CN116063561A - 一种重组μ-芋螺毒肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种重组μ‑芋螺毒肽及其制备方法，其中重组μ‑芋螺毒肽包括芋螺毒肽氨基酸序列和类固醇异构酶序列；芋螺毒肽制备步骤包括三步，分别是菌株的构建与试表达，菌株的发酵培养，蛋白的分离纯化。本发明中芋螺毒肽表达量可实现1.47g/L，提高了240倍；所制备的μ‑芋螺毒肽经细胞毒性测试显示毒性低于市售的芋螺毒肽，其细胞增值率提高20%左右；本发明制备的μ‑芋螺毒肽用作化妆品原料，可提高皮肤光亮度、淡化眼角皱纹、收缩毛孔，具有明显的功效活性。

Description

一种重组μ-芋螺毒肽及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组μ-芋螺毒肽及其制备方法。
背景技术
芋螺毒素(conotoxin或conopeptide或CTX)，由海洋腹足纲软体动物芋螺(Conus)的毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，由许多单一毒肽组成的混合毒素，主要成分是一些对不同离子通道及神经受体高度专一性的活性多肽化合物。芋螺毒素多数由10-40个氨基酸残基组成，富含两对或三对二硫键，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽，可作用于各种离子通道和受体的类型及亚型。与其他天然肽类毒素相比，芋螺毒素具有相对分子质量小、结构稳定、高活性、高选择性等突出优点。
根据芋螺毒素基因及其前体蛋白信号肽的保守性，可将芋螺毒素分为A、O、T、M、P、I等多个超家族。α、αA、κA属于A-超家族，ω、δ、κ、μO属于O-超家族，μ、ψ、ΚM属于M-超家族。天然的μ-芋螺毒肽是由22个氨基酸构成，分子中有三对二硫键，其连接方式为Cys13-Cys15、Cys4-Cys21、 Cys10-Cys22，其结构高度折叠，穿透力强，具有强效的抑制肌肉收缩的作用，因此具有迅速即时祛皱效果。
目前，制备芋螺毒素的方法主要有天然提取和人工化学合成。通过天然芋螺毒管中直接提取，这种方法获取的产量非常少，而且由于海洋生态的破坏使得野生芋螺数量急剧减少，使用该方法会进一步加剧芋螺资源恶化，因此采用天然分离提取获得芋螺毒素用于研究和工业化生产使用并不现实。人工化学合成的方法，即采用分离天然芋螺毒素后测序获得芋螺毒素序列，然后采用人工化学合成获得更多量的芋螺毒素。由于天然芋螺毒素含有特定的二硫键连接方式，因此如何合成特定二硫键连接方式的多肽成为合成中最大的难题，也成为限制获得大量天然芋螺毒素的关键因素。
随着生物技术的发展，采用基因工程的方法，将芋螺毒素的基因转化到微生物中使其表达，后期再进行分离纯化，可望生产出大量高性价比的重组芋螺毒素。但芋螺毒肽作为毒性蛋白，其在大肠杆菌表达的同时会影响宿主菌株的生长繁殖，使其表达产量降低，无法满足工业化生产。同时因芋螺毒素毒性较高，其安全性无法满足医药、化妆品领域的实际应用。如何生产出产量高且毒性低的芋螺毒素成为现阶段亟需解决的问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种重组μ-芋螺毒肽及其制备方法，以解决重组μ-芋螺毒肽在大肠杆菌中表达产量低、活性低、毒性高的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明的一种重组μ-芋螺毒肽的制备及其应用的具体技术方案如下：
一种重组μ-芋螺毒肽，包括如下氨基酸序列：（Ⅰ）芋螺毒肽氨基酸序列；（Ⅱ）类固醇异构酶序列；
优选地，所述的（Ⅰ）μ-芋螺毒肽（μ-CTX）氨基酸序列如SEQ NO 1所示；
优选地，所述的（Ⅱ）类固醇异构酶（KSI）氨基酸序列如SEQ NO 2所示；
优选地，所述的μ-芋螺毒肽（μ-CTX）融合类固醇异构酶（KSI）以及纯化标签（6×His）、酶切位点（肠激酶酶切位点）的HIS-KSI-μ-CTX氨基酸序列如SEQ NO 3所示。
本发明的第二发明目的是提供一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，步骤如下：
步骤一，菌株的构建与试表达；
步骤二，菌株的发酵培养；
步骤三，蛋白的分离纯化。
其中，步骤一菌株的构建与试表达包括如下过程： A1基因的设计与合成，
A2载体的单酶切，
A3基因片段与载体片段连接，
A4连接产物转化至DH5α感受态细胞中，
