DD212403A5

DD212403A5 - Verfahren zur synthetisierung von rinderwachstumshormon

Info

Publication number: DD212403A5
Application number: DD81252964A
Authority: DD
Inventors: Walter L Miller; Joseph A Martial; John D Baxter
Original assignee: Univ California
Priority date: 1980-08-26
Filing date: 1981-08-26
Publication date: 1984-08-15
Also published as: PT73569B; JPS57171999A; JP2534221B2; EP0047600A2; ES8305828A1; IL63628A0; DD204711A5; ES514526A0; IE52755B1; AU544453B2; FI812614L; IL63628A; RO105533B1; DK372881A; SU1471949A3; PH22847A; CA1225948A; PH21216A; ATE72833T1; CZ280596B6

Abstract

Verfahren zur Synthetisierung von Rinderwachstumshormon, gekennzeichnet durch Inkubieren eines Mikroorganismus, der durch einen Expressionstransfervektor transformiert wurde, der eine fuer das Rinderwachstumshormon kodierende Desoxynukleotidsequenz aufweist, die durch Umsetzen einer fuer Rinder-Praewachstumshormon kodierende Desoxynucleotidsequenz mit einem durch Spalten eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzyms erhaltenen DNS-Molekuel erhalten und repliziert wurde, wobei die cDNS, die fuer Rinder-Praewachstumshormon codiert, mit dem Restriktionsenzym Hae II gespalten wurde und das gespaltene Produkt mit einem Enzym der Gruppe, die aus dem Klenow-Fragment von DNS-Polymerase I, T4-DNS und 3'-5'-Exonuklease besteht, inkubiert wurde, sowie Abtrennen des Rinderwachstumshormons aus dem Lysat oder dem Kulturmedium des Mikroorganismus.

Description

- A-

Berlin, den 6.7·1983

III« Ausscheidung aus 59 677/18

APC 12 21/232 811/2

62 586/18

Verfahren zur Synthetisierung von Rinderwachstumshormon

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Srfindung betrifft ein Verfahren zur Synthetisierung von Rinderwachstumshormon«

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Wachstumshormon ist ein Polypeptid-Hormon, welches in der Adenohypophyse (Hypophysen-Torderlappen) synthetisiert und durch die Adenohypophyse sekretiert wird· Das Wachstumshormon wird als ein Vorläuferprotein (Prä-Wachstumshormon) aiit einem iJ-terminalen Signalpeptid und der Wachstumshormon-Sequenz synthetisiert·

Die Aminosäuresequenz für bovines Wachstumshormon ist ermittelt worden (Dayhoff, M. D« et al«, Atlas of Protein Sequence and Structure· Bd* 5, Nachtr· 3, 245 - 352, lätional Biomedical Research Foundation, Washington, D«.C« (1978))·

Normalerweise wird Wachstumshormon während des gesamten Lebens produziert, wenngleich die Produktion der größten Mengen während der Periode vor dem Srwachsenenstadium erfolgt. Das Hormon wird für das Wachstum in dieser Periode benötigt. Obwohl sein Mechanismus noch nicht bis ins Detail geklärt ist, so ist doch bekannt, daß Wachstumshormon das Skelettwachstum, die Stickstoffretention und die Proteinsynthese fördert sowie den Glukose- und Lipidmetabolismus beeinflußt. Mit anderen Worten: Wachstumshormon ist ein

w ,ηη.

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allgemein anabolisch wirkendea Agens«

Die Verwendungen von bovinem Wachstumshormon basieren auf seiner oben beschriebenen bekannten biologiachen Aktivität. Bovines Wachstumshormon kann Jungrindern zwecks Steigerung ihrer Wachstumsgeschwindigkeit und ihres Masaezuwachaes verabreicht werden, wodurch die zwischen Geburt und Hindfleischvermarktung liegende Zeitspanne verkürzt wird« Der daraus resultierende "Anstieg der Fleischproduktion könnte beträchtlich sein. Des weiteren unterscheidet sich bovines Wachstumshormon von ovinem Wachstumshormon durch lediglich einige wenige Aminosäuren. Polglich kann bovines Wachstumshormon an Schafe verabreicht werden, um dort die gleichen Ziele wie beim Hind, also steigende ?/achstumsrate, steigenden Zuwachs und damit steigende Fleischproduktion zu erreichen. Ss iat darüber hinaua möglich, in Verfolgung der eben genannten Zwecke bovines Wachstumshormon auch an Schweine und andere Tierarten zu verabfolgen.

Inzwischen sind grundsätzliche Techniken zur Klonung von DNS-Sequenzen bekannt. So beschreiben beispielsweise Seeburg, P. H. et al., Hature, 270, 486 (1977) das Klonen des Ratten-Wachatumshormon-Gensj Shine, J, etal., Hatare«^270« 494 (1977) beschreiben das Klonen des humanen Somatomammotropin-Gens; Derynck, R. et al., Hature« 285% 542 (1980) schließlich beschreiben das Klönen des"humanen Fibroblast-Interferon-Gens.

Methoden zur Darstellung heterologer DNS in einem Mikroorganismus sind nunmehr ebenfalls bekannt. Im Prinzip wird die die heterologe DNS codierende Sequenz an einem Punkt innerhalb eines darstellbaren Operons in einen DNS-Übertragungsvektor inseriert. Für die Produktion eines Hybridproteins

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muß sich die inserierte Sequenz mit der codierenden Sequenz des Operons in der Ableserahmen-Fhase befinden und hinsichtlich der Translation gleichartig ausgerichtet sein« Sind diese Bedingungen gegeben, dann resultiert die Translation des Operons in einem "Durchlesen" zur inserierten codierenden Sequenz dergestalt, daß es sich bei dem so erzeugten Protein um ein i"usionsprotein handelt, welches eine durch das expressible Operon codierte 2ä-terminale Aminosäuresequenz enthält, der sich wiederum eine durch die Einlagerung codierte Aminosäuresequenz anschließt. Siehe hierzu Polisfcy, B. et al·, Proo« Hat, Acad. Sei« USA, 73, 3900 (1976) sowie Itakura, £« et al., Science% 198, 1056 (1979). Verschiedene expressible Operons sind bereits verwendet worden, darunter ^ene für ß-Galaktosidase, ß-Laktamase und Tryptophan«

Die im Torliegenden Text verwendeten Abkürzungen werden allgemein anerkannt und von kompetenten Fachleuten benutzt. So sind beispielsweise diese Abkürzungen durch das J. Biol« Qhem,. ohne weitere Erläuterung angenommen worden«

Ziel der Erfindung

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich, den ^leischzuwachs bei Nutzvieh zu beeinflussen«

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sur Synthetisierung von Rinderwachstumshormon zur Verfugung zu stellen«

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In einer der Torilegenden Verkörperungen ist das Verfahren zur Herstellung eines die Rinderpräwachstumshormon-Sequenz enthaltenden DHS-Übertragungsvektors dadurch gekennzeichnet, daß eine das Rinderpräwaehstumshormon codierende Desoxynukleotidsequenz mit einem DJÜS-Molekül reagiert, welches durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde.

In einer anderen Verkörperung iat die Methode weiter dadurch gekennzeichnet, daß die RinderpräWachstumshormon codierende Desozynukleotidsequenz einen Plus-Strang der folgenden Sequenz aufweist:

5^f - AIDG ATG GCT GGA GGG CCC GGG ACC TCG GTG

CTG GTG GCT TTC GCC CTG CTC TGC CTG GCC TGG ACT CAG GTG

GTG GGC GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC

AAC GCT GTG GTG GGG GGT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT

GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CGG GAG GGA

GAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC

TCC GAA ACC ATC CCG GCG CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC GAG

CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG GTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG GTT GGG CCD CTG GAG TTT CTC AGC AGA GTC

TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT

GAG AAG CTG IAG GAC GTG GAG GAA GGC ATC TTG GCG CTG ATG

CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC GTC

AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC

GAC GCG CTG GTG AAG AAC TAC GGT GTG CTG TCC TGC TTC CGG

AAG GAG CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG - 3¹»

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A = Desozyadenyl, G = Desoxyguanyl, C = Desosyzytosyl and T = Thymidyl

In einer zusätzlichen Verkörperung wird eine Methode zur Herateilung einer bovines Rinderwachstumshormon codierenden Desoxynukleotidsequenz dadurch gekennzeichnet, daß eine bovines Rinderpräwachstumshormon codierende cDBB-Desoxynukleotidaequenz' mit dem Restriktionsenzym Hae II gespalten und das gespaltene Produkt mit einem Enzym inkubiert wird, das aus der das Klenow-Pragment von DUS-PoIymerase I, T4-DUS-PoIymerase oder 3'•••5^I-S2onuklease enthaltenden Gruppe' ausgewählt wurde.

