CN107746432A - 一种Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法 - Google Patents

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    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Abstract

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种Aβ42修饰蛋白及其在大肠杆菌中的表达及纯化方法。本发明构建的Aβ42表达体系提供了原核生物表达人淀粉样蛋白Aβ42表达载体的构建方法，并将表达载体导入至大肠杆菌表达宿主中，经诱导表达、两步纯化及鉴定后获得具有高纯度生物活性的目标Aβ42‑His蛋白。本方法所采用的大肠表达系统，具有表达效率高、表达量大、成本低、易操作等特点，所获得的Aβ42多肽含有His标签方便纯化，且纯度高、产率高，比化学合成Aβ42具有更好的聚集特性和细胞毒性等优点。

Description

一种Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法
技术领域：
本发明属于生物技术和基因工程技术领域，特别涉及一种利用大肠杆菌表达 系统表达并纯化制备高纯度人淀粉样蛋白Aβ42修饰蛋白的方法，具体为重组大 肠杆菌表达载体的构建及转化方法、蛋白诱导表达及纯化方法。
背景技术：
淀粉样蛋白聚集成不溶性的淀粉纤维可导致各种神经性疾病，例如阿尔兹海 默症(Alzheimer’s disease，AD)，又称老年痴呆症，是一种神经退行性疾病。 这种疾病严重影响着世界上数以百万计的老年患者。据国际阿尔茨海默病协会 2016年公布的数据，2015年全球约有4680万AD患者，且其数量以20年翻一 番的速度递增，预测2050年全球将有1.3亿AD患者。由于AD病程长(约10 年)且患者生活需要护理，因此医疗和护理花费惊人。2015年全球AD患者的 医疗花费约为8180亿美元，占全球GDP的1.1％。因此该疾病的病因和寻找抗 AD药物成为世界范围内研究人员关注的焦点。
淀粉样蛋白斑(AD患者大脑中老年斑的主要成分)，主要是由淀粉样β-蛋 白(Aβ)聚集形成的，主要含有39-43个氨基酸。Aβ主要是通过一个含695-770 个氨基酸组成的淀粉样前体蛋白APP通过β-和γ-分泌酶水解而成，但该前体蛋 白的生物功能目前尚不清楚。据报道，Aβ42是大脑中老年斑的主要成分之一。 尽管目前对纤维形成过程中的聚集体的研究，已经取得了较大的进展，但很多关 于这些聚集体的大小、结构、形态以及与细胞毒性之间的关系等方面目前仍存在 很多未知的问题。
目前许多基于抑制Aβ42多肽聚集进行抗AD药物的设计和筛选，为探索其 聚集机制和毒理学性质，首先需要获得高纯度Aβ42。该多肽分子量大小约为4.5 kDa，含有胞外和跨膜结构域。目前Aβ多肽主要通过固相化学合成法(SPPS) 制备，然而SPPS合成过程中残留的氨基酸或多肽片段均严重影响了Aβ的聚集 和毒理特性。由于Aβ42自身存在高疏水性和易于聚集的特性，很难从神经细胞 组织中提取和纯化，因此难以获得大量高纯度的多肽。
基因工程方法具有能够大量生产Aβ的优势，目前已有一些研究组设计出一 些表达系统，并表达纯化获得重组Aβ，然而由于Aβ的高疏水性和聚集体具有 较高的细胞毒性，利用传统的大肠杆菌表达系统依然存在表达量低、纯化步骤复 杂、获得Aβ纯度不高等缺点。利用可溶性蛋白与Aβ融合表达来增加其溶解性 和稳定性可解决上述制备Aβ的缺点，然而通过该方法获得含有Aβ融合蛋白， 后续还需通过蛋白酶酶切去除融合蛋白，该方法不仅纯化过程繁琐复杂，还会造 成大量蛋白的损失。
pET22b表达载体是常用的大肠表达载体之一，载体上含有T7启动子，该启 动子为强诱导型启动子，具有较好的选择特异性和活性。经诱导后几乎能启动转 录细胞内所有类型基因，且能够极大提高插入基因片段的表达量。另外pET22b 表达载体多克隆位点C端自带His标签，为后续目标蛋白的纯化提供便利。
为了解决上述问题，本发明将提供一种简易的高纯度Aβ42修饰蛋白在大肠 杆菌中的表达及纯化方法，以获得高产、高纯度的Aβ42多肽，该多肽具有更强 的聚集特性和细胞毒性，可替代目前研究中广泛使用的化学合成的Aβ42多肽。
发明内容：
为了实现上述目的，本发明提供一种简易的高纯度Aβ42修饰蛋白及其在大 肠杆菌中的表达及纯化方法。
