DE3000982A1

DE3000982A1 - Proteinsynthese

Info

Publication number: DE3000982A1
Application number: DE19803000982
Authority: DE
Inventors: Keith C Backman; Gail D Lauer; Mark Ptashne; Thomas M Roberts
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 1979-01-15
Filing date: 1980-01-12
Publication date: 1980-08-07
Also published as: NL8000127A; JPS5599193A; CA1174617A; FR2446318A1; SE8000297L; GB2039916A

Description

Proteinsynthese

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von prokaryotischen oder eukaryotischen Proteinen in nativer, unverschmolzener, von Fremdpeptiden freier Form in Bakterien.

Methoden der Rekombination von DNA in vitro wurden angewendet, um verschiedene eukaryotische Gene in Plasmide, die von Escherichia coli getragen werden, einzufügen in dem Bemühen, diese Bakterien zur Bildung von eukaryotischen Proteinen zu veranlassen. Die meisten dieser Gene lenkten nicht die Synthese der nativen Proteine, weil die eukaryotischen Signale, die das Kodewort für die Auslösung der Transkription und/oder Übertragung (translation) bilden, in E. coli nicht sehr wirksam sind. Zur Lösung dieses Problems wurde u.a. die Verschmelzung des eukaryotischen Gens mit einem bakteriellen Gen vorgeschlagen. Der Prozeß führt zur Bildung eines Hybridproteins, von dem ein Teil an seinem Carboxylende durch das eukaryotische Protein gebildet wird. In einem Fall war es möglich, ein kleines biologisch aktives Protein von einem Verschmelzungsprodukt abzutrennen (K. Itakura et al, Science 198 (1977) 1056).

Die Weitergabe der Gen-Information (gene expression) findet durch Transkription in mRNA und anschließende Übertragung in Protein statt. Zur Durchführung dieser Maßnahmen muß die dem Gen vorangehende DNA eine Sequenz haben, die a) wirksame Bindung von RNA-Polymerase des Bakteriums und wirksame Auslösung der Transkription lenkt und b) das Kodewort für eine mENA bildet, die wirksame Bindung von mRNA an die Ribosomen und Auslösung der Übertragung in Protein bildet.

Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von nativem, unverschmolzenem prokaryotischem oder eukaryotischem Protein in Bakterien nach einem Verfahren_r das dadurch

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gekennzeichnet ist, daß man in ein bakterielles Plasmid ein Gen für ein prokaryotisches oder eukaryotisches Protein und einen transportablen Promoter einfügt, der aus einem DNA-Fragment besteht, das einen von RNA-Polymerase erkannten Transkriptionsauslösungspunkt und keinen Proteinübertragungs-Startpunkt enthält, wobei man den Promotor vor einem Proteinübertragungs-Startpunkt des Gens unter Bildung eines verschmolzenen Gens, das eine Hybridribosomen-Bindungsstelle aufweist, einfügt, das Plasmid in die Bakterien einfügt, um die Bakterien mit dem das Plasmid enthaltenden verschmolzenen Gen umzuwandeln, und die umgewandelten Bakterien zur Herstellung des prokaryotischen oder eukaryotischen Proteins kultiviert.

Für die Zwecke der Erfindung werden Nukleasen, Restriktionsenzyme und DNA-Ligase verwendet, um einen transportablen Promoter, der aus einem DNA-Fragment besteht, das eine Transkriptionsstelle, aber keinen übertragungsaus lösungspunkt enthält, in der Nähe des Beginns des Gens einzufügen, das das Kodewort für das gewünschte Protein bildet, um eine Hybridribosomen-Bindungsstelle zu bilden. Das durch das Bakterium aus diesem Hybrid gebildete Protein ist das native Derivat des implantierten Gens. Es wurde gefunden, daß das Endonuklease-Digestionsprodukt des lac-Operon von E. coli, ein Fragment von DNA, das einen Transkriptionsauslösungspunkt, aber keinen Übertragungsstartpunkt enthält, die erforderlichen Eigenschaften aufweist, um als transportabler Promoter im Rahmen der Erfindung wirksam zu sein, da es durch bakterielle RNA-Polymerase mit hohem Wirkungsgrad transkribiert wird.

