KR960003548B1 - 생물활성을 갖는 모노머성 성장호르몬의 분리방법 - Google Patents
생물활성을 갖는 모노머성 성장호르몬의 분리방법 Download PDFInfo
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Abstract
내용 없음.
Description
본 발명은 미생물에 의해 생성된 불용성 봉입체(封入體 : inclusion body)로부터 생물학적으로 활성인 성장호르몬을 분리하는 방법에 관한 것이다.
DNA 재조합 기술의 출현으로, 이종의 단백질-코드화 유전자를 세균과 같은 미생물내에 삽입시키고 숙주 미생물내에서 유전자를 발현시키는 방법에 의한 단백질의 대규모 생산이 가능하게 되었다. 이러한 방법에 의하여, 천연의 공급원으로부터 단지 미량만을 수득할 수 있는 몇종의 단백질을 포함한 매우 다양한 단백질을 무제한의 양으로 경제적으로 제조할 수 있게 되었다.
불행히도, 진핵세포에서 유래한 단백질은 목적하는 단백질의 생물학적 활성형을 생성시키는 미생물 숙주내에서의 후-해독과정(post-translational processing)을 수행하지 못할 수 있다. 즉, 예를들어, 다수의 시스테인 잔기를 함유하는 진핵 단백질은, 그들이 미생물 숙주내에서 발현되는 경우에, 생물학적 활성에 필요한 정확한 디설파이드 결합을 형성하지 않을 수 있다. 진핵 단백질은 숙주의 세포내 환경에서 부적합하게 홀딩(folding)될 수 있을 뿐만 아니라, 개개 분자는 분자간 디설파이드 결합 또는 다른 형태의 분자간 결합을 형성하는 결과로 생물학적으로 불활성인 응집체(aggregate) 단백질 올리고머(oligomer)를 형성할 수도 있다.
이러한 현상들 즉, 부적합한 홀딩, 부정확한 디설파이드 결합 형성 및 비공유적 또는 공유적 올리고머화중의 한가지 또는 그 이상의 결과로, 미생물 숙주내에서 이종 유전자의 발현에 의해 생성된 대부분의 단백질은 숙주 세포로부터 가용성인 생물학적 활성 단백질의 형태로 회수되지 않는다. 오히려, 세포의 용해시에 이종 단백질은, 때때로 “굴절체(refractile bodies)”로도 불리우는 불용성 “봉입체(inclusion bodies)”의 형태로 확인된다. 유용한 단백질을 생산하기 위해서는, 봉입체 단백질을 생물학적 액체중에 가용성인 모노머성, 생물학적 활성형으로 전환시킬 수 있도록 하는 방법이 제공되어야 한다.
봉입체 단백질을 가용성인, 모노모성, 생물학적 활성형으로 전환시키는 것 이외에, 내독소, 그밖의 세균성 단백질 및 세균 숙주 및/또는 발효 배지로부터 유래된 오염물질 등을 포함한 세균성 불순물을 제거하기 위한 단백질의 정제가 회수 과정중의 몇부분에서 필요하다. 이러한 조작은 통상적으로 단백질을 이온교환 크로마토그래피와 같은 다양한 크로마토그래피 정제방법으로 처리하여 행해진다.
PCT 출원 제GB 83/00152호에는 효소 키모신을 그의 효소 전구체 형태로 함유하는 대장균에서 생성된 봉입체로부터 시작하여 우유 응고 효소인 키모신을 회수 및 활성화시키는 방법이 기술되어 있다. 그 방법은 우레아, 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 알칼리 용액과 같은 변성제중에 봉입체 단백질을 용해시키고, 변성제를 제거 또는 희석하여 단백질을 재생시키고, 용액의 pH를 저하시켜 효소 전구체의 자가촉매작용성 분해를 야기시켜 단백질의 성숙형을 생성시키는 단계로 이루어진다.
용해도 및 홀딩 특성은 둘다 단백질의 일차 구조 즉, 단백질의 아미노산 서열에 대해 매우 의존성이 높기 때문에, 상이한 단백질들 사이에서는 상당히 달라진다. 선행 기술 분야의 경험에 따르면 동물의 성장호르몬이 특히, 가용성인 모노머성 생물학적 활성형으로 회수하기에 어려운 단백질인 것으로 알려졌다. 즉, 예를들어, 미합중국 특허 제4,512,922호에서는 성장호르몬과 같은 단백질의 경우에, 봉입체 단백질을 강변성제중에 용해시키고, 이어서 수성 완충제로 변성제를 희석함으로써 거의 일정하게 단백질의 재침전이 일어난다고 기술하고 있다. 비록 재침전은 일어나지 않는다해도, 기대되는 활성 수준에는 도달하지 않는다. 이러한 문제점에 대한 해결책으로 봉입체 단백질을 강변성제중에 용해시킨 후, 강변성제를 약변성제로 대체시키고, 계속해서 약변성제를 제거하여 단백질을 재생시키는 성장호르몬의 정제방법이 제시되었다.
