CZ280596B6 - Způsob výroby vektoru pro přenos DNA - Google Patents

Způsob výroby vektoru pro přenos DNA Download PDF

Info

Publication number
CZ280596B6
CZ280596B6 CS816360A CS636081A CZ280596B6 CZ 280596 B6 CZ280596 B6 CZ 280596B6 CS 816360 A CS816360 A CS 816360A CS 636081 A CS636081 A CS 636081A CZ 280596 B6 CZ280596 B6 CZ 280596B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
growth hormone
dna
bovine growth
amino acids
cdna
Prior art date
Application number
CS816360A
Other languages
English (en)
Inventor
Walter L. Miller
Joseph A. Martial
John D. Baxter
Original Assignee
The Regents Of The University Of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22663908&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ280596(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by The Regents Of The University Of California filed Critical The Regents Of The University Of California
Publication of CZ636081A3 publication Critical patent/CZ636081A3/cs
Publication of CZ280596B6 publication Critical patent/CZ280596B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

Způsob výroby vektoru pro přenos DNA pro použití k udržování, replikaci a při expresi desoxynukleotidového sledu, který je k'odem pro prekursor růstového hormonu skotu nebo pro růstový hormon skotu, spočívá v tom, že se uvede v reakci sled nukleotidů, který je k'odem pro prekursor růstového hormonu skotu nebo růstový hormon skotu s molekulou DNA, připravenou štěpením vektoru pro přenos působením restrikčního enzymu.ŕ