本发明提供的技术方案之一，是一种Aβ42修饰蛋白，具体为Aβ42-His蛋 白，是在Aβ42的C端添加6个His后形成，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示， 其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
本发明提供的技术方案之二，是上述Aβ42修饰蛋白在大肠杆菌中的表达及 纯化方法，包括重组表达载体构建、转化与筛选、诱导表达及纯化，步骤如下：
(1)将Aβ42基因插入到表达载体pET22b的多克隆位点，构建重组表达载 体质粒pET22b-Aβ42；
优选地，所述Aβ42基因核苷酸编码序列如SEQ ID No.3所示；
(2)将(1)中构建的重组表达载体质粒转入宿主细胞，经菌落PCR及测序 鉴定得到成功导入表达载体的重组菌株；
所述的宿主细胞是大肠杆菌E.coli BL21(DE3)；
(3)诱导表达Aβ42-His蛋白，由于表达载体pET22b的C端含有His标签， 因此诱导表达获得Aβ42-His蛋白；
所述诱导表达使用的诱导剂为异丙醇-β-硫代半乳糖苷(IPTG)；
(4)由于目标蛋白以包涵体形式表达，因此采用尿素溶液使包涵体变性的 方法纯化蛋白；诱导表达后收集菌体并破碎细胞后，使用含有尿素的变性溶液使 包涵体变性；
所述的尿素的浓度为8M；
(5)变性后过Ni-NTA树脂，进行亲和层析，采用洗脱液进行洗脱得 Aβ42-His蛋白溶液；
所述洗脱液中含有浓度为5M的尿素；
(6)采用超纯水作为透析液对步骤(5)所得的Aβ42-His蛋白溶液进行透 析，并利用Aβ42-His的疏水性促进其聚集形成淀粉样纤维；
(7)透析完成后高速离心后去掉上清，采用六氟异丙醇溶液溶解絮状沉淀， 超声均匀溶解后高速离心去除溶解不完全的杂质，吸取80％上清进行冻干处理备 用，即得Aβ42-His蛋白。
本发明实现上述技术方案的过程具体如下：
1、表达载体及重组Aβ42基因的大肠杆菌工程菌的构建
(1)根据大肠杆菌表达密码子偏好性对Aβ42基因序列进行优化，并由基 因公司合成，核苷酸序列如下：
GATGCCGAGTTTCGCCATGATAGCGGCTATGAGGTGCACCACCAGAAACTGGTGTTCTTTGCCGAGGATGTGGGCAGCAACAAAGGCGCCATTATTGGCCTGATGGTGGGTGGCGTGGTGATTGCC(SEQ ID No.3)；
(2)将优化后Aβ42基因与pET22b表达载体连接，构建重组表达载体 pET22b-Aβ42；
优选地，操作条件如下：
Aβ42基因片段与pET22b表达载体连接，16℃反应4-6h后，连接产物加入 到大肠杆菌JM109感受态细胞中，冰浴30min，42℃反应90s，冰浴2min，加 入1mL LB液体培养基复苏液，250rpm，37℃孵育1h；
4000rpm离心5min收集菌体，重悬菌体后，涂布氨苄霉素抗性的LB培养 基平板，37℃培养过夜。挑取单菌落至液体培养基中，250rpm，37℃过夜培养 。
菌落PCR鉴定阳性克隆后进行测序分析，提取测序正确的阳性转化子质粒 备用；
菌落PCR验证正向引物(NdeI)Aβ42-F：GGAATTCCATATGGATGCCGAGTT TCGCCATG(SEQID No.4)；
菌落PCR验证反向引物(XhoI)Aβ42-R：CCGCTCGAGGGCAATCACCACGC CACC(SEQ IDNo.5)；
(3)重组大肠杆菌表达菌株的构建：
将测序正确的pET22b-Aβ42表达载体质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3) 中，菌落PCR验证转化子，最终获得重组Aβ42基因的大肠杆菌工程菌BL21 -Aβ42。
2、Aβ42-His蛋白的表达及纯化
(1)Aβ42-His蛋白的表达：采用IPTG对工程菌BL21-Aβ42诱导蛋白表达， 37℃诱导4h，菌液离心收集菌体，获得含有Aβ42-His融合蛋白的大肠杆菌菌 体；
(2)Aβ42-His蛋白的纯化：用缓冲液将上述所得菌体重悬，加入终浓度 30μg/mL的溶菌酶和1％PMSF，冰浴30min后超声破碎，12000rpm离心30min， 收集上清和沉淀，SDS-PAGE凝胶电泳发现目标蛋白存在于沉淀中，即Aβ42-His 蛋白主要以包涵体形式表达；将沉淀用含有尿素的变性溶液完全溶解后，高速离 心去除沉淀，将上清经Ni-NTA树脂亲和层析柱，清洗液清洗后，用10个柱体 积洗脱液洗脱蛋白，最终得到Aβ42-His蛋白溶液；