A5菌落鉴定，
A6鉴定菌落的质粒提取，
A7质粒转化至表达菌株感受态细胞中，
A8表达菌株在试管中的小试培养，
A9试管培养菌体的试表达验证；
优选的，步骤A2中所述的载体为pET-28载体；
优选的，步骤A2中所述单酶切所使用内切酶为NcoI；
优选的，步骤A7中所述的表达菌株感受态细胞为ER2566。
步骤二，菌株的发酵培养包括如下过程： B1发酵种子的培养，
B2种子转接至发酵罐培养基中，
B3培养至对数期进行IPTG诱导表达，
B4继续培养4小时，离心收集菌体；
优选的，B3中所述的IPTG诱导浓度为1-2mM。
第三步，蛋白的分离纯化包括如下过程：
C 1菌体均质破碎，
C2梯度离心法，收集包涵体，并进行包涵体洗涤，
C3包涵体复溶，变性条件下NI柱亲和层析，
C4纯化后的蛋白梯度去除变性剂，进行蛋白复性，
C5复性后的蛋白进行肠激酶酶切，切除KSI融合标签，
C6切除后的蛋白进行NI柱亲和层析进一步纯化，收集未结合NI柱部分即为μ-CTX蛋白，
C7置换蛋白缓冲液。
优选的，C3中包涵体复溶buffer与破碎菌体比例为5-10:1（v：g）；
优选的，C4中所述的复性方法为梯度透析，其中使用buffer分别为50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，4M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，2M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，pH=8.0；25mM Tris，pH=8.0。或者为50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，4M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，0.5mM GSH，0.1mM GSSG，2M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，0.5mM GSH，0.1mM GSSG，pH=8.0；25mM Tris，pH=8.0；
优选的，C5中肠激酶酶切条件为1U的肠激酶酶切50ug蛋白，于16度条件下酶切24小时或者为1U的肠激酶酶切50ug蛋白，于4度条件下酶切72小时；
优选的，C7中所述的置换方法为使用G25脱盐层析置换缓冲液为25mM PB，pH=7.4或者为透析的方法，使用截留分子量为1KD的透析袋进行透析置换为25mM PB，pH=7.4。
本发明的一种重组μ-芋螺毒肽及其制备方法具有以下优势：
（1）芋螺毒肽因其本身为毒性蛋白质。在采用异源表达时常常会因为其自身的生物活性导致异源表达的宿主菌株生长繁殖受到影响，降低表达产量。本发明中将μ-芋螺毒肽（μ-CTX）融合类固醇异构酶标签（KSI），具有促进蛋白质形成包涵体的作用与功能，减少对宿主菌株的毒性，从而不影响宿主菌株大肠杆菌的生长繁殖，显著提高μ-CTX的表达产量。文献报道，通过改造pET22b(+)载体成功实现了芋螺毒素It7a在大肠杆菌中可溶表达，但表达量只有6mg/L。本发明中μ-CTX表达量可实现1.47g/L，提高了240倍。
（2）本发明中将μ-芋螺毒肽融合KSI标签使其包涵体表达后，经分离纯化、复性后，再将KSI标签使用肠激酶切割分离后，所制备的μ-芋螺毒肽经细胞毒性测试显示毒性低于市售的芋螺毒肽，其细胞增值率提高20%左右。
（3）本发明制备的μ-芋螺毒肽用作化妆品原料，可提高皮肤光亮度、淡化眼角皱纹、收缩毛孔，具有明显的功效活性。
（4）将μ-芋螺毒肽融合KSI标签进行包涵体表达，经过分离纯化后，需切除KSI融合标签。目前KSI融合标签切割的方法常为化学方法，采用溴化氰在黑暗的环境中进行KSI标签的切割。但是溴化氰是一种有毒的化学试剂，人吸入的最小中毒浓度为5ppm。液态的溴化氰可引起皮肤、粘膜的刺激或灼伤。长期低浓度接触可引起呼吸道刺激症状和消化功能障碍。本发明中在基因工程设计时，在μ-芋螺毒肽融合KSI标签时添加肠激酶酶切位点，在蛋白质分离纯化后，采用肠激酶进行KSI标签的酶切，该方法在实验操作时更加安全，同时减少环境污染，更加方便简单。
附图说明
图1为芋螺毒肽制备工艺流程图；
图2为芋螺毒肽分子构建结构示意图；
图3为芋螺毒肽试管小试表达SDS-PAGE电泳图：泳道1为marker，泳道2为诱导前总蛋白，泳道3为诱导后总蛋白，泳道4为诱导后上清蛋白，泳道5为诱导后包涵体蛋白（15ul上样）；