Description

Vynález se týká způsobu výroby vektoru pro přenos, molekuly DNA, rekombinantního systému pro expresi kódové DNA a způsobu výroby bílkoviny, obsahující aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu.
Dosavadní stav techniky
Růstový hormon je polypeptidový hormon, který je vytvářen a vylučován adenohypofýzou, to jest předním lalokem hypofýzy. Růstový hormon se vytváří nejprve jako bílkovinný prekurzor, který obsahuje N-terminální signální peptid a kódový řetězec pro růstový hormon. Řetězec aminokyselin v růstovém hormonu skotu je znám a byl popsán v publikaci Dayhoff M.D. a další, Atlas of Protein Sequence and Structure, sv. 5, doplněk 3, str. 245 až 352, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., 1978.
Růstový hormon se za normálních podmínek produkuje celý život, i když největší množství se produkuje v období dospívání. Hormon je nutný pro růst v období dospívání. Přestože mechanismus působení hormonu není zcela znám, je známo, že je nutný hlavně pro růst kostí, udržení dusíku, výrobu bílkovin a rovněž k ovlivnění metabolismu glukózy a tukových látek. Jinak řečeno, jde o obecně anabolický hormon.
Použití růstového hormonu skotu ke zvýšení rychlosti růstu zkracuje doba, která je nutná vzestup produkce masa může být se zakládá na jeho známé biologické účinnosti, tak jak byla svrchu popsána. Růstový hormon skotu je možno podávat mladému skotu a ke zvýšení přírůstků, čímž se k dosaženi jatečně váhy. Výsledný velmi významný. Mimoto se růstový hormon skotu liší od růstového hormonu ovce pouze obsahem několika aminokyselin. Z tohoto důvodu je možno podávat růstový hormon skotu ovcím se stejnými výsledky jako u skotu, to jest ke zvýšení rychlosti růstu a přírůstků a tím i ke zvýšeni produkce masa. Růstový hormon skotu je rovněž možno podávat vepřům ke stejnému účelu a se stejným výsledkem.
Základní postup pro klonování sledů DNA je nyní znám. Například v publikaci Seeburg P.H. a další, Nátuře, 270, 486, 1977 se popisuje klonování genu pro růstový hormon krysy. V publikaci Shine J. a další, Nátuře, 270, 494, 1977, se popisuje klonování genu pro lidský choriový somatomammotropin. V publikaci Derynck R. a další, Nátuře 285, 542, 1980, se popisuje klonování genu pro lidský interferon z fibroblastu.
Způsoby exprese heterologní DNA v mikroorganismech jsou nyní také známy. Zásadně se postupuje tak, že se řetězec, který je kódem pro heterologní DNA, včlení do vektoru pro přenos DNA v místě, které se nachází uvnitř operonu, který je schopen exprese. Pro výrobu hybridní bílkoviny musí být včleněný řetězec ve správné fázi se sledem operonu a musí být orientován ve stejném směru vzhledem ke translaci. V případě těchto podmínek se při
-1CZ 280596 B6 translaci operonu přenáší i včleněný řetězec, takže vzniklá bílkovina obsahuje N-terminální řetězec aminokyselin, který je kódem pro operon, schopný exprese, a mimoto řetězec aminokyselin, který je kódem pro včleněnou část. Tyto postupy byly popsány v publikacích Polisky B. a další, Proč. Nat. Acad. Sci., USA, 73, 3900, 1976, Itakura K. a další, Science, 198, 1056, 1979. Nyní se užívají různé operony, schopné exprese, včetně operonu pro betagalaktosidázu, beta-laktamázu a tryptofan.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří způsob výroby vektoru pro přenos, obsahujícího kódovou DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, který spočívá v tom, že se první DNA, obsahující kódový řetězec pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, uvede do styku s druhou DNA, obsahující linearizovaný plasmid hostitele za vzniku vektoru pro přenos, který se pak izoluje.
Součástí podstaty vynálezu je také molekula DNA, obsahující kódové řetězce pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu.
Podstatu vynálezu tvoří rovněž rekombinantní systém pro expresi kódové DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu v hostitelské buňce, který obsahuje kódovou DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, operativně vázanou na řídicí řetězec, kompatibilní s hostitelskou buňkou.
Součástí podstaty je i způsob výroby bílkoviny, obsahující aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, přičemž se pěstují buňky, obsahující systém, který v hostitelské buňce ovlivňuje expresi kódové DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, přičemž tento systém je tvořen kódovou DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového řetězce hormonu skotu, operativně vázanou na řídicí řetězce, kompatibilní s buňkou hostitele, a vzniklá bílkovina se z kultury izoluje.
Ve výhodném provedení obsahuje kódová DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu kódového řetězce pro další aminokyseliny a je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu.
Ve výhodném provedení obsahuje deoxynukleotidový řetězec, který je kódem pro prekurzor růstového hormonu, navíc následující řetězec
1 5' - ATG ATG GCT GCA GGC CCC CGG ACC TCC CTG
CTC CTG GCT TTC GCC CTG CTC TGC CTG CCC TGG ACT CAG GTG
GTG GGC GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC
AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT
GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA
CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC
TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG
CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC
ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC
TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT
GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG
CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC
AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC
-2CZ 280596 B6
GAC AAG
TGC
GCG GAC CGC
CTG
CTG
CGC
CTC CAT TTC
AAG AAG GGG
AAC
ACG
GAG
TAC GAG GCC
GGT
ACG
AGC
CTG
TAC
TGT
CTC CTG GCC
TCC AGG TTC
TGC TTC GTC ATG
TAG- 3'
CGG AAG kde znamená znamená znamená znamená deoxyadenyl, deoxyguanyl, deoxycytosyl a thymidyl.
Podle dalšího výhodného provedení se připravuje deoxynukleotidový řetězec, který je kódem pro růstový hormon skotu tak, že se štěpí cDNA (deoxynukleotidový řetězec, který je prekurzorem pro prekurzor růstového hormonu skotu), působením restrikčního enzymu Hae II a rozštěpený produkt se inkubuje s enzymem, který se volí ze skupiny, obsahující Klenowův fragment. DNA-polymerázy I, T4 DNA polymerázy nebo 3', 5'-exonukleázy.
Podle dalšího provedení se připravuje řetězec pro růstový hormon skotu tak, že se inkubace se svrchu vedeným Klenowovým fragmentem provádí za přítomnosti dATP a výsledný produkt se rozkládá SI nukleázou, čímž se získá deoxynukleotidový řetězec, který je kódem pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, a výsledkem je deoxynukleotidový řetězec, který je kódem pro růstový hormon skotu a navíc obsahuje řetězec následujícího složení:
5 >' - TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT
GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT
GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG
GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC
TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC
CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC
CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA
GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC
TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG
ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC
CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT
GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC
CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG PAC CTG AGG GTC ATG
AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG - 3
kde
A znamená deoxyadenyl,
G znamená deoxyguanyl,
C znamená deoxycytosyl a
T znamená thymidyl.
mon Podle dalšího provedení se skotu tak, že se inkubace se získává řetězec svrchu uvedeným pro růstový horKlenowovým frag-
mentem provádí za přítomnosti dATP, dGTP, dCTP a dTTP a výsledný produkt se inkubuje s enzymem, který se volí ze skupiny, obsahující Klenowův fragment, T4 DNA polymerázu nebo 3', 5' -exonukleázu za přítomnosti dCTP a výsledný produkt se podrobí působení SI
-3CZ 280596 B6 nukleázy, čímž se získá deoxynukleotidový řetězec, který je kódem pro aminokyselinu 1 až 191 růstového hormonu skotu za vzniku desoxynukleotidového řetězce, který je kódem pro růstový hormon skotu a navíc obsahuje řetězec následujícího složení:
1 5' - GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT
GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT
GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG
GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC
TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC
CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC
CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA
GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC
TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG
ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC
CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT
GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC
CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG
AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG - 3
kde
A znamená deoxyadenyl,
G znamená deoxyguanyl,
C znamená deoxycytosyl a znamená thymidyl.
Podle dalšího provedení se získá plasmid pBP348 s obsahem prekurzoru růstového hormonu skotu tak, že molekulou DNA, připravenou štěpením vektoru pro přenos restrikčním enzymem, je pBR322 a restrikčním enzymem je Pst 1.
Podle dalšího provedení pro výrobu vektoru pro přenos DNA s obsahem řetězce pro růstový hormon skotu se postupuje tak, že se uvede v reakci připravený deoxynukleotidový řetězec, který je kódem pro růstový hormon skotu, s molekulou DNA, připravenou štěpením vektoru pro přenos působením restrikčního enzymu.
Podle dalšího provedení způsobu výroby vektoru pro přenos a expresi se postupuje tak, že se molekula DNA, připravená štěpením vektoru pro přenos působením restrikčního enzymu, štěpí v místě, kde se nachází řídicí oblast pro expresi.
Podle dalšího provedení se provádí způsob výroby bílkoviny, obsahující řetězec aminokyselin prekurzoru růstového hormonu skotu nebo aminokyselin pro růstový hormon skotu jako koncový řetězec na zakončení, které obsahuje uhlíkový atom a část prokaryotické bílkoviny jako N-terminální řetězec tak, že se inkubuje mikroorganismus, transformovaný vektorem pro přenos a expresi, obsahující deoxynukleotidový řetězec, který je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu nebo pro růstový hormon skotu.
Podle dalšího provedení se způsob pro syntézu růstového hormonu skotu provádí tak, že se inkubuje mikroorganismus, transformovaný vektorem pro přenos a expresi s obsahem deoxynukleotidového řetězce, který je kódem pro růstový hormon skotu za podmínek,
-4CZ 280596 B6 vhodných pro expresi tohoto kódu pro růstový hormon Skotu s následným čištěním růstového hormonu skotu po jeho izolaci z rozrušených buněk mikroorganismu, nebo ze živného prostředí.
Při provádění způsobu podle vynálezu je nutno klonovat DNA, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu nebo pro růstový hormon skotu a dosáhnout exprese klonované DNA v mikroorganismech.
mRNA, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu, se izoluje z hypofýzy skotu. Obrácený předpis (cDNA-kopie) této mRNA se připraví a včlení do vektoru propenos. Pak se připraví deoxynukleotidový řetězec, který je kódem pro růstový hormon skotu, hydrolýzou řetězce, který je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu. Vektor pro přenos se pak užije k transformování bakterií, v nichž dochází k expresi tímto způsobem klonování cDNA.
