DE3110031A1 - Verschmolzene gene, ihre herstellung und verwendung derselben - Google Patents

Verschmolzene gene, ihre herstellung und verwendung derselben

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Description

Henkel, Kern, rauer Ir Harare;
Registered Representatives
before the European Patent Office
Möhlstraße D-8000 München
Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkld Telegramme: ellipsoid
131,152 Dr.F/sm
PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE Cambridge, MA / V.St.A.
Verschmolzene Gene, ihre Herstellung und Verwendung derselben
13G061/0624
- 5 Beschreibung
Die Erfindung betrifft verschmolzene Gene insbesondere zur Erzeugung eukaryotischer oder prokaryotischer Polypeptide sowie Verfahren bzw. Maßnahmen zu ihrer Bildung bzw. Gewinnung .
In der US-Patentanmeldung mit der Serial No. 3 102 vom 15. Januar 1979 wird ein Verfahren zur Erzeugung eines dicht verschmolzenen Proteins beschrieben. Bei der Durchführung dieses Verfahrens werden vor (in front of) dem Gen für das Protein eine Hybridribosomenbindestelle aus einer Shine-Dalgarno-Sequenz (an einem beweglichen Promotor hängend), mindestens zwei andere Basenpaare und die ATG (Ubertragungsbeginnstelle) des Gens für das Protein geschaffen und dann das verschmolzene Gen in einen Mikroorganismus geklont. Die Menge des erzeugten Proteins ist teilweise eine Funktion der Länge der Hybridribosomenbindestelle, d. h. des Abstands (ausgedrückt in Basenpaaren) zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und der Ubertragungsbeginnstelle. Dieser Abstand wird durch Variieren der Lage des beweglichen Promotors geändert (vgl. die genannte US-Patentanmeldung).
Wenn die Hybridribosomenbindestelle in etwa eine optimale Länge aufweist, erreicht man eine maximale Proteinerzeugung. Ein Verfahren zur Ermittlung der Promotorlage, die diese optimale Ribosomenbindestelle liefert, besteht darin, sich einer Standard-RIA-Technik zur Messung der Proteinerzeugung zu bedienen. Standardtechniken sind jedoch für einige Polypeptide mühsam durchzuführen, für andere stehen sie überhaupt nicht zur Verfügung.
Die Grenzen von Standardproteinanalysenmethoden erschweren auch die Bestimmung der Wirksamkeit einer natürlich auftretenden Ribosomenbindestelle. In ähnlicher Weise können diese Beschränkungen den Nachweis einer spontanten oder induzierten Mutation, die zu einer erhöhten Polypeptidbildung führt, erschweren oder unmöglich machen.
130061/0624
Es wurde nun ein neues Verfahren zur Ermittlung der Menge eines durch einen Mikroorganismus mit einem passenden Gen mit Kodierung für das Polypeptid (unter "Polypeptid" sind hier und im folgenden Proteine und kürzere Polypeptide zu verstehen) erzeugten eukariotischen oder prokaryotischen Polypeptids entwickelt. Hierbei wird zunächst ein eine endständige Aminogruppe aufweisender Bereich (einer Probe des gewünschten Gens) mit Kodierung für ein Fragment des eukaryotisehen oder prokaryotischen Polypeptids an einen eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Genbereich mit Kodierung für ein anderes, analysierbares Polypeptidfragment angeschmolzen. Das hierbei erhaltene verschmolzene Gen wird dann in einen Mikroorganismus geklont. Hier veranlaßt es nun die Bildung eines analysierbaren Hybridpolypeptidprodukts mit einem eine endständige Aminogruppe aufweisenden Fragment des gewünschten Polypeptids und einem eine endständige Carboxygruppe aufweienden Fragment des analysierbaren Polypeptids. Schließlich wird die Menge des analysierbaren Hybridpolypeptids, die direkt proportional zur Menge des eukaryotischen oder prokaryotischen Polypeptids ist, bestimmt.
