JPH06104070B2 - 形質転換した微生物からのソマトトロピンの精製 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は微生物からの蛋白質の抽出および精製について
商業的に有利な方法を開示する。該方法の最初の工程は
多くの不溶性蛋白質を精製するのに有用であり、一方、
後の工程は形質転換した微生物によって産生された変性
ソマトトロピンを復元することを目的とする。該方法は
組換えにより産生されたウシソマトトロピン（rbSt）を
精製するのに特に有用である。

ソマトトロピンは元来各種の動物の脳下垂体抽出物中で
発見された成長ホルモンである。一般に、ソマトトロピ
ンは保存型分子であり、アミノ酸の配列および構造にお
ける類似性が異なる進化的分類の動物間で見い出されて
おり、これは、共通の祖先関係を証明するものである。

ソマトトロピンは２〜３個の鎖内ジスルフィド結合を有
する約200個のアミノ酸の単一鎖より成る球状蛋白質で
ある。従ってウシソマトトロピン（bSt）は190〜191個
のアミノ酸、２個の鎖内ジスルフィドを持つ球状構造、
および約22000ダルトンの分子量より成る。

bStは還元状態にある場合、水性環境では不溶性のまま
でいることができる。本発明は抽出および精製方法に関
するのでこの特性は本発明で利用されている。該開示方
法は、これと同一の特性を有する他のソマトトロピンに
対して適用できる。成長ホルモン、特にbStは大きな商
業的可能性を有する。一般に、成長ホルモンは脂肪に対
する肉の比における有意な増加と共に、ウシ、ブタおよ
びサケの成長速度を増加させることが示されてきた。さ
らに、bStは乳牛におけるミルクの生産を増加させる証
明された能力において値価を有する。効果的な結果を達
成するには１日につき、動物１頭当たり５〜50mgの成長
ホルモンが必要なことが現在予想されている。

実験室規模でエシェリヒア・コリ（E.coli）または他の
微生物からのソマトトロピンの抽出について多くの方法
が現在利用できるが、バイオクアティブなソマトトロピ
ン、特にbStの商業的生産または大規模な生産用の方法
は今日に至るまで利用できなかった。微生物が可溶性蛋
白質としてよりもむしろほとんど沈殿した形態でソマト
トロピンを産生した場合、該開示方法は微生物からのソ
マトトロピンの回収を最適化する。これらの沈殿したソ
マトトロピンは微生物内部の屈折体中でしばしば沈殿す
る。該屈折体は光学顕微鏡下で見える。

ソマトトロピンは微生物内部で屈折体を形成するただ１
つの異種蛋白質ではない。屈折体はしばしば蛋白質の過
剰産生の結果産生される。それらは内部貯蔵機構である
と考えられている。屈折体は病原状態、突然変異または
遺伝子組換え形質転換による異種蛋白質を表現する微生
物において共通して見られる。

イー・コリの如き形質転換した微生物の屈折体中で見い
出される場合、沈殿ソマトトロピンは還元状態であると
考えられる。イー・コリまたは他の原核生物系における
真核蛋白質の表現は天然産生物と同一のアミノ酸鎖をし
ばしば産生できるが、天然蛋白質の二次および三次構造
は該原核生物によって強制されたりまたは複製され得な
い。天然の形態のエネルギー状態が産生物に天然の立体
配置を強制しない場合、生物学的に活性で非抗原性の産
生物を得るには化学的および熱的干渉が必要になる。

bStは、酸化された単量体状態において、それに対して
ジスルフィド結合の３種の異なる配列が可能である４個
のシステイン残基を有し、該配列のうち１つのみが天然
のものである。本明細書の開示で注意しない仕上げ処理
をすると、該システイン残基は利用可能な酸素を用いて
酸化されてランダムなジスルフィドを持つポリマー状お
よび単量体のbStが共に形成される。かく生成されたラ
ンダムな状態はバイオアクティブな成長ホルモンの実質
的収率の減少という結果となる。

蛋白質の還元および再酸化を含む蛋白質の折りたたみの
古典的な研究はリボヌクレアーゼ（RNAse）およびリゾ
チウムの如き酸素について行なわれた。ジボル、ディ
ー、デロレンツォ、エフ、ゴルドベルガー、アール・エ
フ、およびアニフィンセン、シー・ビー（Givol、D.DeL
orenzo、F.、Goldberger、R.F.and Anfinsen、C.B.）、
バイオケミストリー（Biochemistry）、53:676〜684（1
965）；およびサクセナ、ブイ・ピー、およびウェット
ラウファー、ディー・ビー（Saxena、V.P.、and Wetlau
fer、D.B.）、バイオケミストリー（Biochemistry）、
９（25）:5015〜5022（1970）。該蛋白質は典型的に
は、６〜8M尿素またはグアニジン−HClの如き変性剤の
存在において、Ｂ−メルカプトエタノール（BME）また
はジチオスレイトール（DTT）で還元される。次いで、
還元剤および変性剤をゲル濾過によって除去し、該蛋白
質を放置して低濃度にて空気酸化する。