Řetězec DNA, který je kódem pro růstový hormon skotu, se získá pomocí cDNA. Zásadní postup při provádění tohoto způsobu je znám a je popsán například ve svrchu uvedených publikacích Seeburga P.H. a dalších a Deryncka a dalších. Použitá cDNA se získá při použití RNA, extrahované z hypofýz skotu.
DNA, izolovaná z hypofýz skotu běžným zůsobem, se pak izoluje jako polyadenylovaná RNA specifickou chromatografii. Integrita této polyadenylované RNA se pak prokáže translací polyadenylované RNA způsobem, popsaným v publikacích Miller. W.L. a McCarthy B. J. , J.Biol. Chem., 254, 742, 1979 a Martial J.A. a další, Proč. Nat. Acad.Sci., USA, 74, 1816, 1977, s následnou analýzou bílkovin, získaných elektroforézou na SDS-akrylamidovém gelu způsobem, popsaným v publikaci Laemmli U.K., Nátuře, 227, 680, 1970. Růstový hormon skotu je možno dále identifikovat imunologickou srážecí reakcí podle publikace Martial J.A., a další, Proč. Nat. Acad. Sci., USA (viz svrchu).
Polyadenylovaná RNA, která se užije jako matrice při výrobě cDNA s dvojitým řetězcem, se získá běžným způsobem. První řetězec cDNA se získá použitím reverzní transkriptázy, oligo-dT a polyadenylované RNA, způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Millera a McCarthyho a v publikaci Monahan J.J. a další, Biochem., 15, 223, 1976. RNA se odstraní za alkalických podmínek a cDNA s jedním řetězcem se užije pro syntézu druhého řetězce působením reverzní transkriptázy. Klička tvaru vlásničky se odstraní působením S1 nukleázy způsobem podle publikace Leong J.A. a další, J.Virol., 9, 891, 1972, jak bylo popsáno v publikaci Ullrich A. a další, Science, 196:1313, 1977.
Tímto způsobem se získá cDNA, kterou již je možno včlenit do vektoru pro přenos. Vhodným vektorem pro přenos může být vektor, který je schopný transformovat bakterie, například Escherichia coli a Bacillus subtilis nebo kvasinky, například Saccharomyces cerevisiae, dále inl, csp a esp mutanty kmene Neurospora crassa a živočišné buňky ve tkáňové kultuře. Příkladem vektorů pro přenos, které je možno užít při provádění způsobu podle vynálezu a které jsou schopny transformovat Escherichia coli, mohou být plasmidy pSCIOl, pMB9, pBR313, pHR315, pBR316 a pBR322 a vektory, odvozené od bakteriofágů, to jest Charon 3A, Charon 4A, Charon
-5CZ 280596 B6
16A a AgtWES. Λβ. Publikace, které popisují výrobu a vlastnosti těchto vektorů pro přenos, jsou uvedeny v následující tabulce 1.
Tabulka 1
Vektor
Publikace
pSCIOl Cohen a další, Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 70, 1293 a 3240, 1977. Boyer a další, Recombinant Molecules, Bears, a další, Eds,Raven Press, NY, str. 13, 1977. Cohen a další, Recombinant Molecular, str. 91.
pMB9 Rodriguez a další, Molecular Mechanisms in Control
of Gene Expression (ICN-UCLA Symposium on Mol.
Cell. Biol. sv.5), Nieslich a další, Eds.,
Academie Press, NY, str. 471, 1976.
Bolivar a další, Gene, 2, 75, 1977.
pBR313 Bolivar a další, viz svrchu
pBR315
Rodriguez a další, viz svrchu pBR316 pBR322
Rodriguez a další, viz svrchu
Bolivar a další, Gene, 2, 95, 1977.
Bolivar a další, Gene, 4, 121, 1978.
Sutcliffe, Cold. Spring Harbor Symp. on Quant. Biol., 43, 77, 1978.
Charon 3A
Blattner a další,
Science 196,
161, 1977.
Charon 4A
Blattner a další, viz svrchu
Charon 16A
Blattner a další, viz svrchu /igtEWS. Ab
Tremeier a další, Nátuře 263, 526 1976.
Leder a další, Science, 196, 175, 1977.
Dalšími vhodnými vektory pro transformaci Escherichia coli jsou vektory, popsané v publikaci Sinsheimer R.L., Ann. Rev. Biochem., 46, 415, 1977. Vhodné vektory pro transformaci B. subtilis byly popsány v publikacích Iordanascu S., J.Bacteriol., 124, 597, 1964 a Ehrlich S. D., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 74, 1680, 1977. Jeden z těchto vektorů byl identifikován jako plasmid pC194. Hybridní plasmidy, obsahující DNA z kvasinek, a to plasmidovou a/nebo chromozonální, jakož i bakteriální DNA, například plasmidovou, je možno použít k transformaci kvasinek. Plasmidy tohoto typu byly popsány v publikacích Beggs J.D., Nátuře 275, 104, 1978, Asiav C.L. a Carbon J., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 76, 3829, 1979 a Kingsman A.K. a další, Gene 7, 141, 1979. Vektory pro přenos, které mohou být využity pro tkáňové kultury živočišných buněk, jsou například defektivní adenovirus, defektivni virus SV-40 a virus polyomu.
-6CZ 280596 B6
Získaná cDNA se včlení do vektoru pro přenos běžným způsobem. Včlenění cDNA se obvykle provádí na jakémkoliv místě působení restrikčního enzymu, které se ve vektoru pro přenos neopakuje. Charon 3A a 4A a /IgtWES. Ab obsahují vždy větší počet míst a v důsledku toho vzniká několik míst pro včlenění vektorů, některé vektory obsahují jediné místo pro působení restrikčního enzymu. Použitelná místa ve vektorech charon 3A a 4A a AgtWES. Ab jsou uvedena v následující tabulce 2.
Tabulka 2
Vektor
Místo pro působení restrikčního enzymu
PSC101
EcoRI, Hind III, Sal I, Dsm HI, Hpa I, Sma I
pMB9 Eco RI, Hind III, Sal I, Bam HI
pBR313 Eco Xma RI, I Hind iii, Sal I, Bam HI, Hpa I, Sma I
pBR315, pBR322 Rco Ri, Hind III, Sal I, Sam HI, Pst I
pBR316 Hind III, Sal I, Bam HI, Pst I pC194 Hind III
Charon 16A
EcoRI, Sst I
Charon 3A
Eco RI
Charon 4A
Eco RI
Agt WES. Λβ
Eco RI
Obvykle se cDNA včleňuje do restrikčního místa v oblasti, která určuje ještě další vlastnost fenotypu, protože je to účelné pro selekci. Například Hind III, Sal I a Bam HI v pSCIOl, pMB9, pBR313, pBR315, pBR316 a pBR322 se nachází v místě pro odolnost proti tetracyklinu nebo v kontrolní oblasti pro tento gen. Včleněním v tomto místě způsobí ztrátu odolnosti proti tetracyklinu. cDNA je možno včlenit do vektoru pro přenos pomocí látek, usnadňujících vazbu v uvedeném místě. Lze postupovat například tak, že se na cDNA naváže syntetický nukleotid, který obsahuje místo pro štěpení určitou restrikční endonukleázou, například některou ze svrchu uvedených endonukleáz. Pak se cDNA a vektor pro přenos odděleně inkubují s restrikční endonukleázou a pak se spojí za vzniku vektoru s obsahem cDNA. Je také možno postupovat tak, že se na cDNA naváže deoxynukleotid a terminálni transferáza, jak bylo popsáno v publikaci Roychoudhury R. a další, Nucl. Acids, Res., 3, 863, 1976. Po působení restrikční endonukleázy je pak možno vektor pro přenos vázat na doplňkový deoxynukleotid stejným
-7CZ 280596 B6 způsobem. Vektor pro přenos s navázaným deoxynukleotidem a cDNA s navázaným deoxynukleotidem se pak spojí za vzniku vektoru s obsahem cDNA. Je například možno na cDNA navázat dC a pak otevřít vektor v místě pro působení Pst I a navázat dG.
Pak se použije vektor s obsahem cDNA pro transformaci vhodného hostitele. Vhodným hostitelem pro různé vektory mohou být například. E. coli, B. subtilis, kvasinky, N-crass a tkáňové kultury živočišných buněk. Vektory, vhodné pro transformaci těchto hostitelů, byly uvedeny svrchu. Obvykle se užívají tři mutanty Escherichia coli. Jde o chil776, RRI a HB101. Escherichia coli chil776 byl popsán v publikaci Curtis R., Ann. Rev. Microbiol., 30,507, 1976 a v US patentu č. 4 190 495. Escherichia coli RRI byl popsán v publikaci Eugaiczyk A. a další, Molecular Mechanisme in Control of Gene Expression na str. 543. Scherichia coli HB101 byl popsán v publikaci Kedes D.H. a Thomass C.A., Proč. Nati. Acad. Sci., USA 73, 1537, 1976. Vhodný hostitel se transformuje běžným způsobem. Například Escherichia coli chil776 se transformuje vektorem s obsahem cDNA způsobem, popsaným v publikaci Cooke N.E. a další, J.Biol. Chem., 255, 6502, 1980. Kolonie se podrobí selekci a/nebo výběru běžným způsobem. Je možno například postupovat podle ztráty některé vlastnosti, například odolnosti proti tetracyklinu. Selekci je možno provádět tak, že se
1) odstraní cDNA příslušnou restrikční endonukleázou a pak se analyzuje elektroforézou a hybridizací způsobem podle publikace Southern B.M., J.Mol.Biol., 98, 503, 1975, nebo se
2) opakovaně pěstuje transformovaný mikroorganismus způsobem podle publikace Grunstein M. a Hagness D. S., Proč. Nat.
Acad. Sci., USA, 72, 3961, 1975 za současné hybridizace, nebo se
3) kolonie přímo zkoumají na schopnost exprese RIA nebo jiným způsobem.
DNA, kerá je kódem pro růstový hormon skotu, se připravuje například z části, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu. Z ní se DNA odstraní působením vhodné restrikční endonukleázy. Například v případě, že se cDNA včlení do místa pro působení Pst I v plasmidu pBK322, je možno tuto včleněnou část odstranit částečným působením enzymu Pst I, protože cDNA pro růstový hormon skotu uvnitř obsahuje ještě dvě místa pro působení tohoto enzymu. Pak se cDNA rozloží enzymem Hae II. Je také možno postupovat tak, že se rekombinantní plasmid, odvozený od pBR322, podrobí působení Hae II k odstranění části včleněné cDNA. Štěpení působením Hae II odstraní DNA, které je kódem pro N-terminální signální peptid, a dvě ze tří bází, které jsou kódem pro N-terminální Ala růstového hormonu. Tyto báze se pak nahradí inubací včleněné části s Klenowovým fragmentem DNA-polymerázy I a s deoxynukleotidem. Rovněž je možno postupoat tak, že se báze, které jsou kódem pro Ala, rozruší inkubací cDNA s Klenowovým fragmentem, T4 DNA-polymerázou nebo 3', 5'-oxonukleázou za přítomnosti dATP. Klenowův fragment byl popsán v publikaci Klenow M. a Henningsen I., Proč. Nati. Acad. Sci., USA 65, 168, 1970. cDNA, která je kódem pro růstový hormon, se pak včlení do vhodného vektoru pro přenos svrchu uvedeným způsobem.
-8CZ 280596 B6
Klonované DNA se podrobí expresi v bakteriích za vzniku bílkoviny, která obsahuje růstový hormon skotu, pro nějž je kódem včleněný řetězec, nebo pouze růstový hormon. K dispozici je několik možných postupů, například
a) modifikace řetězce, který je užit jako kód za vzniku přesného výchozího bodu pro translaci,
b) selekce nebo konstrukce optimálního vektoru pro expresi,
c) další zpracování po translaci buňek in vivo s využitím aktivity hostitele, nebo in vitro chemickým způsobem a
d) přímá exprese.
V případě, že dochází k expresi složené bílkoviny, je obvykle možno upustit od modifikace klonovaného řetězce nukleotidů, pokud výsledný sled dovoluje translaci včleněné části ve správné fázi a pokud nejsou obsaženy žádné kodony, které by způsobily zastavení translace před počátečním kodonem včleněného řetězce.
Je možno dosáhnout exprese prekurzoru růstového hormonu nebo růstového hormonu ve formě složené bílkoviny tak, že se včlenění cDNA do příslušného místa uvnitř operonu, schopného exprese, včetně například místa pro působení enzymu Pst I v genu pro beta-laktamázu v plasmidu pBR322, jak bylo popsáno v publikacích Villa-Komaroff L. a další, Proč. Nat. Acad. Sci., USA, 75, 3727, 1978, Serburg P. a další, Nátuře 274:795, 1978, místa pro působení enzymu EcoRI v plasmidu pB322, který nese lac řídící oblast a řetězec, který je kódem pro beta-galaktosidázu, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Itakura K., nebo místo pro působení enzymu Hind III v genu trpD v plasmidu ptrpED50, jak bylo popsáno v publikaci Martial J. a další, Science, 205, 502, 1979. Modifikace délky řetězce o jeden nebo dva nukleotidy za účelem dosažení správného sledu při translaci je známa. Včleněním těchto nukleotidů do místa pro působení enzymu Pst I v plasmidu pBR322 svrchu popsaným způsobem vede k odčítání ve správné fázi s pravděpodobností 1/6.