In einer wieder anderen Verkörperung ist die Methode der Herstellung der bovinen Wachstumshormon-Sequenz weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mit dem genanten Klenow-Fragment in Anwesenheit von dATP durchgeführt und das daraus resultierende Produkt mit S1-Uuklease verdaut wird, wobei eine die Aminosäure 2»·«191 von bovinem Wachstumshormon codierende Desoxynukleotidsequenz gewonnen wird, was wiederum in einer bovines Wachstumshormon codierenden Desoxyntikleotidsequenz resultiert, welche einen Plus-Strang der folgenden Sequenz aufweist:

5» - TTC CGA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GGT GTG CTC GGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCC GAG GGA GAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC

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GAG GAG AAA TGA GAC TTG- QM CTG GTT CGG ATC TGA CTG CTG GTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC IGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCO CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT CAC AAA TTT GAC ACA AAC AIG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GCT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG CAG ACG PAC CTG AGG CTC ATG, AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG -3%

wöbe i

A β Desoxyadenyl, G = Desoxyguanyl, Cs Desoxyzytosyl und T = Thymidyl

In noch einer anderen Verkörperung ist die Methode zur Herstellung der boTinen T/achstumshormon-Sequenz weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mit dem. genannten Klenow-Fragment in Anwesenheit von dATP, dGTP, dCtP und dTTP durchgeführt wird und das daraus entstehende Produkt in Anwesenheit von dCTP mit einem Enzym inkubiert wird, welches aus der aus dem genannten Klenow-?ragment, T4-DiTS-Polymerase oder 3¹·..5^f-Exonuklease bestehenden Gruppe ausgewählt wird und schließlich gekannzeichnet dadurch, daß das hieraus resultierende Produkt mit.S1-3ndonuklease verdaut wird, wobei eine die Aminosäuren 1·.,191 des bovinen Wachstumshormons codierende Deaocynulcleotidsequenz gewonnen wird, was wiederum in einer bovines Wachstumshormon codierenden Desoxynukleotidsequenz resultiert, welche einen Plus-Strang der folgenden Sequenz aufweist:

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5* - GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC-AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG GAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCÜ GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG -3%

A s Desax^adenyl, G = Desoxyguanyl, C = Desoxyaytosyl and T = Thymidyl

In einer zusätzlichen Verkörperung ist das dis bovine Prä-" Wachstumshormon-Sequenz enthaltende Plasmid pBP348 dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym hergestellten DUS-Molekül um pBR322 und bei dem Restriktionsenzym um Pst I handelt·

In einer wieder anderen Verkörperung ist ein Verfahren zur Herstellung eines die bovine Wachstumshormon-Sequenz enthaltenden DliS-Übertragungsvektors dadurch gekennzeichnet,

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daß die hergestellte, das bovine Wachstumshormon codierende Desoxynukleotid-Sequenz mit einem DJJS-MoIeicül zur Reaktion gebracht wird, welches durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde.

In einer noch anderen Verkörperung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Bxpressions-Übertragungsvektors dadurch gekennzeichnet, daß das durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym, erzeugte DHS-Holekül an einem Punkt innerhalb einer expressiblen Kontrollregion gespalten wird·

In einer zusätzlichen Verkörperung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Pusionsproteins, welches die Aminosäuresequenz von bovinem Prä-Wachstumshormon oder die Aminosäuresequenz von bovineta Wachstumshorsion als O-terminales Ende und einen Teil eines prokaryotischen Proteins als H-terminales Ende umfaßt, durch Inkubieren eines Mikroorganismus gekennzeichnet, welcher durch einen Ezpressions-Übertragungsvektor transformiert wurde, wobei dieser eine das genannte bovine Prä-Wachstumshormon oder das genannte bovine Wachstumshormon codierende Desoxynukleotidsequenz enthält.

In wieder einer anderen Verkörperung ist ein Verfahren zur Synthese von bovinem Wachstumshormon durch Inicubieren eines durch einen Sxpressions-Übertragungsvektor transformierten Mikroorganismus sowie durch Herausreinigen des bovinen Wachstumshormons aus dem Lyset oder Kulturmedium des genannten Mikroorganismus gekennzeichnet, wobei der genannte Übertragungsvektor eine Desoxynukleotidsequenz enthält, welche das genannte bovine Wachstumshormon unter Bedingungen codiert, die für die Darstellung der genannten bovines Wachstumshormon codierenden Sequenz geeignet sind.

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Die vorliegende Erfindung offenbart insbesondere das Klonen einer das bovine Prä.»Wachstumsiiormon oder das bovine Wachstumshormon codierenden DHS sowie die Darstellung der geklonten DIiS in einem Mikroorganismus·

Aus bovinen Hypophysen wird mRUS isoliert, welche das bovine Prä-Wachstumshormon codiert· Sine umgekehrte Abschrift (eine cDSS-Kopie) der mRHS wird hergestellt und in einen Übertragungsvektor inseriert* Sine daa bovine Wachstumshormon codierende Desoxynukleotid-Sequenz wird durch Hydrolysieren der die Prä-Sequenz der cDUS für bovines Wachstumshormon codierenden Sequenz zubereitet« Der übertragungsvektor wird zur Transformierung von Bakterien verwendet, mit deren Hilfe die geklonte cDIIS dargestellt wird«

Durch Anwendung der cDUS-Methode wird eine.das bovine Wachstumshormon codierende DSTS-Sequens gewonnen. Die grundlegenden Techniken der cDHS-Methode sind bekamt und können den Darlegungen von Seeberg, P. H₊ et al« (siehe oben) sowie Derynck, R. et al« (siehe oben) entnommen werden« Die cDUS wird unter Verwendung einer RUS-Präparation synthetisiert, weiche aus bovinen Hypophysen - als Schablone - extrahiert wurde.

Die RHS wird mittels herkömmlicher Techniken aus bovinen Hypophysen isoliert» Polyadenylierte RUS wird mittels Af finitäts-Chromatografie isoliert. Die Reinheit der polyadenylierten RIiS wird durch Vornehmen einer zellfreien Translation der polyadenylierten RIiS gemäß Beschreibung von Miller, W. L. und McCarthy, B, J., J. Biol. Ghenu, 254, 742 (1979) sowie Martial, J, Α« et al.; Proc« ffat.'Acad« Sei. USA ₄ 74« 1816 (1977) und durch Analysieren der produzierten Proteine durch' SDS-Akrylamid-Gel-Elektrophorese gemäß Beschreibung

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von Laemmli, U, Κ», Hature« 227« 680 (1970) abgeschätzt. Bovines Wachstamshormon wird'des weiteren. durch eine von Martial» J. Α« et al·, Proc, flat» Acad, Sei· USA (siehe oben) beschriebene Immunpräzipitations-Reaktion identifiziert.

Die polyadenylierte RUS wird als Schablone unter Anwendung herkömmlicher Techniken zur Herstellung einer doppelstängi- gen cpHS-Kopie verwendet. Der—erste cDITS-Strang wird mittels umgekehrter Transkriptase, mittels eines Qligo-dT-Primers und der polyadenylierten RES gemäß Beschreibung von Miller und McCarthy (siehe oben) sowie Monahan, J, J, et al·, BJochen,« 1{5« 223 (1976) synthetisiert. Die RUS wird durch Alkaliverdäuung entfernt, und die einstrangige cDHB wird zur Selbst-Primung der Synthese des zweiten Stranges durch umgekehrte Transkriptase verwendet. Die einstrangige Haarnadelschleife wird durch Verdauung mit S1-STuklease (Leong, J, Δ«- et al·, J. Virol,« ^, 891 (1972) beseitigt, wie dies von Ullrich, A; et al., Science, 196« 1313 (1977) beschrieben 7furde· " " "

Die cDÜS ist nun zur Insertion in- einen geeigneten.Übertragungsvektor bereit. Zu den geeigneten übertragungsvektoren gehören jene, welche in der Lage sind, Bakterien wie etwa Escherichia coli und Bacillus subtilis« Hefe (Saccharom^ces cerevisise)» die inl-, csp- und esp-mutanten Stämme von fleoroapora"crassa und tierische Zellen in Gewebekultur zu transformieren, Beispiele für Übertragungsvektoren, die aur Anwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind und S, coli transformieren können, umfassen die Pla.smide pSC101, pMB9, pBR313, pBR315, pBR3i6 and pBR322 sowie die vom Bakteriophagen abgeleiteten Vektoren, d, h, Charon

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16A OQd gtWES

B..

In Tabelle 1 sind Quellen aufgeführt,. Ια denen die Präparation und die kennzeichnenden Merkmale dieser Übertragungsvektoren beschrieben werden«

tabelle 1

Übert rag ungsvektor

Quelle/en

pSC101

pBR 313

pBR 315 pBH 316 pBR 322

Charon 3A Charon 4A Charon 16A gtWES ♦ B

Cohen, et al«, Proc. Hatl· Acad· Sei« USA

10, 1293 und 3240 (1977).

Boyer, et al·, Resombinant Molecules, Beers,

et al·, Eds, Raven Press, IY, Seite

(1977).

Cohen et al·, Recombinant Molecules^, Seite

Rohriguea et al♦, Molekular Mechanismus in

Control of Gene Expression (ICH-UClA

Symposium on Mol, & Cell· Biol· Bd; 5),

Uieslich et al·, Eds· Academic Press,

SY, Seite 471 (1976).

Bolivar, et al·, Gene, 2, 75 (1977)·

Bolivar et al· (siehe oben)

Rodriguez et al·, (siehe oben)

Bolivar et al,, Gehe, 2,95 (1977)*

Bolivar et al., Gene, A, 121 (1978).

Sutcliffe, Cold Spring'Harbor-'Symp, on Quant.

Biol., 41, 77 (1978).

Blattner et al., Science, 196, 161 (1977).

Blattner et al·, (siehe oben)*

Blattner et al·, (siehe oben).

Tremeier et al., Bature, 263, 526 (1976).

Leder et al., Science, 196, 175 (1977).