본 발명자들은, 미합중국 특허 제4,512,922호에 기술된 것과 같은 2단계 재생방법이 많은 문제점을 수반하는 것을 밝혀내었다. 가용성인 생물학적 활성 성장호르몬의 수율은 특히 우수하지 못하였다. 더우기 이 방법에서는 관련된 성장호르몬의 종류에 따라 다양한 결과가 얻어진다. 예를 들어, 강변성제로서 8M 구아니딘 하이드로클로라이드와 약변성제로서 3.5M 우레아를 사용하는 경우에는, 가용성인 생물학적 활성 돼지 성장호르몬의 수율이 약 1% 또는 그 미만의 정도인 것으로 밝혀졌다. 한편, 소의 성장호르몬의 수율은 이보다 다소 높아 약 5% 정도에 달하지만, 이것도 상업적인 관점에서는 여전히 단지 최저한의 수준 정도이다. 더우기 이러한 방법에 의하여 회수된 단백질의 정체에 있어서도 문제점이 야기된다. 즉 이러한 방법으로 회수된 단백질을 정제하기 위해 이온교환 컬럼에 충진시키면, 대량의 가용성 단백질 응집체가 컬럼에 결합되어 비교적 단시간내에 컬럼을 오염시키고 차단하게 된다. 이러한 것은 응집체를 제거하려는 시도에서 환원조건하에서 컬럼 정제법을 수행하는 경우에도 마찬가지이다. 2단계 재생방법을 사용하는 데에는 또한 수많은 처리단계와 비싼 시약이 필요하기 때문에 상업적인 생산의 측면에서도 문제점이 있다.
본 발명자들은 또한, 8M 우레아중에 봉입체 단백질을 가용화시키고, 이어서 변성제를 함유하지 않는 완충제에 대해 용액을 투석시켜 우레아를 제거하여 단일단계로 단백질을 재생시킴으로써 봉입체로부터 성장호르몬을 회수하고자 시도하였다. 회수된 모노머성 성장호르몬의 수율은 매우 낮아, 즉 1% 또는 그 미만의 정도였다.
본 발명의 목적은 미생물에 의해 생산된 성장호르몬을 가용성인, 모노머성 생물학적 활성형으로 회수하는효율적인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 정제 컬럼이 단시간내에 막히거나 차단되지 않도록 크로마토그래피 정제 컬럼을 사용하여 미생물에 의해 생산된 성장호르몬을 회수 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 그밖의 목적 및 이점은 이하의 발명의 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
본 발명은 봉입체로부터 가용성이며, 생물학적 활성인 모노머성 성장호르몬을 분리 및 정제하는 효율적이며 경제적인 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서는 선행 기술 분야에서의 2단계 재생방법 또는 우레아를 사용하는 방법에서 야기되는 여러가지 문제점들이 일어나지 않는다. 특히, 본 발명의 방법은 실질적으로 가용성인 성장호르몬 응집체의 존재를 감소시키며, 따라서 이온교환 크로마토그래피 과정중의 컬럼 오염의 문제를 경감시킨다. 더우기, 본 발명의 방법은 회수 과정에서 사용되는 시약의 수와 가격을 저하시킨다.
선행 기술 분야에서의 교시와는 상반되게, 본 발명자들은, 적절한 조건하에서 성장호르몬 봉입체는 구아니딘염 용액에 가용화될 수 있으며, 그후에 구아니딘의 일단계 제거과정에 의해 재생될 수 있음을 밝혀내었다. 구아니딘이 신속한 일단계 재생과정에서 제거되는 경우에, 필수적으로 모든 단백질 응집체는 용액으로부터 침전되어, 크로마토그래피 정제단계 이전에 이들을 가용성인 모노머성 성장호르몬으로부터 분리시킬 수 있다. 결과적으로, 컬럼의 오염 및 차단이 최소화되고 컬럼의 사용수명이 연장된다.
본 발명을 수행함에 있어서는, 봉입체를 가용화시키고 구아니딘염, 바람직하게는 구아니딘 하이드로클로라이드의 수용액으로 추출함으로써 단백질을 변성시킨다. 구아니딘염 용액을, 예를들어 투석방법을 이용하여, 변성제를 함유하지 않는 완충용액으로 대체시켜 변성된 성장호르몬의 적어도 일부가 그의 천연의 모노머성 배열로 재폴딩(refold)되도록 한다. 부수적으로, 용액중에 존재할 수 있는 거의 모든 성장호르몬 응집체 뿐만 아니라, 일부 단백질성 오염물질도 침전된다. 침전된 오염물질 및 응집체는 쉽게 분리되며, 그후 잔류하는 생물학적 활성형의 모노머성 성장호르몬의 용액은 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 구아니딘을 변성체를 함유하지 않는 완충용액으로 대체시키는 단계는 중간 변성제의 사용없이 수행된다. 상업적 규모의 생산과정에서, 중간 변성제의 배제는 비용면에서 물질의 상당한 절감을 나타내는 것이다.