Prekurzor růstového hormonu a růstový hormon se připravuje ze složení bílkoviny, schopné specifického štěpení in vitro. Klonovaný řetězec nukleotidů se modifikuje tak, aby byl kódem pro řetězec aminokyselin při specificitě proteolytického enzymu. Vhodným řetězcem je AspAspAspAspLys, který je přednostně štěpen enzymem enterokinázou, jak je popsáno v současně podávané US přihlášce č. 125 878, podané 29. února 1980. Jak je v této přihlášce popsáno, včlení se řetězec nukleotidů, který je kódem pro svrchu uvedený sled aminokyselin, a to těsně v blízkosti nukleotidového řetězce, který je kódem pro N-terminální sled prekurzoru růstového hormonu.
V případě prekurzoru růstového hormonu znamená toto včlenění modifikaci původně včleněné cDNA odstraněním nukleotidu v poloze 5' řetězce, který je kódem pro prekurzor růstového hormonu. Svrchu uvedená cDNA, která je včleněna v případě růstového hormonu, nemusí být modifikována. Modifikace včleněné části pro prekurzor růstového hormonu se dosahuje buď řízeným působením exonukleázy nebo T4 DNA-polymerázy na zakončení 3',nebo kombinací
-9CZ 280596 B6 štěpení endonukleázou v místě, které je v žádoucí vzdálenosti od zakončení 5', s následnou chemickou syntézou, která obnoví tu část žádaného řetězce, která byla odstraněna. Další podrobnosti tohoto postupu jsou popsány v US přihlášce č. 125 878. Při tomto postupu se s výhodou užívá T4 DNA-polymerázy a SI nukleázy a získá se cDNA řetězec, který je kódem pro prekurzor růstového hormonu, bez oblasti 5'. Řetězec nukleotidů, který je kódem pro svrchu uvedený řetězec aminokyselin, se naváže na cDNA, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu nebo pro růstový hormon, přičemž se působí DNA-ligázou, jak bylo popsáno v publikaci Valenzuela a další, Nátuře, 280, 815, 1979. Modifikovaný řetězec cDNA se pak včlení do vektoru pro expresi složené bílkoviny, tak jak bylo svrchu popsáno. Hostitelské bakterie, například Escherichia coli HB101, RRI nebo chil776, nebo jiné bakterie, se transformují působením vektoru, který nese kód pro prekurzor růstového hormonu. Transformované kolonie se třídí na odolnost proti ampicilinu. Vybrané kolonie se pak pěstují za podmínek, vhodných pro expresi složené bílkoviny. Po expresi této bílkoviny se prekurzor růstového hormonu nebo růstový hormon odštěpí enzymatickou hydrolýzou působením enterokinázy.
Při použití příslušného vektoru pro přenos a expresi je možno dosáhnout přímé exprese prekurzoru růstového hormonu, to jest hormonu, který není vázán na žádnou prokaryotickou bílkovinu. Základním principem pro přímou expresi je skutečnost, že včleněný segment DNA úplně nahradí segment, který je kódem a je přenášen bakteriální řídicí oblastí tak, že základní složka řídicí oblasti, která má být zachována, je ukončena jednotkou pro expresi, která obsahuje promotor a vazné místo ribozomu, schopné působit na organismus hostitele. Není nutné odstranit všechny nukleotidy, které jsou kódem pro hostitelskou část složené bílkoviny. Vztah mezi ribozomálnim vazným místem s kodonem AUG, od něhož začíná včleněná část, je takový, že tento kodon může být uložen kdekoli mezi kodonem 3 až 11 ribozomálního vazného místa, jak bylo popsáno v publikacích Shine J. a další, Proč. Nat. Acad. Sci., USA, 71, 1342, 1974 a Steitz J., Proč. Nat. Acad. Sci., USA, 72, 4734, 1975. V oblasti nukleotidů 3 až 11 je AUG prvním kodonem, od něhož začíná translace. V případě ptrpE30, který je odvozen od svrchu popsaného ptrpED50 a obsahuje operátor, promotor, atenuátor a ribozomální vazné řetězce tryptofanového operonu, spolu s řetězcem nukleotidů, který je kódem pro sedm aminokyselin bílkoviny trp E s následným místem pro působení enzymu Hind III, je odstranění minimálního množství 23 až 29 nukleotidů z místa pro působení Hind III zapotřebí pro vznik místa pro včlenění cDNA při řízení operonem tryptofanu.
Pro přímou expresi prekurzoru růstového hormonu se původní včleněná cDNA modifikuje svrchu popsaným způsobem k odstranění 5'-nepřenesené oblasti. Vektor pro přímou expresi je možno získat modifikací ptrpE30, při níž se odstraní nukleotidy 23 až 29 při použití T4 DNA polymerázy a SI nukleázy svrchu uvedeným způsobem. Vazný řetězec nukleotidů, který obsahuje restrikční místo pro Bam HI endonukleázu, se naváže na modifikovanou cDNA a současné na modifikovaný ptrpE30 způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Valenzuela a dalších. Tímto způsobem se usnadní včlenění, které se pak provádí v podstatě způsobem, popsaným v publikaci Ullrich A. a další, Science, 196, 1313, 1977. Vhodný hostitel, například Escherichia coli HB101, RRI nebo chil776 nebo jiná bak
-10CZ 280596 B6 terie se transformují rekombinantním vektorem, který nese včleněnou část, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu. Transformované kolonie se podrobí výběru na odolnost proti ampicillinu a pak se pěstují za podmínek, vhodných pro expresi prekurzoru růstového hormonu.
Přímé exprese růstového hormonu je možno dosáhnout způsobem, popsaným v publikaci Gooddel D.V. a další, Nátuře, 281, 544, 1979. Je také možno postupovat tak, že se naváže řetězec nukleotidů s obsahem místa pro působení Bam HI a výchozí kodon AUG na cDNA, která je kódem pro růstový hormon. Takto modifikovaná cDNA se pak včlení do modifikovaného ptrpE30 svrchu uvedeným způsobem.
Prekurzor růstového hormonu je možno provést na růstový hormon odstraněním N-terminálního řetězce hydrofóbních aminokyselin, které obsahují signální peptidy. In vitro je možno provést odstranění signálního peptidu tak, že se na bílkovinu, extrahovanou z transformovaných buněk, působí přípravek s obsahem surových mikrosomů způsobem, popsaným v publikaci Jackson R. C. a Blobel G., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5598, 1977. In vivo je možno odstranění signálního peptidu provést při přímé bakteriální expresi řetězce, který je kódem pro prekurzor růstového hormonu. Bakteriální signální peptidy a signální peptidy savců mají podobné řetězce. Bílkoviny s obsahem signálních peptidů savců je možno získat pomocí bakteriálních buněk a tak získat růstový hormon buď v periplasmatickém prostoru, nebo v prostředí.
Takto získaný prekurzor růstového hormonu a růstový hormon je možno čistit známým způsobem, například gelovou filtrací, chromatografií na iontoměniči a způsoby, které využívají různé rozpustnosti.
Podrobnosti způsobu podle vynálezu budou dále popsány v průběhu příkladů. V průběhu těchto příkladů bylo působení restrikčních endonukleáz prováděno za podmínek, optimálních pro každý jednotlivý enzym. Restrikční endonukleázy, jejich názvosloví a místa, specifická pro jejich působení, jsou podrobně uvedeny v publikaci Roberts R., Crit. Rev. Biochem., 4, 123, 1976. Tyto enzymy jsou nyní také běžně dodávány New England Biolabs, Cambridge, Masachusetts a současně jsou uvedeny dodavatelem i optimální podmínky pro působení těchto enzymů. Reverzní transkriptázu je možno získat od Dr. J.Beard, Life Sciences, lne., St. Peterburg, Florida. Použití reverzní tanskriptázy a vhodné reakční podmínky pro její působení byly již dříve popsány v publikacích Seeburg P.H. a další, Nátuře, 276, 795, 1978, a ve svrchu uvedených publikacích Seeburga P.H. a dalších a Shinea J. a dalších. T4 DNA polymerázy je možno získat od New England Biolabs. Použití T4 DNA polymerázy a vhodné reakční podmínky jsou popsány v US přihlášce č. 125 878. SI nukleáza z mikrokoků je dodávána z Miles Laboratories, Elkhart, Indiana. Použití S1 nukleázy a vhodné reakční podmínky byly popsány ve svrchu uvedené publikaci Ullricha A. a dalších. Terminální deoxynukleotidová transferáza byla získána od Enzo Biochemicals, New York, New York. Použití tohoto enzymu a vhodné reakční podmínky byly popsány ve svrchu uvedené publikaci Roychoudhury a dalších. Klenowův fragment DNA polymerázy I je možno získat od Boehringer Biochemicals, Indianapolis, Indiana.
-11CZ 280596 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Způsob výroby cDNA prekurzoru růstového hormonu skotu
Hypofýzy krav se odeberou krátce po porážce a ihned se zmrazí v kapalném dusíku. RNA se připraví homogenizací těchto žláz v roztoku guanidinthiokyanátu podle publikace Chirginwin J.M. a další, Biochem., 18, 5294, 1979. RNA se odstředí v roztoku 7,5 M CaCl způsobem podle svrchu uvedené publikace Ullricha a dalších. Pak se RNA extrahuje fenolem a sráží ethanolem. Polyadenylovaná RNA se čistí při použití chromatografie na oligo-dT-celulóze způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Millera a McCarthyho a v publikaci Aviv N. a Leder D., Proč. Nat. Acad. Sci., USA, 69, 140, 1972.
Polyadenylovaná RNA se přenese do bezbuněčného systému při použití retikulocytů králíka způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Millera a McCarthyho a v publikaci Martial J.A., a další (1977). Prekurzor růstového hormonu skotu, syntetizovaný v tomto systému, se vysráží imunologickým způsobem při použití heterologního antiséra proti růstovému hormonu ovce a získá se adsorpcí na Staphylococcus aureus Cowan I, fixovaný na formaldehyd podle svrchu uvedené publikace Martial J. A. a dalších (1977). 35S-bílkoviny se podrobí elektroforéze na 12,5 % SDS polyakrylamidovém gelu podle svrchu uvedené publikace Laemmliho. Analýza ukazuje, že polyadenylovaná RNA, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu, tvoří přibližně 12,6 % celkové polyadenylované RNA hypofýzy.
Polyadenylovaná RNA se podrobí reverzní transkripci do cDNA s jedním řetězcem při použití reverzní transkriptázy podle svrchu uvedených publikací Millera a McCarthyho a Monahana a dalších. RNA se odstraní hydrolýzou za alkalických podmínek. Pak se cDNA s jedním řetězcem extrahuje fenolem, chromatografuje na Sephadexu G-50 (Pharmacia, lne. Uppsala, Švédsko) a vysráží se ethanolem. Pak se cDNA s jedním řetězcem užije k syntéze druhého řetězce cDNA při použití reverzní transkriptázy svrchu popsaným způsobem. Vzniklá vlásnička na zakončení 3' prvního řetězce cDNA se odstraní působením S1 nukleázy, tak jak bylo uvedeno ve svrchu uvedených publikacích Leonga a další, a Ullricha A. a dalších. Tato cDNA s dvojitým řetězcem se čistí extrakcí fenolem, chromatografií na Sephadexu G-50 a srážením ethanolem. Pak se naváže na zakončení 3'- ještě dCMP při použití dCTP a terminální transferázy, tak jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Roychoudhury a další.
Plasmid pBR322 se rozštěpí Pst I endonukleázou a naváže se dGMP svrchu uvedeným způsobem s tím rozdílem, se užije dGTP místo dCTP. 50 ng plasmidu pBR322 s dG po štěpení Pst I a 20 ng cDNA s dvojitým řetězcem po navázání dC se naváže v 50 μΐ reakční směsi způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Cooka a dalších .
-12CZ 280596 B6
Transformace Escherichia coli chi 1776 působením plasmidu se provádí následujícím způsobem. Escherichia coli chi 1776 se k získání propustnosti pro DNA inkubuje v 75 mM chloridu vápenatého, 5 mM chloridu horečnatého, 10 mM tris-pufru o pH 7,5 po dobu 20 minut při teplotě 4 ”C. Plasmid a bakterie se inkubují 60 minut při teplotě 4 C a pak 2 minuty při teplotě 41 ’C. Transformované kolonie se podrobí výběru na odolnost proti tetracyklinu. Přítomnost klonované DNA se stanoví hybridizací kolonií na čerstvě připravené cDNA, značené 32P, z hypofýz skotu, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Grunsteina a Hognesse. Plasmidová DNA se připraví z vybraných kolonií, rozštěpí se enzymem Pst I, podrobí se elektroforéze na 1% agaróze, barví ethidiumbromidem a pak se přenese na nitrocelulózové filtry způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Southernově. Přítomnost sledu pro růstový hormon v přenesené DNA se stanoví hybridizací na klonovaný růstový hormon krysy s plnou délkou cDNA tak, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci (Seeburga P. H. a dalších) a podrobí se značení (Maniatis, R. a další), Proč. Nat. Acad. Sci. USA 72, 1184 (1975). Jeden z klonů který byl takto získán, byl označen pBP348. Včleněná část obsahuje 831 párů bází.