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Andere ζor Transformierung von S« coli geeignete Vektoren sind bei Sinsheimer, R« L«, Ann; Her,"Biochem« 46,415 (1977) beschrieben« Zur Transformierung von B« sahtilia geeignete Übertragungsvektoren sind von lordanescu, S«, J. Bacteriol« 1241 597 (1964) und Ehrlich, S. D«, Proc« Uatl« Acäd, Sei; USA 74« 1680 (1977) beschrieben worden* Ein derartiger Vektor ist als Plasmid pC194 identifiziert worden* Hybridplasmide mit Gehalt am Hefe-DHS '·.— sowohl Plasmidals auch/oder chromosomaler DIiS --and bakterieller DHS — ζ. B· Plasmid — werden aur Transformierung von Hefe verwendet« Derartige Plasmide sind von Beggs, J« D«». Mature, ^25» ¹°4 (1978)} Asiav, C« L. und Garbon, J., Proc« latl« Acad« Sei« USA 76, 3829 (1979) sowie von Singsman,Ά« K« et al«/ Gene 7, 141 (1979) beschrieben worden« Za den Übertrag ungsVektoren, die zur Transformierung von Tierzellen in Gewebekulturen verwendet werden können, gehören das Adenodefektive Virus, das SV-defektive Virus und das Polvoma-Virus«

.Unter Anwendung konventioneller Techniken wird die cDSS in einen Übertragungsvektor inseriert. Die cDHS wird gewöhnlich in irgendeine im Übertragungsvektor nur einmal existierende Restriktionsstelle inseriert« Charon 3A und 4A sowie auch gt WES · B enthalten keine solchen einmaliehen Stellen; für diese Vektoren werden demzufolge Restriktionsstellen, von begrenzter Anzahl herangezogen« Die einmaligen Restriktionsstellen in den verschiedenen übertra-

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gungavektoren und die nutzbaren Reatriktionsstellen in den Vektoren Charon 3A und 4A sowie gt WSS » B sind in Tabelle 2 aufgeführt·

Tabelle 2

Übertragungavektor Einmalige Reatriktionaatellen

pSC1O1

PBR313 pBR315, pBR322

pBR3i6 pC194

Charon 16A Charon 3A Charon 4A gt WES <, B

EcoRI, Hind III, Sal I, Bam HI, Hpa I, Sma I ""~ ' ScoRI, Hind'III, Sal I, 3am HI, BcoRI, Hind III, ,Sal I, Baa HI, Hpa I, Sma I, Xma" I ScoRI« Hind III,"Sal I, Bam HI, Pat I "-- ' -'-· Hind III, Sal I, Bam HI, PatI Hind III - - -

3CoRI, Sst I

ScoRI

BcoRI

Generell wird die cDHS zur Erleichterung der Selektion in eine innerhalb eines phänotypischen Merkmals gelegene Restriktionsstelle inseriert· So befinden sich beispielsweise Hind III, Sal I, und Bam HI in pSC101, pMB9, pBR313, pBR315; pBR322 innerhalb des"Gens für Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeit oder dessen Kontrollregion, Die Einlagerung an dieser Stelle resultiert in einem Verlust an Tetrazyklin*Widerstandafähigkeit, Die cMS kann in den Übertrag unga vektor durch Anwendung von Restriktionsstellen-Verbindern oder durch Desoxynukleotid-Schwanzbildung inseriert werden* Bei der erstgenannten Methode kann ein synthetisches Uukleotid, welches eine Rekognitionssteile für eine einzelne

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Restrikt ions-Endonuklease von der oben diskutierten Art enthält, am stumpfen Ende mit der cDUS verbunden werden· Die qJ)S3 und der übertragungsvektor werden separat mit der Restriktions-Endonuklease inkubiert und sodann gekühlt, um den die cDlTS enthaltenden Übertragungsvektor zu formieren« Bei der letztgenannten Methode kann die cDNS unter Verwendung eines Desoxynukleotids und terminaler Transferase, wie sie von Rovchoudhurv, R. et. al«, Fuel. Acids Res.« 2» ^s^3 (1976) beschrieben wurde, zur Schwanzbildung gebrächt werden. In der gleichen Vorgehensweise kann der Übertragungs— vektor nach Verdauung mit einer Restriktions-Endonuklease bei Verwendung des komplementären Desosvnukleotids zur Schwanzbildung gebracht werden. Der geschwänzte Übertragungsvektor und die geschwänzte cDIFS werden dann gekühlt, um 'den cDETS-haltigen Übertragungsvektor zu formieren* So kann die cDHS beispielsweise dC-geschwänzt sein, und der übertragungsvektor kann an der Pst-I-Stelle geöffnet und dG-geschwänzt se in ν ~ ".

Der cDNS-haltige Übertragungsvektor wird nun zur Transfor-Eiierung eines geeigneten Wirtes verwendet. Za den für die verschiedenen übertragungsvektoren geeigneten Wirten gehören B. ooli, B. subtilis» Hefe, ff. crassa und Tierzellen in Gewebekultur,"Die zur Transformierung'jedes dieser Wirte befähigten Übertragungsvektoren sind bereits oben beschrieben worden. Herkömmlicherweise werden drei mutante Stämme ^Yon S. coli verwendet» Es.handelt sich hierbei um 1776, RRI und HB101. B. coli 1776 ist bei Curtis, R., Ann. Rev. Microbiol. 30, 507 (1976) und im US-PS Ir. 4 190 495 beschrieben worden. Ξ. coli RHI ist bei Dugaiczyk, A« et al«, Molecular Mechanismus in Control of Gene Expressions, Seite 543 beschrieben worden; E. coli HB 101 schließlich ist bei Kedes, D. H. und Thomas, C. A., groc. Natl. Acad. Sei.

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USA J2t 1537 (1976) beschrieben worden« Die geeigneten Wirte werden vermittels herkömmlicher Techniken transformiert· Beispielsweise wird E· coli 1776 durch den von Cooke, Bf. B. et al«, J. Biol« Chem«, 255, 6502 (1980) beschriebenen cDÜS-haltigen tJbertragungsvektor transformiert. Ebenfalls durch konventionelle Techniken werden Kolonien selektiert und/oder einem Screening unterworfen· So können Kolonien beispielsweise auf der Basis des Verlustes von einem phanotypischen Merkmal wie etwa der Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeit selektiert werden* Das Screening der Kolonien kann (1) durch Beseitigen der cDBB durch eine geeignete Restriktions-Endonukiease sowie Analyse mittels Elektrophorese und Hybridisation (southern, Ξ» Μ«, J. Mol. Biol«, 98, 503 (1975) oder (2) Replika-Plattieren nach der'Beschreibung von Grunstein, M« und Hogness, D. S., Proc« gat. Acad. Sex« USA, J2, 3961 (1975) und Hybridisie- " ren mit einer geeigneten Sonde oder schließlich (3) durch Prüfung der Kolonien direkt hinsichtlich ihrer Darstellung mittels Radioimmunoassay oder anderen Techniken vorgenommen werden«

Die bovines Wachstumshormon codierende DlTS kann aas ,jener Einlagerang gewonnen werden, welche bovines Prä-Wachstumshormon codiert· Die das Prä-Hormon codierende DITS wird durch eine geeignete Restriktions-Sndonuklease beseitigt. Ist zum Beispiel die cDUS in die Pst-I-oteile des Plastnids pBR322 eingelagert, dann kann die cDHS-Einlagerung durch teilweise Verdauung mit Pst I entfernt werden« da die cDUS für bovines Wachst umshörnion zwei interne Pst-!-Stellen enthält. Andererseits kann das von pBR322 abgeleitete rekombinante Plasmid mit Hae II verdaut werden, um einen Teil der cDM3-Binlagerung zu"entfernen. Die Hae-II-Verdauung beseitigt die das üT-terminale Signalpeptid cödöerende DÜS sowie zwei der

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drei Basen, die das U-terminale AIa des Wachstumaiiormons cod±ren. Diese Basen werden durch Inkabieren der Einlagerung mit dem Klenow-Fragment der DUS-Polytnerase I und der Desocynukleotide ersetzt. Andererseits können die AIa codierenden Basen durch Inkubieren der cDITS mit Klenow-Pragment, 24-DUS-PoIyraerase oder 3^f··· 5'-Exonuklease in Anwesenheit von dATP aasgestrichen werden* Das Klenow-Fragment ist von Klenow» HY und Henningsen, I*, Proe, 2Iatl« Acad» Sei« USA« 65, 168 (1970) beschrieben worden« Die Wachstumshormon codierende cDNS wird nun in der oben beschriebenen Weise in einen geeigneten Obertragungsvektor inseriert.

Die geklonte DHS wird in Bakterien dargestellt, um entweder ein Fusionsprotein zu erbringen, welches das durch die inserierte Sequenz codierte bovine Wachstumshormon enthält, oder aber um das Wachstumshormon selbst zu erbringen» Verschiedene mögliche Techniken stehen zur Wahl, sie können beinhalten (a) die Modifikation der codierenden Sequenzen zwecks Erlangung eines genau erwünschten übertragenden Startpunktes; (b) die Selektion oder Konstruktion eines optimalen Expressionsvektors und (c) die nach der Übertragung erfolgende Bearbeitung entweder durch Ausnutzung der in-vivo-Bearbeitungsaktivität des Wirtes oder in-vitro durch chemische Mittel und (d) die direkte Darstellung,

Wo ein Fusionsprotein hervorgebracht wird, wird die Modifikation der geklonten STukleotidsequenz im allgemeinen solange unnötig sein, solange die resultierende Sequenz die Iranslation der Einfügung im richtigen Ableserahmen ermöglicht und keine Stop-Kodone vor dem Anfangskodon der inserierten Sequenz intervenieren. Wachstums-Prähormon oder Wachstumshormon werden als ein Fusionsprotein durch Insertion der cDItfS in geeignete Stellen innerhalb ausgeprägter

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Qperons (Expressionsvektoren) dargestellt, so etwa unter Einbeziehung der Pst-I-Steile im ß-Laktamase-Gen von pBä322 (Villa-Komaroff, L. et al., Proc· JJat» Acad« Soi USA^ 75," 3727 (1978) j Serburg, ?· et al·, Nature 274, 795 (1978)), der ScoRI-Stelle von pBR322, die die lac-Kontrollregion und ß-Galaktosidase codierende Sequenz trägt (Itakura, K«, siebe oben) oder unter Einbeziehung der Hind-III-Steile des trpS-Gena von Plasmid ptr_gED5O (Martial'j J. et al♦,"Science;'205, 602 (1979)).