본 발명의 방법은 세균과 같은 미생물 내에 불용성 봉입체로 존재하는 동물 성장호르몬, 특히 소의 성장호르몬(bGH) 또는 돼지의 성장호르몬(pGH) 및 이들의 생물학적 활성 단편 및 아미노산 서열은 상이하지만 여전히 성장호르몬 활성을 나타내는 동족체를 모노머성인 생물활성형으로 분리하는 데에 사용될 수 있다.
세균숙주 내에서 성장호르몬을 발현시킬 수 있는 발현벡터(expressing vectors)를 제조하는 방법은 본 분야에서 공지되어 있다[참조예 : Seeburg et al., DNA, 2 : 37-45(1983) 및 Goeddel et al., Nature, 281 : 544-548(1979)]. 본 발명의 방법중 한가지 양태에 있어서는, 파지 람다 프로모터(phage lambda promotor)의 조절하에서 Δ7pGH(7개의 N-말단 아미노산이 적은 돼지의 성장호르몬과 메티오닌 및 세린)에 대해 코드화하는 제1플라스미드 pL-mu- Δ7 SGH 및 온도-감수성 람다 파지 억제 단백질에 대해 코드화된 제2플라스미드 pCI 857로 형질전환된 에쉐리키아 콜라이(E. Coli) 숙주 균주 HB 101에 의해 생산된 pGH-함유 봉입체를 사용한다. 또 다른 양태에서는, Δ9bGH(9개의 N-말단 아미노산이 적은 소의 성장호르몬과 메티오닌 및 세린)에 대해 코드화한 플라스미드 pL-mu-Δ9bGH 및 플라스미드 pCI 857로 형질전환된 이. 콜라이 숙주 균주 HB 101에 의해 생산된 bGH-함유 봉입체를 사용한다. 그러나, 본 발명의 방법은 어떠한 숙주/벡터 조합에 의해 생산된 재조합체 성장호르몬의 정제에도 동등하게 적용될 수 있지만, 단 성장호르몬은 숙주내에서 불용성 봉입체의 형태로 생산되어야 한다.
본 발명의 회수 및 정제과정을 이용하기 전에, 형질전환체 세포는 일반적으로 기계적 또는 효소적 방법으로 용해시켜 세포내에 고립되어 있는 봉입체를 회수한다. 봉입체는 원심분리하고 완충용액으로 세척하여 세포질 물질의 잔여부분의 벌크로부터 분리시킬 수 있다. 바람직하게는, 발효배지로부터 세포를 분리하여 수득한 세포 페이스트를, 수산화나트륨을 사용하여 pH 7.8로 조정한 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(20mM) 및 제1인산나트륨(100mM)를 함유하는 수성 완충용액중에 분산시킨다. 세포는 맨톤-가울린 균질화기(Manton-Gaulin homogenizer)와 같은 포페트-형 균질화기(poppet-type homogenizer)에 1회 또는 그 이상 통과시킴으로써 분해시켜 성장호르몬 봉입체를 유리시킨다. 성장호르몬 펠렛은 원심분리하여 용액의 기질 및 세포 잔유물의 일부로부터 분리한다. 수득된 펠렛은 EDTA-제1인산나트룸 완충용액(EDTA 10mM, NaH2PO40.2M, pH=7.5로 조절)중에 재현탁시켜 1회 또는 그 이상 세척하고, 원심분리시켜 세척액으로부터 분리시킨다. 수득한 세척된 펠렛은 수일내에 사용할 경우엔 약 4℃에서 저장하고, 후에 사용할 경우엔 냉동시킨다.
선행 기술에서 제시된 회수공정에서는 일반적으로 세척단계에서 세포 잔유물 및 오염 단백질을 최대한 제거하기 위하여 트리톤-엑스(Triton×-100)과 같은 세제, 2-머캅토 에탄올과 같은 환원제 및 라이소자임과 같은 효소를 사용하는 세척단계가 이용된다. 그러나 본 발명자들은 세척단계에서 이러한 시약의 사용이 불필요함을 확인하였다. 더우기, 세척단계에서 이러한 시약의 사용은 목적하는 단백질의 일부의 손실을 야기시키기 때문에 세척단계에서 이들을 배제하는 것이 유익하다. 비록, 세척단계에서의 이들 시약의 배제가 가용화 단계를 통해 일부 추가의 오염물질이 수반되는 것을 허용한다고 해도, 이들 오염물질중의 일부는 어떤 추가의 시약을 사용하지 않고서도 본 발명의 방법에서 후에 침전되는 것으로 밝혀졌다.