Příklad 2
Analýza sledu cDNA
Plasmid pBP348 se rozštěpí enzymem Pst I a fosfát na zakončení 5' fragmentů DNA se odstraní alkalickou fosfatázou a nahradí se značením 32P-fosfátem při použití polynukleotidkinázy. Následujícím štěpením celou řadou dalších restrikčních endonukleáz, elektroforézou na polyakrylamidovém gelu, barvením a autoradiografií svazků DNA se získá mapa restrikčních míst klonované DNA. Pak se získá větší množství pBP348 a opět se provádí štěpení Pst I, Pvu II nebo Sau 3A, ke značení se užije / Y32P/ATP a polynukleotidkynázy a pak se získaný materiál štěpí dalšími enzymy, čímž se získají fragmenty DNA, značené pouze na jednom konci. Tyto fragmenty se získají eluci z polyakrylamidového gelu a pak se sledují způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Cook a další a v publikaci Maxam A. M. a Gilbert W. Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 1560 (1977). Sled, který má být včleněn, je znázorněn na obr. 1 spolu s odpovídajícím sledem aminokyselin, pro něž je kódem uvedený řetězec, to jest řetězec, který svým sledem odpovídá sledu odpovídající mRNA.
Směr odečítání je možno rozeznat tak, že ve včleněné části chybí kodony pro zastavení činnosti. Polohy aminokyselin jsou číslovány od aminokyseliny, která má volnou aminoskupinu v růstovém hormonu skotu, načež se postupuje v kladném směru až do terminální karboxylové skupiny a v negativním směru k prvnímu kodonu AUG, o němž se předpokládá, že je signálem pro počátek translace. Stejně jako je tomu v případě dalších hormonů, je po translaci zapotřebí růstový hormon dále zpracovat. Translací mRNA pro růstový hormon se získá prekurzor růstového hormonu s obsahem signálního peptidu, který může být uvolněn při přechodu do endoplasmatického prostoru.
-13CZ 280596 B6
Příklad 3 (A) Opakuje se postup, uvedený v příkladu 1, při použití plasmidu pBR 315 místo plasmidu pBR322. Všechny podmínky zůstávají stejné včetně výběru rekombinantních klonů. Včleněná část se odstraní a analyzuje stejným způsobem, jako v příkladu 2, čímž se získá DNA o 831 párech bází se sledem, uvedeným na obr. 1.
(B) Opakuje se postup podle přikladu 1, avšak užije se plasmidu pBR316 místo plasmidu pBR322. Všechny podmínky jsou jinak stejné jako v příkladu 1. Odstranění a analýza včleněné části se provádí způsobem podle příkladu 2, čímž se získá DNA se sledem, znázorněným na obr.l.
Příklad 4
Pro postup podle tohoto příkladu se připraví cDNA, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu, způsobem podle příkladu 1. Všechny řetězce, navázané na volná zakončení v průběhu tohoto postupu, se připravují způsobem, popsaným v publikaci Scheller R. H. a další, Science 196, 177 (1977). Restrikční endonukleázy, použité při provádění tohoto postupu, jsou běžně dodávány od New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, přičemž bylo užito optimálních podmínek, doručených dodavatelem. Transformace Escherichia coli chil776 se provádí způsobem, uvedeným v příkladu 1.
(A) Na cDNA se po její výrobě podle příkladu 1 naváží v místě působení enzymu Hind III sledy 5' - CCAAGCTTGC -3' při použití T4 DNA ligázy způsobem, popsaným v publikaci Valenzuela P. a další, Nátuře 280, 815 (1979). Po navázání se produkt podrobí působení enzymu Hind III nebo Hsu I a pak se postupuje způsobem, uvedeným v publikaci Ullrich A. a další, Science 196, 1313 (1977). Plasmid pBR322 se rozštěpí v místě pro působeni enzymu Hind III působením enzymu Hind III nebo Hsu I, načež se zpracuje působením alkalické fosfatázy, tak jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Ullricha A. a dalších. Po vysrážení ethanolem se rozštěpený plasmid pBR322 naváže na cDNA s obsahem zakončení po působení enzymu Hind III, tak jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Ullricha A. a dalších. Při použití této směsi se transformuje Escherichia coli chil776 a transformované kolonie se podrobí výběru na citlivost na tetracyklin. Přítomnost klonované DNA se prokazuje způsobem podle příkladu 1. Kolonie s obsahem včleněné části se zpracovávají tak, že se tato část odstraní působením enzymu Hind III a Hsu I a provádí se analýza stejným způsobem, jako v příkladu 2. Včleněná část obsahuje přibližně 830 párů bází a má sled, uvedený na obr. 1.
(B) Opakuje se způsob podle příkladu 4(A), avšak užije se několika vektorů místo plasmidu pBR322. Užije se například plasmidů pSIOl, pMB9, pBR313, pBR315 a pBR316 místo plasmidu pBR322. Všechny podmínky včetně volby rekombinantních klonů jsou jinak stejné jako v odstavci A. Pro všechny plasmidy byly získány stejné výsledky, to znamená, že v každém případě byl získán rekombinantní plasmid, obsahující včleněnou část se sledem, uvedeným na obr. 1.
-14CZ 280596 B6 (C) Opakuje se postup podle příkladu 4(A), avšak užije se několik dalších restrikčních endonukleáz a jiných vazných řetězců. Užijí se například vazné řetězce v místech Sal I a Bam HI místo Hind III. Sled těchto řetězců je 5’ - GGTCGACC - 3' a 5'
- CCGGATCCGG - 3'. V případě, že se užije první z řetězců, provádí se štěpení endonukleázou Sal I, a v případě, že se užije druhého řetězce, užije se endonukleázy Bam HI. Další podmínky včetně výběru rekombinantních klonů jsou jinak totožné jako v odstavci 4(A). V případě obou řetězců a obou restrikčních endonukleáz bylo dosaženo týchž výsledků.
(D) Opakuje se způsob podle odstavce 4(C), přičemž se užije plasmidů pSCIOl, pMB9, pBR313, pBR315 a pBR316 místo plasmidu pBR322. Všechny podmínky jsou jinak stejné jako v odstavci 4(C) a byly také získány stejné výsledky, to znamená, že v každém případě byl včleněn sled, který je znázorněn na obr. 1.
(E) Opakuje se postup podle odstavce 4(A) s tím rozdílem, že se v místě působení Eco RI užije vazný řetězec se sledem 5'
- CCGAATTCGG - 3' místo vazného řetězce v místě působení Hind III (Hsul). Všechny podmínky jsou jinak stejné s tím rozdílem, že transformované kolonie nejsou podrobeny výběru podle citlivosti na tetracyklin. Přítomnost klonované DNA se zjišťuje stejným způsobem jako v příkladu 1. Získá se rekombinantní klon, který obsahuje včleněnou část, znázorněnou na obr. 1.
(F) Opakuje se postup podle odstavce 4(E) s tím rozdílem, že se užijí plasmidy pSCIOl, pMB9, pBR313 a pBR315 místo plasmidu pBR322. Jinak se užije stejných podmínek jako v odstavci 4(E) a pro každý plasmid se také dosáhne stejných výsledků.
(G) Opakuje se způsob podle příkladu 4(A), avšak užije se vazného řetězce 5' GCTGCAGC - 3' v místě pro působení restrikčního enzymu Pst I, který se užije místo vazného řetězce v místě Hind III (Hsu I). Jinak se užije stejných podmínek s tím rozdílem, že výběr rekombinantních klonů se provádí způsobem podle příkladu 1. Tímto způsobem se získá rekombinantní klon, jehož sled odpovídá sledu, znázorněnému na obr. 1.
(H) Opakuje se postup podle příkladu 4(G) s tím rozdílem, že se užijí plasmidy pBR315 a pBR316 místo plasmidu pBR322. Jinak se užijí stejné podmínky jako v příkladu 4(G) a dosáhne se týchž výsledků.
(I) Opakují se příklady 1, 3(A), 3(B), a 4(A) až (H) s tím rozdílem, že se užije Escherichia coli RRI nebo Escherichia coli HB101 místo Escherichia coli chil776. Všechny podmínky jsou jinak stejné a bylo také dosaženo stejných výsledků.
Příklad 5
V tomto případě byla cDNA, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu, připravena stejným způsobem jako v příkladu 1. Do místa pro působení enzymu Eco RI byly navázány řetězce způsobem, který byl popsán ve svrchu uvedené publikaci Valenzuela P. a další, a tyto řetězce byly navázány také na cDNA,
-15CZ 280596 B6 načež bylo provedeno štěpení enzymem EcoRI, tak jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Ullricha A. a dalších.
(A) Jako vektor pro přenos byl užit Charon 16A DNA, připravený podle svrchu uvedené publikace Blattnera a dalších. Kohezivní zakončení byla spojena inkubací po dobu 60 minut při teplotě 42 °C v 0,1 M tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8,0 za přítomnosti 10 mM chloridu hořečnatého. Vektor byl rozštěpen v místě působení Eco RI endonukleázou Eco RI a získaná směs byla podrobena působení alkalické fosfatázy podle svrchu uvedené publikace Ullricha A. a dalších. Po srážení ethanolem byl vektor, zpracovaný působením fosfatázy, přidán k cDNA s obsahem zakončení pro působení enzymu Eco RI v molárním poměru 2 mol vektoru na 1 mol cDNA. Směs se naváže působením T4 DNA ligázy podle svrchu uvedené publikace Ullricha A. a dalších. Výsledná směs se přímo přidá k suspenzi buněk Escherichia coli chil776, připravené způsobem podle příkladu 1, a transformace se rovněž provádí způsobem, popsaným podle příkladu 1. Rekombinantní fágy se izolují a pěstují na Lac~ bakteriích na plotnách s obsahem 5-chlor-4-brom-3-indolyl-p-D-galaktosidu (X6) v koncentraci 80 μg/ml, a rekombinantní fágy s obsahem cDNA, včleněné do místa pro působení Eco RI v plasmidu Charon 16A, se podrobí výběru podle produkce bezbarvých plaků. Zvolený rekombinantní plasmid se izoluje a podrobí působení přebytku endonukleázy Eco RI a výsledná směs se analyzuje způsobem podle příkladu 2. Získá se DNA o přibližně 830 párech bází se sledem, uvedeným na obr.l. Je také možno postupovat tak, že se získaná směs přímo užije in vitro k získání rekombinantních fágů způsobem, popsaným v publikaci Sternberg N. a další, Gene 1, 255 (1977). Rekombinantní fágy je také možno sledovat podle hybridizace plaků in sítu způsobem, popsaným v publikaci Benton W. D. a Davis R. W., Science 196, 180 (1977).
(B) Charon 3A nebo 4A DNA, připravený podle svrchu uvedené publikace Blattnera a dalších, se užije jako vektor pro přenos místo Charonu 16A DNA. Všechny podmínky jsou jinak stejné jako pro Charon 16A DNA. Výběr rekombinantních fágů se provádí (a) pěstováním na Lac+ bakteriích na plotnách s obsahem X6 s následnou izolací bezbarvých plaků a hybridizací nebo natrávení restrikční endonukleázou podle svrchu uvedené Blattnerovy publikace. Včleněná část se odstraní svrchu uvedeným způsobem, čímž se získá DNA o přibližně 830 párech bází se sledem, znázorněným na obr.1.
(C) /A gt WES. Ab DNA, podle publikace Tiemier a dalších, tak jak byla svrchu uvedena, se užije jako vektor pro přenos místo Charonu 16A. Všechny podmínky jsou jinak totožné jako pro Charon 16A. Selekce rekombinantních fágů se provede hybridizací podle svrchu uvedené publikace Benttona a Davise. Včleněná část se odstraní svrchu uvedeným způsobem, čímž se získá DNA o přibližně 830 párech bází se sledem, znázorněným na obr.l.
(D) Opakují se příklady 5(A) až (C), avšak užije se Escherichia coli RPI, Escherichia coli HB101, Escherichia coli DP50 nebo Escherichia coli DPSOSupF místo Escherichia coli chil776. Všechny podmínky jsou jinak totožné a byly získány také totožné výsledky.
-16CZ 280596 B6
Příklad 6
V tomto příkladě byla cDNA, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu Skotu připravena rovněž způsobem podle příkladu 1. Byly užity vazné řetězce v místě Hind III a cDNA byla štěpena enzymy Hind III nebo Hsu I podle příkladu 4(A).