Die geschilderten Erkenntnisse und Maßnahmen werden auch bei einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren zur Ausbildung oder Gewinnung eines auf ein gewünschtes eukaryotisches oder prokaryotisches Polypeptid kodierten Gens, von welchem eine Probe ein- oder mehrfach derart mutiert ist, daß das mutierte Gen eine Kodierung für eine größere Menge an dem gewünschten Polypeptid aufweist als nichtmutierte Proben dieses Gens, ausgenutzt. Hierbei werden zunächst Proben eines verschmolzenen Gens mit einem eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Genbereich mit Kodierung für ein analysierbares Polypeptidfragment, der an einen eine endständige Aminogruppe aufweisenden Genbereich mit Kodierung für ein Fragment des gewünschten Polypeptids verschmolzen ist, bereitgestellt. Die verschmolzenen Gene werden dann in Mikroorganismen geklont und erzeugen darin ein analysierbares Hybridpolypeptid. Danach werden sämtliche verschmolzenen Gene
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mit einer oder mehreren Spontanmutation(en), die sie zur Erzeugung einer größeren Menge Hybridpolypeptid (als durch nicht-mutierte Proben) veranlaßt (veranlassen)» selektiert, worauf aus dem (den) verschmolzenen Gen(en) durch übliche in vitro- oder in vivo-Verfahren das Gen für das gewünschte Polypeptid wiederhergestellt bzw. wiederaufgebaut wird. Das Gen kann dann ohne weiteres in einen Mikroorganismus geklont werden, um dort in reiner Form die Erzeugung größerer Mengen aj\ dem gewünschten Polypeptid zu dirigieren.
Das geschilderte Verfahren läßt sich durch Mutieren der Mikroorganismen nach der anfänglichen Klonung modifizieren. Dies erreicht man durch Einsatz üblicher Mutagene, z. B. von Röntgenstrahlen oder chemischen Mutagenen, wie Nitrosoaminen,
Das Mutationsselektierverfahren ist insbesondere im Hinblick auf Verschmelzungen, die ungeachtet der Lage des Promotors nicht zur Bildung großer Mengen an Polypeptid fähig sind, von Bedeutung. Sukzessive Mutationen liefern unter Umständen Proben, die zur wirksamen Polypeptiderzeugung fähig sind.
Die geschilderten Erkenntnisse und Maßnahmen werden auch bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von Genen mit maximal wirksamen Hybridribosomenbindestellen ausgenutzt. Hierbei werden, wie beschrieben, Proben eines verschmolzenen Gens mit einem Genbereich mit Kodierung für ein Fragment des gewünschten eukaryotischen oder prokaryotischen Polypeptide, der mit einem Genbereich mit Kodierung für ein anderes, analysierbares Polypeptidfragment verschmolzen ist, bereitgestellt. Das verschmolzene Gen liefert dann die Information für die Bildung eines analysierbaren Hybridpoiypeptidprodukts mit einem eine endständige Aminogruppe aufweisenden Fragment des gewünschten PoIypeptids und einem eine endständige Carboxygruppe aufwei-
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senden Fragment des analysierbaren Polypeptids. Vor (in front of) diesem verschmolzenen Gen wird ein beweglicher Promotor in verschiedenen Abständen plaziert, worauf diejenigen Verschmelzungen, die den Promotor an einer Stelle, an der das meiste analysierbare Hybridpolypeptid gebildet wird, enthalten, selektiert werden. Schließlich wird das Gen für das gewünschte Polypeptid wiederhergestellt und kann in dieser Form große Mengen an nichtverschmolzenem Polypeptid erzeugen.
Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher erläutert. Im einzelnen zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines generalisierten verschmolzenen Gens gemäß der Erfindung;
Fig. 2 und 3 schematische Darstellungen des Aufbaus der zwei verschmolzenen Gene gemäß der Erfindung;
Fig. 4 eine schematische Darstellung eines in vitro-Genwiederaufbaus und
Fig. 5 eine schematische Darstellung eines in vivo-Genwiederaufbaus.
Erfindungsgemäß kann man sich jedes eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Genbereichs mit Kodierung für ein analysierbares Polypeptidfragment bedienen. Der Genbereich mit Kodierung für das gewünschte Polypeptidfragment kann in den Genbereich für das andere analysierbare Polypeptidfragment an jeder Stelle, die die Analysierbarkeit nicht beseitigt, eingefügt werden.
zu dienen.