성장호르몬을 함유하는 봉입체는 가용화되고 단백질은 구아니딘염, 바람직하게는 구아니딘 하이드로클로라이드의 수용액으로 추출하여 변성시킨다. 강한 캐오트로프(chaotrope)인 구아니딘 하이드로클로라이드는 6 내지 8M의 농도에서 완전히, 그러나 가역적으로 단백질을 변성시킬 수 있다. 유익하게는, 존재 가능한 고분자량의 불순물을 제거하기 위하여, 본 발명의 방법에서 사용하기 전에 구아니딘 하이드로클로라이드 용액을 정제한다. 불순물은 한외여과에 의해, 또는 본 분야에서 공지된 그밖의 어떠한 적절한 정제방법에 의해 제거할 수 있다. 바람직하게는, 용액은 또한 약 20mM 내지 100mM 농도의 에탄올아민을 함유한다. 바람직하게는, 봉입체는 용액 ℓ당 약 1 내지 2.5g의 농도로 성장호르몬을 제공하기에 충분한 양으로 구아니딘 하이드로클로라이드 용액중에 용해시킨다. 그후 용액을 분자의 홀딩이 완전히 펴질 수 있는 충분한 시간동안 정치시킨다. 이를 위해서는 약 6 내지 약 36시간의 기간이 만족스러운 것으로 밝혀졌다.
성장호르몬이 가용화되고 변성된 후에, 용액중의 성장호르몬의 적어도 일부를 구아니딘 하이드로클로라이드를 변성제를 함유하지 않는 완충용액으로 대체시킴으로써 재생시킨다. 선행 기술분야에서는 용액중에 잔유하는 단백질의 양을 최대화하기 위해 변성제를 서서히 제거하도록 지시하고 있는 반면에, 본 발명에 있어서는 구아니딘염의 상당히 신속한 제거가 실제로 바람직한 것으로 밝혀졌는데, 이는 이러한 신속한 제거가 재생된 단백질 용액중에서, 크로마토그래피 컬럼을 오염시키는 경향이 있으며 생물학적 활성을 갖지 않는 가용성 단백질 응집체의 존재를 감소시키기 때문이다. 따라서, 구아니딘염은 약 10시간 미만의 시간에 걸쳐 제거하는 것이 바람직하다. 이온교환 크로마토그래피를 하기 전에, 침전물인 응집된 성장호르몬을 실질적으로 모두 제거하는 능력은 본 방법의 주요 이점이다.
구아니딘 하이드로클로라이드의 대체는 단백질 용액으로부터 소분자를 제거하기 위한 공지된 어떤 방법에 의해서도 수행될 수 있다. 바람직한 구아니딘 하이드로클로라이드 제거방법에는 다이아필트레이션(diafiltration) 및 투석방법이 있다. 본 발명에서는 로미콘사(Romicon, Inc.)의 시판 제품인 로미콘(Romicon) HF 4S와 같은 중공섬유 한외여과기(hollow fiber ultrafrltration unit)를 사용한다. 이 기기는 분자량 약 10,000 이하인 분자는 통과시키는 중공섬유 한외여과막을 사용한다. 한외여과막을 통한 성장호르몬 용액의 순환으로 성장호르몬은 저류되는 반면, 구아니딘 하이드로클로라이드 용액은 막을 통과하게 된다. 용액의 용적은 에탄올아민 약 60mM을 함유하며 pH가 9.0 내지 9.8로 조절된 희석용액을 공급함으로써 유지시킨다. 희석액의 공급량은 성장호르몬 용액의 용적당 약 5 내지 약 7용적이며, 공급속도는 시간당 약 0.5 내지 약 4용적이다. 따라서, 용액의 유속은 중공섬유 한외여과기의 막표면 10ft2상에서 시간당 약 120ℓ에 해당한다.
한편, 구아니딘-함유 용액은 구아니딘염의 농도가 성장호르몬의 재생이 이루어질 정도로 저하될 때까지 희석할 수 있다. 이것은 약 1M 이하의 구아니딘 농도에서 일어난다.
구아니딘 하이드로클로라이드가 용액으로부터 제거됨에 따라, 존재하는 일부 단백질성 오염물질 및 성장호르몬 응집체는 용액으로부터 침전된다. 침전물은 원심분리 및 여과와 같은 공지된 방법에 의해 용액으로부터 제거할 수 있다. 경우에 따라, 성장호르몬 용액은 원심분리 단계전에 한외여과에 의해 다소 농축시킬 수도 있다.