Modifikationen der Sequenzlänge durch ein oder zwei nucleotide zwecks Erreichung der korrekten Ablesungsphase sind im Fachgebiet weithin bekannt. Einfügungen an der Pst-I-Steile von. pBR322 mit deni Ziel der Schwanz bildung kommen mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 : 6 in korrektem Phasenaustand und Ableserahmen vor, fachstums-Prähormon oder Wachstumshormon werden aus Fusionsproteinen hergestellt, die einer spezifischen Spaltung in vitro zugänglich sind« Die geklonte JüTukleotidsequenz wird~modofcziert, um jene Aminosäuresequenzen zu codieren, welche die Spezifität für ein proteolytisches Enzym erbringen» Eine dafür geeignete Sequenz ist AspAspAsp AspLys, die vorzugsweise durch das Enz^m Enterokinase gespalten wird« Hierzu liegt die Beschreibung in der Anmeldungsschrift der Serien-üTr. 125 878, eingereicht am 29· Februar 1980,' vor· Wie dort ausgeführt, wird eine die oben genannte Aminosäuresequenz codierende koppelnde Sukleotid— sequenz nächst der den erwünschten Amonoterminus von Wachstums-Prähormon codierenden jJukleotidsequenz inseriert»

Eine derartige Insertion erfordert beim Wachstums-Prähormon die Modifikation der originalen cDHS-Einlagerung durch Beseitigen der HuJcleotide auf dem 5^r -Ende der das Wachst ums-Prähormon codierenden Sequenz· Die cDIiS-Sinlagerung für

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Wachstumshormon - oben beschrieben - bedarf keiner Modifikation. Die Modifikation der Einlagerung für Wachstums-Prähormon erfolgt entweder durch kontrollierte Verdauung des 3'-Bndes der Einfügung mittels S'-Sndonuklease oder T4-DNS Polymerase, oder aber durch die Kombination von Restriktions-Ehdonukleasespaltung an einem Punkt an der 5'-Seite des gewünschten Startpunktes gemeinsam mit chemischer Synthese zum Zwecke der Wiederherstellung jenes so entfernten Teiles der gewünschten Sequenz, Weitere Einzelheiten dieser Vorgehensweiaen sind der U.S,-Patentanmeldung der Serien-Hr* 125 878 zu entnehmen» Bei Anwendung dieser Methodik vorzugsweise unter Einsatz von T4-DITS-Polymerase und S1-Uuklease - wird die das Wachstums-Prähormon codierende cDHS-Sequenz ohne die nichtübersetzte 5'-Region gewonnen* Die die vorangehende Aminosäuresequenz codierende Verbinder-ISukleotidsequenz wird durch DUS-Ligase gemäß Beschreibung von Yalenzuela et al·, Hature» 280» 815 (1979) jener cDUS-stumpfendig verbunden, welche entweder Wachstums-Prähormon oder Wachstumshormon codiert» Die modofizierte cDIIS-Sequenz wird in der oben beschriebenen Yieise in einen Pusionsprotein-Ezpressionsvektor inseriert. Wirtsbakterien wie etwa E. coli HB101, RHI oder 1776 oder andere Bakterien werden durch jene rekombinanten Vektoren transformiert, welche die inserierte Wachstums-Prähormon codierende Region tragen. Trans formant en werden hinsichtlich Ampizillin-Resistenz selektiert. Die Transformanten werden sodann unter Bedingungen angebaut, die für die Darstellung des Pusionsproteins günstig sind. Nach der Darstellung des J¹Usionsproteins wird das Wachstums-Prähormon oder Wachstumshormon durch enzymatische Hydrolyse mittels Bnterokinase herausgespalten«

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Durch Verwendung geeigneter Expressions-übertragungavektoren wird das Wachstums-Prähormon der vorliegenden Erfindung auch direkt dargestellt, d· h« nicht an irgendein prokaryotisches Protein angeschmolzen.« Das der direkten Darstellung zugrundeliegende Prinzip besteht darin, daß das inserierte DNS-Segment rollständig jenes codierende Segment ersetzt, welches normalerweise durch die bakterielle Kontrollregion transkribiert und übersetzt wird· Die zu bewahrende essentielle Komponente der Kontrollregion wird als Expressionseinheit bezeichnet. Die Expressionseinheit umfaßt einen Promotor und eine zum Wirken im Wirtsorganismus befähigte ribosomale Bindungssteile, Ss ist nicht erforderlich, die. den Wirtsanteil des Fusionsproteins codierenden Uukleotide in ihrer Gesamtheit zu beseitigen· Die Beziehung zwischen der ribosomalen Bindungssteile und dem Startkodon (AUG) ist solcherart, daß der Startkodon irgenwo innerhalb der 3 bis 11 STukleotide der ribosomalen.Bindungsstelle angesiedelt v/erden kann (Shine, J. et al·, Proc« Sfat. Acad· Sei· USA,

71, 1342 (1974) und Steitz, J,,,'Proc· ffat· Acad· Sei· USA,

72, 4734 (1975))· In dieser 3·. ,H-Fukleotidregion aetzt das zuerst angetroffene AUG den Ableserahmen für die Translation· Im Falle des vom oben beschriebenen ptrpED5O abgeleiteten ptrpE3O» das den Operator, Promotor,"Attenuator und die Ribosom-Bindungssequenzen des Tryptophan-Qperons gemeinsam mit der Bukleotidsequenz enthält, welche sieben Aminosäuren des trpS-Proteins mit anschließender Hind-III-Steile codiert, schafft die Beseitigung eines Minimums von 23··,29 Nucleotiden, von der Hind -HI-Stelle einen Platz für die Insertion in eine Expressionseinheit unter Tryptophan-0peronkontrolle·

Für die direkte Darstellung von Wachstums-Prähormon wird die orginale cDNS-Einfügung in oben beschriebener Weise

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modifiziert, um die unübersetzte 5'-Region zu entfernen* Ein Teictor für die direkte Darstellung kann durch Modifikation von ptrpE30 konstruiert werden, indem die 23·..29-lukleotide" unter Verwendung von T4-DEfS-Polymerase und Sl-Euklease in der oben beschriebenen Weise entfernt werden«⁴ Eine die Restriktionssequenz für Bam-HI-Bndonoklease enthaltende Verbinder-ÜTukleotidsequeaz wird stumpfendig durch die von Valenzaela et al. (siehe oben) beschriebene Vorgehensweise sowohl mit der'modifizierten cDUS-Einfügung als auch mit dem modifizierten ptrp_E3Q verbunden. Dies erfolgt zur Erleichterung der Insertion, welche im wesentlichen in der von Ullrich, A« et al., Science, 196, 1313 (1977) beschriebenen Weise vorgenommen wird· Geeignete Wirte wie etwa E+coli HB101, RHI oder 1776 oder andere Bakterien werden durch"jene rekombinanten Vektoren transformiert, welche die inserierte Wachstums-Prähormon codierende Region tragen* Transformanten werden hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber Amp iz ill in ausgewählt und dann unter Bedingungen angezogen, die für die Darstellung von Wachstums-Prähormon günstig sind·

Wachstumshormon kann direkt mit der von C-oeddel D· V« et^al,, Iature, 281, 544 (1979) beschriebenen Methode dargestellt werden· Andererseits kann eine die Eam-HI-Stelle und den Startkodon (AUG) enthaltende Verbinder-JSfukleotidsequenz stumpf endig'mit der Wachstumshormon codierenden cDUS verbunden werden· Diese modofozierte cDiiS wird dann in der oben beschriebenen Weise in das modofozierte ptrpE3Q inseriert ·

Wachstums-Prähormon wird durch Entfernen der 33-terminalen Sequenz der signalpeptidhaltigen hydrophoben Aminosäuren zu Y/achstumshormon umgewandelt. Die invitro-Beseitiguag

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des Signalpeptids könnte durch Behandlung des aus transformierten, induzierten Zellen extrahierten Proteins mit einer Präparation von "rohenⁿ¥ikrosomen ausgeführt werden, wie dies von Jackson, R* C; und Blobel, G*, Proc>Nat.Acad*Sci· USA, J±_f 5598 (1977) beschrieben wurde. Die in-vivo-Beseitigung'des Signalpeptids kann während der direkten bakteriellen Ausbildung der Wachstums-Brähormon codierenden Sequenz vorkommen* Bakterielle und von Säugern stammende Signalpeptide weise Sequenzähnlichkeiten auf* Proteine mit Säuger-Signalpeptiden können durch bakterielle Zellen bearbeitet werdenj dies resultiert in einer Exkretion von Wachstumshormon in den periplasmatischen Raum oder in das Medium*

Wachstums-Prähormon und Wachsturnshormon, in der beschriebenen Weise synthetisiert, werden durch bekannte Techniken wie beispielsweise Gel-Filtration, Ionen-Austauschchromatografie, Äffinitäts-Chromatografie und Differential-Löslichkeit stechniken gereinigt·

Die Einzelheiten der vorliegenden Erfindung sollen weiter durch die folgenden Ausführungsbeispiele beschrieben werden* In diesen Ausführungsbeispielen wurden die Verdauungenmit Restriktions-Endonukleasen unter Bedingungen ausgeführt, die für jedes Enzym optimiert worden waren* Restriktions-Sndonukleasen, ihre Nomenklatur und Stellen-Spezifität sind im einzelnen von Roberts, R*, Crit. Rev. Biochem*, 4,, 123 (1976) beschrieben worden* Die Enzyme wurden auf kommerziellem Wege bezogen und - sofern nicht anders angegeben unter optimalen Bedingungen go&äß den Empfehlungen der Hersteller eingesetzt« Umgekehrte Transkriptase wurde ebenfalls kommerziell bezogen* Die "Verwendung von umgekehrter 'Transkriptase sowie geeignete Reaktionsbedingungen sind vor dem bereits von Seeburg, P. H* et al·, flature. 276, 795 (1978),

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Seeburg, P* Η« et al. (siehe oben) sowie Shine, J. et al« (siehe oben) beschrieben worden. Weiterhin wurde 14-DUS-Polymerase kommerziell bezogen· Die Verwendung von 14-DHS-Polymerase sowie geeignete Heaktionabedingungen sind bereits in der Anmeldung der Serien-Hr· 125 878 beschrieben worden· Einsatz von S1-Uuklease, welche ebenfalls auf kommerziellem Wege bezogen wardem und geeignete Reaktionsbedingungen sind bereits von Ullrich, A« (siehe oben) beschrieben worden· Weiterhin wurde terminale Desosynukleotid-Transferase auf handelsüblichem Wege bezogen* Die Anwendung dieses Enzyms sowie die hierfür passenden Reaktionsbedinguagen sind von Roychoudhury et al« (siehe oben) mitgeteilt worden· Auch das Klenow-Fragment von DIS-PoIymerase I wurde handelüblich bezogen·

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an.einigen Beispielen näher erläutert. .