(6)透析并纯化Aβ42-His纤维：将上述Aβ42-His蛋白溶液用超纯水透析， 将咪唑等去除，同时利用蛋白的强疏水性加速其聚集形成纤维，通过高速离心， 收集沉淀即为Aβ42-His纤维；
(7)获得高纯度Aβ42-His单体：将上述Aβ42-His纤维用六氟异丙醇溶解， 超声处理使得纤维充分打散，高速离心去除不溶性杂质后，吸取80％上清进行冻 干处理，即得Aβ42-His蛋白单体。
上述Aβ42-His蛋白的鉴定：
(1)电泳鉴定：Aβ42-His蛋白的表达及纯化包涵体蛋白过程中每一步都取 样进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示在5.6kDa附近有一条明显的条带；
(2)质谱鉴定：将纯化所得Aβ42-His蛋白进行MALDI TOF/TOF质谱鉴定 分子量，结果表明所得产物确为目标Aβ42-His蛋白；
(3)ThT荧光染色分析聚集特性：将上述纯化所得Aβ42-His蛋白进行培养， 并按时间段取样进行ThT染色，通过检测荧光值变化来分析聚集特性，证明本 发明所得Aβ42-His蛋白比化学合成的人淀粉样蛋白Aβ42具有更强的聚集特性。
有益效果：
1、本发明构建的Aβ42表达体系提供了原核生物表达人淀粉样蛋白Aβ42的 表达载体的构建方法，并将表达载体导入至大肠杆菌表达宿主中，经诱导表达、 两步纯化及鉴定后获得具有高纯度生物活性的目标Aβ42-His蛋白，该蛋白是 Aβ42的修饰蛋白，在Aβ42的C端的添加6个His后，较化学合成的Aβ42多肽 聚集性增强3-4倍。
2、由于Aβ42-His较Aβ42具有更强的聚集性，且采用本发明所述的表达纯 化方法表达量大、成本低、纯度高，可替代化学合成的Aβ42多肽用于阿尔兹海 默症致病机理研究和相应药物筛选开发的研究中；同时为其他疏水性、毒性蛋白 或多肽的研究提供新的思路。
3、本发明首次利用pET22b大肠表达载体，利用其多克隆位点N端T7强启 动子和C端的His*6标签，提高了表达量，精简了纯化过程，最终1L菌液可得 约36mg Aβ42-His多肽，远高于现有其他生物表达Aβ42方法。
4、本发明利用Aβ42蛋白的强疏水性，采用简易的纯水透析方法，加速其 形成纤维，再利用该蛋白在六氟异丙醇中的较好溶解性，溶解打散纤维，同时排 除其他杂蛋白，最终获得高纯度Aβ42-His单体。该方法解决了表达纯化过程中 蛋白形成聚集体和纤维的问题。
附图说明：
图1 Aβ42-His表达和纯化流程图；
图2表达载体pET22b-Aβ42构建示意图；
图3 Aβ42-His蛋白纯化电泳图；
其中，M：蛋白marker；泳道1：细胞破碎液上清；泳道2：细胞破碎后沉 淀(包涵体IBs)；泳道3：变性液溶解IBs离心后上清；泳道4：变性液溶解IBs 离心后沉淀；泳道5：变性液溶解IBs上清过Ni-NTA柱穿流液；泳道6：Ni-NTA 柱清洗液；泳道7：洗脱液，即洗脱Aβ42-His蛋白溶液；
图4MALDI TOF/TOF质谱检测分析图；
图5ThT荧光染色分析聚集特性。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例， 对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解 释本专利，并不用于限定本发明。
本发明使用限制性内切酶及DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司，小 量质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自Omega bio-tech，Ni+树脂购自sigma公司，其他试剂未特别注明来源的，均购自上海生 工生物工程股份有限公司。基因及引物合成来自于苏州金唯智生物科技有限公 司。实验操作未详述的，均根据实验室手册——如《分子克隆》进行操作。
Aβ42-His表达和纯化流程图如图1所示。
实施例1：pET22b-Aβ42表达载体质粒及重组Aβ42大肠杆菌表达菌株的构 建
表达载体pET22b-Aβ42构建示意图如图2所示；
(1)首先对Aβ42进行大肠杆菌表达密码子偏好性优化，并由基因公司合成 获得Aβ42基因片段，序列如SEQ ID No.3所示，目的片段两端酶切位点分别为 NdeI和XhoI；