가용성인, 모노머성 성장호르몬을 함유하는 용액은 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 이온교환 크로마토그래피에는, DE-52 셀룰로우즈 이온교환 수지를 사용하는 파마시아(Pharmacia) 이온교환 컬럼과 같은 통상적인 장치를 이용한다. 용액을 컬럼에 충진시킨 후, 컬럼에 결합되지 않고 통과하는 분획중에서 정제된, 생물활성 성장호르몬을 수집한다.
이온교환 크로마토그래피에 의하여 회수된 성장호르몬, 한외여과에 의해 농축, 추가의 정제단계 및 경우에 따라서는 성장호르몬을 안정한 분말형태로 제공하는 동결건조와 같은 통상의 처리단계로 처리할 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명의 실시를 더욱 상세히 설명하고자 하는 것이다. 별도로 지시하지 않는한, 모든 백분율은 중량기준이며 모든 온도는 ℃이다.
[실시예 1]
본 실시예에서 사용되지 않는 돼지 성장호르몬(pGH)의 봉입체를 함유하는 형질전환 세포는 하기의 방법으로 제조한다 :
10%(v/v) 글리세롤을 가한 이. 콜라이 HB 101(pL-mu-Δ7SGH 및 pCI 857) 세포의 셈플(ATCC 53031)은 필요할 때까지 액체 질소하에 또는 -85℃에서 저장한다.
A. 접종
9ℓ 발효조에 충진하는 접종물은 500ml 플라스크중의 ESM-1또는 ESM-2 배지 200ml에 세포를 가하여 수득한다. 배지의 pH는 7.0으로 조정한다. 플라스크는 배지의 약간의 통기가 일어날 수 있도록 두장의 밀크 필터로 밀폐시키고 뉴 브른스윅크 회전 진탕기(New Brunswick Rotary Shaker)를 사용하여 30℃에서 16 내지 20시간 동안 300rpm으로 진탕시킨다.
* 미량 성분 용액 G/L : EDTA 5, FeCl3·6H2O 0.5, ZnO 0.05, CuCl2·2H2O 0.01, Co(NO3)2·6H2O 0.01, (NH4)2MoO40.01.
B. 발효조
발효조는 총 용적 16ℓ의 뉴 부른스윅크 마이크로겐(New Brunswick Microgen)이다. 우선 액체 배지 9ℓ를 발효조에 충진시키고 접종물 180ml를 가한다.
C. 발효배지
초기 배지 9ℓ의 조성은 아래에 기재하였다.
배지는 121℃에서 20분 동안 멸균시키고 NaOH를 사용하여 pH를 6.8로 조정한다.
배지 250mg에 각각 암피실린 및 카나마이신을 가한다. 항생제 용액은 여과하여 멸균한다.
D. 영양소 공급
유도기(즉, 온도를 42℃로 상승시켰을때)에, 발효배지에 영양소를 가한다. 물 약 1ℓ중의 NZ 아민A(효소성 카제인 가수분해물) 및 글리세롤 200g을 가한다. 유도기 5시간 후에 NZ 아민 A 100g 및 글리세롤 100g을 추가로 공급한다.
E. 발효조의 조작
최상의 결과를 제공하는 조작 조건은 하기와 같이 설정한다.
1. 성장기(16 내지 24시간)
a. 배지의 온도=28 내지 30℃
b. 교반기의 속도=1000RPM
c. 교반기에 의한 입력 에너지 : 1.0 내지 2.0마력/100갈론
d. 통기 속도 : 10ℓ(STP)/분
e. 배압(Back Pressure) : 5lbs/in2
f. 용존 산소 : 공기 포화치의 20% 이상
g. 발효배지에 의한 빛(파장 550nm)의 흡수 : A550
2. 유도기
a. 배지의 온도
(1) 유도의 첫시간 : 42℃
(2) 유도의 잔여시간 : 40℃
b. 교반기의 속도 : 1200RPM
c. 교반기에 의한 입력 에너지 : 0.5 내지 1.5마력/100갈론
d. 통기 속도 : 10ℓ(STP)/분
e. 배압(Back Pressure) : 3 내지 6lb/in2
f. 용존 산소 : 바람직하게는 공기포화치의 20% 이상. 이러한 값을 얻기 위해서는 유입 공기를 산소로 보충한다.
