有する5.92kb断片を、上の節D.6に記載するのと全く
同様にして調製した。

等モル量のこれらの断片を結合し、そして結合混合物
を、上の節D.6.aに記載するように使用して、E.コリ
（E.coli）MM294をAmp^Rに形質転換した。Amp^Rコロニー
を、ユニーク再生BamH I部位を含有する所望の9.44kbプ
ラスミドについてスクリーニングした。候補のプラスミ
ドを制限分析によりさらにスクリーニングした。上記と
同一のペンタデカマーのプライマーを用いるDNA配列決
定により、正しい構成の融合部における配列、pLK51.5
7、は次の通りであることが明らかにされた： pLK82.88の構成 pDG151をKpn Iで完全消化し、BamH Iで消化し、そし
てすべての４種類のdNTPの存在下にクレナウで処理し
た。Kpn IはLEU配列を次に示すように切離す： こうして、得られる線状平滑末端断片は、Kpn I（平
滑）末端において、LEU 2遺伝子の最初の82コドンと一
緒にLEU 2プロモーター、およびコドン83からの追加の
Ｇを含有する。BamH I（平滑）末端は、いくつかのポリ
リンカーコドンが先行しかつエノラーゼターミネーター
が後続するコドンを提供する。

これらの断片を分子内平滑末端結合に好適な20μg/ml
の合計DNA濃度において平滑末端条件下に結合し、そし
てこの混合物を使用してMM294をAmp^Rに形質転換した。A
mp^Rコロニーを、ユニーク再生BamH I部位を含有する所
望の9.54kbプラスミドの存在についてスクリーニングし
た。候補プラスミドを、制限分析によりそして最後にDN
A配列決定により、さらにマッピング（mapping）した。
pLK82.88中の関連する融合配列は、次の通りであること
が確証された： pLK82.90の構成 pDG151をKpn Iで完全消化し、dGTPの存在下にクレナ
ウで平滑末端にし、Bg1 IIで消化し、そして所望の6.88
kb DNA断片を精製した。この断片はLEU 2プロモータ
ー、第182LEU 2コドンおよびコドン83の１ヌクレオチド
を提供する。融合のためのKan遺伝子を得るために、pDG
151をEcoR Iで完全消化し、S1ヌクレアーゼで処理し、B
g1 IIで消化し、そして所望の2.53kb断片を精製した。
この断片はポリリンカーからの７−2/3コドンを提供す
る。

２つの前期断片を同モル量で接着末端の条件下（60μ
g/mlの合計DNA）で結合し、10μg/mlに希釈し、そして
分子内結合に好適な平滑末端条件下で結合した。この結
合混合物を使用してE.コリ（E.coli）MM294をAmp^Rに形
質転換し、そして追加のApa I認識部位を含有する所望
の9.4kbプラスミドの存在についてコロニーをスクリー
ニングした。プラスミドを制限分析によりさらにマッピ
ングし、そして正しい構成体、pLK82.90、は前述のよう
にDNA配列決定により、次の融合配列を含有することが
確証された： D.6 エノラーゼ融合体を含有するプラスミドの構成 pEK7.14はENO Iの最初の７コドン、ポリリンカーの７
コドン、および262mtAPH−Ｉコドンのインフレーム（in
frame）融合を、すべてエノラーゼプロモーターおよび
停止配列の制御下にコードする。mtAPH−Ｉコドンおよ
びエノラーゼターミネーターはpDG151から誘導される。
残りのコドンおよびエノラーゼプロモーターは、pEno46
の誘導体から得られる。

前期誘導体を得るため、pEno46をまずHind IIIで消化
し、E.コリ（E.coli）エンドヌクレアーゼIII、S1ヌク
レアーゼ、BAPで処理し、そして自己相補的ホスホリル
化（phosphoryleted）Sal Iオクタヌクレオチド５′−G
GTCGACC−３′の存在下に平滑末端の条件下で結合する
ことによって修飾した。この結合混合物を使用してE.コ
リ（E.coli）MM294をAmp^Rに形質転換し、そしてAmp^Rコ
ロニーを新しいSal I部位の存在についてスクリーニン
グした。この修飾プラスミドpEno46（I24）は、ジデオ
キシシークエンシングにより、Eno Iコード配列中のコ
ドン７のすぐ後にSal Iオクタヌクレオチドが挿入され
ていることが確証された。このSal I切離し部位は、Eno
Iリーディングフレーム中において−１であり、そして
Gly−Arg−Proトリペプチドをコードする。