還元された蛋白質の再酸化について現在受けいれられて
いる機構はランダムなジスルフィドを形成する蛋白質の
急速な再酸化、ひき続いてのジスルフィド交換（シャフ
リング（Shuffling）を含む。該蛋白質は最初正しくな
いジスルフィド結合を形成するかも知れないが、他の蛋
白質上の遊離チオール基またはチオール試薬での還元に
よりこれらのジスルフィドは再び還元できる。これによ
り各蛋白質分子にいろいろなジスルフィド結合の態様を
とる機会が与えられ、該分子の大部分は最低エネルギー
の立体配置に至る。アシャールヤ、エイ・エス、および
タニウチ、エイチ、（Acharya、A.S.、and Taniuchi、
H.）、モレキュラー・アンド、セルラー・バイオケミス
トリー（Molec.and Cell.Biochem.）、44:129〜148（19
82）；およびアニフィンセン、シー・ビー（Anfinsen、
C.B.）、サイエンス（Science）、181:223〜230（197
3）。

前記の蛋白質と異なり、十分に還元されたbStは最も水
性の溶媒に不溶である。かくして、還元された蛋白質の
酸化についての古典的技術の多くはbStに対して適用で
きず、イー・コリからのrbSt精製に関する文献で教示さ
れる利用可能な方法は商業的適用については実用的でな
かった。

利用可能な文献は微生物からの異種蛋白質の精製の一般
的原理を開示している。基本的には、工程は細胞死滅、
溶解、宿主異物の選択的可溶化、沈殿した異種蛋白質の
機械的収集および異種蛋白質の可溶化、ひき続いてのさ
らなる濾過工程を含む。

本出願以前は、多量の所望されない蛋白質および他の宿
主細胞の異物の汚染沈殿なくして宿主細胞を死滅させる
ことはできなかった。所望する不溶性蛋白質と共に所望
されない蛋白質の沈殿は後の精製手順の複雑さを増加さ
せる。本明細書には細胞を死滅させる非極性有機溶媒の
使用を開示する。熱、フェノールまたはフェノールとト
ルエンの組合せを用いる標準的な死滅工程を排すること
により、および本明細書中で開示する非極性有機溶媒を
用いることにより所望されない宿主蛋白質の沈殿を最小
化することができる。

本発明は、洗剤（detergent）の存在における効果的な
一工程のソマトトロピンの復元を提供する。先行技術の
忠告によるといずれもの所望する蛋白質のその天然状態
への復元はシステイン残基を通じてのbStの重合を避け
るために1mg/ml以下の低濃度で行う必要があったことが
示唆される。尿素またはグアニジンの如き非洗剤カオト
ロピック（chaotropic）剤中でのソマトトロピンの可溶
化を避けることによって、本発明はその問題を解決す
る。穏かな洗剤を用いてソマトトロピンを可溶化するこ
とによって、本発明は15mg/ml以上の濃度においてrbSt
および類似のソマトトロピンを復元するのが可能なこと
を証明する。

開示される方法は先行技術の方法以上に他の利点を有す
る。この方法はメルカプトエタノールまたはグルタチオ
ンの如きチオール還元剤の必要性を排する。所望する蛋
白質を可溶化するのに尿素またはグアニジンの如き変性
剤の高濃度を用いる必要がない。尿素およびグアニジン
は１リットル当たり９モルまでのモル濃度で用いられな
ければならず、かかる濃度は大規模の精製において生産
コストを増加させる結果となる問題を必ずひき起こす。
この方法は、また、可溶化洗剤としてドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）の代替品を提供し、これはSDSがbStから
除去するのが困難であることが公知なので有利である。
デラカ、ジェイ・エム（Dellacha）、アナルズ・オブ・
ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Anna
lsN.Y.Acad.Sci.）148:313〜327（1968）。この方法の
さらに１つの利点は洗剤の除去に際し、bStが２つの区
分された集団に分割されることである。洗剤の除去に際
し、rbStは可溶な単量体または容易に除去できる不溶な
集合体のいずれかとして見い出される。二量体または三
量体の割合は有意量ではなく、ゲル濾過またはイオン交
換クロマトグラフィーによるそれらの除去は任意であ
る。

最後に、開示される方法は代替の精製方法と比較してよ
り経済的である。

開示される方法を用いると、該生物体によって産生され
たrbStの60％までの収率が得られる。脳下垂体除去ラッ
トにおけるinvitroテストによって測定されるように、
該rbStは天然状態でありかつバイオアクティブな形態で
ある。パーロウ、エイ・エフら（Parlow、A.F.、et a
l.）、エンドウクリノラジー（Endocrin.）、77:1126
（1965）。

情報の開示 形質転換した微生物による多種類の動物からのソマトト
ロピンの表現は公知である。ゲデル、ディー・ブィら
（Goeddel、D.V.etal.）、「ダイレクト・エクスプレシ
ョン・イン・エシェリヒア・コリ・オブ・ア・ディー・
エヌ・エイ・シーケンス・コウディング・フォー・ヒュ
ーマン・グロウス・ホルモン（Direct Expressionin Es
cherichia coli of a DNA sequence coding for humang
rowth hormone）」、ネイチャー（Nature）、281、544
〜548（1979）およびシーブルグ、ピー・エイチら（See
burg、P.H.et al）「エフィシィエント・バクテリアル
・エクスプレション・オブ・ボビン・アンド・ポルシン
・グロウス・ホルモンズ（Efficient Bacterial Expres
sion of Bovine and Porcine Growth Hormones）」、デ
ィー・エヌ・エイ（DNA）、2:37〜45（1983）。

