NL8000127A

NL8000127A - Werkwijze voor het vormen van prokaryotische of eukaryotische proteinen alsmede een daarbij toepasbaar gekoppeld gen.

Info

Publication number: NL8000127A
Application number: NL8000127A
Authority: NL
Original assignee: Harvard College
Priority date: 1979-01-15
Filing date: 1980-01-09
Publication date: 1980-07-17
Also published as: JPS5599193A; CA1174617A; FR2446318A1; DE3000982A1; SE8000297L; GB2039916A

Description

v * k

Werkwijze voor het vormen vaii prokaryotische of eukaryotische proteïnen alsmede een daarbij toepasbaar gekoppeld gen.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het vormen van prokaryotische of eukaryotische proteïnen in native, niet gekoppelde vorm en vrij van vreemde peptiden, in bacteriën.

5 DNA-recombinaties in vitro zijn toegepast om verschillende eukaryotische genen in Escherichia coli plasmiden in te bouwen ten einde te trachten deze bacteriën aan te zetten tot het vormen van eukaryotische proteïnen. De meeste van deze genen hebben echter geen invloed gehad op de synthese van native 10 proteïnen omdat de eukaryotische genen die coderen voor initiering van transscriptie en/of translatie niet goed in IS. coli functioneren. Om deze moeilijkheid op te lossen heeft men voorgesteld om het eukaryotisch gen te koppelen met een bacterieel gen. Dit resulteerde in de vorming van een hybrid proteïne waarvan het deel 15 aan de terminale carboxylgroep wordt gevormd door het eukaryotisch proteïne. In één geval is men er in geslaagd om een klein biologisch actief proteïne te scheiden van een koppelingsprodukt (K. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)).

Gen-expressie vindt plaats door transscriptie tot 20 mRNA gevolgd door translatie tot proteïne. Daartoe moet het DNA dat aan het gen voorafgaat, een struktuur bezitten die 800 0 127 tf .*4r 2 a) tot een doeltreffende binding van bacterieel RNA polymerase en doeltreffende initiering van transscriptie leidt, en b) codeert voor een mRNA dat tot een doeltreffende binding van mRNA aan de ribosomen en initiering van translatie tot proteïne 5 leidt.

Volgens de uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor het vormen van natief, niet gekoppeld prokaryotisch of eukaryotisch proteïne in bakteriën door in bakterieel plasmide een gen voor een prokaryotisch of eukaryotisch proteine in te 10 bouwen alsmede een verplaatsbare promotor bestaande uit een DNA fragment met een voor RNA polymerase herkenbare transscriptie-initieringsplaats maar zonder proteïne translatie startplaats waarbij deze promotor boven een proteïne-translatie-startplaats van het gen wordt ingebracht onder vorming van een gekoppeld gen 15 met een hybride ribosoom bindingsplaats, waarna het plasmide in de bakteriën wordt gebracht die daardoor worden getransformeerd, en de getransformeerde bakteriën worden gekweekt onder vorming van prokaryotisch of eukaryotisch proteïne.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding worden 20 nucleasen, restrictie-enzymen en DNA ligase toegepast om de verplaatsbare promotor bestaande uit een DNA fragment met een trans-scriptieplaats maar zonder een translatie-initieringsplaats nabij het beginpunt van het gen dat voor het gewenste proteïne codeert, in te bouwen onder vorming van een hybride ribosomale bindings-25 plaats. De door dit hybrid getransformeerde bakterie vormt een proteïne dat het natieve derivaat van het geïmplanteerde gen is.

Gevonden is, dat het endonuclease afbraak produkt van het E. coli lac operon, een DNA fragment met een transscriptie-initieringsplaats maar zonder translatie-startplaats, over de 30 vereiste eigenschappen beschikt om als een verplaatsbare promotor die in een hoog rendement door bakterieel RNA polymerase wordt overgeschreven, te functioneren. Het gevormde mRNA bevat een ribo-somele bindingsplaats (Shine-Dalgerno (S-D) sequence) maar geen voor translatie-initiering benodigd AUG of GUG. Volgens de uitvin-35 ding wordt echterjeen hybrid gevormd dat bestaat uit de S-D sequens 800 0 1 27 **.

3 *♦ en initiator afkomstig van het lac operon en de AUG sequens van het gen. Dit gekoppeld gen wordt met een hoog rendement vertaald en overgeschreven. Door gebruik te maken van de enzymen exonuclease III en SI kan de promotor op elke gewenste plaats voor de trans-5 latie startplaats van het gen worden ingebouwd om een optimale proteïneproduktie te bereiken. Omdat de promotor op een restrictie-plaats boven de translatie startplaats van het gen kan worden ingebouwd, kan het gen eerst op de restrictieplaats worden geknipt waarna het gewenste aantal base-paren en elke enkel-stengige 10 uiteinden kunnen worden verwijderd door behandelen met nuclease gedurende een passend gekozen tijd, gevolgd door hereniging.

Voorbeeld 15 Een konijne β-globine gen werd eerst gekloneerd aan de Hin III plaats van pBR322, een E.. coli plasmide, via met restrictie-enzym verknipt oorspronkelijk DNA, reconstitutie van het gen met T4 ligase, inbrengen van het gereconstitueerde gen aan de Hin III plaats onder gebruikmaking van gesynthetiseerde 20 Hin III verenigers, en hereniging onder gebruikmaking van DNA ligase.