pEno46（I24）からの所望の配列をM13ファージに移し
てM13mp8::Eno46（I24）を得た。これを行うために、pE
no46（I24）をSal IおよびEcoR Iで消化し、そして所望
の745bp ENO Iプロモーター断片を精製した。バクテリ
オファージM13mp8RF DNAをEcoR IおよびSal Iで完全消
化し、そして上で精製した745bpの断片およびM13ベクタ
ー（3:1のモル比）を50μg/mlの合計DNA濃度におよび接
着末端条件下で結合した。E.コリ（E.coli）K12株WB373
（M13に感受性の細胞）を100ナノグラムのこの結合混合
物で形質転換し、そしてプラークを745bp挿入体の存在
についてスクリーニングした。所望の組み換えファージ
は、MBmp8からのポリリンカー配列の７コドンを、pEno4
6（I124）により提供されるEno Iの最初の７コドンにフ
レームを合わせて融合する。この組み換えファージ中の
Hind III部位によりコードされるリーディングフレーム
は、pDG151中のポリリンカーのHind III部位（＋１）に
よりコードされるリーディングフレームと同一（＋１）
である。こうして、この組み換えファージは、pEK7.14
の構成に使用する760bp EcoR I/Hind III断片のための
便利な入手源である。

組み換えファージ、M13mp8Eno46（I24）RF DNAをEcoR
Iで消化し、dATPおよびTTPの存在下にクレナウで修復
し、Hind IIIで消化し、そして760bpのENOIプロモータ
ー断片を精製した。プラスミドpDG151をSal Iで完全消
化し、すべての４種類のdNTPの存在下にクレナウで修復
し、そしてHind IIIで消化した。精製されたENOIプロモ
ーターおよび消化されたベクター断片を2:1のモル比で
接着末端条件下で60μg/mlの合計DNAにおいて結合し、
そして結合した断片を20μg/mlに希釈し、そして平滑末
端の条件下で結合した。この混合物を使用してＸ−gal
含有ペトリ皿上でE.コリ（E.coli）MM294をAmp^Rに形質
転換し、そして白色のAmp^R形質転換体を所望の11.6kbプ
ラスミドの存在についてスクリーニングした。（mtAPH
−Ｉに先行する280bpのlacオペレーター断片を欠失した
プラスミドを含有する形質転換体は、白色のコロニーを
与えることが予測されるであろう。） 候補プラスミドを制限酵素消化によりさらにマッピン
グし、そして得られる融合部における配列は、pEK7.14
中において、次の通りであることが確証された： D.7 代りの制御配列を有するベクターpDG151::RSVの構
成 pDG151::RSVはラウス肉腫ウイルスから誘導される制
御配列を用いるS.セレビシエー（S.cerevisiae）E.コリ
（E.coli）のシャトルベクターである。それは、pDG151
からコーディネイト3.04および2.75の間の配列を除去
し、そしてそれらをRSVプロモーター配列で置換するこ
とによって構成される（ATG先行Hind III部における再
結合は、プロモーターとmtAPH−Ｉコドンとの作用可能
な結合を再生する）。

プラスミドpDG151をSal Iで完全消化し、E.コリ（E.c
oli）DNAポリメラーゼＩ、クレナウ断片ですべての４種
類のdNTPの存在下に処理し、そして最後にHind IIIで完
全消化した。プラスミドpRSV−NeO I（下を参照）をNru
IおよびHind IIIで完全消化した。消化したDNA断片を
混合し（1:2.5のモル比）そして50μg/ml（合計DNA濃
度）で接着末端条件下で結合した。結合した線状DNA断
片を25μg/mlに希釈し、そして分子内円の形成に好適な
平滑末端条件下にさらに結合した。この結合したDNAをP
vu IIで消化して（望まないpRSV−Neo I結合生産物を不
活性化するため）そしてこのDNAの150ngを使用してE.コ
リ（E.coli）K12株MM294をアンピシリン耐性に形質転換
した。非構成的Lac⁺コロニー（pDG151の280bpのSal I/H
ind III DNA断片の不存在）をカナマイシン耐性につい
てスクリーニングした。Amp^R Kan^Rの候補コロニーを、
ラウス肉腫ウイルスのプスモーターをコードする400bp
のNru I/Hind III DNA断片を含有する所望の11.24kbプ
ラスミドの存在についてスクリーニングした。プラスミ
ドpDG151::RSV（11.24kb）は診断的1235bpのEcoR I断片
を放出し（928bpのLEU 2 DNAの307bpのRSV DNAへの融
合）、所望のSal I認識部位を再生し（Sal Iの修復、GT
CGA/CGA、Nru I融合）そして診断的Sal I/EcoR I（307b
p）およびNru I/EcoR I（150bp）DNA断片を再生した。

pRSVNeo Iの構成 プラスミドpRSVneo（5.73kb、APH−IIコード配列を本
発明の修飾截断APH−Ｉコード配列と区別するためにこ
こではpRSVne IIと呼ぶ）は記載されている〔ゴルマン
（Gorman）,C.ら，サイエンス（Science）（1983）221:
551−553〕。mtAPH−Ｉコード配列をコードする1210bp
のHind III/Pvu II DNA断片（プラスミドpFC20から）を
APH−IIについてのバクテリアのプロモーターおよびび
構造コード配列をコードするpRSVneo IIのの1352bpのHi
nd III/Pvu II領域と置換することによって、pRSVneo I
Iを修飾してpRSVNeo Iを得た〔ベック（Beck）,E.ら，
ジーン（Gene）（1982）19:327〕。