图4为芋螺毒肽NI柱纯化各组分SDS-PAGE电泳图：泳道1为marker，泳道2为包涵体复溶蛋白，泳道3为NI柱纯化流穿组分，泳道4为NI 柱纯化50mM imidazole洗脱组分，泳道5为NI 柱纯化100mM imidazole洗脱组分，泳道6为NI 柱纯化250mM imidazole洗脱组分，泳道7为NI 柱纯化500mM imidazole洗脱组分（15ul上样）；
图5为芋螺毒肽肠激酶酶切前后各组分SDS-PAGE电泳图：泳道1为marker，泳道2肠激酶酶切前组分，泳道3为肠激酶酶切后组分（15ul上样）；
图6为纯化后的μ-芋螺毒肽（μ-CTX）SDS-PAGE电泳银染染色结果图：泳道1为marker，泳道2为纯化后的μ-芋螺毒肽，泳道3为市售的μ-芋螺毒肽（5ul上样）。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。
本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排他性的包括。例如，包括所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明实施例所用的试剂盒仪器均为市售产品。
本发明中μ-芋螺毒肽毒性测试采用细胞MTT法：采用成纤维细胞L929(小鼠成纤维细胞)进行毒性测试。使用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液将培养的成纤维细胞L929(小鼠成纤维细胞)稀释配成6×103/mL的单细胞悬液。96孔培养板每孔接种100μL的细胞悬浮液，置含体积分数为5％CO2培养箱中，37℃培养24h，弃去原培养液，每孔分别加入实验组、阴性对照组(单纯细胞培养液)和阳性对照组(4％DMSO)，每组8孔；将培养板移入37℃、体积分数5%CO2培养箱中，培养48h取出培养板，每孔再加入MTT(噻唑蓝) 250μL，继续在37℃条件下培养2h，弃原培养液，立即加入二甲基亚砜，每孔150μL，室温放置并轻轻震荡10～15min；选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(A)，并计算细胞相对增殖率RGR(%)＝(实验组吸收值/阴性对照组吸收值)×100％。
本发明中蛋白浓度的定量采用bradford法：配制1mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）母液，向母液中加入蒸馏水配制一组组分浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4mg/ml的BSA溶液。加入各组分体积，反应10min后，使用紫外分光光度计检测各样品在595nm的吸光值，制作标准曲线。准备待测样品，加入测试样品各组分体积，10min后，使用紫外分光光度计检测各样品在595nm的吸光值，根据标准曲线以及测试样品吸光值，计算测试样品蛋白质浓度。
本发明中μ-芋螺毒肽活性测试采用化妆品功效测试的方法：将μ-芋螺毒肽（μ-CTX）制备为化妆品原料。使用含μ-芋螺毒肽制备化妆品喷雾，并招募志愿者进行测试使用，使用产品后的1天，7天，14天，28天对其面部图像进行采集（CANFIELD，VISIA-CR；图像处理增强分析系统 Image-Pro® Plus Chinese Version 7.0.1），并对其面部图像分析L值（反应皮肤光亮度）、眼角皱纹及脸颊毛孔等变化值进行分析。
实施例1：
本实施例1工艺路线如图1所示。
1. pET-28a-His-KSI-μ-CTX-ER2566菌株的构建与试表达
（1）基因的设计与合成：
人工设计并合成His-KSI-μ-CTX的核苷酸序列如SEQ NO 4所示，其分子构建设计思路如图2所示。从pUC19-KSI-μ-CTX质粒上扩增KSI-μ-CTX片段，其PCR反应体系如表1所示，PCR反应程序如表2所示。对扩增的KSI-μ-CTX片段进行凝胶电泳检测，使用TIANGEN的普通DNA产物纯化试剂盒对目的片段进行纯化，实验操作按照说明书指导进行，纯化后使用NanoDrop对片段进行浓度测定。
（2）pET-28a载体的酶切
利用NcoI内切酶对pET-28a载体进行酶切如表3所示。
（3）基因片段与载体片段连接：酶切后的pET-28a载体片段与基因片段KSI-μ-CTX按照Gibson Method法对目的片段及载体骨架进行连接，如表4所示。