(2)用NdeI和XhoI将Aβ42片段从基因公司提供的质粒上切下，经琼脂糖 凝胶电泳后，胶纯化回收目标酶切产物。同样用NdeI和XhoI双酶切pET22b表 达载体质粒，胶回收后与上述得到的目标基因片段连接。16℃反应4-6h后，连 接产物加入到大肠杆菌JM109感受态细胞中，冰浴30min，42℃反应90s，冰 浴2min，加入1mL LB液体培养基，250rpm，37℃孵育1h。4000rpm离心5 min收集菌体，去除800μL上清后重悬菌体，涂布氨苄霉素抗性的LB培养基平 板，37℃培养过夜。挑取单菌落至5mL LB液体培养基中，250rpm，37℃过 夜培养。菌落PCR鉴定阳性克隆后进行测序分析。提取测序正确的阳性转化子 质粒备用，命名为pET22b-Aβ42。
菌落PCR引物设计如下：
正向引物(NdeI)Aβ42-F：GGAATTCCATATGGATGCCGAGTTTCGCCATG(S EQ ID No.4)；
反向引物(XhoI)Aβ42-R：CCGCTCGAGGGCAATCACCACGCCACC(SEQ ID No.5)。
(3)Aβ42多肽大肠杆菌表达菌株的获得：将测序正确的pET22b-Aβ42表达 载体质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，菌落PCR验证转化子，最终获 得重组Aβ42基因的大肠杆菌工程菌BL21-Aβ42。
实施例2：Aβ42-His蛋白的表达及纯化
(1)Aβ42-His蛋白的表达：
挑取构建好的BL21-Aβ42工程菌单菌落至5mL LB培养基中过夜37℃培养， 按1％接种量转接至50mL新鲜LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8， 加入终浓度0.5mM IPTG诱导，诱导温度为37℃，诱导时间4h。最终6000rpm 离心10min收集菌体。(2)Aβ42-His蛋白的纯化：
用缓冲液lysis buffer(20mM Tris-HCl，pH 7.4，200mM NaCl，1mM EDTA， 1mMDTT)将上述所得菌体重悬，加入终浓度30μg/mL的溶菌酶和1％PMSF， 冰浴30min后超声破碎，12000rpm离心30min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE 凝胶电泳发现目标蛋白存在于沉淀中，即Aβ42-His蛋白主要以包涵体形式表达； 将沉淀用变性液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl,8M尿素,1mM DTT) 完全溶解后，高速离心去除沉淀，将上清经Ni-NTA树脂亲和层析柱，10个柱体 积清洗液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl,5M尿素,50mM咪唑,1mMDTT)清洗后，用10个柱体积洗脱液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl,5 M尿素,500mM咪唑,1mM DTT)洗脱蛋白即得Aβ42-His蛋白溶液；
经BCA试剂盒测定蛋白浓度，计算蛋白含量，1L菌液可得约36mg Aβ42-His 蛋白，Aβ42-His蛋白纯化电泳图如图3所示。
(3)透析并纯化Aβ42-His纤维：将上述Aβ42-His蛋白溶液置于3kDa孔径 的透析袋中，室温下用超纯水透析36h，每隔12h更换一次透析液。该过程可 将咪唑、尿素等去除，同时利用蛋白的强疏水性加速其聚集形成纤维。之后12000 rpm离心20min，收集沉淀，该沉淀即为Aβ42-His纤维；
(4)获得高纯度Aβ42-His单体：用2mL六氟异丙醇将上述Aβ42-His纤维 完全溶解(可根据纤维的量适当增加六氟异丙醇的量)，超声波处理使得纤维充 分打散，超声输入功率为150W，超声时间10min。之后12000rpm高速离心30 min，去除不溶性杂质后，吸取80％上清进行冻干处理，即得高纯度Aβ42-His 蛋白单体。
Aβ42-His蛋白的氨基酸及对应核苷酸序列如下所示：
MDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIALEHHH HHH(SEQ ID No.1)；