プラスミドpRSVneo IIをPvu IIおよびHind IIIで完全
消化した。プラスミドpFC20をPvu IIおよびHind IIIで
完全消化した。消化した断片を混合し（1:1のモル比）
そして40μg/ml（合計のDNA濃度）において接着末端条
件下に結合した。結合した線状DNA断片を20μg/mlに希
釈し、そして分子内の形成に好適な平滑末端の条件下に
さらに結合した。E.コリ（E.coli）K12株MM294を150ng
のこの結合DNAでAmp^Rに形質転換し、そして非構成的Lac
⁺コロニー（pFC20源含有断片ではなくpRSVneo II源含有
断片で形質転換した）を所望の5.59kbプラスミドの存在
についてスクリーニングした。プラスミドの候補をHind
III（ユニーク部位）、Pvu II（ユニーク部位）、Hind
III/Pvu II（4.3および1.21kbのDNA断片）およびEcoR
I（3.04および2.55kbのDNA断片）でスクリーニングし
た。pRSVneo Iと表示する１つの形質転換体（5.59kb）
は、APH−IIプロモーターおよびコード配列について置
換されたmtAPH−Ｉコード配列をコードした。さらに、
プラスミドpRSVneo Iは、高いレベルのカナマイシン耐
性をE.コリ（E.coli）K12株MM294に付与した（＞100μg
/ml）。

E. 截断Kan遺伝子の発現およびそれによる選択 E.1 E.coli中での発現 第５図は、プラスミドMCK 4.1が野生型APH−Ｉ蛋白質
（V2−10）のコドンV2−10を失なっており、しかも最小
培地において非常に高いレベルのカナマイシン耐性（30
0μg/ml薬物において100％のプレート効率）を付与する
ことを示す。同様に、プラスミドMCK 1.4は野生型APH−
Ｉ蛋白質のコドン２−９を失っており、そして非常に高
いレベルのカナマイシン耐性を付与する。こうして野生
型配列中の位置10におけるシステインおよび野生型蛋白
質配列のアミノ酸２−９は、活性に必須ではない。

第６図は、プラスミドをもたない（パネルＡ）、野生
型プラスミドpNG56（パネルＢ）、プラスミドMCK 1.4
（コドン２−９の欠失）（パネルＣおよびＤ）またはプ
ラスミド4.1（コドン２−10の欠失）（パネルＥおよび
Ｆ）をもつE.コリ（E.coli）K12株MM294からの抽出物の
２次元電気泳動的分離〔Ｏ′ファレル（Farrell）,P.J.
ら、ジャーナル・オブ、バイオロジカル・ケミストリー
（J Biol Chem）（1975）250:4007〕の一連の一部分を
示す。培養物をトリプトファン（100μg/ml）の不存在
下（パネルA,C,E）または存在下（パネルB.D.F）におい
て増殖させ、そして³⁵S−メチオニン（10μC/ml）で５
分間標識付けした。

第６図から明らかなように、プラスミドMCK 4.1およ
びMCK 1.4は低い見掛け分子量の蛋白質をコードし、そ
して見掛け荷電を変更した。プラスミドMCK 1.4およびM
CK 4.1をもつ細胞により合成された新しいポリペプチド
鎖を示す矢印と、円を付した野生型蛋白質の位置（パネ
ルＢ）とを比較せよ。さらに、第６図から明らかなよう
に、これらの新しい変更されたポリペプチドの合成は、
E.コリ（E.coli）trpプロモーターに作用可能に結合し
たこの混合物中の截断コード配列と一致して培地中のト
リプトファンのレベル（パネルＣおよびＥとＤおよびＦ
とをそれぞれ比較する）により調節される。さらに、精
製されたAPH−IV2−10はパネルＥにおいて示され新しい
主要な標識スポットとともに移動する（図示せず）。

さらに、プラスミドpFC15によりコードされる変更さ
れたHind III認識部位の突然変異およびプラスミドpFC1
9によりコードされる変更されたXma I/Sma I認識部位
は、これらの修飾APH−Ｉコード配列により付与される
高いレベルの耐性を変化させない。

E.2 真核生物における主要な選択可能遺伝標識として
のmtAPH−Ｉの使用 真核生物の形質転換のための、すなわち、lacY^-宿主
中における選択道具としてのmtAPH−Ｉの効能の結果
を、表１に示す。

真核生物に適当な制御配列に作用可能に結合したmtAPH
をコードするプラスミドを前述のように、使用して、S.
セレビシェー（S.Cerevisiae）S173−6Bプロトプラスト
を形質転換した。表１に示すように、期待される大きさ
の形質転換頻度が得られた。頻度は直接選択されるG418
^R形質転換体／μｇプラスミドDNAとして表わされる。