（4）连接产物转化至DH5α细胞中
取40ul感受态细胞DH5α置于冰浴中，待感受态细胞融化后，在40ul感受态细胞悬液中加入10ul 的连接产物，轻轻混合均匀后，冰上放置30min后，于42度水浴中热击60秒。热击停止后，立即置于冰上2min。向热击后的液体中加入1ml LB 液体培养基，37度，200rpm，摇床培养1h，使菌体恢复正常生长状态后，取200ul涂布于含有50ng/ml卡那霉素的LB平板上，37度培养箱倒置培养过夜。
（5）菌落鉴定
分别挑取pET-28a-His-KSI-μ-CTX平板上的单菌落，转接到新的LB(Kan)平板上，做cPCR，其中cPCR体系如表5所示，cPCR反应程序如表6所示，每平板挑取8个克隆。
（6）鉴定菌落的质粒提取
转接克隆正确的pET-28a-His-KSI-μ-CTX至7mL的LB(Kan)试管，37℃摇床培养过夜，进行质粒提取，使用TIANGEN的质粒小提试剂盒，实验操作按照说明书指导进行，提取质粒后取10μl样品送测序鉴定。
（7）pET-28a-His-KSI-μ-CTX质粒转化至ER2566感受态细胞中
取100ul感受态细胞ER2566置于冰浴中，待感受态细胞融化后，在100ul感受态细胞悬液中加入2ul 经鉴定成功的pET-28a-His-KSI-μ-CTX质粒，轻轻混合均匀后，冰上放置30min后，于42度水浴中热击60秒。热击停止后，立即置于冰上2min。向热击后的液体中加入1ml LB 液体培养基，37度，200rpm，摇床培养1h，使菌体恢复正常生长状态后，取200ul涂布于含有50ng/ml卡那霉素的LB平板上，37度培养箱中过夜培养，在含有卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆菌。
（8）pET-28a-His-KSI-μ-CTX-ER2566在试管中的培养
挑取在含有卡那霉素的LB平板上的阳性克隆菌接种于10mL含50ug/ml的卡那霉素的培养液中，37度，200rpm摇床进行培养，培养至对数生长期即OD600为0.6-0.8时，记录OD600数值，取部分样品，5000r/min离心5min收集菌体，为诱导前菌体。剩余菌液加入IPTG使其终浓度为1mM，随后37度诱导表达4h，记录OD600数值，所得菌体为诱导后菌体。发酵结束后，5000r/min离心5min收集菌体。
（9）pET-28a-His-KSI-μ-CTX-ER2566试管培养菌体的试表达验证
对步骤（8）所得到诱导前与诱导后的菌体根据取样时的OD值计算加入25mM Tris，pH=8.0的缓冲液，使其复溶后均为10 OD/ml，重悬后，冰浴条件下进行超声破碎，超声破碎条件为超声工作1s，停2s，共计5min，破碎后分别取样诱导前全菌样品，诱导后全菌样品，诱导后上清样品，诱导后包涵体样品。所有样品各取20ul与5ul loading dye于95度条件下加热5min。配制15% SDS-PAGE分离胶和5% SDS-PAGE浓缩胶，以上样品各自取10ul上样，200V电泳50min。电泳结束后，使用考马斯亮蓝于染色摇床上染色约1h，取出染色液，加入100ml脱色液，于脱色摇床上脱色1h，观察25-35KDa处有明显条带，如图3所示。
2. pET-28a-His-KSI-μ-CTX-ER2566菌株的发酵培养
将在含有卡那霉素的LB平板上的阳性克隆菌接种于1L含50ug/ml的卡那霉素的培养液中进行发酵培养，37度，200rpm摇床过夜培养。第二天将过夜培养的种子液加入已灭菌的10L发酵罐培养基中进行培养，培养至对数生长期即OD600为0.6-0.8时，加入IPTG使其终浓度为1mM，随后37度继续诱导表达4h。发酵结束后，5000r/min离心10min收集菌体。
3. 蛋白的分离纯化
（1）His-KSI-μ-CTX菌体均质破碎。
步骤2发酵所得菌体取30g加入300ml 的20mM PB，500mM NaCl，5%甘油，0.05%Tween-20，1mM DTT，pH=8.0 缓冲液，重悬后，于4度条件下均质破碎3遍，300bar 1遍，900bar 2遍，得到破碎菌液。
（2）梯度离心法，收集包涵体，并进行包涵体洗涤。
破碎后的菌体4000g×20min×4℃离心，弃沉淀，上清14000g×20min×4℃离心，弃上清，收集包涵体。包涵体使用300ml 的20mM PB，500mM NaCl，5%甘油，0.05% Tween-20，1mM DTT，1M urea，pH=8.0 缓冲液清洗两遍。