Plasmid pC194, izolovaný ze Staphylococcus aureus způsobem podle svrchu uvedené publikace Ehrlicha S. D., se užije jako vektor pro přenos. Plasmid pC194 se rozštěpí v místě působení Hind III enzymem Hind III nebo Hsu I a pak se zpracovává působením alkalické fosfatázy podle svrchu uvedené publikace Ullricha A. a dalších. Pak se cDNA se zakončeními v místě působení Hind III naváže na rozštěpený pC194 podle svrchu uvedené publikace Ullricha A. a dalších. Indukce B. subtilis RUB331 se provádí způsobem podle publikací Sgaramella V. a další J. Mol. Biol., 105, 587 (1976) a Borenstein S. a Ephrati-Elizue E. , J. Mol. Biol., 45, 137 (1969). Transformace B. subtilis RUB331 se provádí směsí, popsanou ve svrchu uvedené publikaci Sgaramella a další a Borensteina a dalších. Buněčná suspenze se nanáší přímo na L plotny s obsahem 3 μg chloramfenikolu. Po selekci se izolují rekombinanty a podrobí se působení enzymu Hind III a získaný materiál se analyzuje jako v příkladu 2. Tímto způsobem se získá DNA o přibližně 830 párech bází se sledem, znázorněným na obr. 1.
Přiklad 7
Syntéza cDNA, která je kódem pro růstový hormon skotu (A) Plasmid pBR348 se podrobí působení endonukleázy Hae II, čímž se získá fragment o 1600 párech bází. Jedno místo pro působení Hae II se nachází uvnitř včleněné cDNA, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu, a druhé místo se nachází v místě pBR322 plasmidu. Natrávením se získá následující materiál:
+1 +2
5' -
TTC ' 5'
Růstový hormon skotu může začínat buď ala v poloze +1, nebo phe v poloze +2 při zakončení NH2 (Dayhoff a další, viz svrchu), takže je možno se pokusit o doplnění kodonu ala nebo o jeho úplné odstranění. Úplné odstranění je možno dosáhnout inkubací DNA s dATP a Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I, protože první bází kodonu phe v poloze +2 (v řetězci 3'---> 5') je A. Touto reakcí se získá následující materiál:
+1 +2
5’
- C TTC
DNA se extrahuje fenolem a vysráží. Přebytek dATP a rozložených bází se odstraní chromatografií na Sephadexu G-50. Zbývající uhlíkový atom na zakončení 5' v původní poloze +1 v místě kodonu pro ala se pak odstraní působením SI nukleázy způsobem, popsaným
-17CZ 280596 B6 v publikaci Shine a další, Nátuře 285, 456 (1980). Tímto způsobem se získá následující materiál:
TTC
5' (B) Opakuje se postup podle příkladu 7(A) tak, že se sled desoxynukleotidů, který je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu, odstraní z vektorů pro přenos, získaných podle příkladů 3, 4, 5 a 6, při použití příslušných restrikčních enzymů před působením Hae II. Použité vektory a restrikční enzymy jsou uvedeny v následující tabulce 3.
Tabulka 3
Restrikční enzym
Vektor pro přenos (příklad)
Pst I 3A, 3B, 4G, 4H
Hind III 4A, 4B, 6
Sal I 4C, 4D
Bam HI 4C, 4D
Eco RI 4E, 4F, 5A, 5B,
Po natrávení příslušným restrikčním enzymem se sled pro prekurzor růstového hormonu izoluje elektroforézou na gelu a pak se zpracovává způsobem podle příkladu 7(A), získají se tytéž výsledky.
(C) opakuje se postup podle příkladu 7(A) a 7(B) při použití T4 DNA polymerázy nebo 3'-5' exonukleázy místo Klenowova fragmentu DNA polymerázy I. Všechny ostatní podmínky jsou tytéž a v každém případě se také získá identický sled, který je fragmentem růstového hormonu skotu.
Příklad 8 (A) Působením enzymu Hae II podle příkladu 7(A) nebo7(B) se získá fragment růstového hormonu skotu + 1 +2 ' - C TTC ..... 3 ' ' - G CGG AAG ..... 5'
Tento fragment je možno doplnit tak, že se inkubuje s dATP, dGTP, dCTP, dTTP a Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I. Touto reakcí se získá následující materiál:
-18CZ 280596 B6 +1
G GCC TTC G CGG AAG '
5'
DNA se extrahuje fenolem a vysráží. Získaný sled se pak inkubuje s Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I za přítomnosti dCTP. Sled se pak podrobí působení S1 nukleázy podle publikace Shine a dalších, Nátuře 285, 456 (1980), čímž se získá následující materiál:
5' - GCC TTC ..... 3 ’ ' - CGG AAG ..... 5' .
(B) Opakuje se postup podle příkladu 8(A) s tím rozdílem, že se užije T4 DNA polymeráza nebo 3'-5' exonukleáza místo Klenowova fragmentu v druhém inkubačním stupni, to jest za přítomnosti dCTP. Všechny ostatní podmínky jsou totožné a v každém případě se také získá stejný sled pro růstový hormon skotu.
Příklad 9
Desoxynukleotidový sled, který je kódem pro růstový hormon skotu, se včlení do vektoru pro přenos svrchu popsaným způsobem pro sled, který je kódem pro prekurzory růstového hormonu.
(A) Opakují se příklady 1, 3(A), 3(B), 4(A), až (I), 5(A) až (D) a 6, přičemž se užije DNA, připravená podle příkladů 7(A), 7(B) nebo 7(C) místo DNA, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu. Všechny další podmínky jsou totožné. DNA se odstraní natrávením příslušným restrikčním enzymem, například jako v tabulce 3, a analyzuje se podle příkladu 2. DNA, jejíž sled začíná kodonem Phe v poloze 2 a končí sledem, znázorněným na obr. 1, je výsledným produktem ve všech případech.
(B) Opakuje se způsob podle příkladu 1, 3(A), 3(B), 4(A) až (I), 5(A) až 5(B) a 6, přičemž se užije DNA, připravená podle příkladů 8(A) nebo 8(B), místo DNA, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu. Všechny ostatní podmínky jsou totožné. DNA se odstraní působením příslušného restrikčního enzymu, tak jak jsou uvedeny například v tabulce 3, a analyzuje se způsobem podle příkladu 2. Ve všech případech se získá DNA, jejíž sled začíná kodonem pro Ala v poloze 1 a pokračuje sledem, znázorněným na obr.l.
Příklad 10
Exprese růstového hormonu skotu
Růstový hormon skotu může být doveden k expresi jakýmkoli ze svrchu popsaných způsobů.
(A) Exprese růstového hormonu skotu ve formě prekurzoru jako složené bílkoviny byla provedena radioimunologicky a při použití minibunék. Při radioimunologickém pokusu byla Escherichia coli chil776 s obsahem pBP348, nebo Escherichia coli s obsahem pBP322
-19CZ 280596 B6 jako kontrola pěstována v živném prostředí a oddělena odstředěním. Buňky byly znovu uvedeny v suspenzi a rozrušeny růstovým hormonem ovce s radioaktivním značením s následným přidáním protilátky proti růstovému hormonu ovce nebo skotu. Imunologický komplex byl vysrážen a jeho přítomnost byla měřena radioaktivním způsobem. Tento pokus prokázal, že si složená bílkovina uchovává aspoň z určité části imunologickou účinnost růstového hormonu skotu. Aby bylo možno dále zkoumat vlastnosti složené bílkoviny, byl proveden pokus na minibuňkách způsobem, popsaným v publikaci Meagher R. B. a další, Cell, 10 521 (1977). Na obr.2 jsou znázorněny pásy, získané při elektroforéze na gelu při použití materiálu z minibuněk Escherichia coli chil776. Pás (a) byl získán z buněk, transformovaných pBP348. Pás (b) byl získán z buněk, transformovaných pBR322. Pás (c) je užit pro označení molekulové hmotnosti. (A) označuje složenou bílkovinu při použití β-laktamázy a prekurzoru růstového hormonu skotu. (B) označuje prekurzor laktamázy a (C) označuje β-laktamázu. Tento pokus prokazuje, že pBP348 vytváří složenou bílkovinu, která obsahuje 183 aminokyselin β-laktamázy, 217 aminokyselin prekurzoru růstového hormonu skotu a malý počet spojujících aminokyselin, které jsou kódem pro oblast 5', k jejíž translaci za běžných podmínek nedochází. Celková molekulová hmotnost je přibližné 45 000 a je v souhlasu s předpokládanou molekulovou hmotností hybridní bílkoviny.
(B) Pro přímou expresi prekurzoru růstového hormonu skotu se včleněná DNA nejprve oddělí z pBP348 částečným působením endonukleázy Pst I a čistí preparativní elektroforézou na gelu. 15 μg takto čištěné DNA se pak modifikuje tak, že se tato DNA uvede v suspenzi ve vodě, k níž se přidá koncentrovaný roztok solí, takže výsledná směs obsahuje 70 mM tris-pufru o pH 8,8, 70 mM chloridu hořečnatého, 10 mM dithiothreitolu a 13,75 jednotek 74 DNA polymerázy v celkovém objemu 250 μΐ. Reakční směs se inkubuje několik minut při teplotě 37 °C a pak se přidá dATP do koncentrace 50 mM k ukončení endonukleolytického natrávení následujícího adeninového zbytku. Po 30 sekundách další inkubace se enzym inaktivuje teplem při teplotě 65 “C na 5 minut. Postup se ještě dvakrát opakuje, v prvním případě se užije dCTP místo dATP a v dalším případě se užije dTTP. Získaná DNA se izoluje vysrážením ethanolem. Působením S1 nukleázy se získají požadovaná zakončení podle svrchu uvedené publikace Ullricha A. a dalších. Tímto způsobem se získá molekula DNA, která je ukončena v poloze -26. U těchto molekul dojde k translaci v případě, že se včlení do vektoru pro expresi s místem včlenění 3 až 11 nukleotidů od místa pro vazbu ribosomálního sledu v jednotce, určené k expresi.
Vektor pro přímou expresi se získá modifikací plasmidu ptrpE30 tak, že se odstraní nukleotidy 23 až 29 při použití T4 DNA polymerázy a S1 nukleázy svrchu uvedeným způsobem.
Modifikovaná cDNA a modifikovaný vektor pro expresi se opatří specifickým vazným řetězcem, který na jednom svém zakončení obsahuje sled 5' - CCGGATCCGG - 3', a na druhém zakončení obsahuje komlementární sled při použití DNA ligázy podle svrchu uvedené publikace Valenzuely. V důsledku toho vznikají restrikční místa, citlivá na endonukleázu Bam HI, tato místa jsou zavedena k usnadnění inzerce. Včlenění se provádí podle svrchu uvedené publikace Ullricha A. a dalších. Hostitelská bakterie Escherichia coli HB101, RRI nebo chi!776 se transformuje rekombinantním vektorem,
-20CZ 280596 B6 který nese včleněnou modifikovanou oblast, která je kódem pro prekurzor růstového hormonu, a transformované kolonie se podrobí výběru na odolnost k ampicilinu. Pro další analýzu se vybere transformovaná kolonie, která se označí ptrpE30/bGH.
Bakteriální buňky, transformoané ptrpE30/bGH, se pěstují ve standardním minimálním prostředí M9, které se doplní Leu, Pro, vitamínem B1 a ampicilinem, při teplotě 37 °C. V časné fázi log se trp operon indukuje přidáním kyseliny β-indolylakrylové v množství 30 μg/ml. U kontrolních kultur se indukce neprovádí. Po dalších 3 hodinách růstu se 1,5 ml buněk radioaktivně značí přidáním 20 μΟί 35S-L-Met a buňky se inkubují ještě 10 minut, načež se oddělí odstředěním a promyjí, načež se uvedou v suspenzi ve 250 μΐ pufru, který obsahuje 10 objemových % glykolu, 5 objemových % β-merkaptoethanolu a 2,3 % (hmotnostní/objemová %) SDS v 0,0625 M tris-pufru o pH 6,8. Suspenze se 5 minut vaří a pak se nanese na SDS polyakrylamidový gel o koncentraci 10 % (hmotnostní /objemová %) a podrobí se frakcionaci elektroforézou. Pásy bílkovin se označí autoradiograficky. Tímto způsobem je možno prokázat pás nové bílkoviny o přibližně 24 000 daltonů, který není možno pozorovat u kultur bez indukce nebo bez transformace.
Prekurzor růstového hormonu skotu se čistí běžným způsobem, například filtrací na gelu, chromatografií na iontoměniči, afinitní chromatografií nebo technikami, které využívají různé rozpustnosti. Prekurzor růstového hormonu je možno převést na růstový hormon následujícím způsobem, který byl popsán ve svrchu uvedené publikaci Jacksona a dalších.
(C) Specifický vazný řetězec se sledem 5' - CCGGATCCGGATG - 3' na jednom řetězci a s doplňkovým sledem na druhém konci se naváže na DNA, která je kódem pro růstový hormon skotu, připravený podle příkladu 7(A) až (C) a 8(A) až (B). Tato modifikovaná DNA se pak včlení do modifikovaného plasmidu ptrpE30 způsobem, popsaným v příkladu 10(B). Hostitelská bakterie se transformuje a pěstuje a výsledný růstový hormon skotu se čistí způsobem, popsaným v příkladu 10(B).
Vynález byl popsán ve spojení se specifickým provedením, je však zřejmé, že jsou možné další modifikace. Je zřejmé, že do oboru vynálezu spadají také jakékoli variace nebo adaptace uvedeného způsobu v případě, že bude zachován princip způsobu podle vynálezu a variace se budou týkat pouze známých nebo běžných reakcí.