Wie aus Fig. 1 hervorgeht, enthält ein den Geneinbau erleichterndes verschmolzenes Gen gemäß der Erfindung von rechts nach links einen ersten, eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Genbereich mit Kodierung für ein analysierbares Polypeptidfragment an einen zweiten, eine endständige Aminogruppe aufweisenden Genbereich mit einer Restriktionsstelle angeschmolzen. "Links" und "rechts" dienen zur Bezeichnung von Stellungen, die früher bzw. später kopiert (transcribed) werden. Wenn der betreffende Bereich nicht von Hause aus eine solche Stelle trägt, wird in den Bereich eine für mindestens ein Restriktionsenzym empfindliche DNS-Kopplung eingefügt. Die natürliche Restriktionsstelle oder DNS-Kopplung dient als Stelle für die Einfügung eines dritten Genbereichs, d. h. eines eine endständige Aminogruppe aufweisenden Bereichs eines Gens für ein Fragment eines gewünschten prokaryotischen oder eukaryotischen Polypeptids, in den zweiten Genbereich. Dieser Bereich kann seine eigene Ubertragungsbeginnstelle (ATG) aufweisen oder keine derartige Stelle besitzen. In letzterem Falle kann eine solche Stelle an das linke Ende des gewünschten Genbereichs angeschmolzen werden.
Vor (in front of) dem dritten Genbereich befindet sich ein Promotor mit einer Kopierbeginnstelle und einer Shine-Dalgarno-Sequenz. Bei diesem Promotor handelt es sich entweder um einen natürlichen Promotor oder - bei dem Verfahren, bei dem die Promotorlage geändert wird - um einen beweglichen Promotor.
Zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz Und der Ubertragungsbeginnstelle befinden sich immer mindestens zwei Basenpaare. Bei dem nicht mit-einem beweglichen Promotor arbeitenden Testverfahren bilden sie selbstverständlich einen Teil des natürlichen DNS-Strangs mit dem gewünschten Gen. Bei dem
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Verfahren, bei dem die Promotorlage variiert wird, hängen diese Basenpaare entweder von Hause aus an der Promotor-Shine-Dalgarno-Sequenz und/oder dem gewünschten Gen.
Wenn die Basensequenz des Genbereichs für das gewünschte Polypeptidfragment soweit bekannt ist, daß auch der richtige Leserahmen (reading frame) für diesen Genbereich bekannt ist, wird, falls erforderlich, eine DNS-Kopplung derart angeordnet, daß der gewünschte Genbereich nach der Einfügung mit dem ersten Genbereich in Phase ist. Wenn die Sequenz nicht genügend bekannt ist, kann der gewünschte Genbereich in drei verschiedene Verschmelzungen mit unterschiedlich angeordneten Kopplungen eingefügt werden. Die Kopplungen können irgendwo auf dem zweiten Genbereich angeordnet werden, wobei lediglich drei Stellungen erforderlich sind, um sämtliche drei möglichen Leserahmen abzudekken. Die Kopplungslage, die eine übertragung des speziellen Genbereichs, der rastermäßig in den ersten Genbereich kommen soll (desired to proceed in frame into the first gene region), muß bei diesem Genbereich benutzt werden»
Zur Bereitstellung von verschmolzenen Genen mit dem optimal plazierten Promotor wird ein beweglicher Promotor an Proben der beschriebenen Verschmelzungen in verschiedenen Abständen von der Lage der Übertragungsbeginnstelle angebracht. Die Proben der an Promotoren hängenden verschmolzenen Gene werden dann in Mikroorganismen geklont. Die das Promotorfragment in optimalem Abstand von der Übertragungsbeginnstelle tragenden verschmolzenen Gene werden aufgrund ihrer Bildung der größten Menge an analysierbarem Hybridpolypeptid erkannt und selektiert. Danach wird das Gen für das gewünschte eukaryotische oder prokaryotische PoIypeptid mit dem optimal plazierten Promotor wiederaufgebaut. Der Wiederaufbau erfolgt an derselben Verschmelzungsprobe, die für den Polypeptidtest bzw. die Polypeptidanalyse verwendet wurde oder an einer Probe dieser Verschmelzung, die vor Durchführung des Polypeptidtests bzw. der Polypeptid-
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analyse beiseite gestellt wurde. Da nach Durchführung der Polypeptidanalyse der optimale Promotorabstand bekannt ist, kann ferner ein beweglicher Promotor bei einer anderen Verschmelzungsprobe im optimalen Abstand eingesetzt werden. Die Wiederherstellung bzw. der Wiederaufbau erfolgt dann mit dieser Verschmelzung. Nach der Wiederherstellung vermag das Gen ohne weiteres in einem Mikroorganismus die Erzeugung einer maximalen Menge des gewünschten Polypeptids in reiner Form zu dirigieren.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher veranschaulichen.