天然に生じるbStは不均質な蛋白質の混合物であり、そ
のアミノ酸配列は公知である。バラジニ、エイ・シーら
（Paladini、A.C.、et al.）、モレキュラー・バイオロ
ジー・オブ・グロウス・ホルモン、（Molecular Biolog
y of Growth Hormone）、シーアールシー・レビューズ
・イン・バイオケミストリー（CRC Reviews Bioche
m.）、15（１）:25〜56（1983）。天然に生じる混合物
はウシの脳下垂体から精製されてきた。その商業的可能
性は乳牛および飼育牛の両方についての生物学的研究に
よってよく認識されかつ実証されている。エパード、ピ
ー・ジェイおよびバウマン、ディー・イー（Eppard、P.
J.and Bauman、D.E.）、ジ・エフェクト・オブ・ロング
−ターム・アドミニストレイション・オブ・グロウス・
ホルモン・オン・パフォーマンス・オブ・ラクティティ
ング・デアリィ・カウズ（The Effect ofLong−Term Ad
ministration of Growth Hormone on Performance of L
actating DairyCows）；およびバウマン、ディー・イー
（Bauman、D.E.）、エフェクト・オブ・グロウス・ホル
モン・オン・グロウス・レイツ・アンド・ママリィ・デ
ィベロップメント・オブ・ルーミナンツ（Effect of Gr
owth Hormone on Growth Rates and Mammary Developme
nt of Ruminants）、プロセス1984コーネル・ニュート
リション・コンファレンス・フォー・フィード・マニュ
ファクチャーズ（Proc.1984 Cornell Nutrition Confer
ence for Feed Manufactures）、５〜17頁、ニューヨー
ク、イサカ（Ithaca）、コーネル大学版。

形質転換した微生物におけるbStの産生は多種類の遺伝
子組換えプラスミズドによって達成される。カリフォル
ニア大学、ディー・エヌ・エイ・トランスファー・ベク
トルズ・コーディング・フォー・ボビン・グロウス・ホ
ルモン、...、アンド・ユースフル・フォー・トランス
フォーミング・マイクロオーガニズム・フォー・プロダ
クション・オブ・フュージョン・プロテインズ（DNA Tr
ansfer Vectors Coding for Bovine Growth Hormon
e、...、and Useful for Transforming Microorganisms
for Production of Fusion Proteins）、ヨーロッパ特
許出願第47600号；イエダ・リサーチ・アンド・ディベ
ロップメイント（Yeda Research and Development）
社、プロダクション・オブ・ボビン・グロウス・ホルモ
ン・バイ・マイクロオーガニズムズ（Production of Bo
vine Growth Hormone by Microorganisms）；英国特許
出願GB2073245A号；およびショーナー、ビー・イーら
（Schoner,B.E.et al.）、ロウル・オブ・エム・アール
・エヌ・エイ・トランスレイショナル・イフィシェンシ
ー・イン・ボビン・グロウス・ホルモン・エクスプレシ
ョン・イン・エシェリヒア・コリ（Role of mRNA Trans
lational Efficiency in Bovine Growth Hormone Expre
ssion in E′scherichia coli）、ピーエヌエイエス（P
NAS）米国、81:5403〜5407（1984）。

bStの同族体も公知である。ビオゲン・エヌブイ、ディ
ー・エヌ・エイ・シーケンシズ、レコンビナント、ディ
ー・エヌ・エイ・モレキュールズ・アンド・プロセス・
フォー・プロデューシング・ボビン・グロウス・ホルモ
ン−ライク・ポリペプチド・イン・ハイ・イールド（Bi
ogen NV、DNA Sequences、Recombinant DNA Molecules
and Processes for Producing Bovine Growth Hormone
−Like Polypeptides in High Yield）、ヨーロッパ特
許出願第10395号；およびショーナー、ビー・イーら（S
choner、B.E.、et al.）、前掲。本発明と異なりbStの
これらの同族体はbStの５′端および３′端での塩基の
挿入に関するものであり天然に生じたアミノ酸配列と異
なる蛋白質をつくり出す。

イー・コリ以外の形質転換した微生物におけるbStの産
生が報告されている。グレイ、ジー、ら（Gray、G.、et
al.）、シンセシス・オブ・ボビン・グロウス・ホルモ
ン・バイ・ストレプトミセス・リビダンス（Synthesis
of Bovine Growth Hormone by Streptomyces lividan
s）、ジーン（Gene）、32:21〜30（1984）；およびイン
・イースト（in Yeast）、米国特許第4443539号。