Claims (9)

1. Způsob výroby vektoru pro přenos, obsahujícího kódovou DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, vyznačující se tím, že se první DNA, obsahující kódový řetězec pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, uvede do styku s druhou DNA, obsahující linearizovaný plasmid hostitele, za vzniku vektoru pro přenos, který se pak izoluje.
2. Molekula DNA, obsahující kódové řetězce pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu.
3. Molekula DNA podle nároku 2, obsahující kódové řetězce pro prekurzor růstového hormonu skotu.
4. Rekombinantní systém pro expresi kódové DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu v hostitelské buňce, vyznačující se tím, že obsahuje kódovou DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, operativně vázanou na řídicí řetězce, kompatibilní s hostitelskou buňkou.
5. Rekombinantní systém pro expresi podle nároku 4, vyznačující se tím, že je uložen v plasmidu.
6. Rekombinantní systém pro expresi podle nároku 4, vyznačující se tím, že kódová DNA pro aminokyseliny
2 až 191 růstového hormonu skotu obsahuje kódové řetězce pro další aminokyseliny a je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu.
7. Rekombinantní systém pro expresi podle nároku 6, vyznačující se tím, že je uložen v plasmidu.
8. Způsob výroby bílkoviny, obsahující aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, vyznačující se tím, že se pěstují buňky, obsahující systém, který v hostitelské buňce ovlivňuje expresi kódové DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, přičemž tento systém je tvořen kódovou DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, operativně vázanou na řídicí řetězce, kompatibilní s buňkou hostitele, a vzniklá bílkovina se z kultury izoluje.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že kódová DNA pro aminokyselinu 2 až 191 růstového hormonu skotu obsahuje kódové řetězce pro další aminokyseliny a je kódem pro prekurzor růstového hormonu skotu.
CS816360A 1980-08-26 1981-08-26 Způsob výroby vektoru pro přenos DNA CZ280596B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18134880A 1980-08-26 1980-08-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ636081A3 CZ636081A3 (en) 1995-02-15
CZ280596B6 true CZ280596B6 (cs) 1996-03-13