また、表１の結果は第８図に示されている。第８図に
おいて、形質転換されたS173−6Bおよび形質転換されな
いS173−6Bの両者のG418含有培地での増殖が比較されて
いる：（１）プラスミドを含まず；（２）pLK11.17;
（３）pDG148;（４）pDG150;（５）pDG151::RSV。

G418により選択される形質転換頻度は、LEU2⁺選択を
用いて得られるものよりも２〜４倍高かった。

第９図は、宿主が工業用酵母菌株であるとき得られた
同様な結果を示す。S.セレビシェー（S.cerevisiae）株
5121,C454,C464（エタノールの生産に使用されている３
種類の工業用酵母菌株）またはパンを焼くとき用いられ
る、レッド・スター（Red Star）、CBS6508およびGB472
2を、プラスミドpDG149で形質転換し、そして節C.3に記
載するように、形質転換体をG418^Rについて直接選択し
た。左側のペトリ皿はプラスミドDNAで処理しないプロ
トプラストのG418^R選択から得られた。これに対して、
右側のペトリ皿はpDG149で処理したプロトプラストのG4
18^R選択から得られた。上のパネルはレッド・スターで
あり、中央のパネルはGBS6508であり、そして下のパネ
ルはGB4722である。

節C.7の手順に従って実施した形質転換した酵母から
抽出されたDNAのサザー・ブロットにより、形質転換し
た宿主中のmtAPH−Ｉコード配列の存在がさらに確証さ
れた。

E.3 得られる耐性レベル（原核生物／真核生物） 真核生物の制御系を含有するプラスミドにより酵母菌
へ付与されたG418耐性のレベルは、trpプロモーターま
たはLEU 2プロモーター（両者はE.コリ−（E.coli）中
で作用する）を含有するプラスミドによりE.コリ（E.co
li）に付与されたKan^Rのレベルより大きい。

第２図は、プラスミド含有細胞のための50％のプレー
ト効率を与えるのに要求される抗生物質の濃度を示す。
「E.コリ（E.coli）」と表示する欄は、プラスミド含有
E.コリ（E.coli）K12株MM294についてのカナマイシン耐
性を示す。「S.セレビシェー（S.cerevisiae）」と表示
する欄は、プラスミド含有S.セレビシェー（S.cerevisi
ae）株S173−6BについてのG418耐性を示す。

こうして耐性のレベルを、生産されるAPH−Ｉ活性の
量についてのアッセイとして使用できる。pDG148,pDG15
0,pFC19,およびpDG151::RSVは、それぞれSV40（哺乳動
物）、ENO 1（酵母）、trp〔E.コリ（E.coli）〕および
RSV（哺乳動物）のプロモーターの制御のもとにある成
熟mtAPH−Ｉ配列のための発現ベクターである。融合体
のすべては、成熟蛋白質に比較して高い活性の発現レベ
ルを示す。

E.4 真核生物内の融合蛋白質の生産 融合蛋白質をコードするベクターで形質転換された酵
母を、ゲル電気泳動およびウエスタン分析（Western an
alysis）により分析して期待される融合配列の生産につ
いて証明した。

第10図は、対照としてmtAPH−Ｉ発現を用いる、酵母
エノラーゼ融合体の生産を示す。プラスミドをもたない
（パネルＡ）;pDG150で形質転換した（パネルＢおよび
Ｃ）；およびpEK7.14で形質転換した（パネルＤおよび
Ｅ）酵母菌株S173−6B宿主細胞の抽出物を、35Sメチオ
ニンパル標識付けした後にＯ′ファレル（Farrell）
〔Ｏ′ファレル,P.J.ら、ジャーナル・オブ・バイロジ
カルケミストリー（J.Biol.Chem.）（1975）250:4007）
の２次元電気泳動にかけた。パネルA,BおよびＤは得ら
れるオートラジオグラフを示す。パネルＣおよびＥは、
それぞれ抗APH−Ｉ血清および¹²⁵I Staph A蛋白質と反
応したＢおよびＤの免疫ブロット（immunoblot）であ
る。

パネルA,BおよびＤにおいて、一番上の矢印はβ−イ
ソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ〔すなわち、pDG1
50またはpEK7.14で形質転換された細胞により超過剰生
産される（hyperproduce）ことが期待されるLEU 2コー
ド蛋白質〕の位置を示す。右下角の矢印は、mtAPH−Ｉ
の発現生産物に相当する、パネルＢ（pDG150）において
のみ得られた蛋白質を示し、そしてパネルＤ（pEK7.1
4）の左中央の矢印はENO 1:mtAPH−Ｉ融合についての正
しい分子量および電荷（charge）において位置する蛋白
質を示す。こうして、融合蛋白質は、mtAPH−Ｉより増
大した分子量をもつばかりでなく、かつまた同様に期待
される異る電荷を有することが示される。融合蛋白質自
体を示すパネルＤにおける非融合mtAPH−Ｉスポットの
不存在は、pEK7.14によりコードされる優性選択可能活
性に帰因することに注意されたい。