（3）包涵体复溶，变性条件下NI柱亲和层析。
包涵体使用150ml 的50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，8M urea，pH=8.0的缓冲液进行过夜溶解。溶解后的样品离心，上清0.45um膜过滤后进行NI柱亲和层析纯化，层析镍柱使用150ml 的50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，8M urea，pH=8.0的缓冲液平衡后，上样，再平衡，分别使用含50mM 、100mM、250mM、500mM咪唑的50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，8Murea，pH=8.0的缓冲液进行洗脱，各洗脱组分如图4所示。
（4）纯化后的蛋白梯度去除变性剂，进行蛋白复性。
经步骤（3）得到的目的组分，进行梯度复性透析，将蛋白于50mM Tris，300mMNaCl，1mM DTT，4M urea，pH=8.0的buffer中四度透析8h，取出透析蛋白于50mM Tris，300mMNaCl，1mM DTT，2M urea，pH=8.0的buffer中四度透析8h，然后再将蛋白于四度条件下在50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，pH=8.0的buffer中透析8h，最终将蛋白于25mM Tris，pH=8.0的buffer中透析8h，完成复性，并使用Bradford法进行蛋白定量。
（5）复性后的蛋白进行肠激酶酶切，切除KSI融合标签。
经步骤（4）得到的蛋白组分，加入肠激酶，进行酶切，酶切反应按照1U的肠激酶酶切50ug His-KSI-μ-CTX于16度条件下酶切24小时，分别于酶切前于酶切后取蛋白样品。其酶切效果如图5所示。
（6）切除后的蛋白进行NI柱亲和层析进一步纯化，收集未结合部分即为μ-CTX蛋白。
步骤（5）酶切所得到的His-KSI和μ-CTX混合蛋白进行NI柱亲和层析纯化，层析镍柱使用25mM Tris，pH=8.0平衡后，上样，再使用25mM Tris，pH=8.0平衡，使用含25mM Tris，500mM imidazole，pH=8.0缓冲液洗脱杂蛋白。μ-CTX为NI柱亲和层析柱流穿部分。其结果如图6所示。
（7）G25脱盐置换为保存缓冲液。
将步骤（6）所得的μ-CTX进行G25纯化，其中平衡以及洗脱缓冲液为25mM PB，pH=7.4。
实施例2：
在实施例1的基础上，其中蛋白的分离纯化中的步骤（4）纯化后的蛋白梯度去除变性剂，进行蛋白复性，具体步骤为经步骤（3）得到的目的组分，进行梯度复性透析，将蛋白于50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，4M urea，pH=8.0的buffer中四度透析8h，取出透析蛋白于50mM Tris，300mM NaCl，0.5mM GSH，0.1mM GSSG，2M urea，pH=8.0的buffer中四度透析8h，然后再将蛋白于四度条件下在50mM Tris，300mM NaCl，0.5mM GSH，0.1mM GSSG，pH=8.0的buffer中透析8h，最终将蛋白于25mM Tris，pH=8.0的buffer中四度透析8h，完成复性，并使用Bradford法进行蛋白定量。
实施例3：
在实施例1的基础上，其中蛋白的分离纯化中的步骤（3）包涵体复溶，变性条件下NI柱亲和层析，具体方法为包涵体使用300ml 的50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，8Murea，pH=8.0的缓冲液进行过夜溶解。溶解后的样品离心，上清0.45um膜过滤后进行NI柱亲和层析纯化，层析镍柱使用50ml 的50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，8M urea，pH=8.0的缓冲液平衡后，上样，再平衡，分别使用含50mM 、100mM、250mM、500mM咪唑的50mM Tris，300mMNaCl，1mM DTT，8M urea，pH=8.0的缓冲液进行洗脱。
实施例4：
在实施例1的基础上，其中蛋白的分离纯化中的步骤（5）复性后的蛋白进行肠激酶酶切，切除KSI融合标签，具体方法为经步骤（4）得到的蛋白组分，加入肠激酶，进行酶切，酶切反应按照1U的肠激酶酶切50ug His-KSI-μ-CTX于4度条件下酶切72小时。