Family

ID=22663908

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS816360A CZ280596B6 (cs) 1980-08-26 1981-08-26 Způsob výroby vektoru pro přenos DNA

Country Status (24)

Country Link
EP (1) EP0047600B1 (cs)
JP (2) JP2534221B2 (cs)
KR (1) KR830007822A (cs)
AT (1) ATE72833T1 (cs)
AU (1) AU544453B2 (cs)
CA (1) CA1225948A (cs)
CZ (1) CZ280596B6 (cs)
DD (4) DD212403A5 (cs)
DE (1) DE3177273D1 (cs)
DK (1) DK372881A (cs)
ES (2) ES504968A0 (cs)
FI (1) FI812614L (cs)
GR (1) GR74350B (cs)
HU (1) HU195535B (cs)
IE (1) IE52755B1 (cs)
IL (1) IL63628A (cs)
NZ (1) NZ198050A (cs)
PH (2) PH21216A (cs)
PL (1) PL232797A1 (cs)
PT (1) PT73569B (cs)
RO (1) RO105533B1 (cs)
SU (1) SU1471949A3 (cs)
YU (1) YU44962B (cs)
ZA (1) ZA815696B (cs)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4443539A (en) * 1980-02-05 1984-04-17 The Upjohn Company Process for preparing bovine growth hormone
JPS58996A (ja) * 1981-06-01 1983-01-06 ザ・ボ−ド・オブ・トラステイ−ズ・ミシガンステ−トユニバ−シテイ− 細菌中での牛成長ホルモン遺伝子のクロ−ン化
NZ201918A (en) * 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US5254463A (en) * 1981-09-18 1993-10-19 Genentech, Inc. Method for expression of bovine growth hormone
EP0278121B1 (en) * 1981-09-18 1995-09-06 Genentech, Inc. Microbially produced bovine growth hormone (BGH) and its use
IE55244B1 (en) * 1982-05-25 1990-07-18 Lilly Co Eli Cloning vectors for expression of exogenous protein
EP0103395A3 (en) * 1982-08-17 1985-05-22 Biogen N.V. Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield
JPS59501852A (ja) * 1982-09-16 1984-11-08 アムジエン 鳥類の成長ホルモン
CA1341012C (en) * 1982-09-27 2000-06-06 Biogen, Inc. Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing swine growth hormone-like polypeptides
ZA837173B (en) * 1982-11-08 1984-05-30 Univ Case Western Reserve Genomic bovine growth hormone
AU2092983A (en) * 1982-11-08 1984-05-17 Genentech Inc. Porcine growth hormone produced by recombinant dna technology
EP0111814A3 (en) * 1982-12-16 1985-08-14 Mgi Pharma, Inc. The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone
DE3247922A1 (de) * 1982-12-24 1984-06-28 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten
JPS6011557A (ja) * 1983-04-19 1985-01-21 ジエネツクス・コ−ポレイシヨン クロ−ンヒツジ成長ホルモン遺伝子
US4859600A (en) * 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
US4755465A (en) * 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
US5198361A (en) * 1983-07-15 1993-03-30 Bio-Technology General Corp. Plasmids for production of met-asp-gln bovine growth hormone, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby and related methods
BG49718A3 (bg) * 1983-07-15 1992-01-15 Bio- Technology General Corp Метод за получаване на полипептид със супероксиддисмутазна активност
US4521409A (en) * 1983-10-03 1985-06-04 Cornell Research Foundation, Inc. Use of growth hormone to enhance ruminant mammary development
EP0147178B1 (en) * 1983-12-23 1991-08-14 Pfizer Inc. Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria
US4935370A (en) * 1983-12-23 1990-06-19 Pfizer Inc. Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria
US5489529A (en) * 1984-07-19 1996-02-06 De Boer; Herman A. DNA for expression of bovine growth hormone
US4861868A (en) * 1985-02-22 1989-08-29 Monsanto Company Production of proteins in procaryotes
US5037806A (en) * 1985-02-22 1991-08-06 Monsanto Company Biologically active method using somatotropins
ATE76435T1 (de) 1985-06-26 1992-06-15 Upjohn Co Solubilisation und oxidation von somatotropin aus transformierten mikroorganismen.
US4786501A (en) * 1985-07-15 1988-11-22 International Minerals & Chemical Corp. Cylindrical implants for the controlled release of growth hormones
JPS63500941A (ja) * 1985-09-18 1988-04-07 ジ・アップジョン・カンパニ− 選択的脱アミノ化による哺乳動物ソマトトロピンの生物学的活性の増強
US5631227A (en) * 1985-09-18 1997-05-20 The Upjohn Company Somatotropin analogs
ES2019874B3 (es) * 1986-10-08 1991-07-16 Upjohn Co Bioactividad mejorada de somatotropina de mamiferos mediante desamidacion selectiva.
US5215896A (en) * 1987-03-20 1993-06-01 Creative Biomolecules, Inc. Leader sequences for the production of recombinant proteins
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5268284A (en) * 1988-03-11 1993-12-07 The Upjohn Company Ribosome binding site
JP2787729B2 (ja) * 1990-08-02 1998-08-20 株式会社ニッポンジーン 組換え型ミンク成長ホルモン遺伝子、組換え型ミンクプレ成長ホルモン遺伝子、ミンク成長ホルモン又はミンクプレ成長ホルモン形質転換プラスミド、及び、ミンク成長ホルモン又はミンクプレ成長ホルモン形質転換大腸菌
WO2002051238A2 (en) 2000-12-26 2002-07-04 Monsanto Technology Llc Recombinant dna vectors for expression of somatotropins

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO783722L (no) * 1977-11-08 1979-05-09 Genentech Inc Rekombinant-plasmid samt fremgangsmaate til dets fremstilling
GR71912B (cs) * 1978-08-11 1983-08-16 Univ California
ZA802992B (en) * 1979-06-01 1981-10-28 Univ California Human pre-growth hormone
IL59690A (en) * 1980-03-24 1983-11-30 Yeda Res & Dev Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it

Also Published As

Publication number Publication date
EP0047600B1 (en) 1992-02-26
AU544453B2 (en) 1985-05-30
DD204711A5 (de) 1983-12-07
PT73569A (en) 1981-09-01
YU206281A (en) 1984-08-31
DK372881A (da) 1982-02-27
EP0047600A2 (en) 1982-03-17
PT73569B (en) 1982-11-09
JP2534221B2 (ja) 1996-09-11
IE52755B1 (en) 1988-02-17
FI812614A7 (fi) 1982-02-27
ES8305828A1 (es) 1983-04-16
JPS57171999A (en) 1982-10-22
CZ636081A3 (en) 1995-02-15
DE3177273D1 (de) 1992-04-02
ES8405072A1 (es) 1984-05-16
DD212403A5 (de) 1984-08-15
ES514526A0 (es) 1983-04-16
PL232797A1 (en) 1983-07-18
JP2763024B2 (ja) 1998-06-11
ES504968A0 (es) 1984-05-16
JPH09135691A (ja) 1997-05-27
DD212267A5 (de) 1984-08-08
IL63628A0 (en) 1981-11-30
FI812614L (fi) 1982-02-27
CA1225948A (en) 1987-08-25
SU1471949A3 (ru) 1989-04-07
HU195535B (en) 1988-05-30
GR74350B (cs) 1984-06-26
YU44962B (en) 1991-06-30
NZ198050A (en) 1984-12-14
IE811822L (en) 1982-02-26
KR830007822A (ko) 1983-11-07
DD211581A5 (de) 1984-07-18
EP0047600A3 (en) 1982-10-20
IL63628A (en) 1991-06-10
ATE72833T1 (de) 1992-03-15
PH22847A (en) 1989-01-19
AU7449681A (en) 1982-03-04
ZA815696B (en) 1982-08-25
RO105533B1 (ro) 1995-10-01
PH21216A (en) 1987-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ280596B6 (cs) Způsob výroby vektoru pro přenos DNA
AU620673B2 (en) Somatotropin analogs
KR870000701B1 (ko) 인체 성장 호르몬의 제조방법
US6127150A (en) Purification cloning of peptides
EP0020147B2 (en) A dna transfer vector for human pre-growth hormone, a microorganism transformed thereby, and a method of cloning therefor
CS219257B2 (en) Method of making the eukaryotic protein
JPS59144743A (ja) 組換ｄｎａ技術によつて産生されるブタ成長ホルモン
JP2970811B2 (ja) 原核生物細胞中にポリペプチドを調製するための発現システム
KR870000501B1 (ko) 사람의 프로인슐린의 아미노산 배열을 함유하는 단백질의 제조방법
EP0070675A1 (en) Human calcitonin precursor polyprotein structural gene
US4675297A (en) Genes encoding bovine prolactin
US5747290A (en) Process for the production of recombinant polypeptides
EP0046669B1 (en) Somatostatin or somatostatin precursors
US6194200B1 (en) Expression systems for preparation of polypeptides in prokaryotic cells
US6692941B1 (en) Bovine growth hormone
US5332664A (en) Human calcitonin precursor polyprotein structural gene
EP0113372A1 (en) Vector
US5631227A (en) Somatotropin analogs
KR860001922B1 (ko) 소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법
EP0236452B1 (en) Enhanced bioactivity of mammalian somatotropin through selective deamidation
US7101981B1 (en) Bovine growth hormone recombinantly produced in E. coli
CA1302321C (en) Preparation of polypeptides
EP0263206A1 (en) Enhanced bioactivity of mammalian somatotropin through selective deamidation
JPS59501243A (ja) ベクタ−

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20010826