パネルＤおよびＥの各々は、矢印で表示されるI¹²⁵抗
APH−Ｉ免疫反応性標識に相当する単一のみのスポット
を示す。残りの³⁵Sスポットはその位置を方向づけかつ
明らかにする。パネルＣ中の¹²⁵IスポットはパネルＢ中
に示されるmtAPH−Ｉスポットに相当し、そしてパネル
Ｅ中のそれは、期待される、パネルＤ中の融合蛋白質に
相当する。再び、パネルＥ中に非融合mtAPH−Ｉ免疫反
応性スポットの不存在に注意されたい。

LEU 2融合体で形質転換された酵母菌株S173−6Bの抽
出物のウエスタン分析は、第11図に示すように、期待さ
れる蛋白質の生産をさらに確証した。その図において、
レーンA,B,CおよびＥは、それぞれpLK82.90,pLK82.88,p
LK51.57およびpLK11.17で形質転換された細胞の抽出物
に相当する。レーンＤおよびＦに見られる抽出物は形質
転換されない酵母のものであり、そしてレーンＦ中にお
けるそれにはまた精製されたmtAPH−Ｉが点在する。

〔レーンＧはサイズ、マーカー（size marker）を含む。〕

期待されるように、mtAPH−Ｉ標準は＞30,000の分子
量に相当する。この分子量の蛋白質はレーンA,B,Cおよ
びＥ中に見られず、このことにより融合蛋白質それら自
体は４種類の融合プラスミドによりコード化される高い
レベルの優性選択可能活性に起因することが示される。
これらのレーンにおける融合蛋白質は、それぞれ約39.
1,38.9,36.0および31.7kDの期待する分子量を与える。p
LK82.90およびpLK82.88において生産される蛋白質間の
分子量の差はゲル上で感知できるが、これは約230ダル
トンの差を示すだけである。

F. ポータブルP_LN_RBS EcoR I/Hind III Pre−ATGカセ
ットのための供与体プラスミドの構成 mtAPH−Ｉ遺伝子をP_LN_RBSカセットの構成のための便
利な遺伝標識として使用した。まず、P_Lλファージプロ
モーターおよびＮ−遺伝子のリボソーム結合部位
（N_RBS）を含有するDNA配列を、シマタケおよびローゼ
ンバーグ（Rosonberg）、ネイチャー（Nature）（198
1）292:128に記載されるpKC30の誘導体から得た。pKC30
は、pBR322からのHind III/BanH Iベクター断片中にク
ローニングされたλファージからの2.34kb断片を含有す
る。P_LプロモーターおよびN_RBSは、Bg1 I部位とHpa I部
分との間においてpKC30中のセグメントを満たす。この
誘導体はEcoR I部位に転化されたBal II部位を有する。

P_Lプロモーターのすぐ前のBg1 II部位を、次のように
してEcoR I部位に転化した:pKC30をBg1 IIで消化し、ク
レナウおよびdNTPで修復し、ナチリガーゼでEcoR Iリン
カー（ニュー・イングランド・バイオラブスから入手可
能）に結合し、そしてE.コリ（E.coli）株MM294ラムダ
^＋中に形質転換した。プラスミドをAmp^RTet^R形質転換体
から単離し、そして所望の配列は制限酵素分析により確
証された。得られるプラスミドpFC3をPvu IおよびHpa I
で二重消化して、所望の配列を形成するほぼ540bpの断
片を得た。この断片をHinf Iで部分的に消化し、そして
424bp断片を単離し、クレナウおよびdATPで処理し、次
いでSIヌクレアーゼで処理して、３′末端配列−AGGAGA
A（ここで−AGGAGA部分はN_RBSである）をもつ平滑末端
の断片を生成した。この断片をEcoR Iで処理して、５′
−EcoR I/Hinf I（部分修復、S1平滑）−３′末端をも
つ347塩基対のDNA断片を得た。

P_LN_RBSを含有する所望のEcoR I/Hind IIIカセットを
含有するプラスミドを得るために、得られる断片をpDG1
44から得られたEcoR I/Hind III（修復）で切離された
プラスミドベクター中に結合した。

したがって、pDG144をHind IIIで消化し、クレナウお
よびdNTPsで平滑末端にし、次いでEcoR Iで消化した。
このベクター断片を上で調製したEcoR I/Hinf（修復）
断片と結合し、そしてMC1000−39531中に形質転換し
た。Amp^R Kan^Rコロニーを選択し、プラスミドを単離
し、そして正しい配列構成を制限分析および配列決定に
より確証した。正しい配列を含有する１つのプラスミド
をP_LKanと表示した。