试验例1在本发明的基础上，使用Bradford法进行μ-CTX，根据测试结果以评估本发明制备方法产量。对比例1在本发明的基础上，测试本发明制备的μ-CTX与市售芋螺毒肽的细胞增值率。以评估μ-CTX的细胞毒性。对比例2在本发明的基础上，制备含μ-CTX和不含μ-CTX的化妆品喷雾，以评估μ-CTX的功效活性。
试验例1
（1）配制1mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）母液，向母液中加入蒸馏水配制一组组分浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4mg/ml的BSA溶液。按照表7加入各组分体积，反应10min后，使用紫外分光光度计检测各样品在595nm的吸光值，制作标准曲线。
（2）对实施例1中所制备的μ-芋螺毒肽进行浓度测定，加入测试μ-芋螺毒肽各组分如表7所示体积，10min后，使用紫外分光光度计检测各样品在595nm的吸光值，根据标准曲线以及测试样品吸光值，计算各待测样品蛋白质浓度。
（3）计算实施例1中μ-芋螺毒肽的产量。结果如表7所示。
对比例1
（1）将实施例1中所制备的μ-芋螺毒肽与市售的μ-芋螺毒肽分别使用Bradford法进行蛋白浓度测试，并将其分别稀释为0.2、0.1、0.05mg/ml;
（2）使用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液将培养的成纤维细胞L929(小鼠成纤维细胞)稀释配成6×103/mL的单细胞悬液。96孔培养板每孔接种100μL的细胞悬浮液，置含体积分数为5％ CO2培养箱中，37℃培养24h;
（3）弃去原培养液，每孔分别加入不同浓度的本发明制备的μ-芋螺毒肽组溶液、市售μ-芋螺毒素组溶液、阴性对照组(单纯细胞培养液)和阳性对照组(4％DMSO)，每组8孔；将培养板移入37℃、体积分数5％CO2培养箱中，培养48h取出培养板，每孔再加入MTT(噻唑蓝)250μL，继续在37℃条件下培养2h，弃原培养液，立即加入二甲基亚砜，每孔150μL，室温放置并轻轻震荡10～15min；选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(A)，并计算细胞相对增殖率RGR(％)＝(实验组吸收值/阴性对照组吸收值)×100％，其结果如表8所示。
对比例2
（1）别称取重组μ-芋螺毒肽（μ-CTX）500mg，1，2-戊二醇100g，丁二醇300g，己二醇5g，辛甘醇5g，加水补至1000g；于室温环境充分搅拌均匀即可；保存在4℃冰箱备用;
（2）含重组μ-芋螺毒肽（μ-CTX）护肤品水喷雾制备：按照以下质量分别称取：步骤（1）所得的护肤品原料50g，丙二醇10g，苯氧乙醇6g，乙基己基甘油0.7g，乙氧基二甘醇5g ，加水补至1000g。于室温环境，充分搅拌均匀即可，灌入喷雾瓶中;
（3）含重组μ-芋螺毒肽（μ-CTX）水喷雾的功效测试：招募7名年龄为25-55岁，身体健康，且在测试前无使用药品以及手术等情况。每天分别于8点，10点，12点，14点，16点，20点按压泵头5下让水雾均匀喷洒与面部，其他日常的护肤品使用实验制备的无任何功效物质的简单乳液。在使用产品之前作为0天，使用产品后的1天，7天，14天，28天对其面部图像进行采集（CANFIELD，VISIA-CR；图像处理增强分析系统 Image-Pro® Plus ChineseVersion 7.0.1）,并对其面部图像分析L值（反应皮肤光亮度）、眼角皱纹及脸颊毛孔等变化值进行分析。其中3人使用的测试样不含μ-CTX所得的护肤品原料作为对照数据，其测试结果如表9所示。
实验结果表明，试验例1中测试实施例1中制备的μ-CTX蛋白浓度为0.7mg/ml，共制备2100ml，所得产量为1.47g/L(蛋白重量/1L发酵液)。结果如表7所示。相比文献报道，通过改造pET22b(+)载体进行芋螺毒素It7a在大肠杆菌中表达量6mg/L提高了240倍。
对比例1将本发明中制备的μ-芋螺毒肽与市售的μ-芋螺毒肽进行细胞毒性实验，结果显示本发明所制备的μ-芋螺毒肽毒性低于市售的芋螺毒肽，其细胞增值率提高20%左右，结果如表8所示。