Beispiel
Es werden drei Plasmide, nämlich pLG 200, pLG 300 und pLG 400, aufgebaut. Jedes besitzt eine durch ein Restriktionsenzym verwundbare Stelle in einem anderen übertragungsleseräster auf einem Bereich des lacI-Gens. Jedes der drei Plasmide enthält auch einen Bereich des lacZ-Gens mit Kodierung für ein analysierbares Fragment des Polypeptids ß-Galactosidase. Die Plasmide pLG 300 und pLG 400 werden aus dem Plasmid pLG 200 aufgebaut. Letzteres wird seinerseits entsprechend Fig. 2 aufgebaut.
Zunächst wird das Plasmid pLG 2 mit einer lacI-lacP-lacZ-GenverSchmelzung wie folgt aufgebaut; Ein Eco RI-Fragment aus pMC4 mit dem intakten lacI-Gen, dem lac-Promotor und einem eine endständige Aminogruppe aufweisenden Bereich von lacZ wird mit einem Eco RI-stumpfendigen Fragment (aus Ai12, beschrieben in Ptashne in The Operon, Miller und Mitarbeiter, Herausgeber, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1978) mit" dem eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Bereich von lacZ verbunden, wobei ein Fragment
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mit einem intakten lacI-lacP-lacZ-Bereich entsteht. Dieses Fragment wird in ein Rückgrat mit pBR 322-DNS von der RI-Stelle bis zur PvuII-Stelle eingefügt, wobei das Plasmid pLG 2 entsteht.
Danach wird ein lacl-lacZ-verschmolzenes Gen durch in vivo-Rekombination auf pLG 2 gekreuzt, wobei das Plasmid pLG 5 entsteht. Dieses Plasmid wird dann teilweise mit PvuII verdaut (digested). Der die endständige Aminogruppe aufweisende Bereich des lacI-Bereichs wird durch eine Hin d III-Kopplung ersetzt, wobei pLG 200 entsteht. Dieses sorgt nach Öffnung an der Hin d III-Stelle für einen der drei möglichen Übertragungsleseraster.
Das Plasmid pLG 300, das einen zweiten Leseraster zu liefern vermag, wird wie folgt aus pLG 200 aufgebaut. Das pLG 200 wird mit Hin d III zerschnitten. Die Enden werden mit DNS-Polymerase gefüllt. Schließlich wird eine Bam-Kopplung eingefügt. Hierbei entsteht"dann pLG 300.
Zur Schaffung des dritten Leserahmen wird pLG 300 mit Barn zerschnitten. Nach Auffüllung wird schließlich noch eine Hin d III-Kopplung eingefügt, wobei pLG 400 entsteht.
Gemäß Fig. 3 wird ein Bereich eines Gens für ein gewünschtes Polypeptid, nämlich Kaninchen-ß-globin, in das Plasmid pLG 300 eingefügt, indem ein aufgefülltes Pst-Bam-Globinfragment aus pGL 6 mit einem aufgefüllten Pst-Bam-Rückgratfragment von pLG 300 unter Bildung von pLG 302 verknüpft wird.
In wechselnden Abständen vor der Ubertragungsbeginnstelle des verschmolzenen Gen wird ein lac-Promotorfragment eingefügt. Dies geschieht gemäß den Lehren der bereits genannten US-Patentanmeldung mit der Serial No. 3 102. pLG 302 wird mit Hin d III geöffnet, mit Endonuklease III und S1" (oder BaI 131) reseziert und dann mit Pst geschnitten, so daß ein Promotorfragment mit einem Pst-Ende und ein stumpfes Ende eingefügt werden können.
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Plasmide mit Promotoren an wechselnden Abständen vom Ausgangspunkt des verschmolzenen Gens werden in E. coli geklont und auf einem Indikatoragar, der seine Farbe in Abhängigkeit von der Menge des durch die Bakterien gebildeten ß-Galactosidase graduell ändert, wachsen gelassen. Diejenigen Kolonien, die die größte Farbänderung hervorrufen, werden als Kolonien mit optimaler Promotorlage selektiert.