該形質転換した微生物を培養しおよび発酵する方法も公
知であり前記引用文献中で詳細に開示されている。

形質転換した細胞からの生物学的に活性なbStの精製も
以前記載されたことがある。ジェネンテク（Genentec
h）社、「プュアリフィケイション・アンド・アクティ
ビティ・アシュアランス・オブ・プレシピテイティッド
・ヘテロロガス・プロテインズ（Purification and Act
ivity Assurance of Precipitated Heterologous Prote
ins））、米国特許第4511502号；第4511503号；第45129
22号および第4518526号；バイオテクノロジー・ジェネ
ラル（Biotechnology General）社「エクスプレション
・ベクトルズ・フォー・エンハンスド・プロダクション
・オブ・・ポリペプタイズ....アンド・リレイティッド
・メソッズ（Expression Vectors for Enhanced Produc
tion of Polypeptides....and Related Methods）」、
ヨーロッパ特許出願第131843号；および、ショーナー、
アール・ジーら（Schoner、R.G,、et al）、「アイソレ
イション・アンド・ピュアリフィケイション・オブ・プ
ロテイン・グラニュールズ・フロム・イー・コリ・セル
ズ・オウバープロデューシング・ビーエスティ（Isolat
ion and Purification of Protein Granules from E.co
li Cells Overproducing bSt）」、バイオ／テクノロジ
ー（Bio/Tech.）、3:151〜154（1985）。

本発明は洗剤の存在において、ソマトトロピンを容易に
ジスルフィド結合の形成が起こるコンホメーションとす
る洗剤の使用を開示する。該溶剤を除去して生物学的に
活性な状態が得られる。これは強変性剤（0.01〜2.0
％）としての洗剤を記載するジエネンテク（Genentec
h）の特許についての非自明な改良である。そこでは該
洗剤は蛋白質の折りたたみを広げるのに用いられる。次
いで該洗剤を除去した後、ジスルフィド結合を形成しお
よび該蛋白質を折りたたんで生物学的に活性な状態とす
る。

加えて、出願人が知っている先行技術は本明細書中に開
示する方法の利点、効力および経済的な節約を有する方
法を記載していない。

発明の要約 本発明は形質転換した微生物からの不溶性蛋白質を抽出
する一般法に関する。

さらに詳しくは、蛋白質の抽出に先立って微生物を殺す
改良方法を記載する。細胞をトルエンまたはキシレンあ
るいはそれらの組合せの致死量を暴露する。非極性有機
溶媒は実質的な蛋白質の崩壊および変性が可能なので、
該溶媒の使用は有利である。フェノールと異なりキシレ
ンまたはトルエンの如きより弱い極性の有機溶媒は宿主
汚染物の大きな沈殿をなくして微生物を効果的に殺す。
宿主細胞が沈殿形態である所望する天然のまたは異種の
蛋白質の実質的割合を表現する場合、フェノールの回避
はコストが低減化されかつより高い収率が得られる点で
有利である。一旦殺された細胞を溶解すると、蛋白質の
抽出および精製についての標準的方法を用いて所望する
蛋白質が得られる。

本発明は、前記で開示した殺す工程から後の有利な酸化
工程を開示する。この工程は形質転換した微生物の細胞
質内で不溶である組換えによって産生されたソマトトロ
ピンに対して特に有用である。特に、この工程は、弱い
変性洗剤を用いる選択的可溶化によって一旦宿主細胞の
蛋白質および汚染物の大部分が除去されると、洗剤より
濃い溶液中の溶解酸素を用いて残存する不溶性ソマトト
ロピンを酸化して生物学的に活性な状態とできることを
証明する。これは天然のジスルフィド結合配位への単一
工程の変換である。先行技術に記載されている再シャフ
リングおよび再折りたたみ工程は排される。洗剤の全除
去は不必要であり、該溶液の生物学的活性は希釈および
実験室動物への注射の後、検出できる。酸化に対して有
用な洗剤はドデシル硫酸ナトリウム（SDS）およびｎが
８〜20であり、R₁がメチルまたはエチルであってR₂が水
素、メチル、エチル、ｎ−プロピルまたはイソプロピル
である式Ｉで表わされる構造を有する洗剤を包含する。
この工程で好ましいソマトトロピンはrbStである。

この改良の有利な点は尿素またはグアニジンの如き高モ
ル塩溶液の排除である。該塩は大規模な商業環境下で扱
いにくく、かつ高価である。加えて、成長ホルモンから
容易に除去される洗剤の使用は純度を増加させ、かつ従
来の方法が収率の減少する重合をひき起こすと教示する
濃度5mg/mlを超える濃度で変性および酸化が起こること
を可能とする。米国特許第4518526号。最終的に、より
高濃度での酸化は工程のより低容量によって低生産コス
トという結果となる。

前記方法において、選択した生物体はイー・コリであ
る。好ましい殺すための溶媒はトルエンである。好まし
い洗剤は該置換基および変数が前記で定義したのと同じ
である式Ｉで表わされる構造を有する洗剤である、rbSt
を天然状態まで酸化するにおける最も好ましい洗剤はＮ
−ラウロイルメチルグリシンである。

前記の記載において、および本明細書を通じて以下の語
句は次の意味を有する。

「形質転換した微生物からの生物学的に活性なソマトト
ロピン」は哺乳動物の成長速度テストで検出可能な活性
を有するその天然の立体配置へ十分回復したソマトトロ
ピンを言う。