对比例2将本发明中制备的μ-芋螺毒肽制备为化妆品原料，并以此原料制备化妆品喷雾，将含有μ-芋螺毒肽与不含μ-芋螺毒肽的化妆品喷雾分别进行功效测试，结果显示，用含有重组μ-芋螺毒肽（μ-CTX）在L值提高率即皮肤光亮度、淡化眼角皱纹即抗皱、毛孔缩小率即紧致三个皮肤功效的维度均有效果，且随着使用时间的延长，功效作用具有累计效果。三个功效维度中抗皱效果即淡化眼周细纹的能力最强，结果如表9所示。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (9)

1.一种重组μ-芋螺毒肽，其特征在于，包括如下氨基酸序列：（Ⅰ）芋螺毒肽氨基酸序列；（Ⅱ）类固醇异构酶序列。
2.根据权利要求1所述的一种重组μ-芋螺毒肽，其特征在于，所述的（Ⅰ）μ-芋螺毒肽（μ-CTX）氨基酸序列如SEQ NO 1所示，所述的（Ⅱ）类固醇异构酶（KSI）氨基酸序列如SEQ NO 2所示，所述的μ-芋螺毒肽（μ-CTX）融合类固醇异构酶（KSI）以及纯化标签（6×His）、酶切位点（肠激酶酶切位点）的HIS-KSI-μ-CTX氨基酸序列如SEQ NO 3所示。
3.根据权利要求1所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：步骤一，菌株的构建与试表达；步骤二，菌株的发酵培养；步骤三，蛋白的分离纯化。
4.根据权利要求3所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，步骤一包括如下过程：
A1基因的设计与合成;A2载体的单酶切;A3基因片段与载体片段连接;A4连接产物转化至DH5α感受态细胞中;A5菌落鉴定;A6鉴定菌落的质粒提取;A7质粒转化至表达菌株感受态细胞中;A8表达菌株在试管中的小试培养;A9试管培养菌体的试表达验证;
步骤二包括如下过程：
B1发酵种子的培养;B2种子转接至发酵罐培养基中;B3培养至对数期进行IPTG诱导表达;B4继续培养4小时，离心收集菌体;
步骤三包括如下过程：
C 1菌体均质破碎;C2梯度离心法，收集包涵体，并进行包涵体洗涤;C3包涵体复溶，变性条件下NI柱亲和层析;C4纯化后的蛋白梯度去除变性剂，进行蛋白复性;C5复性后的蛋白进行肠激酶酶切，切除KSI融合标签;C6切除后的蛋白进行NI柱亲和层析进一步纯化，收集未结合NI柱部分即为μ-CTX蛋白;C7置换蛋白缓冲液。
5.根据权利要求4所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，A2中所述的载体为pET-28载体。
6.根据权利要求4所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，A7中所述的表达菌株感受态细胞为ER2566。
7.根据权利要求4所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，B4中所述的IPTG诱导浓度为1-2mM。
8.根据权利要求4所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，C4中所述的复性方法为梯度透析，其中使用buffer分别为50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，4M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，2M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，pH=8.0；25mM Tris，pH=8.0；或者为50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，4M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，0.5mM GSH，0.1mM GSSG，2M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mMNaCl，0.5mM GSH，0.1mM GSSG，pH=8.0；25mM Tris，pH=8.0。
9.根据权利要求4所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，C5中肠激酶酶切条件为1U的肠激酶酶切50ug蛋白，于16度条件下酶切24小时或者为1U的肠激酶酶切50ug蛋白，于4度条件下酶切72小时。
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