g. 최종 흡수율 : A550=118 내지 153
[이.콜라이 세포로부터 Δ7-pGH의 회수]
10ℓ 발효조에 대해 상술한 방법에 의하여 파일롯트 플랜트에서 생성된 발효육즙 200ℓ로부터 수득된 세포를 원심분리에 의해 육즙으로부터 분리하여, 수산화나트륨으로 pH를 7.8로 조정한, EDTA(20mM) 및 NaH2PO4(100mM)를 함유하는 완충용액 50ℓ에 재현탁시킨다. 세포를 파괴시키기 위하여 세포 현탁액을 8,000psig의 압력하에서 맨톤-가우린 균질화기(Manton-Gaulin homogenizer)에 2 내지 3회 통과시킨다. Δ7-pGH의 완전한 봉입체를 원심분리(13,000g, 10분간)하여 수집한 후 세포 잔유물로부터 분리한다. 그후 회수한 봉입체(7,000g)를 수산화나트륨으로 pH 7.5로 조절한, EDTA(10mM) 및 NaH2PO4(0.2M)를 함유하는 완충용액으로 세척한다. 원심분리하여 봉입체를 세척 완충용액으로부터 회수한 후, 수산화나트륨으로 pH 9.0으로 조절한, 구아니딘 하이드로클로라이드 8M과 에탄올아민 60mM의 용액 460ℓ에 용해시킨다. 용액을 12시간 동안 교반하여 pGH 분자의 홀딩이 완전히 펴지도록 한다.
구아니딘 하이드로클로라이드는 중공섬유 형태의 PM-10막을 통해 다이아필트레이션(diafiltration)에 의해 용액으로부터 제거한다. 막의 평균 공극 크기는 15Å이며, 이는 분자량이 10,000 또는 그 미만인 분자의 통과를 가능하게 한다. 용액으로부터 거의 모든 구아니딘 하이드로클로라이드가 제거된 후, 구아니딘 하이드로클로라이드의 제거에 의해 용액으로부터 침전되는 pGH 분자 응집체 및 단백질성 불순물을 제거하기 위하여 10분 동안 13,000g로 용액을 원심분리시킨다. 그후 pGH를 와트만(Whatman) DE-52 이온교환 겔(DEAE 셀룰로우즈)을 15cm까지 충전한 25cm 컬럼을 이용하여 이온교환 크로마토그래피하여 정제한다. 가용성의 재생된 pGH를 함유하는 용액을 컬럼에 충진시키고 컬럼과 결합하지 않고 통과하는 용출액중에서 pGH를 수집한다. 우레아를 사용하는 유사한 회수방법을 이용할 때에 이온교환 크로마토그래피중에 나타나는 컬럼의 오염 및 차단은 육안으로 관찰되지 않는다. 목적하는 순도에 도달되지 않으면 이온교환 크로마토그래피 단계를 반복 수행한다.
그후 pGH를 함유하는 용액을 PM-10 중공섬유막을 통한 한외여과에 의해 더 정제하여 pGH 0.2%를 함유하는 용액을 수득한다. 그후 저분자 오염물질은 코넬(Cornell) 완충용액에 대하여 한외여과함으로써 제거한다. 이 과정은, 처음에는 50% 코넬 완충용액(Na2CO311mM, NaHCO313mM)에 대하여, 두번째에는 2% 코넬 완충용액(Na2CO30.42mM, NaHCO30.50mM)에 대하여 수행한다. 그후 용액은 PM-10 중공섬유를 통한 한외여과에 의해 농축시켜 pGH 0.2 내지 2%를 함유하는 용액을 수득한다. 그후 용액을 원심분리하여 상동액은 0.2μ 공극 필터를 통해 여과한다. 그후 용액중의 pGH를 동결건조시켜 분말상태의 생물활성형 pGH로 수득된다.
[실시예 2]
본 실시예는 소의 성장호르몬(bGH)의 제조에 관한 것이다. 본 실시예에서 사용되는 형질전환 세포는 하기의 방법에 따라 제조된다.
4%(v/v) 글리세롤이 첨가된 이. 콜라이 HB 101(pL-mu-Δ9bGH 및 pCI 857) 세포의 샘플(ATCC 53030)은 필요할 때까지 액체 질소하에서 저장한다.
9ℓ 발효조에 충진하는 접종물은, 각각 LB 배지 200ml씩을 함유하는 2개의 500ml 조절 플라스크(baffled flask)에 세포를 가하여 수득한다. LB 배지는 다음의 조성으로 이루어진다 : 트립톤 10g/ℓ, 효모 추출물 5g/ℓ, NaCl 10g/ℓ, 암피실린 100μg/ml 및 카나마이신 50μg/ml. 배지의 pH는 7.0이 되도록 조정한다. 플라스크는 배지의 약간의 통기가 일어날 수 있도록 밀크 필터로 밀폐시키고, 뉴 부른스윅크 진탕기를 사용하여 30℃에서 15 내지 20시간 동안 200rpm으로 진탕한다.
발효조는 총 용적 16ℓ의 뉴 부른스윅크 마이크로겐이다. 액체 배지 9ℓ를 발효조에 처음 충진하고 접종물 400ml를 가한다. 접종물의 A550은 4 내지 6이다.