Het Hin III brokstuk aan het carboxyl uiteinde van het gekloneerde gen werd verwijderd door gedeeltelijke afbraak met Hin III. De daarbij ontstane "kleverige uiteinden" van het Hin 25 III werden gekoppeld onder gebruikmaking van E. coli DNA polymerase I waarna de segmenten met behulp van T4 ligase aan elkaar werden geplakt. Het aldus gevormde plasmide bevatte een enkel Hin III stuk dat 25 base-paren voor de eindstandige aminogroep van het globine gen lag.

30 Uit verschillende monsters van het gekloneerde gen werden verschillende aantallen van de 25 base-paren tussen het Hin III brokstuk en het ATG dat codeert voor het translatie startpunt, als volgt verwijderd: het plasmide werd met Hin III verknipt, gedurende verschillende tijdsduren variërend van 0,5 tot 10 min.

35 behandeld met Exo III, en daarna met SI om enkel-strengige uiteinden 80 0 0 1 27 4 te verwijderen.

Hierna werd de verplaatsbare promotor van het lac operon, een Rl-Alu restrictie-fragment van E. coli DNA, ingébracht door elk monsters van het plasmide te behandelen met Rl, 5 een enzym dat op een specifieke plaats enkele 30 base-paren boven de Hin III plaats knipt. De promotor werd op deze plaats ingebracht waarvoor ëén "kleverig uiteinde" en ëén "flush" uiteinde nodig zijn die aan elkaar worden geplakt met hetzelfde ligase.

Vervolgens werden kolonies van E_. coli die elk 10 een van de aldus gevormde plasmiden bevatten, geselekteerd op β-globine vorming onder gebruikmaking van RIA-screening technieken.

Het globine gen in voornoemde plasmiden kan elk gen zijn dat codeert voor prokaryotische of enkaryotische proteïnen terwijl in plaats van de Hin III-plaats elke andere specifieke 15 restrictie-plaats in aanmerking komt. Wanneer de restrictie-plaats te ver van het begin van het gen ligt en daardoor moeilijk toegankelijk is, kan hij worden opgeschoven (een Hin III plaats bijvoorbeeld kan opgeschoven door het plasmide te openen met Hin III, behandelen met Exo III en SI, en de plasmide segmenten weer aan 20 elkaar te plakken bij aanwezigheid van overmaat Hin III verenigers). De Rl-plaats kan door elke andere restrictie-plaats die geschikt is om de verplaatsbare promotor in te brengen, worden vervangen bijvoorbeeld Pst, BAM of Sal I.

Met natL-ruk wordt er op gewezen, dat de moeilijk-25 ste stap, het kloneren van het gen aan het plasmide, eenmaal plaats vindt en intakt wordt gelaten. Het promotor-fragment draagt zijn constitutieve expressie over op de cel zodat eenvoudig geconstateerd kan worden of de promotor intakt is.

30 0 Θ 1 27

Claims

1. Gekoppeld gen dat codeert voor een hybride ribosoom bindingsplaats, gekenmerkt door 5 de regio van een bakterieel gen bestaande uit,in volgorde van transscriptie de SD-regio, en ten minste ëên base-paar dat aan voornoemde SD-regio grenst, gekoppeld met de regio van een gen dat codeert voor een prokaryo- 10 tisch of eukaryotisch proteïne, bestaande uit,in volgorde van transscriptie ten minste één base-paar dat aan een translatie-startplaats grenst, en voornoemde translatie-startplaats.

2. Gekoppeld gen volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gen verder boven de SD-regio de promotor regio van het bakteriële gen bevat en onder de translatie-startplaats van het gen dat codeert voor prokaryotisch of eukaryotisch proteïne de regio van laatst genoemd gen. 20

3. Werkwijze voor het vormen van natief niet gekoppeld prokaryotisch of eukaryotisch proteïne in bakteriën, met het kenmerk, dat in een bakteriëel plasmide een gen wordt ingebracht dat codeert voor prokaryotisch of eukaryotisch proteïne, en een ver- 25 plaatsbare promotor bestaande uit een DNA fragment met een voor RNA polymerase herkenbare transscriptie-initieringsplaats maar zonder proteïne-translatie-startplaats, welke promotor boven een proteïne-translatie-startplaats van het gen wordt ingebracht onder vorming van een gekoppeld gen met een hybride ribosoom-bindings- 30 plaats, waarna het plasmide in de bakteriën wordt gebracht onder transformatie daarvan en de getransformeerde bakteriën worden gekweekt onder vorming van prokaryotisch of eukaryotisch proteïne.

4. werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, 35 dat de bakterie Escherichia coli is. 800 0 1 ik *

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de verplaatsbare^Jmotor het restrictie-endonuclease afbraak-produkt van een operon is.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de verplaatsbare promotor het restrictie-endonuclease afbraak-produkt van het E. coli lac operon is.

7. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, 10 dat het gen wordt ingebracht door kloneren aan het plasmide, instellen van de afstand tussen het ingebrachte gen en een voorgaande specifieke restrictie-plaats door behandelen met een nuclease, en kloneren van de verplaatsbare promotor aan deze restrictie-plaats , 15

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gen wordt ingebracht door kloneren aan het plasmide, instellen van de afstand tussen het ingebrachte gen en een '-oorgaande specifieke restrictie-plaats door behandelen met een nucl». ise, 20 en kloneren aan deze restrictie-plaats van een verplaatsbare promotor gevormd door endonuclease afbraak van het IS. coli lac operon.

9. Werkwijzen en daarmee verkregen produkten 25 zoals beschreven in de beschrijving en voorbeelden. 80 0 0 1 27