Ausführungsbeispiel 1 Synthese von boviner Wachst ums-Prähormon-cDIifS

Weibliche bovine Hypophysen wurden kurz nach Schlachtung der Spendertiere gesammelt und unerzüglich in flüssigem Stickstoff eingefroren« Die Gesamt-RUS wurde durch Homogenisieren der Hypophysen in einer Quanidin-Thiozyanat-Lösung hergestellt (Chirgwin, J» M« et al«/ Biochem«, 18* 5294 (1979))· Die 'RH^-S wurde entsprechend der Beschreibung von Ullrich, A« et al. (siebe oben) durch 5»7M CsGl zentrifugiert« Sodann wurde "die RiTS mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt« Polyadenylierte RUS wurde unter Anwendung

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der Qligo-dT-Zellulose-Affinitätschromatografie gereinigt (Miller und McCarthy - siehe oben - sowie Aviv, H. und Leder, P·, Proc· ffa-fc, Acad· Sei· USA, 69« 1408 (1972))_#

Die polyadenylierte RUS wurde gemäß Beschreibung von Miller und McCarthy (siehe oben) sowie Martial, J· A. et al (siehe oben - 1977) unter Verwendung von Saninchen-Retikulozyten in ein zellfreies System umgesetzt· Das in diesem System synthetisierte bovine Wachstums-Prähormon wurde mittels eines heterologen antiovinen Wachstumshormon-Antiserums immunpräzipitiert und durch Adsorption an formalinfizierten Staphylococcus aoreaa Cowan Stamm I gemäß Beschreibung von Martial, J. Α· et'al« (siehe oben 1977) präpariert. Die 35 S-Proteine wurden gemäß Beschreibung von Laemmli (siehe oben) der Elektrophorese auf plattenartigen 12,5->3-SDS-?olyakrylamid-Gelen unterzogen· Diese Analyse zeigte, daß die bovines Wachstums-Prähormon codierende polyadenylierte RUS etwa 12,6 ?o der gesamten pitultären polyadenylierten RUS ausmachte»

Polyadenylierte RIiS wurde unter Einsatz von Umkehrtranskriptase nach der von Miller und McCarthy (siehe oben) beschriebenen Methode sowie nach der von Monahan et al· (siehe oben) beschriebenen Methode in einzelstragige cDUS umgekehrt transkribiert. RlJS wurde durch alkalische Hydrolyse beseitigt· Die einzelstrangige cDITS wurde mit Phenol extrahiert, über G-50 Sephdex (Handelsmarke) chromatografiert und einer Sthanolpräzipitation unterzogen· Die einzelstrangige cDHS wurde dazu benutzt, die Synthese des zweiten cDUS-Stranges mittels ümkehrtranskriptase in oben beschriebener Weise selbst in G-ena zu setzen· Die einzelstrangige "Haarnadelschleife¹¹ am 3'-£nde des ersten cDÜFS-Stranges wurde entsprechend'der Beschreibung von Leong et al. (siehe

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oben) und Ullrich, A, et al, (siehe oben) durch Verdauung mit S1-Iuklease beseitigt· Die doppelstrangige cDHS wurde mittels Phenolextrakt ion, Chromatografie über G-50 Sephadex und Ethanolpräzipitation gereinigt. Die doppelstrangige cDIS wurde laut Beschreibung von Roychoudhory et al« (siehe oben) unter Verwendung von dCTP und terminaler Transferase 3^f dCMP-geschwänzt.

Das Plasmid pBE322 wurde durch Pst-I-Endonuklease gespalten und mit dGMP vermittels der oben"beschriebenen Schwanzbildungsprozedur geschwänzt, wobei allerdings anstelle von dCTP dGTP eingesetzt wurde, 50 ng des dC-geschwänzten, Pst-I-gespaltenen Plasmids pBR322 sowie 20 ng der dC-geschwänzten doppelstrangigen cDE3 wurden in einer 50-/til-Reaktion gemäß Cook et al, (siehe oben) gekühlt.

Die Transformation von S, coli 1776 mit der Plasmid-Präparation wurde folgendermaßen ausgeführt: Ξ, coli 1776 wurde durch 20mlnü.tige Inkubation bei 4 ⁰C in 75 mM CaCl₂, 5 mffl MgCl₂ und 10 mM Tris (pH 7,5) für DHS permeabel gemacht· Plasmid und Bakterien wurden 60 min bei 4 ⁰C und daran anschließend 2 min bei 41 ⁰C inkubiert. Die transformierten Kolonien wurden hinsichtlich Tetraz^klin-Resistenz selektiert. Das Vorhandensein von geklönter DiIS wurde durch

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Kolonie-Etybridisierung an frisch präparierte ^J P-markierte bovine Hypophysen-cDIiS gemäß Beschreibung von Grünste in und Hogness (iaLehe oben) nachgewiesen. Aus selektierten Kolonien wurde Plasmid-DHS präpariert, mit Pst I zerschnitten, auf 1%iger Agarose einer Elektrophorese unterzogen, mit. Ethidiumbromid gefärbt, fotografiert und schließlich nach der Methode von Southern (siehe oben) auf Uitrozellulosefilter übertragen. Das Vorhandensein von Wachstumshormonsequenzen in er übertragenen DIS wurde durch Hybridisa-

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tion an geklönte Rattenhormon-DUS voller Länge abgeschätzt (Seeburg, P. H, et al« - siehe oben), welche durch Einschnitt-Translation markiert worden war (Maniatis, H, et al», ?roc. Hat. Acad, Sei· USA, 72, 1184 (1975)). Ein IQon wurde gewonnen, welcher mit der durch Schnitt-Translation markierten DüTS hybridisierte. Dieser Klon erhielt die.Bezeichnung pJ3348· Die Einlagerung enthält 831 Basenpaare,

Ausfuhrungsbeispiel 2

Sequenzanal.7se der cDffS, Plasmid pBP348 wurde mit Pst I zerschnitten, das Phosphat an den 5'-Enden des DITS-Fragments wurde mit alkalischer Phosphatase entfernt und unter 7er-

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wendung von Polynukleotid-Kinase durch ^J P-Phosphat ersetzt.

Weiteres Zerschneiden mit einer Reihe anderer Restriktions-Endonukleasen, Polyakrylamidgel-Slektrophorese sowie Färben und autoradiografische Untersuchung der DHS-Banden ergeben eine Restriktionskarte der geklonten DM3, Uun wurde eine große Charge pBP348 präpariert und mit Pst I, Pvu II oder

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Sau 3A zerschnitten sowie mit ^P ATP"und Polynukleotid-Kinase markiert und dann mit anderen Enzymen zerschnitten, um DJtfS-Pragmente zu erbringen, die an einem einzelnen Ende markiert sind. Diese Fragmente wurden durch Elution aus Polyakrylamidgel präpariert und nach der Beschreibung von Cooke et al· (siehe oben) sowie Maxam, A,.M, und Gilbert, W,,. Proc> Hat, Acad. Sei· USA, 74, 1560 (1977) in ihrer Sequenz dargestellt. Die Sequenz für die inserierte cDÜTS ist in Abbildung 1 gemeinsam mit der entsprechenden vorhergesagten Aminosäuresequenz dargestellt, welche durch den Empfindungstrang, d,h, den sequentiell der jeweiligen mRiiS entsprechenden Strang codiert wird.

Der korrekte Ableserahmen wird an einem Fehlen von Termina-

• · · ο O "

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tionakodonen über einen beträchtlichen Anteil der Einlagerung hinweg wiedererkannt. Die Nummerierung der Aminosäurepositionen erfolgt mit der amino-terminalen Aminosäure von bovinem Wachstumshormon beginnend und in der positiven Richtung fortsetzend bis zum Sarboxy-terminalen Ende; in der negativen Richtung läuft die Numerierung bis zum ersten AUG-Kodon, vorausgesetzt, daß es sich dabei um den Punkt der Translationsinitiation handelt.

Unsere Befunde deuten darauf hin, daß - gemeinsam mit vielen anderen Hormonen - die Synthese von Wachstumshormon eine nach der Translation erfolgende Umsetzung mit einschloß* Die Translation von Wachstumshormon-mRIIS erbringt einen Yorläufer (Wachstums-Prähormon), welcher ein Signalpeptid enthält, das während des Transits in das endoplasniatiache Retüculum freigesetzt werden kann*

Ausführungsbeispiel 3

(A) Ausführungsbeispiel 1 wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 Plasmid pBR315 verwendet wird» Alle Bedingungen einschließlich der Selektion der recombinanten Klone entsprechen der bereits gegebenen Beschreibung» Die Einlagerung wird entfernt und gemäß Beschreibung in Ausfuhr ungsb eis piel 2 analysiert. Als Ausbeute wird eine DIiS von etwa 831 Basenpaaren mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz gewonnen*

(B) Ausführungsbeispiel 1 wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 Plasmid pBR3i6 verwendet wird* Alle Bedingungen sind mit den in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen identisch* Die Beseitigung und Analyse der Einlagerung gemäß Ausführungsbeispiel 2 erbringt eine DHS mit der

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in Abbildung 1 gezeigten Sequenz.