ATGGATGCCGAGTTTCGCCATGATAGCGGCTATGAGGTGCACCACCAGAAACTGGTGTTCTTTGCCGAGGATGTGGGCAGCAACAAAGGCGCCATTATTGGCCTGATGGTGGGTGGCGTGGTGATTGCCCTCGAGCACCACCACCACCA CCAC(SEQ ID No.2)；
实施例3：Aβ42多肽鉴定
(1)电泳鉴定：最终得到的Aβ42-His蛋白经SDS-PAGE电泳确定纯度及分 子量，如图3所示，在5.6kDa附近有一条明显的条带。经BCA试剂盒测定蛋 白浓度，最终计算1L菌液可得约36mg Aβ42-His多肽，远高于现有其他生物表 达Aβ42方法。
(2)质谱鉴定：将纯化所得Aβ42-His多肽进行MALDI TOF/TOF质谱鉴定， 如图4所示，荷质比为766.33所对应的肽段为第1-6个氨基酸肽段MDAEFR； 荷质比为1336.6所对应的肽段为第7-17个氨基酸肽段HDSGYEVHHQK；荷质 比为1325.69所对应的肽段为第18-29个氨基酸肽段LVFFAEDVGSNK；荷质比 为2334.24所对应的肽段为第30-51个氨基酸肽段GAIIGLMVGGVVIALEHHHH HH。因此可证明该蛋白即为目标Aβ42-His蛋白。
实施例4：硫黄素(ThT)荧光染色分析聚集特性
已知荧光化合物硫黄素(ThT)具有与淀粉样蛋白的β-sheet结构特异性结合 而显著增强荧光强度的性质。将上述纯化所得Aβ42-His脱盐并冻干处理后，称 取少量Aβ42-His粉末，用20mM NaOH溶液溶解，配成275μM母液，并用pH 8.0PBS缓冲液稀释至终浓度25μM，37℃培养，浓度按Aβ42-His：ThT＝1:1摩 尔比混匀，在激发波长440nm，发射波长485nm条件下检测荧光强度变化来分 析聚集特性。并以化学合成的Aβ42在同等实验条件下设置对照实验。
如图5结果显示：纯化所得Aβ42-His的ThT荧光强度随时间迅速增强，具 有较短的延滞期，培养约4h后开始逐渐进入稳定期。另外对比了重组Aβ42-His 与化学合成Aβ42ThT荧光随时间的变化，发现重组Aβ42-His蛋白比化学合成 的Aβ42具有更强的聚集性，聚集时间短且荧光强度增强3-4倍，因此证明本发 明所得Aβ42-His蛋白比化学合成人淀粉样蛋白Aβ42具有更好的生物活性，可 完全替代化学合成Aβ42，广泛地应用于淀粉样蛋白的聚集性和筛选聚集抑制剂 的研究中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技 术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变 形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以 权利要求为准。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法
<130> 1
<141> 2017-10-27
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln
1 5 10 15
Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile
20 25 30
Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Leu Glu His His His
35 40 45
His His His
50
<210> 2
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atggatgccg agtttcgcca tgatagcggc tatgaggtgc accaccagaa actggtgttc 60
tttgccgagg atgtgggcag caacaaaggc gccattattg gcctgatggt gggtggcgtg 120
gtgattgccc tcgagcacca ccaccaccac cac 153
<210> 3
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gatgccgagt ttcgccatga tagcggctat gaggtgcacc accagaaact ggtgttcttt 60
gccgaggatg tgggcagcaa caaaggcgcc attattggcc tgatggtggg tggcgtggtg 120