プロモーター−RBSカセットを提供するための他のベ
クターpFC5は、成功した構成（successful constructio
n）のための遺伝標識としてlac−Ｚ融合フラッグを使用
する。1984年１月13日に寄託されたｐβＩ−Z15（ATCC
No.39578）は、lac−Ｚへ融合した140bpのβ−IFNとATG
とを含有する配列をpBR322中に融合することによって調
製した。ｐβＩ−Z15において、pBR322のEcoR I部位は
保持され、そして挿入部はATG出発コドンの直前にHind
III部位を含有する。pBI−Z15をHind IIIで制限処理
し、クレナウおよびdNTPで修復し、次いでEcoR Iで消化
した。得られるEcoR I/Hind III（修復）ベクター断片
を、上のEcoR I/Hinf I（修復）断片と結合した。この
結合混合物を使用してMC1000−39531を形質転換し、そ
して成功した構成体を含有するAmp^R形質転換体を、ラク
トース最小ペトリ皿上で34℃で増殖するが、30℃で増殖
しない能力によって同定した。（形質転換体を30℃およ
び34℃でＸ−gal−Ampペトリ皿上でおよび30℃および34
℃で最小ラクトースペトリ皿上で平板培養した。適切な
構成をもつ形質転換体は両者の温度においてＸ−gal−A
mpペトリ皿上で青色であるが、最小ラクトースペトリ皿
上では34℃において増殖するだけである。）成功した構
成体をpFC5と表示した。

適当な遺伝標識およびレプリコンと一緒にこのカセッ
トを含有するように構成したpFC5またはpP_LKanおよび類
似ペクターを使用してEcoR I/Hind III P_LN_RBS断片のた
めの入手源をクローニングし、そして得た。次いで、所
望の配列のためのATG出発コドンの背後において前記配
列のための発現ベクター中に、このカセットを便利に配
置することができ、ここでこのコドンはその前に近接し
てHind III部位を含有する。

G. P_LN_RBS−ATGカセットを提供するベクターの構成−p
P_LN_RBSATGおよびpDG141（P_L） P_LN_RBSカセットは、また、des−ATGカセットを適当な
宿主ベクター中に結合することにより、作用可能に結合
したATG出発コドンをもつことができる。Hind III部位
から下流の適当な距離でATG出発コドンを提供する合成
配列を含有するpBR322の誘導体であるpBW20を、こうし
て使用することができる。

pBW20を調節するために、pBR322をHind IIIで消化
し、クレナウおよび４種類のdNTPで修復し、次いでPva
Iで消化した。次いでこのベクター断片を、標準的平滑
末端結合において、自己相補的ドデカマーTATGAGCTCATA
（これはATG配列から下流に部分的に重なるSac I認識部
位を含有する）と結合した。この結合混合物を使用して
E.コリ（E.coli）MM294を形質転換し、そして正しい構
成はプラスミドの単離およびマクサム−ギルバート（Ma
xam−Gilbert）配列決定により確証された。pBW20中の
得られる関連配列は、次のとおりである： pP_LN_RBSATGを調製するため、pP_LKanをHind IIIおよび
EcoR Iで消化し、そしてpBW20からのEcoR I/Hind III消
化BAP処理ベクター断片に結合した。Amp^Rコロニーを選
択し、そして所望のベクターの構成は配列決定または制
限酵素の分析により確証された。

正しい構成体pP_LN_RBSATGを含有する１つのクローン化
されたコロニーは、こうして、発現しようとする遺伝子
配列の挿入に適する宿主プラスミド中のP_LN_RBS−ATGカ
セットのための入手源を提供する。このカセットを含有
する適切に制限処理された宿主ベクターは、Sac Iで消
化し、クレナウまたはSIヌクレアーゼで平滑末端化し、
そして平滑末端の遺伝子を挿入することによって得るこ
とができる。

1984年１月24日にATCCに寄託されそして受託番号3958
8を付与されたpDG141は、また、P_LN_RBS−ATGカセットの
ためのATGを提供することができる。pDG141は、trpプロ
モーターカセットの前にpBW20と同一のドデカマー挿入
部を含有する。こうして、前節の手順に従うが、pBW20
の代わりにpDG141を使用すると、類似のプラスミドpDG1
41（P_L）が得られる。

H. 発現におけるP_LN_RBSカセットの使用 以下の実施例は、IL−２の生産および適当なコード配
列の首尾よい発現に適する、発現ベクターの構成を記載
することによって本発明の１つの面を例示する。IL−２
およびその修飾された形態は、デビアント細胞代謝（de
viant cell metabolism）に対して向けられる治療にお
いて有用な、リンホカイン（lymphokine）と表示される
タンパク質の部類の構成員である。もちろん、IL−２の
生産について例示する方法に類似する方法で適当なコー
ド配列を提供することによって、所望のペプチドを同様
に生産できるであろう。さらに、P_LN_RBSカセットの代わ
りに、P_LN_RBSATGカセットを前述のような所望のペプチ
ドのコドンの前に配置できるであろう。