「ウシソマトトロピン同族体」は天然に生じるbStの最
長形態に実質的に類似しかつミルクの生産および成長速
度を増加させるのに有用な生物学的活性を有する蛋白質
を言う。かかる同族体は、脳下垂体からの精製したbSt
中で見い出される不均質種と同一のアミノ酸配列を有す
る組換えによって産生されたrbStおよびヨーロッパ特許
出願第103395号に記載されている如きbStエンコーディ
ングDNAを修飾することによって人工的につくり出され
たそれらのrbSt種を共に包含する。

「カオトロピック（chaotropic）剤」は適当な濃度の水
性溶液中で水和の状態、溶媒の環境または溶媒の表面相
互作用のいずれかを変化させて、その表面での変化によ
り蛋白質の空間的立体配置またはコンホメーションを変
化できる蛋白質変性剤を言う。かかる剤の例は尿素、グ
アニジン、塩酸塩、チオシアン酸ナトリウム、およびSD
Sおよびトリトン（Triton）Ｘ−100の如き洗剤を包含す
る。

「微生物」は細菌、酵母、放線菌類および個々の生物体
として細胞培養で発育された場合の高等目の植物および
動物からの単一細胞の如き単一細胞原核生物および真核
生物の生物体を言う。

「酸化」は蛋白質のシステイン残基上の還元されたチオ
ール基が架橋して三次元構造となる過程を言う。

「不溶性蛋白質」は蛋白質または最初の均質化媒質を産
生する微生物の細胞質中の如き特定の水性環境中で溶解
しないいずれもの蛋白質を言う。機能的に定義されたこ
れらの蛋白質は標準的な超遠心分離法によってペレット
化できる蛋白質である。宿主細胞は所望する蛋白質を不
溶な状態に維持できる浮遊培地中に溶解し、そこより該
蛋白質は遠心分離によって可溶物質から分離する。

不溶性蛋白質の単離の一般法は当業界で公知である。米
国特許第4512922号参照。微生物体中で形成される不溶
性蛋白質の例はインシュリン、キモシン、ソマトトロピ
ン、バチルス・スリンギエンシス（Bucillus thuringie
nsis）の結晶蛋白、繊維芽細胞インターフェロン、ウイ
ルス性蛋白質、および組織プラスミノーゲンアクチベー
ターを包含する。

「ソマトトロピンの不溶性形態」は形質転換した生物体
によって産生されつつある異種成長ホルモンの沈殿形態
を言う。それは不溶性蛋白質のタイプである。

「選択的可溶化」は抽出および精製手順において、宿主
異物を可溶化しかつ所望する不溶性蛋白質を不溶な状態
のままにしておく工程を言う。

「ソマトトロピン」は哺乳動物、魚類および鳥類の成長
ホルモンを言う。ソマトトロピンは生物学的活性を維持
できるのに十分なアミノ酸配列の同一性があるこれらの
蛋白質の同族体を包含する。かかる同族体は脳下垂体か
らの精製した調製物中で見い出される不均質種と同一の
アミノ酸配列を有する組換えによって産生されたソマト
トロピンおよびヨーロッパ特許出願第103395号に記載さ
れた如きソマトトロピン・エンコーディングDNAの修飾
によって人工的につくり出された同族体を包含する。

「形質転換した微生物」は分子遺伝学でよく知られた技
術を用いて人工的に細胞中に挿入されたプラスミドを含
有するまたはそれに対して宿主となる原核生物または真
核生物の単一細胞生物体を言う。

「非緩衝性アルカリ性溶液」は7.0を超えるpHを有しか
つ水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムの如き非緩衝
性塩を含有する水性溶液を言う。エチレンジアミン四酢
酸［EDTA］の如きキレート剤が所望により包含されてよ
い。しかし、有意な緩衝能を有する塩はこれらの溶液に
加えない。これらの溶液は所望する不溶性蛋白質のフラ
クションの溶解および回収に先立って細胞を懸濁するの
に用いる。

詳細な説明 開示する多段方法は所望する蛋白質が不溶性である場合
最適に有用である。該方法は不溶性異種蛋白質を単離し
精製するのに開発されたが、該方法の殺す工程は全ての
不溶性蛋白質に対して一般的適用性を有する。

不溶性形態にある所望する蛋白質の割合を決定するのは
しばしば有益である。形質転換した微生物系統において
産生された異種蛋白質の場合、変異は可溶性蛋白質に対
する不溶性蛋白質の割合に影響するかも知れない。不溶
性ソマトトロピンに対する可溶性ソマトトロピンの比並
びに系統間の収率の比較を決定するには、ラジオイムノ
アッセイが最適である。ソマトトロピンを産生する細胞
を溶解し、加えたソマトトロピンに対する抗体をラベル
する。混合物を遠心分離し、上澄液対ペレットにおける
ラベル量を比較して該生物体によって産生されつつある
可溶性ソマトトロピンに対する不溶性ソマトトロピンの
比を得る。米国特許第4512922号、25〜26欄。

形質転換した微生物からソマトトロピンの単離について
の各種工程は、効果的細胞死滅、細胞破壊、所望されな
い細胞異物の選択的不溶化または除去、ソマトトロピン
の可溶性、ひき続いての濾過または透析およびその組合
せによる更なる精製である。各工程は当業界で公知のい
くつかの数の方法により達成できる。