attgcc 126
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ggaattccat atggatgccg agtttcgcca tg 32
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ccgctcgagg gcaatcacca cgccacc 27

Claims (7)

1.一种Aβ42修饰蛋白，其特征在于，所述蛋白是在Aβ42的C端的添加6个His后形成的Aβ42-His蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的一种Aβ42修饰蛋白，其特征在于，所述Aβ42-His蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.权利要求1所述Aβ42-His蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，包括重组表达载体构建、转化、诱导表达以及纯化，步骤如下：
(1)将Aβ42基因插入到表达载体pET22b的多克隆位点，构建重组表达载体质粒pET22b-Aβ42；
(2)将(1)中构建的重组表达载体质粒转入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，获得重组菌株；
(3)对重组菌株进行诱导，表达Aβ42-His蛋白；
(4)诱导表达后收集菌体并破碎细胞后，使用含有尿素的变性溶液使包涵体变性；
(5)变性后过Ni-NTA树脂，进行亲和层析，采用洗脱液进行洗脱得Aβ42-His蛋白溶液；
(6)采用超纯水作为透析液对步骤(5)所得的Aβ42-His蛋白溶液进行透析；
(7)透析完成后高速离心后去掉上清收集沉淀，采用六氟异丙醇溶液溶解沉淀，均匀溶解后去除溶解不完全的杂质，吸取上清进行冻干处理，即得Aβ42-His蛋白。
4.如权利要求3所述的Aβ42-His蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，具体如下：
(1)将SEQ ID No.3所示的Aβ42基因与pET22b表达载体连接转化，挑选阳性转化子验证，并提取pET22b-Aβ42质粒；
(2)将测序正确的pET22b-Aβ42表达载体质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，菌落PCR验证转化子，获得大肠杆菌工程菌BL21-Aβ42；
(3)采用IPTG对工程菌BL21-Aβ42诱导蛋白表达，37℃诱导4h，菌液离心收集菌体，获得含有Aβ42-His蛋白的大肠杆菌菌体；
(4)用缓冲液将上述所得菌体重悬，加入终浓度30μg/mL的溶菌酶和1％PMSF，冰浴30min后超声破碎，12000rpm离心30min，收集沉淀；
(5)将沉淀用含有尿素的变性溶液完全溶解后，高速离心去除沉淀，将上清经Ni-NTA树脂亲和层析柱，清洗液清洗后，用洗脱液洗脱蛋白得Aβ42-His蛋白溶液；
(6)将上述Aβ42-His蛋白溶液用超纯水透析，通过高速离心，收集沉淀即为Aβ42-His纤维；
(7)将上述Aβ42-His纤维用六氟异丙醇溶解，超声处理使得纤维充分打散，高速离心去除不溶性杂质后，吸取80％上清进行冻干处理，即得Aβ42-His蛋白单体。
5.如权利要求3所述的Aβ42-His蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，步骤(4)所述变性溶液组成为：20mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl,8M尿素,1mM DTT。
6.如权利要求3所述的Aβ42-His蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，步骤(5)所述洗脱液组成为：20mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl,5M尿素,500mM咪唑,1mM DTT。
7.权利要求1所述Aβ42-His蛋白在淀粉样蛋白聚集性研究中的应用。
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