天然IL−２は、そのＮ−末端にアラニンをもつ133ア
ミノ酸配列である。原核生物系中の発現のため、天然遺
伝子中のリーダー配列のコドンをATGで置換し、Ｎ−末
端にメチオニン残基を有する蛋白質を生産する。下の節
において、Ｎ−末端メチオニンをもち、天然Ｎ−末端ア
ラニンを欠損し、そしてここにIL−2 des−ala,Ser125
と表示する125位置にセリンを含有する133アミン酸修飾
IL−２配列は、本発明のカセットの制御のもとに生産さ
れる。本発明のカセット、例えば節H.3に記載するも
の、を用いる別のIL−２構成体、またはIL−２の他の形
態を含む構成体を、もちろん、つくることができる。

pFC54の構成 pFC54はIL−２の修飾された形態のための発現ベクタ
ーであり、ここで位置125におけるシステインはセリン
残基で置換されている（IL−2 des−ala,ser125）。そ
れはP_LN_RBSカセットの源としてpFC5を使用し、コード配
列の源としてpLW46を使用し、そして高いコピー数のレ
プリコンの源としてpCS4を用いて、次のようにして構成
される： pCS4（下を参照）およびpFC5の各々をEcoR IおよびHi
nd IIIで消化し、そして消化物を1:2のモル比、60μg/m
lにおいて接着末端条件下で結合した。この結合したDNA
（150ng）を使用してMC1000−39531をAmp^Rに形質転換
し、そしてLac^-形質転換体を所望の5.45kbプラスミドに
ついてスクリーニングした。正しいプラスミドpFC8は、
pCS4の110bpのtrp制御区域の代わりに所望の346bpのEco
R I/Hind III P_LN_RBS断片を含有した。

pLW46はユニークHind III/Ban II断片としてムチイン
（mutein）IL−２（des−ala,Ser125）のためのコード
配列を含有する。E.コリ（E.coli）MM294中に形質転換
したこのプラスミドは、1983年９月26日に寄託されそし
てATCC番号39452を与えられた。

pLW46をPva II（望まない断片を切離すため）、Hind
IIIおよびBan IIで完全消化した。また、pFC8をHind II
IおよびBan IIで完全消化した。これらの消化物を混合
し（4:1のモル比、50μg/mlのDNA）接着末端条件下で結
合し、そしてこの混合物（100ngのDNA）を使用してMC10
00−39531をAmp^Rに形質転換した。成功した形質転換体
を、pLW46のPst I部位を欠損し、ユニークXba I部位、
ユニークHind III部位を含有し、かつ526bpのEcoR I/Xb
a I断片を生ずる所望の54kbプラスミドについてスクリ
ーニングした。所望のプラスミドをpFC54と表示した。
その構成は第12図に要約されている。

E.コリ（E.coli）DG95ラムダ溶原株（lambda lysogl
n）中に形質転換したpFC54は、No.2015としてCMCCにお
いて寄託され、そして1984年９月４日にATCCに委託され
そして受託番号39831号を有する。

pCS4の構成 pCS4は、pCS3（温度感受性高コピー数のレプリコンを
含有するプラスミド）から、pCS3からのより小さいEcoR
I/BamH I消化断片をEcoR I/Xho II消化断片（プラスミ
ドp1 trp 3−４−１からのtrpプロモーター／βIFN解読
配列を含有する）で置換することにより構成された。プ
ラスミドp1 trp 3−４−１は1984年３月30日にATCCに寄
託されそして受託番号ATCC 39646を有する。pCS3は1982
年６月３日にATCCに寄託されそして受託番号ATCC39142
を有する。

IL−2des−ala,Ser125の生産 pFC54をE.コリ（E.coli）DG95ラムダ溶原株中に形質
転換し、そして形質転換体を次のように増殖および誘導
させた:pFC54/DG95の新鮮な一夜サンプルを、5g/lのカ
サミノ酸、５μg/lのグルコース、100μg/mlのアンピシ
リンおよび10μモルのFeSO₄を補充したN8−２培地（500
mlにつき:20ミリモルのNH₄Cl、44ミリモルのKH₂PO₄、5
6.3ミリモルのNa₂HPO₄、18ミリモルのK₂SO₄、0.4ミリモ
ルのMgSO₄、６モルのZnSO₄、６μモルのMnSO₄、0.2μモ
ルのCuSO₄、0.4％のグルコース、0.002％のチアミン）
中に接種した。細胞を30℃において0.150のOD₆₈₀に増殖
させ、次いで温度を上昇させることにより誘導した。こ
れらの形質転換体は、40℃において１〜２時間の誘導の
後、蓄積された合計の細胞蛋白質の20％としてIL−2,de
s−ala、Ser125を生産した。生産レベルをアッセイする
ため、0.5mlの細胞を遠心し、そして沈殿物を20μｌの
３％のSDS、62.5ミリモルのトリスHCl.pH6.8中に再懸濁
させた。95℃に５分間加熱した後、試料を12.5％のSDS
ポリアクリルアミド３％積み重ねゲル上で展開した。次
いで、生産レベルをクーマッシー・ブルー（Coomassie
Blue）着色SDS−ポリアクリルアミドゲルの濃度により
アッセイした。生産されたIL−２の活性は標準アッセイ
法により確認された。