細胞死滅方法の使用は細胞破壊に先立ち随意でよく、い
くつかの方法が当業界で公知である。細胞死滅は安全の
見地から有用である。本明細書において細胞死滅は蛋白
質の沈殿を最小化する非極性有機溶媒で達成される。好
ましい溶媒はトルエンまたはキシレンである。溶媒の量
は殺す細胞の濃度およびタイプに依存する。それは標準
的な活性テストを用いて実験的に決定される。通常致死
量は10mlの試料中の目に見える細胞の数を１以下に減少
させるのに必要な溶媒濃度として定義される。活性は溶
媒に暴露される生物体により変化させる培養技術によっ
て容易に決定される。これらの技術は当業者にとって公
知である。一般に、水性層の飽和点を超える溶媒量を加
える必要がある。可燃性ヒュームの汚染は適用な安全性
を確保するのに考慮しなくてはならないが、最小致死量
の過剰量は該方法にとって有害ではない。

微生物を殺した後、超音波処理、圧力処理、または洗剤
による如き、いずれかの数の公知方式によって細胞を破
壊する。好ましい方法は溶液を加熱せず、高レベルの細
胞破壊を得る。好ましい方法は細胞を破壊するのにマン
トン−ガウリン（Manton−Gaulin）の如きホモゲナイザ
ーを用いることである。破壊の第２のサイクルも効果的
である。

８〜10.5のpHで、アルカリ性条件の低イオン濃度の緩衝
液または脱イオン水中に破壊した細胞を懸濁する。該溶
液を２°〜15℃間に保ち、ソマトトロピンを可溶化しな
いが、細胞膜および他の所望されない細胞異物を選択的
に可溶化する洗剤で直ちに処理する。rbStに対して効果
的な洗剤はトリトン（Triton）Ｘ−100およびデオキシ
コレートを包含し、テルギトール（Tergitol）15−５−
７が好ましい。ホウ酸ナトリウムは好ましい緩衝液であ
る。

固体を沈殿させるのに十分な遠心分離によって可溶化し
た細胞異物を不溶性ソマトトロピンから機械的に分離す
る。次いで沈殿物を前記の緩衝液中に反復して懸濁しか
つ再遠心分離して可溶化された細胞異物を排除する。

次に不溶性ソマトトロピンを可溶化し、制御された条件
下で酸化する。該条件は収率を減少させる望ましくない
重合を最小化するように設定される。

SDSまたはｎが８ないし20で、包括的に；R₁がメチルま
たはエチルであり；およびR₂が水素、エチル、メチルま
たはｎ−プロピルである式Ｉの洗剤を用いると、ソマト
トロピンの可溶化および酸化は比較的高濃度で達成でき
る。洗剤に対するソマトトロピンの比は洗剤の酸部位に
依存する：洗剤の酸部位が弱ければ弱いほど、可溶化に
必要な洗剤の量は多くなる。例えば、比較的強い酸部位
を有するドデシル硫酸ナトリウムを用いると、1:1の比
で十分である。しかし、式Ｉの洗剤を用いると、２〜５
の比が好ましい。洗剤を希釈する緩衝液の使用は任意で
ある。

一旦ソマトトロピンが可溶化されると、該酸化は所望に
より空気を導入して混合物に通じることによって促進さ
れてよい。空気は攪拌または溶液に直接空気を通じるこ
とのいずれかによって導入される。空気の導入の速度お
よび方法は調製物の量に依存する。酸化を完全に進行さ
せて濃縮の間、以後の重合試薬を避けることが必要であ
る。エルマン（Ellman）試薬を用いることによって酸化
をモニターすることができる。メソッズ・オブ・エンザ
イモロジー（Methods of Enzymology）、25:457〜464
（1972）。

rbStを可溶化する好ましい方法は0.1〜0.5MでpH8〜10.5
のホウ酸ナトリウム緩衝液中のＮ−ラウロイル・メチル
グリシン（ハムポジル（Hamposyl）R L−95、ダブリュ
ー・アール・グレイス（W.R.Grace）、レキシントン（L
exington）、マツチューセッツ州）の水性溶液を加える
ことである。rbStを可溶化するのに必要なハムポジル量
は存在するrbStの各グラムについて約２〜10gであり、
4:1の比が好ましい。洗剤量が少ないとrbStの溶解性を
低下させ、洗剤量が多いと生産コストを増加させる。次
いで、少くとも16時間空気を混合物に通す間、15〜25℃
で溶液を攪拌する。

次いで、陰イオン交換樹脂により洗剤を除去する。好ま
しいイオン交換樹脂は塩化物形であるダウエックス（Do
wex）１×４（ダウ・ケミカル（Dow Chemical）社）で
ある。濾過および新しい樹脂の添加によって該樹脂を除
去して混合物を実質的に洗剤無しとする。洗剤を除去す
ると、rbStは２つの集団、単量体および大きな高分子体
に分れる。該高分子物質は次の工程で記載する如く、容
易に除去できる沈殿を形成する。残存するソマトトロピ
ンは単量体であって天然の形態である。