A. 발효배지
초기 배지 9ℓ의 조성은 하기에 기재하였다 :
배지는 15psig의 증기압력하에서 멸균(121℃, 15 내지 20분간)시키고 pH는 NaOH로 6.8이 되도록 조정한다.
항생제 암피실린 및 카나마이신을 각각 25mg/ℓ의 농도가 되기에 충분한 양으로 배지에 가한다. 항생제 용액은 여과하여 멸균시킨다.
발효과정중에, 발효조에 영양소를 3회 추가 공급한다. 첫번째 공급물(A550=30 내지 35일때)은 물 1ℓ중의 NZ 아민 A 250g 및 글리세롤 250g으로 구성된다. 이것은 온도유도 전에 세포의 밀도가 A550값 50 내지 60으로 증가하도록 한다. 50 내지 60의 세포 밀도에서(접종후, 23 내지 25시간 경과시), 발효조에 다시 NZ 아민 A 250g 및 글리세롤 250g을 공급하고, 1시간에 걸쳐 온도를 42℃로 상승시킴으로써 세균이 bGH를 합성하도록 유도한다. A550이 90 내지 100에 달했을때 NA 아민 A 125g 및 글리세롤 125g을 마지막으로 공급하여 이들 영양소가 잔여 유도기에서 이용될 수 있도록 한다.
B. 발효조의 조작
최상의 결과를 제공하는 조작 조건은 하기와 같이 설정한다.
1. 기간 : 0 내지 24시간
a. 배지의 온도=28℃
b. 교반기의 속도 : 1000RPM
c. 교반기에 의한 입력 에너지 : 0.5 내지 1.5마력/100갈론
d. 통기 속도 : 10ℓ(STP)/분
e. 배압(Back Pressure) :3lb/in2
f. 용존 산소 : 공기 포화치의 50%
g. 16시간 후에 추가 공급. A550=30 내지 35
h. 발효배지에 의한 빛(파장 550nm)의 흡수율. 유도기에서의 A550=50 내지 60/24시간
2. 기간 : 24 내지 32시간
a. 배지의 온도
(1) 24시간째부터 25시간째 까지의 온도 : 42℃
(2) 25시간째부터 32시간째 까지의 온도 : 40℃
b. 교반기의 속도 : 1200RPM
c. 교반기에 의한 입력 에너지 : 1.0 내지 2.0마력/100갈론
d. 통기 속도 : 10ℓ(STP)/분
e. 배압(Back Pressure) : 3 내지 6lb/in2
f. 용존 산소 : 공기 포화치의 10 내지 40%.
이 값을 얻기 위해서는, 유입공기는 산소로 보충시키고 발효조에 도입시키기 전에 주 스파저(Sparger)를 통해 혼합한다.
g. 최종 흡수율 : A550=100 내지 123
h. 24시간 및 29시간 경과시 추가공급
C. 결과
상술한 방법에 따른 전형적인 3회의 시험으로부터 얻은 결과는 다음과 같다.
9-ΔbGH에 대한 발효배지의 최종분석
분석방법 : 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
발현수준 : 세포당 Δ9-bGH 7×106분자
10ℓ 발효조 내에서 전술한 발효 조건을 사용하여 파일롯트 플랜트에서 소의 성장호르몬,
9-bGH을 대량 생산한다.
[이. 콜라이 세포로부터 Δ9-bGH의 회수]
10ℓ용 발효조를 사용하여 상술한 방법에 의해 파일롯트 플랜트에서 생산된 발효육즙 86ℓ로부터 수득한 세포를 원심분리하여 육즙으로부터 분리하고 수산화나트륨으로 pH 7.8로 조절한, EDTA(20mM) 및 NaH2PO4(100mM)를 함유하는 완충용액 50ℓ중에 재현탁시킨다. 세포를 파괴시키기 위하여, 세포 현탁액을 8,000psig의 압력하에서 맨톤-가우린 균질화기에 2 내지 3회 통과시킨다. 원심분리(13,000g, 10분간)하여 Δ9-bGH의 완전한 봉입체를 수집하고 세포 잔유물로부터 분리해낸다. 그후 회수된 봉입체(7,000g)를 수산화나트륨으로 pH 7.5로 조절한, EDTA(10mM) 및 NaH2PO4(0.2M)를 함유하는 완충용액으로 세척한다. 봉입체를 원심분리에 의해 세척 완충용액으로부터 회수하여, 수산화나트륨으로 pH 9.0으로 조절한, 구아니딘 하이드로클로라이드 8M 및 에탄올아민 60mM의 용액 200ℓ중에 용해시킨다. 용액을 12시간 동안 교반하여 pGH 분자의 홀딩이 완전히 펴지도록 한다.