Die gebildete mRNA enthält eine Ribosomenbindungsstelle (Shine-Dalgerno (S-D)-Sequenz), jedoch nicht das für die Auslösung der Übetragung (translation) erforderliche AUG oder GUG. Gemäß der Erfindung wird jedoch ein Hybrid, das aus der S-D -Sequenz und dem Initiator aus dem lac-Operon und der AUG-Sequenz des Gens besteht, gebildet, und ein solches verschmolzenes Gen wird wirksam übertragen

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und umgeschrieben (transcribed). Durch Verwendung der Enzyme Exonuklease III und Sl kann der Promoter in jede gewünschte Stellung vor dem Startpunkt der Übertragung des Gens gebracht werden, um optimale Proteinbildung zu erzielen. Da der Promoter an einer Restriktionsstelle vor dem ÜbertragungsStartpunkt des Gens eingefügt werden kann, kann man das Gen zuerst an der Restruktionsstelle zerschneiden, die gewünschte Zahl von Basenpaaren und etwaige einzelne verdrallte Enden (stranded tails) durch Behandlung mit Nukleasen während der geeigneten Zeit entfernen und wiederverknüpfen.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter erläutert.

Beispiel

Ein Kaninchen-ß-globin-Gen wurde zuerst in die Hin III-Stelle von PBR322, ein Plasmid der E. coli-Bakterien, über Restriktions-Enzymschnitte der ursprünglichen DNA geklont, worauf das Gen durch T4-Ligase rekonstituiert, das rekonstituierte Gen in die Hin III-Stelle unter Ver-Wendung von chemisch synthetisierten Hin III-Bindegliedern (linkers) eingefügt und mit DNA-Ligase wieder verknüpft wurde.

Der Hin III-Schnitt am Carboxy1-Ende des geklonten Gens wurde entfernt, indem teilweise mit Hin III digeriert wurde, die hierbei gebildeten Hin III-"Haftenden" mit DNA-Polymerase I von E. coli ausgefüllt wurden und mit T4-Ligase wieder verknüpft wurde. Dies hinterließ im gebildeten Plasmid einen einzelnen Hin III-Schnitt im Abstand von 25 Basenpaaren vor dem Amino-Ende des Globin-Gens.

Unterschiedliche Zahlen der 25 Basenpaare zwischen dem Hin III-Schnitt und dem den Startpunkt der Übertragung signalisierenden ATG wurden von verschiedenen Proben des geklonten Gens wie folgt entfernt: Das Plasmid wurde mit Hin III zerschnitten, für verschieden lange Zeiten von

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0,5 bis 10 Minuten mit Exo III reseziert und dann zur Entfernung von einzelnen gedrallten Enden (stranded tails) mit Sl behandelt.

Der transportable Promoter des Lac-Operon, ein RI-AIu-Restriktionsfragment von E. coli—DNA, wurde dann durch Behandlung jeder Probe des Plasmids mit Rl, das an einer einzigen Stelle etwa 30 Basenpaare oberhalb der Hin III-Steile schneidet, eingefügt, und der transportable Promoter wurde an dieser Stelle in das Plasmidgerüst eingefügt. Dies erfordert ein "Haftende" und ein "bündiges" ("flush") Ende, die beide durch die gleiche Behandlung mit Ligase verknüpft wurden.

Kolonien von E. coli, die jeweils eines dieser erhaltenen Plasmide enthielten, wurden dann für die ß-Globinherstellung unter Anwendung von RIA-Screening-Methoden ausgewählt, um die eine oder mehrere Kolonien zu finden, die ß-Globin bilden.