高分子のrbStを包含する残存固体汚染物の除去によって
洗剤無しの混合物をさらに精製する。該汚染物は遠心分
離またはミクロ濾過の如き当業界でよく知られた技術に
よって除去する。好ましい方法は添加し、濾過によって
除去されるセラトム（CELATOM）（イーグル−ピチャー
（Eagle−Picher）、シンシナティー（Cincinnati）、
オハイオ州）またはスペルセル（SUPERCEL）（ジョンズ
−マンビィル（The Johns−Manville）社、ニューヨー
ク、ニューヨーク州）の如き濾過助剤を用いることであ
る。濾液は0.45ミクロンの孔サイズを有するミクロフィ
ルターを通過させてよい。

限外濾過によって濾液を濃縮する。好ましい濾過膜は分
子量10000でカットオフするポリスルホン膜である。約2
0000を超える分子量を有するソマトトロピンは保持さ
れ、該保持物を水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリ
ウムの如き塩基でpH9〜10とした水に対して透析する。r
bStはフィルター上に沈殿する高濃度のコロイドを形成
し易いので、アルカリ性の水を濾過装置に通して、この
時点で実質的な損失を回避するのが効果的である。

ソマトトロピンは透析しこの時点で凍結乾燥でき、また
はDEAEセファローズの如きイオン交換カラムを通過させ
ることによってさらに精製できる。該カラムをpH9.0〜1
0.5のアルカリ性条件下に保つ。ソマトトロピンを含有
するフラクションを該カラムから収集する。

限外濾過または他の類似方法を用いて該フラクションを
濃縮し、最後に濃縮物をミクロフィルターを通して濾過
する。次いで、仕上げた透過物を凍結乾燥する。

当業者ならば、さらに工夫を凝らすことなく、これまで
の記載を用いて本発明を最大限に実施できると考えられ
る。以下の詳細な実施例は本発明の方法を実施する仕方
を記載するものであり、単に例示的なものであってこれ
までの開示を限定するものではないと解釈されるべきで
ある。当業者ならば、反応体、条件および技術に関する
方法から適当な変法を直ちに認識するであろう。

実施例 実施例1.イー・コリからのbStの抽出および天然状態へ
の酸化 工程1.トルエンでのイー・コリの死滅 bStを表現する形質転換したイー・コリはアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Cu
lture Collection）（ATCC No.31826）または他の普通
に知られた出発源から得ることができる。イー・コリAT
CC31826についてのヨーロッパ特許出願第131893号また
は米国特許第4511503号に記載されている如き特定の存
在するプロモーターを作用開始させるのに適した条件下
で該細胞をファーメンター中で発育させ、収穫する。

細胞3.5gの乾燥重量を有しかつ50mgrbSt/g湿潤細胞を含
有する湿潤細胞10kgを、溶液を攪拌しながら、窒素の導
入により酸素を５％以下に減少させた容器に入れる。こ
れは200リットルの細胞スラリーである。このスラリー
にトルエン6.7リットルを加え、該スラリーを15℃で１
時間攪拌する。

工程2.細胞の破壊 死んだ細胞を4lpm、12000×Ｇにて、ウエストファリア
固体放出遠心分離機（Wertfalia solids discharging c
entrifuge）で遠心分離する。細胞ペレットを脱イオン
水中に再懸濁して46リットルの全体積とする。EDTAの35
グラムを加え、IN NaOHでpHを9.0に調整する。該細胞を
攪拌して均一な懸濁液を形成し、ガウリン（Gaulin）ホ
モゲナイザー中での均質化に先立ち５℃まで冷却する。
該ガウリンホモゲナイザーを9000psigで作動させる。破
壊した細胞を出来るだけ早く５℃まで冷却し、２回目は
10000psigで均質化する。次いで生成物を出来るだけ早
く20℃まで冷却する。

工程3.洗剤および緩衝液での洗浄 懸濁液にテギトール（Tergitol）15−５−７の２リット
ルを加える。溶液を30分間攪拌し、2lpmにてウエストフ
ァリア固体放出遠心分離機（12000G）中で遠心分離す
る。得られたペレットを脱イオン水50リットル中に懸濁
し、15分間攪拌して均一に懸濁させる。IN NaOHで該懸
濁液をpH8〜９に調整し、2lpmにてウエストファリア固
体放出遠心分離機（12000G）中で再遠心分離する。

工程4.bStの可溶化および酸化 固体を直ちにＮ−ラウロイル・メチルグリシン（ハムポ
ジルＬ−95）1.5kgを含有するpH10.0の100mMホウ酸ナト
リウム緩衝液50リットル中に懸濁する。溶液を20℃にて
１時間激しく攪拌してペレットを完全に可溶化し、次い
で少くとも16時間、１時間当たり５立方フィートで空気
を加えながら、20℃で穏かに攪拌する。

工程5.ダウエックス１×４でのハムポジルの除去 IN NaOHでハムポジル抽出物のpHを10,5に調整する。次
いで、400m1/分の液速で塩化物形であるダウエックス１
×４の75リットルカラムに該抽出物を供給する。pH10.5
の50mMホウ酸ナトリウム45リットルで該カラムを洗浄
し、rbStを含有するフラクションを収集する。