구아니딘 하이드로클로라이드는 중공섬유 형태의 PM-10막을 통해 다이아필트레이션하여 용액으로부터 제거한다. 막의 평균 공극(poer) 크기는 15Å인데, 이는 분자량이 10,000 또는 그 미만인 분자의 통과를 가능하게 한다. 용액으로부터 모든 구아니딘 하이드로클로라이드를 제거한 후, 구아니딘 하이드로클로라이드의 제거에 따라 용액으로부터 침전하는 bGH 분자 응집체 및 단백질성 불순물을 제거하기 위하여 10분동안 13,000g으로 용액을 원심분리한다. 그후 pGH를 와트만 DE-52 이온교환 겔(DEAE 셀룰로우즈)를 15cm까지 충전한 25cm 컬럼을 이용하여 이온교환 크로마토그래피 정제한다. 가용성의 재생 bGH를 함유하는 용액을 컬럼에 충진시키고, 컬럼과 결합하지 않고 통과하는 유출액중에서 bGH를 수집한다. 우레아를 사용하는 회수 방법을 이용하는 경우에 이온교환 크로마토그래피 과정중에 관찰되는 컬럼의 오염 및 차단은 육안으로 관찰되지 않는다. 목적하는 순도에 도달되지 않았으면 이온교환 크로마토그래피 단계를 반복 수행한다.
그후 bGH를 함유하는 용액을 PM-10 중공섬유막을 통한 한외여과에 의해 더 정제하여 0.2%의 bGH를 함유하는 용액을 수득한다. 그후 저분자량 오염물은 코넬(Cornell) 완충용액에 대하여 한외여과함으로써 제거한다. 이 과정은, 처음에는 50% 코넬 완충용액에 대하여, 두번째는 2%의 코넬 완충용액에 대하여 수행한다. 용액은 PM-10 중공섬유를 통한 한외여과에 의해 농축시켜 0.2 내지 2%의 bGH를 함유하는 용액을 수득한다. 그후 용액을 원심분리하고 상등액은 0.2μ 공극 필터를 통해 여과한다. 용액중의 bGH는 동결건조하여 분말상태의 생물활성형 bGH로 수득된다.
Claims (12)
- 불용성 봉입체를 구아니딘염 용액으로 추출하여 성장호르몬을 가용화 및 변성시키고 ;구아니딘염 용액을, 중간 변성제의 사용없이, 변성제를 함유하지 않는 완충용액으로 대체시켜 용약중에서 성장호르몬의 적어도 일부분을 재생시키고 ;변성제를 함유하지 않는 완충용액으로부터 침전된 오염물질 및 응집체를 제거하고 ; 이온교환 크로마토그래피에 의해 용액중의 모노머성 성장호르몬을 정제하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하여, 미생물 내에서 이종 유전자의 발현에 의하여 생산된 불용성 봉입체로부터 생물학적으로 활성인 모노머성 성장호르몬을 회수 및 정제하는 방법.
- 제1항에 있어서, 구아니딘염이 구아니딘 하이드로클로라이드인 방법.
- 제2항에 있어서, 구아니딘 하이드로클로라이드 용액의 농도가 약 6M 내지 약 8M인 방법.
- 제3항에 있어서, 구아니딘 하이드로클로라이드 용액이 또한 약 20mM 내지 100mM의 에탄올아민을 함유하는 방법.
- 제4항에 있어서, 봉입체를 ℓ당 약 1내지 약2.5g의 성장호르몬 농도를 제공하기에 충분한 양으로 구아니딘 하이드로클로라이드 용액중에 용해시키는 방법.
- 제2항에 있어서, 구아니딘 하이드로클로라이드중의 성장호르몬의 용액을 재생시키기 전에 약 6 내지 약 36시간의 기간동안 정치하는 방법.
- 제2항에 있어서, 구아니딘염을 다이아필트레이션(diafiltration) 또는 투석에 의해 제거하는 방법.
- 제2항에 있어서, 구아니딘염을 약 10시간 미만의 기간에 걸쳐 제거하는 방법.
- 제2항에 있어서, 성장호르몬이 돼지의 성장호르몬 또는 이들의 생물학적 활성 단편, 또는 동족체인 방법.
- 제2항에 있어서, 성장호르몬이 소의 성장호르몬 또는 이들의 생물학적 활성 단편, 또는 동족체인 방법.
- 제2항에 있어서, 봉입체를 가용화시키기 전에, 세제, 환원제 및 효소를 함유하지 않는 완충용액으로 봉입체를 세척하는 방법.
- 제11항에 있어서, 봉입체를 세척하는 용액이 에틸렌디아민테트라아세트산 및 제1인산나트륨을 함유하는 방법.
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