Gemäß Fig. 4 wird das intakte ß-Globingen in vitro wie folgt wiederhergestellt: Von den selektierten Plasmiden wird das RI-Sau 3A-Fragment mit dem lac-Promotor und der eine endständige Aminogruppe aufweisenden Kodierstelle des ß-Globingens dargestellt. Dieses Fragment wird mit einem Bam-Alu-Fragment aus pßG1 (vgl. Efstratiadis und Mitarbeiter in "Cell", Band 10, Seiten 571 bis 585 (1977)) mit dem eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Kodierbereich des ß-Globingens verknüpft. Das wiederaufgebaute bzw. wiederhergestellte Gen wird dann in ein RI-PvuIII-Rückgrat von pBR 322 eingefügt. Dieses wiederhergestellte bzw. wiederaufgebaute Gen dirigiert nach der Klonung in E. coli und dessen Züchtung die Bildung bzw. Erzeugung maximaler Mengen des gewünschten Kaninchen-B-globins.
Gemäß Fig. 5 läßt sich bei einer weiteren Probe das ß-Globingen in vivo wie folgt wiederaufbauen bzw. wiederherstellen; Die Verschmelzung mit dem optimal angeordneten Promotor wird in ein Plasmid mit einem Marker für Ampicillinresistenz eingefügt. Dieses Plasmid wird dann mit einem weiteren Plasmid, das den fehlenden Teil des Gens für das ß-Globin plus einen kleinen Oberlappungsbereich zur Gewährleistung einer Homologie für die genetische Neu- bzw. Rekombination gekreuzt. Letzteres Plasmid trägt keinen lac-Promotor, es trägt jedoch einen Marker für Tetracyclinresistenz. Die gewünschte Neukombination trennt den lac-Promotor von dem ß-Galactosidasegen. Diese Neukombination ist somit aus anderen Neukombinationen mit Resistenz gegen beide Antibiotika aufgrund seines lac-Phenotyps identifizierbar.
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Die beschriebenen Wiederaufbaumaßnahmen entsprechen den Wiederaufbaumaßnahmen, die nach Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Selektion passender, spontan oder durch induzierte Mutation mit Hilfe von Mutagenen entstandener Mutanten, durchführbar sind.
Andere Ausführungsformen bewegen sich ebenfalls im Rahmen der Erfindung. So kann beispielsweise der Genbereich für ein analysierbares Polypeptid mit anderen lacI-Genen verschmolzen werden. Ein Beispiel hierfür ist das t-Antigen des Simian Virus (vgl. Robert und Mitarbeiter in "Proc. Natl. Acad. Sei." USA, Band 76, Seiten 5596 bis 5600 (1979)). Weitere geeignete Gene, z. B. Male und lamB, werden von Bassford und Mitarbeitern in "The Operon", Miller und Mitarbeiter, Herausgeber, Seiten 245 bis 261, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1978, beschrieben. Gene für Polypeptide, die im eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Bereich analysierbar sind und anstelle des ß-Galactosidasegens verwendet werden können, sind beispielsweise die E. coli trpC- und trpD-Gene mit Kodierung für zwei Polypeptide. Jedes besitzt zwei spezifische enzymatische Aktivitäten bei der Tryptophanbiosynthese. Weitere Beispiele sind Hefegene mit Kodierung für enzymatisch aktive Polypeptide. So besitzt beispielsweise ein solches Hefegen eine Kodierung für ein Polypeptid mit drei enzymatischen Aktivitäten bei der Histidinbiosynthese.
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Claims (10)

Patentansprüche
1. Verschmolzenes den mit einem ersten, eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Genbereich mit Kodierung für ein analysierbares (assayable) Polypeptidfragment und einem zweiten, eine endständige Aminogruppe aufweisenden und mit dem Genbereich mit endständiger Carboxygruppe verschmolzenen Genbereich mit einer Restriktionsstelle.
2. Verschmolzenes Gen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen dritten, eine endständige Aminogruppe aufweisenden Genbereich mit Kodierung für ein Fragment eines eukaryotischen oder prokaryotischen Polypeptide, der sich an der Restriktionsstelle befindet, enthält.
3. Verschmolzenes Gen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es vor (in front of) dem dritten Genbereich eine Ubertragungsbeginnstelle (translation start site) und einen beweglichen (portable) Promoter mit Kopierbeginnstelle (transcription start site) aufweist.