pFC53の構成 ATG出発コドンによりコードされるメチオニン直後の
アラニンの存在により上のものと異る134アミノ酸残基
を有するIL−２配列（天然配列中の正常Ｎ−末端）は、
前の説明中に記載したものに正確に類似する方法で得る
ことができる。この蛋白質のコード配列（ここでIL−2s
er125と表示する）は、pLW55からのコード配列を含有す
るHind III/Bam II断片として得られる。（MC1000−395
31中のpLW55は1983年11月18日にATCCに寄託されそして3
9516の受託番号を与えられた。）pCS4からの温度感受性
高コピー数しプリコンと本発明のP_LN_RBSカセットを含有
する得られるプラスミドを、pFC53と表示した。

E.coli DG95ラムダリソゲン中のpFC53の形質転換体
は、IL−2ser125を生産する培養物を与えた。

次のプラスミドはATCC〔the American Type Culture
Collection,Rockville,Maryland,U.S.A.（ATCC）〕に、
特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペ
スト条約及びそれに基く規則（ブタペスト条約） 〔the Budapest Treaty on the International Recog
nition of the Deposit of Microorganisms for the Pu
rposes of Patent Procedure and Regulations thereun
der（Budapest Treaty）〕の条件に従い、寄託され、維
持され、そしてブタペスト条約の条件に従い入手可能と
されている。このような菌株の入手可能性は、特許法に
従い政府の権限のもとに許可された権利に違反して発明
を実施する承諾と解釈されない。

寄託されたプラスミドは、次に示したATCC受託番号を
付与されている。これらのプラスミドは、また、シタス
・コーポレーション（本出願人）のマスター・カルチャ
ー・コレクション〔the Master Culture Collection（C
MCC）of Cetus Corporation,Emeryville,California,U.
S.A. the assignee of the present application〕に寄
託されており、そして示したCMCC受託番号を付与されて
いる：プラスミド CMCC受託番号 ATCC番号 pDG144 1960 39579 pFC19 1832 39551 pDG149 1928 20694 pDG148 1929 20695 pDG141 1966 39588 pFC5 1935 39864 pFC54 2015 39831 pCS3 −− 39142

フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６１８４９９ (32)優先日 1984年６月８日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６４６６９３ (32)優先日 1984年８月31日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６８５３１２ (32)優先日 1984年２月８日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９８３１ 審判番号 平7−8232 (72)発明者 ローヤー，フランシス シー アメリカ合衆国，カリフオルニア 94611，オークランド，サロニ ドライ ブ 6641 (72)発明者 ストツフエル，スーザン アメリカ合衆国，カリフオルニア 94530，エル セリト，エルム コート 1008 (56)参考文献 特開 昭58−189197（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−38300（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｃｌ．147（1981) Ｐ．217−226 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，11（1983）Ｐ．6895−6911

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】後記リボゾーム結合部位（RBS）配列の
   ３′の6bp内で開裂を可能にするHind III制限部位を有
   する第三DNA配列の上流にあるλファージのＮ−遺伝子
   のRBSに対応する第二DNA配列に作用可能に連結されたP_L
   プロモーターである第一DNA配列を有する、原核生物に
   おける異種性蛋白質の発現のためのポータブル調節可能
   制御カセットであって、ATCC 39831として寄託されたベ
   クターから得ることができる制御カセット。
2. 【請求項２】前記第一DNA配列及び第二DNA配列がATG開
   始コドンに作用可能に連結されており、これらのすべて
   が第三DNA配列の上流にあり、該第三DNA配列は、前記AT
   G開始コドンのＧの３′側の6bp以内で開裂を可能にする
   制限部位であって前記カセット中の他のどこにも存在し
   ない制限部位を有する、請求項１に記載のカセット。
3. 【請求項３】異種蛋白質の発現のための制御カセット含
   有ベクターであって、該ベクターが、後記リボゾーム結
   合部位（RBS）配列の３′の6bp内で開裂を可能にするHi
   nd III制限部位を有する第三DNA配列の上流にあるλフ
   ァージのＮ−遺伝子のRBSに対応する第二DNA配列に作用
   可能に連結されたP_Lプロモーターである第一DNA配列を
   有する、原核生物における異種性蛋白質の発現のための
   ポータブル調節可能制御カセットであって、ATCC 39831
   として寄託されたベクターから得ることができる制御カ
   セットであることを特徴とするベクター。
4. 【請求項４】前記第一DNA配列及び第二DNA配列がATG開
   始コドンに作用可能に連結されており、これらのすべて
   が第三DNA配列の上流にあり、該第三DNA配列は、前記AT
   G開始コドンのＧの３′側の6bp以内で開裂を可能にする
   制限部位であって前記カセット中の他のどこにも存在し
   ない制限部位を有する、請求項３に記載のベクター。
5. 【請求項５】ATCC 39831として寄託されているベクター
   pFC54である、請求項３又は４に記載のベクター。