工程6.ハムポジル−自由抽出物の仕上げ 標準スーパーセル（Supercel）3kgを前記の溶液に加
え、次いで溶液を攪拌して均一な懸濁液を得る。次い
で、混合物をフィルタープレス上で濾過する。得られた
フィルターケーキをpH10.0の50mMホウ酸ナトリウム12リ
ットルで洗浄する。次いで、洗液と濾液を合する。

工程7.限外濾過 分子量10000でカットオフするポリスルホン膜を用い、
工程６からの合した濾液および洗液の溶液を４リットル
まで濃縮する。次いで、IN NaOHでpHを10.3に調整した
発熱物質の無い水40リットルを用い、保持物体積を一定
に維持しながら濃縮溶液を透析濾過する。該保持物を収
集し、pHを10.3に調整した脱イオン水10lで限外濾過膜
を洗浄する。

工程8.DEAEセファローズイオン交換 次いで、rbSt濃縮物を炭酸塩形であるDEAEのカラムに供
給して通す。該セファローズをpH9.2の5mM炭酸ナトリウ
ムで平衡化する。濃縮物を液速30ml/分で該セファロー
ズカラムに供給し、ひき続いて液速300ml/分でpH9.2の5
mM炭酸ナトリウム６リットルを供給する。次いで、液速
300ml/分でカラムに供給されるpH9.2の150mM炭酸ナトリ
ウム緩衝液300リットルを用いて該カラムを溶出する。r
bStを含有するフラクションを貯めておく。

工程9.溶出物の限外濾過 IN NaOHを用いてrbStを含有するフラクションをpH10.0
に調整し、分子量10000でカットオフするポリスルホン
膜を用いて濃縮して４リットルとする。次いで、NaOHで
pH10.3に調整された発熱物質の無い水40リットルを用い
て保持物体積を一定に維持しながら溶液を４リットルを
透析濾過する。保持物を収集し、pH10.3に調整した脱イ
オン水３リットルで限外濾過膜を洗浄する。次いで保持
物と洗液溶液を合する。

工程10.最終仕上げおよび凍結乾燥 0.45μのドウラポア（Durapore）膜の５平方フィートを
含有するペリコン（Pellicon）Ｒ（ミリポア（Millipor
e）社、ベッドフォード（Bedford）、MA）フィルターを
用い、工程９からの保持物および洗液溶液を400mlまで
濃縮する。次いで、NaOHでpHを10.3に調整した発熱物質
の無い水2.4リットルを用いて一定の保持物体積を維持
しながら濃縮物を透析濾過する。次いで透過物を凍結乾
燥する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−161321（ＪＰ，Ａ) Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，1966 〔55〕Ｐ．31−45 Ａｎｎ．Ｒｅｃｈ．ｖｅｔ．，1974 〔５〕Ｐ．213−221

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ドデシル硫酸ナトリウムおよびｎが８ない
   し20であり、包括的に；R₁がメチルまたはエチルであ
   り、かつR₂が水素、メチル、エチル、イソプロピルまた
   はｎ−プロピルである式： の洗剤より成る群から選択される洗剤の存在下において
   ソマトトロピンを酸化することを特徴とする形質転換し
   た微生物からのソマトトロピンを酸化することを特徴と
   する形質転換した微生物からのソマトトロピンの不溶性
   形態を天然のジスルフィド結合のコンホメーションに酸
   化する方法。
2. 【請求項２】該ソマトトロピンの酸化に先立ち該微生物
   を非緩衝性アルカリ性溶液中に溶解する請求の範囲第１
   項記載の方法。
3. 【請求項３】該洗剤が、ｎが８ないし20であり、包括的
   に；R₁がメチルまたはエチルであり；かつR₂が水素、メ
   チル、イソプロピル、またはｎ−プロピルである式Ｉの
   化合物類から成る群から選択される請求の範囲第１項記
   載の方法。
4. 【請求項４】1mg/mlよりも高濃度で、該ソマトトロピン
   を酸化して天然のジスルフィド結合のコンホメーション
   とする請求の範囲第１項記載の方法。
5. 【請求項５】1mg/mlよりも高濃度で、該ソマトトロピン
   を酸化して天然のジスルフィド結合のコンホメーション
   とする請求の範囲第３項記載の方法。
6. 【請求項６】該ソマトトロピンがウシソマトトロピンま
   たはウシソマトトロピン同族体である請求の範囲第３項
   記載の方法。
7. 【請求項７】該ソマトトロピンがウシソマトトロピンま
   たはウシソマトトロピン同族体である請求の範囲第４項
   記載の方法。
8. 【請求項８】該ソマトトロピンがウシソマトトロピンま
   たはウシソマトトロピン同族体である請求の範囲第５項
   記載の方法。
9. 【請求項９】該微生物がイー・コリの系統である請求の
   範囲第１項記載の方法。
10. 【請求項１０】該洗剤がＮ−ラウロイルメチルグリシン
    である請求の範囲第３項記載の方法。
11. 【請求項１１】該洗剤がＮ−ラウロイルメチルグリシン
    である請求の範囲第５項記載の方法。
12. 【請求項１２】該洗剤がＮ−ラウロイルメチルグリシン
    である請求の範囲第６項記載の方法。
13. 【請求項１３】該洗剤がＮ−ラウロイルメチルグリシン
    である請求の範囲第８項記載の方法。