4. Verfahren zur Bestimmung der Menge eines eukaryotischen oder prokaryotischen Polypeptids, das durch einen Mikroorganismus mit einer passenden Genkodierung für dieses Polypeptid erzeugt wurde, dadurch gekennzeichnet, daß man einen eine endständige Aminogruppe aufweisenden Bereich einer Probe des betreffenden Gens mit einem eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Genbereich mit Kodierung für ein anderes, analysierbares Polypeptidfragment verschmilzt, um ein verschmolzenes Gen mit Kodierung für ein analysierbares Hybridpolypeptid zu erzeugen, daß man das verschmolzene Gen in einen Mikroorganismus klont und daß man die (zur Menge des eukaryotischen oder prokaryotischen Proteins direkt proportionale) Menge an dem durch das verschmolzene Gen in dem Mikroorganismus erzeugte Menge an dem analysierbaren Hybridpolypeptid ermittelt.
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5. Verfahren zur Erzeugung eines verschmolzenen Gens mit Kodierung für ein gewünschtes eukaryotisches oder prokaryotisches Polypeptid/ wobei eine Probe des verschmolzenen Gens seinen beweglichen Promotor in optimalem Abstand von seiner Übertragungsbeginnstelle aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man Proben eines zur Kodierung für ein analysierbares Hybridpolypeptid fähigen verschmolzenen Gens mit einem eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Genbereich mit Kodierung für ein analysierbares Polypeptidfragment, das an einen eine endständige Aminogruppe aufweisenden Genbereich mit Kodierung für ein Fragment des gewünschten eukaryotischen oder prokaryotischen Polypeptids verschmolzen ist, bereitstellt, daß man den beweglichen Promotor in wechselnden Abständen vor der übertragungsbeginnstel-Ie der Proben des verschmolzenen Gens einfügt, daß man die Proben des verschmolzenen Gens in Mikroorganismen klont, daß man das durch die verschmolzenen Gene in den Mikroorganismen erzeugte analysierbare Hybridpolypeptid analysiert, daß man das die größte Menge an dem analysierbaren Hybridpolypeptid erzeugende verschmolzene Gen selektiert und daß man aus dem selektierten verschmolzenen Gen das Gen mit Kodierung für das gewünschte eukaryotische oder prokaryotische Polypeptid wiederherstellt.
6. Verfahren zur Erzeugung eines Gens mit Kodierung für ein gewünschtes eurkaryotisches oder prokaryotisches Polypeptid, wobei eine Probe des Gens ein- oder mehrfach derart mutiert ist, daß das mutierte Gen im Vergleich zu nichtmutierten Proben des Gens für eine größere Menge an dem gewünschten Polypeptid kodiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß man Proben eines zur Kodierung für ein analysierbares Hybridpolypeptid fähigen verschmolzenen Gens mit einem eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Genbereich mit Kodierung für ein analysierbares Polypeptidf ragment, das an einen eine endständige Aminogruppe aufweisenden Genbereich mit Kodierung für ein Fragment
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des gewünschten eurkaryotischen oder prokaryotischen Polypeptids verschmolzen ist, bereitstellt, daß man die Proben des verschmolzenen Gens in Mikroorganismen klont, daß man das durch die verschmolzenen Gene in den Mikroorganismen erzeugte analysierbare Hybridpolypeptid analysiert, daß man das im Vergleich zu nichtmutierten Proben des verschmolzenen Gens eine größere Menge an dem analysierbaren Hybridpolypeptid erzeugende mutierte verschmolzene Gen selektiert und daß man aus dem selektierten verschmolzenen Gen das Gen mit Kodierung für das gewünschte eukaryotische oder prokaryotische Polypeptid wiederherstellt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Klonung des verschmolzenen Gens in Mikroorganismen die betreffenden Mikroorganismen mutiert.
8. Verschmolzenes Gen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Genbereich aus einem Genbereich mit Kodierung für E. coliß-Galactosidase und der zweite Genbereich aus einem Genbereich mit Kodierung für einen E. coli-Hemmer (repressor) besteht.
9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Genbereich mit Kodierung für das analysierbare PoIypeptidfragment aus einem Bereich für das E. coli-Gen mit Kodierung für ß-Galactosidase besteht.
10. Verfahren nach Ansprüchen 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Genbereich mit Kodierung für das analysierbare Polypeptidfragment aus einem Bereich für das E. coli-Gen mit Kodierung für ß-Galactosidase besteht.
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