Ausführungsbeispiel 4

Für dieses Auaführungsbeispiel wird die das bovine Prä-Wachst omsiiornion codierende cDITS in der im Ausfüiirungsbeispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt. Alle in diesem und den folgenden Ausführungsbeispielen verwendeten Restriktionsstellen-Verbinder werden nach der von Scheller, R* H· et.al·, Science 196, 177 (1977) beschriebenen Methode zubereitet· Die in diesem und'den folgenden Ausführungsbeispielen verwendeten Restriktions-Endonukleasen sind im Handel zu beziehen; die gewählten optischen Bedingungen richten sich nach den Empfehlungen der Hersteller, Die Transformation von E, coli 1776 erfolgt in der in AosfUhrungsbeispiel 1 beschriebenen Weise·

(A) Hind-III-Verbinder mit der Sequenz 5¹ - CCAAGCTTGG - V werden" der in Aus führ ungsbeispiel 1 hergestellten cDSTS durch stumpfendige Ligation unter Einsatz von 14-DHS-Ligase verbunden, wie dies von Valenzuela, P. et al·, nature, 280, 815 (1979) beschrieben worden ist· iiach der Ligation "wird das Produkt mit Hind III oder Efeu I entsprechend der von Ullrich, A· et al. 'Science, jj96, 1313 (1977) beschriebenen Vorgehensweise verdaut. Ebenfalls nach/der von Ullrich, A· et al, (siehe oben) beschriebenen Vorgehensweise wird Plasmid pBR322 an der Hind-Ill-Restriktionsstelle entweder mit Hind III oder Hsu I gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt, !lach der Ethanolausfällung wird das phosphatasebehandelte gespaltene pBR322 der kohäsive Kind-III-Termini enthaltenden cDUS gemäß Beschreibung von"Ullrich, A et al. (siehe oben) verbunden, S. coli 1776 wird mit dem Ligationsgemisch transformiert, und die trans-

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formierten Kolonien werden hinsiehtlieh ihrer TetrazyklinResistenz selektiert» Das Vorhandensein von geklönter DNS wird entsprechend der Beschreibung in AasfUhrungsbeispiel 1 bestimmt«. Gewonnen wird eine Kolonie, welche eine Einlage.* rung enthält, die mit der durch Einschnitt-Translation markierten Dl^-S hybridisierte«. Die Einlagerung wird durch Verdauung mit Hind III oder Hsα I beseitigt und gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 2 analysiert*. Die Einlagerung enthält etwa 830 Basenpaare und weist die in Abbildung 1 dargestellte Sequenz auf.

(B) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei anstelle von pBH322 verschiedene Vektoren verwendet werden» Im vorliegenden Ausführungsbeispiel werden die Plasmide pSC101, pMB9, pBR313» pBR'315. und pBR316 anstelle von -pBR322 verwendet. Alle Bedingungen einschließlich der Selektion von rekombinanten Klonen entsprechen der in (A) gegebenen Beschreibung· Sür alle Plasmide werden identische Ergebnisse erzielt, d.'h., in jedem Paile wird ein rekombinantes Plasmid gewonnen, welches eine Einlagerung mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz aufweist.

(C) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei verschiedene andere Restriktionsstallen-Verbinder und Restriktions-Sndonukleasen verwendet werden. In diesem Ausführungsbeispiel werden anstelle der Verbinder für Hind III die Verbinder für Sal I und Bam HI verwendet. Die Sequenz dieser Verbindung~Sind 5' -"GGTGGACG - V und 5' - CCGGATCCGG 3¹. Werden Sal-I-Verbinder eingesetzt, dann werden die verbinderbehandelte cDITS und p3R322 mit Restriktions-Bndonuklease Sal I gespalten, und werden Bam-HI-Verbinder eingesetzt, dann ist die Restriktions-Sndonuklease Bam Hi. Alle Bedingungen einschließlich der Selektion von rekömbinanten

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Klonen entsprechen der in Ausführungsbeispiel 4(A) gegebenen Beschreibung. Mir beide Verbinder und Restriktions-Endonukleasen werden identische Ergebnisse gewonnen»

(D) Ausführungsbeispiel 4(G) wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 die Plasmide pSC1O1, pMB9, pBR313, pBR315 und pBR3i6 verwendet werden. Alle Bedingungen entsprechen den in Aasführungsbeispiel 4(G) beschriebenen; es werden identische Resultate erzielt, d. h., in jedem PaI-Ie wird eine Einlagerung gewonnen, welche in Abbildung 1 gezeigte Sequenz aufweist.

(E) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei ein Eco-RI-Restriktionsverbinder mit der Sequenz 5¹ - CCGAATTCGG-3' anstelle des Hind—Ill-Verbinder sowie EcoRI anstelle von Hind III (Hsu I)"verwendet wird· Alle Bedingungen sind mit den bereits beschriebenen identisch, mit Ausnahme dessen, daß die transformiertera Kolonien nicht hinsichtlich. Tetrazyklin-Sensitivität selektiert werden. Das Vorhandensein von geklönter DHS wird in der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen ϊ/eise erreicht. Gewonnen wird ein rekombinanter Klon, welcher eine Einlagerung enthält, die die in Abbildung 1 gezeigte Sequenz aufweist.

(P) Ausführungsbeispiel 4(E) wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 die'Slasmide pSC1O1, pMB9, pBR313 und pBR315 verwendet werden. Beibehalten werden .die in Ausführungsbeispiel 4(E) beschriebenen Bedingungen^ für jedes Plasmid werden identische Resultate ersielt.

(G) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei ein ?st-I-Reatriktionsverbinder mit der Sequenz 5V- GCTGCAGC 3'""und .Pst I anstelle des Hind-III-Verbinder bzw« Hind-III

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(Hsu I) eingesetzt werden. Die gleichen Bedingungen werden beibehalten, mit der Ausnahme, daß die Selektion rekombinanter .Klone in der die Ausführungabeispiel 1 beschriebenen Weise vorgenommen wird* Gewonnen wird ein rekombinanter Klon mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz»

(H) Ausführungsbeispiel 4(0) wird wiederholt, wobei anstelle von pBR-322 die Plasmide pBE315 und pBR3i6 verwendet werden. Es werden die gleichen Bedingungeil wie in Ausführungsbeispiel 4(G) beibehalten und identische Resultate erzielt.

(I) Die Ausführungabeiapiele T, 3(A), 3(B) und 4(A)...(H) werden wiederholt, wobei B. coli RRI oder E, coil HB101 anstelle von B.coli 1776 verwendet werden. Alle Bedingungen entsprechen der bereits gegebenen Beschreibung; es werden identische Ergebnisse erzielt.

Ausführungsbeispiel 5

Bei diesem Ausführungsbeispiel wird die cDETS wie in Ausführungsbeispiel 1 hergestellt. Bco-RI-Restriktionssteilenverbinder werden gemäß der von Valenzuela, P. et al. (siehe oben) beschriebenen Vorgehensweise stumpfendig an die" cDItfS angelagert und entsprechend der Beschreibung von Ullrich, A. et al. (siehe oben) mit Bco RI gespalten,.

(A) In der von Blattner et al. (siehe oben) beschriebenen Weise hergestellte Charon-16-DNS wird als Übertragungsvektor verwendet. Die kohäsiven Enden werden durch 60minütige Inkubation bei 42 ⁰G in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) und 10 mM MgCl₂ gekühlt. Der Vektor wird an der Sco^RI-Restriktionssteile mit Eco-RI-Endonuklease gespalten und dann in der

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von Ullrich, A, et al, (siehe oben) beschriebenen Weise mit alkalischer Phosphatase behandelt· Nach der Ethanölausfällung wird die phosphatasebehandelte Vektor-DHS zu cDU3 hinzugegeben, welche kohäsive Eco-RI-Termini in einem molaren Verhältnis von 2 Mol Vektor'"au 1 Mol cDUS enthält. Das Gemisch wird gemäß Beschreibung von Ullrich, A, et al· (siehe oben) mit T4-DIiS-Ligase verbunden« Das Ligationsgemisch wird direkt einer Suspension von E, coli- " 1776-Zellen zugesetzt, welche entsprechend Ausführungsbeispiel 1 für die Transformation vorbereitet wurden· Ebenfalls nach der im Ausführung sb eis pi el 1 beschriebenen Weise wird die Transformation vorgenommen«. Die rekombinanten Phagen werden zurückgewonnen und auf Lac"* auf Platten angelegt, welche 5-Chlor-4-brom-3-indolyl-ß-D-Galaktosid (26), (80 g/ml) enthalten· Für die Herstellung von farblosen Belägen werden rekombinante Phagen selektiert, welche die in die Eco-RI-Steile von Charon 16A inserierte cDUS enthalten· Ein"ausgewählter Rekombinat wird isoliert und mit einem Überschuß an Eco-RI-Endonuklease verdaut; das Aufschlußprodukt wird in"der in Ausführungsbeispiel 2 beschriebenen Weise analysiert. Zurückgewonnen wird eine DiTS von etwa 830 Basenpaaren Länge und der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz· Anderenfalls wird die Ligationsmischung dazu benutzt, rekombinante Phagen.durch in-vitro-Verpack en gemäß der Beschreibung von Sternberg, !"· et al;,'Gene 2» ²55 (1977) zu bilden, Rekombinante Phagen können darüber hinaus durch Anwendung der von Benton, W«D, und Davis, R· W., Science 196, 180 (1977) berichteten in-aitu-Plaque-Hffbridisatiönstechnik' ausgelesen werden«

(3) In der von Blattner et al. (siehe oben) beschriebenen «eise hergestellte Charon-3A-DUS oder Charon-4A-DiIS wird anstelle der im vorangegeangenen Ausführungsbeispiel genannten Char on-16 A-DiTS als Übertragungsvektor verwendet. Alle

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Bedingungen sind mit den für Charon- 16A-DHS beschriebenen identisch· Die Selektion rekombinanter Phagen erfolgt durch (a) Plattieren der Phagen auf Lac⁺-Bakterien auf X6-haIt igen Platten und Isolieren farbloser Plaques sowie darauffolgend entweder Hybridisation an eine geeignete Sonde oder Restriktions-Sndonuklease-Verdauung in der von Blattner et al» (siehe oben) beschriebenen Weise« Die Einlagerung wird nach, der bereits dargestellten Methode entfernt; als Ausbeute wird eine DHS τοη etwa 830 Basenpaaren Länge mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz gewonnen,

(G) Als Übertragungsvektor wird anstelle der v/eiter oben. verwendeten Gharon-16A die nach Beschreibung von Timier et al· (siehe oben) hergestellte gt WSS , B-DiTS genutzt. Alle "Bedingungen entsprechen den für Charon 16A beschriebenen. Die Selektion rekombinanter Phagen erfolgt nach der Hybridisationsniet ho de von Benton und Davis (siehe oben). Die Einlagerung wird in der oben beschriebenen Weise entfernt und erbringt eine DlTS von etwa 830 Basenpaaren Länge mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz.