Das Globin-Gen im vorstehend beschriebenen Aufbau kann ein beliebiges Gen sein, das das Kodewort für prokaryotische oder eukaryotische Proteine bildet, und eine beliebige andere einmalige Restriktionsstelle kann an Stelle der Hin III-Stelle verwendet werden. Wenn die Restriktionsstelle unzweckmäßig weit vom Beginn des Gens entfernt ist, kann sie verlegt werden. (Beispielsweise kann eine Hin III-Stelle verlegt werden, indem das Plasmid mit Hin III geöffnet, mit Exo III und Sl digeriert und das erhaltene Plasmid in Gegenwart von überschüssigen Hin III-Bindegliedern wieder verknüpft wird.) Jede beliebige geeignete Restriktionsstelle kann an Stelle des R1-Punkts für die Einfügung des transportablen Promoters verwendet werden (beispielsweise Pst, BAM oder Sal I). Abschließend ist zu betonen, daß die schwierigste Stufe, das Klonen des Gens in das Plasmid, einmal erfolgt und unverändert bleibt. Das Promoterfragment überträgt

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seine Aufbau-Information (constitutive expression) auf die Zelle, so daß es leicht ist, einen Screening-Test zum Auffinden von intakten Promotern durchzuführen.

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Claims

VON KREISLER SCHÖNWALD EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler t 1973 Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selling, Köln Dr. H.-K. Werner, Köln D[!CHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF D-5000 KÖLN 1 AvK/Ax 1o. 1 .80 President and Fellows of Harvard College, Cambridge, Ma. (U.S.A.). Patentansprüche

1. Verschmolzenes Gen, das das Kodewort für eine Hybridribosomen-Bindungsstelle bildet, enthaltend den Bereich eines bakteriellen Gens, der in der Reihenfolge der Transkription den SD-Bereich und wenigstens ein dem SD-Bereich benachbartes Basenpaar enthält und mit dem Bereich eines Gens für ein prokaryotisches oder eukaryotisches Protein verschmolzen ist, der wenigstens ein Basenpaar, das einem Übertragungsstartpunkt (translation start site) benachbart ist, und den Startpunkt der Übertragung enthält.

2. Verschmolzenes Gen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem vor dem SD-Bereich den Promoterbereich des bakteriellen Gens und nach dem Übertragungsstartpunkt des Gens für das prokaryotische oder eukariotische Protein den Bereich des Gens enthält, der das Kodewort für das prokaryotische oder eukaryotische Protein bildet.

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Telefon: (0221) 131041 Ti-Ii;*: 8.·'- ¹W diipti ti · IeI. <ji..im:n ü..„_ip.,i, ,.| K.Jn

3. Verfahren zur Herstellung von nativem, unverschmolzenem prokaryotischem oder eukaryotisehern Protein in Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß man in ein bakterielles Plasmid ein Gen für ein prokaryotisches oder eukaryotisches Protein und einen transportablen Promoter
einfügt, der aus einem DNA-Fragment besteht, das einen von RNA-Polymerase erkannten Transkriptionsauslösungspunkt und keinen Proteinübertragungs-Startpunkt enthält, wobei man den Promotor vor einem Proteinübertragungs-Startpunkt des Gens unter Bildung eines verschmolzenen Gens, das eine Hybridribosomen-Bindungsstelle
aufweist, einfügt, das Plasmid in die Bakterien einfügt, um die Bakterien mit dem das Plasmid enthaltenden verschmolzenen Gen umzuwandeln, und die umgewandelten
Bakterien zur Herstellung des prokaryotischen oder
eukaryotischen Proteins kultiviert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterien Escherichia coli verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der transportable Promoter das Produkt der
Digestion eines Operons durch Restriktionsendonuklease ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der transportable Promoter das Produkt der
Digestion des lac-Operons von E. coli durch Restruktionsendonuklease ist.

7. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gen einfügt, indem man das Gen in das Plasmid klont, den Abstand zwischen dem eingefügten
Gen und einer vorhergehenden einmaligen Restriktionsstelle durch Behandlung mit einer Nuklease einstellt
und den transportablen Promoter in die Restriktionsstelle klont.

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8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gen einfügt, indem man das Gen in das Plasmid klont, den Abstand zwischen dem Gen und einer vorhergehenden einmaligen Restriktionsstelle durch Behandlung mit einer Nuklease einstellt und in die Restriktionsstelle einen transportablen Promoter klont, der durch Digestion des lac-Operons von E. coli durch
Endonuklease gebildet worden ist.