(D) Die Ausführungsbeispiele 5(A),,.(C) werden wiederholt, wobei Ξ, coli HEI, R, coli HB101« S,coli DP50 oder E, coli DP50SupJ" anstelle von Ξ. coli 1776 verwendet werden. Alle Bedingungen sind identisch} es werden identische Ergebnisse erzielt,

Ausfuhr ung;abeispiel 6

Pur dieses Ausführungsbeispiel wird die bovines Prä-Wachstumshormon codierende DIiS in der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise zubereitet, Ss werden Hind-III-Restriktionsstellenverbinder zugesetzt, und die cDHS wird mit

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Hind III oder Hsu I in der in Ausführungsbeispiel 4(A) beschriebenen Weise verdaut»

Als Übertragungsvektor wird.das Plasmid pC194 verwendet, das - wie von Ehrlich, S. D, (siehe oben) beschrieben, aus £>· a or aus isoliert worden war, pC194 wird an der Hind-III-Stelle mit Hind III oder Hsα I gespalten and dann"mit alkalischer Phosphatase in der von Ullrich, A. et al· (siehe oben) beschriebenen V/eise behandelt, Ebenfalls in der von Ullrich, A, et al, (siehe oben) beschriebenen Weise wird die QBES mit Hind-III-kohäsiven Termini mit dem gespaltenen pC194 verbunden. Entsprechend der Beschreibung von Sgaramella, V. et al,, J, Mol, B'iol«. 105« 587 (1976) sowie Borenstein, S, und Ephrati-Elizue,. E;,' J,Mol,Biol,, 45, (1969) erfolgt eine Kompetenz-Induktion von B,subtilis HUB33I· Die Transformation von B. subtilis HÜB331 erfolgt unter Verwendung der ebenfalls von Sgaramella et al, und Borenstein et al, beschriebenen Ligationsmischung, Die Zellsuspension wird direkt auf L-?latten angelegt, welche 3 g Chloramphenikol enthalten. Ein selektierter Recombinant wird isoliert und mit Hind III verdaut5 das Aufschlußprodukt wird gemäß Ausführüngsbeispiel 2 analysiert. Zurückgewonnen wird eine DiJS von etwa 830 Basenpaaren Länge und der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz«

Ausführungabeis ρiel 7 Synthese der bovineses Wachstumshormon codierenden cDHS

(A) Plasmad pBR348 wird mit Hae-II-Endonuklease verdaut, woraus ein Fragment mit 1 6OO Basenpaaren entsteht, Sine Hae-II-Stelle befindet sich Innerhalb der das Wachstums-Prähormon codierenden cDIiS-Einlagerung, die zweite Stelle

-34- 6,7,1933

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befindet sich innerhalb dea pBR322-Anteils des Plasmids. Die Verdauung erbringt

+1 +2

5^f - G TTC..., V 3* - O GGG AAG.... 5¹.

Bovines Wachstumshormon- kann entweder mit dem +1-ala-oder dem +2-phe-Reat am M₂-terminalen Ende beginnen (Davhoff et al. siehe oben),, ao daß der eine versuchen könnte, den ala-Kondon zu komplettieren, während ein anderer versuchen könnte, den ala—Kodon auszulöschen. Der Versuch des Auslöschens erfolgt durch Inkubieren der DNS 'mit dATP und dem Ivlenow— Fragment von DUS-Polymerase I, da die erste Base des +2-phe-Kodons (auf dem 3* 5^T-Strang) A ist. Diese Reaktion ergibt

+ 1 +2

5^f - G TTG .... V

V - AAG .... 5^f

Die DUS wird mit Phenol extrahiert und ausgefällt.. Überschüssiges dATP und die verdauten Basen werden durch Chromatografie auf G-50 Sephadex beseitigt. Das verbleibende 5* überstehende G des +1-ala-Sondona wird sodann gemäß Beschreibung von Shine et al., Fat ure 285. 456 (1980) mit S 1-Sfukl ease entfernt. Diese Verdauung' erbringt

+2 5^f - TTC *... 3'

V - AAG.... 5'

(B) Ausführungsbeispiel 7(A) wird wiederholt, wobei die das bovine Prä-Wachstumshormon codierende Desoxynukleotidsequenz durch Verdauung derjenigen Übertragungsvektoren entfernt

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wird, die in den Ausfuhrungsbeispielen 3, 4, 5 und 6 durch das geeignete Restriktionsenzym vor der Verdauung mit Hae II hergestellt worden waren« Die verwendeten Übertragungsvektoren und Restriktionsenzyme sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

jJach Verdauung mit dem geeigneten Restriktionsenzym wird die bovine Prä-Wachstumshormon-Sequenz mittels GeI-El ektro-r phorese isoliert und dann gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 7(a) weiterbehandelt· Es werden identische Resultate erzielt·

Tabelle 3

Restriktionsenzym Übertragungsvektor (Ausführungsbeispiel)

Pst I 3A, 3B, 4G, 4E

Hind III 4A, 4B, 6

Sal I 4C, 4D

3am HI 4<3, 4D

Eco RI 42, 4P, 5A, 5B, 5C

(C) Die Äusführungsbeispiele 7(A) und 7(B) werden wiederholt, wobei anstelle des Klenow-Fragment3 von DSTS-Polymerase I T 4-DIiS-PoIy me rase oder 3¹ ♦••5'-32:onuklease verwendet wird· Alle anderen Bedingungen sind identisch; in jedem Falle wird die identische Sequenz des Fragments von bovinem Wachstumshormon gewonnen»

Ausfuhrungsbeispiel 8

(A) Das bovine Wachstumshormon-Fragment

+1 +2

5' - C TTC .... V

3' - G CGG AAG .... 5'

-36- 6.7.1983 61 586/18

wird durch Hae-II-Verdauung gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel' 7(A) oder 7(B) hergestellt· Der Komplettierungsversuch wird folgendermaßen durchgeführt: Die DUS wird mit dATP, dCTP, dTTP und dem Klenow-Fragment von DlTS-PoIymerase I Inkubiert

Diese Reaktion erbringt

+1 +2

5¹ - G GGC ΪΤΟ .... V

V - G CGG AAG ...... 5¹ .

Die DIiS wird mit Phenol extrahiert und ausgefällt. Die Sequena -wird sodann in Anwesenheit von dCTP mit dem Klenow-Fragment von D]JS-PoIytnerase I inkubiert. Danach wird die Sequenz laut Beschreibung von-Shine et al., Nature« 285» (1980) mit 31-STuklease verdaut} dies erbringt die Sequenz

5' - GCC TTC .... 3' 3' - CGG AAG ..... 5» .

(B) Ausführungsbeispiel 8 (A) wird wiederholt, wobei im zweiten Inkubationsschritt, d. h. unter Anwesenheit von dCTP T4-DITS-Polymerase oder 3'....S'-Exonuklease anstelle des IQenow-Fragments verwendet wird. Die anderen Bedingungen sind identisch; in jedem Falle wird die identische bovine Wachstumshormonsequena erlangt,

Ausführungsbeispiel 9

Die das bovine Wachstumshormon codierende Desoxynukleotiä-Sequena wird in Übertragungsvektoren inseriert, wie dies im vorangegangenen Text für die das bovine Prä-Wachstumshormon codierende Sequens beschrieben wurde.

(A) Die Ausführungsbeispiele 1, 3(A), 3(B), 4(A)...(I),

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(D) und 6 werden wiederholt, wobei anstelle der das bovine Prä-Wachstumshormon codierenden DIiS jene DIiS verwendet wird, die in den Ausführungsbeispielen 7(A), 7(B) oder 7(G) hergestellt worden war. Alle anderen Bedingungen bleiben unverändert. Die DlS wird durch. Verdauung mit dem geeigneten Restrictionsenzym - wie beispielsweise in Tabelle 3 dargelegtt - entfernt und gemäß Ausführungsbeispiel 2 analysiert» In jedem Falle wird eine DHS mit einer Sequenz gewonnen, welche mit dem Phe-Kodon auf Position 2 beginnt und sich zum Ende der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz fortsetzt,

(B) Die Ausführungsbeispiele 1, 3(A), 3(B), 4(A),.,(I), 5(A),,,(D) und 6 werden wiederholt, wobei anstelle der das bovine Prä-Wachstumshormon codierenden·DUS jene DiTS verwendet wird, die in den Ausführungsbeiapielen 8(A) oder 8(B) hergestellt worden war. Alle anderen Bedingungen bleiben unverändert. Die DSS wird durch Verdauung mit dem geeigneten Restriktionsenzym - wie beispielsweise in Tabelle 3 dargelegt - entfernt und gemäß Ausführungsbeispiel 2 analysiert. In jedem Falle wird eine DUS mit einer Sequenz gewonnen, welche mit dem Ala-Kodon auf Position 1 beginnt und sich sum Ende der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz fort» setzt,

Ausführungsbeispiel 10 Darstellung; des bovinen Wachstumshormons

Bovines Wachstumshormon kann durch jedwede der oben beschriebenen Methoden dargestellt werden,

(A) Darstellung von bovinem Wachstums-Prähormon als ein Fu-

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sionsprotein wurde mittels eines Radioimmunoassay-Versuches und eines Hini2ell-Versuch.es demonstriert. Im Radioimmunoass ay-V er sucJx wurden pBP348-iialt ige B.coli 1776 oder p3R322-haltige E.coli als KontrollVariante in-Mährbouillon angebaut und mittels"Zentrifugation gesammelt. Die Zellen wurden resuspendiert und lysiert, sodann wurden strahlenmarkiertes ovines Wachstumshormon sowie oviner (oder boviner) Wachst umshormon-Antikorρer hinzugegeben. Der Immunkomplex wurde ausgefällt und hinsichtlich Radioaktivität gemessen. Dieser Versuch zeigt, daß das Fusionsprotein einen Teil der' bovinen Wachstumshormon-Inmunoaktivitat zurückhält. Um darüber hinaus die Produktion eines Fusionsproteins zu veranschaulichen, wurde ein Minizeil-Versuch nach der von Meagher, R. B. et al.... Cell« JH), 521 (1977) beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt. Abbildung 2 zeigt die aus Ξ.-coli- 1776-Minizellen resultierenden Gelelektrophorese-Banden« Bande (a) wurde von. B. coli 1776 gewonnen, das mit pBP348 transformiert worden"war. Bande (b) wurde von S. coli 1776 gewonnen, das mit pBR322 transformiert worden war. Bande (c) sind Molekülmasse-Marker. (A) zeigt das Fusionsprodukt von ß-Laktamase und bovinem Wachstums-Prähormon« (B) zeigt Prä-Laktamase, und (G) zeigt ß-laktamase. Dieser Versuch zeigt, daß pBP348 ein Fusionsprotein erzeugt, welches aus 183 Aminosäuren von ß-Laktamase, 217 Aminosäuren von bovinem Wachstums-Prähormoh und einigen durch die normalerweise nichtübersetzte 5'-Region codierten verbindenen Aminosäuren besteht. Die ermittelte gesamte relative Molekülmasseannähernd 45 000 - stimmt mit der vorausberechneten relativen Molekülmasse des Hybridproteins überein«

(3.) Zur direkten Darstellung von bovinem Wachst ums-Prähormon wird die Sinlagerungs-DiJS zunächst durch teilweise Pst-I-EndonuBeaseverdauung von pBP348 separiert und mittels

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präparativer Gel-Elektrophorese gereinigt. Sodann wird eine 15- g-Probe der gereinigten Einlagerungs-DitfS modifiziert, indem die DITS in Wasser suspendiert wird, welchem eine konzentrierte Salzlösung zugesetzt wird, so daß die endgültige Zusammensetzung 70 mM (pH,. 8,8), 70 ml MgOIp, 10 mM Dithiothreitol und 13,75'Einheiten T4-Dli5-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 250 1 enthält. Das Reaktionsgemisch wird für einige Minuten bei 37 ⁰C inkubiert, so dann wird dATP bis zu einer Konzentration von 50 mM zugesetzt, um die endonukleolytische Verdauung am nächstgelegenen Adenin-Rest zu beenden. Fach 30 s zusätzlicher Inkubation wird das Enzym durch 5minütige Wärmebehandlung bei 65 ⁰G inaktiviert. Dieser Vorgang wird zweimal durchgeführt, wobei einmal dCTP anstelle von dATP und beim zweitenmal erneut dTTP verwendet wird. Die behandelte DiJS wird mittels Sthanolpräzipitation zurückgewonnen. Die Verdauung mit Sl-Suklease zur Erlangung von stumpfen Enden wird in der von Ullrich, A. et al., (siehe oben).beschriebenen Weise ausgeführt« Dieses Vorgehen dient dazu, ein DÜTS-Molekül zu erzeugen, das am Startkodon auf Position EFr. -26 abschließt. Derartige Moleküle werden übersetzt, wenn sie in einen Sxpressionsvektor inseriert 'werden, dessen Insertionssteile sich etwa 3·· 11 STukleotide von der Ribosom-Bindungsstellensequenz einer Expressionseinheit entfernt befindet.

Sin Vektor für die direkte Darstellung wird durch Modifikation des Plasmids ptrpE3Q vermittels Beseitigen von 23...29 Uukleotiden unter Einsatz von T4-D£TS-Polymerase und S1-äuklease gemäß obiger Beschreibung konstruiert.

Sowohl die modifizierte cDITS als auch der modifizierte Expressionsvektor werden mit einem spezifischen Verbinder mit der Sequenz 5'-CCGGA¹ICCGg^' an einem Strang und seiner

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komplementären Sequenz am anderen Strang versorgt; dies erfolgt durch stumpfendige Ligation unter Verwendung von DIiS-Ligase, wie dies von Valenzuela (siehe oben) beschrieben wurde. Die Verbinder liefern gegenüber Bam-HI-Endonuklease senaetive Restrikt ionssteilen -, letztere wird zur Erleichterung der Insertion verwendet« Die Insertionsreaktion wird in der von Ullrich, A. et al« (siehe oben) beschriebenen Weise durchgeführt. Die Wirtabakterien Ξ. coli HB101. REI oder 1776 werden durch die die inserierte modifizierte Wachstums-Frähormon codierende Region tragenden rekombinanten Vektoren.transformiert,. und die Transformanten werden hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber Ampizillin selektiert. Ein einzelner, für die v/eitere Analyse ausgewählter Transformant wird als ptrpE3Q/bGH bezeichnet.

Durch ptrp_S30/bGH transformierte Bakterienzellen werden bei 37 ⁰C in einem mit Leuzin, Prolin, Vitamin B1 und Ampizillin angereichertem Stamdard-Minimalmedium (M9) angebaut. In der frühen log-Pha.se wird das trp-Qperon durch Zusetzen von ß-Indolylakrylsäure (30 g/ml Medium) induziert. Die Kontrollkulturen bleiben"uninduziert. Mach drei, weiteren Stunden Wachstum werden 1,5 ml Zellen durch Hinzugeben von 20 Ci S-L-Methionin radioaktiv markiert und 10 min lang inkubiert. Die Zellen werden sodann durch Zentrifugation gesammelt, gewaschen und in 250 ^uI Pufferlösung - 10 % (V/V) Glykol, 5 % (V/V) 3-Merkapt©ethanol und 2,3 %> (M/V) SDS in 0,06251. Tris (pH 6,8) - resuspendiert· Die Suspension wird 5 min gekocht, dann einem 10-/S-(M/V)-SDS-Polyakrylamid-GeI appliziert und elektrophoretisch "fraktioniert. Die Proteinbanden werden autoradiografisch sichtbar gemacht. Die Ergebnisse lassen das Vorhandensein einer neuen Proteinbaru de von etwa 24 000 Dalton erkennen, welche in nicht induzierten oder nichttransformierten Kulturen nicht beobachtet

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Das bovine Wachstums-Prähormon wird durch, herkömmliche Techniken einschließlich beispielsweise Gelfiltration, Ionenaus tauschchromatograf ie, Affinitätschromatografie und Differential-Löalichkeitstechniken gereinigt. Die Überführung von Wachstums-Prähormon in Wachstumshormon erfolgt durch das von Jackson, R. C, et al« (siehe oben) beschriebene Verfahren*

(C) Ein spezifischer Verbinder mit der Sequenz 5'-CCQGAiTGCG GATG-3¹ auf einem Strang und seiner komplementären Sequenz auf dem anderen wird der das bovine Wachstumshormon codierenden DiJS, wie sie in den A us führ ungs be is pi el en 7(A) ,,. + (G) und 8(Α)···(Β) hergestellt wurde, stumpfendig verbünden»" Diese modifizierte DHS wird dann gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 10(E) in das modifizierte Plasmid ptrpE3Q inseriert· Wirtsbakterien werden laut Ausführungsbeispiel 10(B) transformiert, kultiviert, und das resultierende::bovine "Wachstumshormon wird gereinigt»

'flenn auch die Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben worden ist, so versteht es sich von selbst, daß sie weiterer Modifikationen fähig ist. Mit der vorliegenden Anmeldung sollen einige Variationen, Anwendungen oder Bearbeitungen der Erfindung bezüglich ihrer Grundsätze geschützt werden; dies schließt auch solche Abweichungen von der hier dargestellten Qffenlegung ein, die sich aus der bekannten und üblichen Präzis in jenem Fachgebiet ergeben, auf das sich die Erfindung besieht«

Claims

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Erfindungsanspruch

Verfahren zur Synthetisierung von Rinderwachst umshormon, gekennzeichnet durch Inkabieren eines Mikroorganismus, der durch einen Bxpressionstranfervektor transformiert wurde, der eine.für daa Rinderwachst umshormon kodierende Desozynukleotidsequenz aufweist, die durch Umsetzen einer für Rinder-Präwachstumshormon kodierende Desoxynucleo* tidsequenz mit einem durch Spalten eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym erhaltenen DHS-Molekül erhalten und repliziert wurde, wobei die cDBfS, die für Rinder-Präwachstumshormon codiert, mit dem Restriktionsenzym Hae II gespalten wurde und das gespaltene Produkt mit einem Snzym der Gruppe, die aus dem. dlenow-Fragment von DUS-Polymerase I, T4-D£fS' und 3^f-5^!-Exonuklease besteht, inkubiert wurde, sowie Abtrennen des Rinderwachstumshormons aus dem Lysat oder dem Kulturmedium des Mikroorganismus·

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen