CN107266540A

CN107266540A - 一种结核分枝杆菌延伸因子EF‑Tu蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN107266540A
Application number: CN201710592912.6A
Authority: CN
Inventors: 杨娟娟; 罗岭; 孟春; 洪晶; 夏菁潞; 赵晨
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2017-07-19
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2017-10-20

Abstract

本发明涉及一种结核分枝杆菌延伸因子EF‑Tu蛋白的制备方法，属于重组蛋白的制备方法技术领域。所述的结核分枝杆菌EF‑Tu（MtbEF‑Tu）的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明采用原核表达系统B834(DE3)宿主菌，对全长的MtbEF‑Tu蛋白进行诱导表达，获得折叠正确的上清表达的目的蛋白，解决了MtbEF‑Tu蛋白难表达的问题。本发明涉及的一种制备MtbEF‑Tu蛋白的方法具有流程简单、周期短、成本低的优点，且获得的蛋白折叠较好，为进一步的结构生物学研究和新型药物设计奠定了一定的基础。

Description

一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于重组蛋白的制备方法技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法。

背景技术

EF-Tu蛋白是结核分枝杆菌反式翻译过程中重要的延伸因子，参与调控结核分枝杆菌在应激条件和正常的指数生长状态下的蛋白合成过程。EF-Tu蛋白作为分子开关调节蛋白合成的活性状态和非活性状态。在活性状态，EF-Tu与GTP结合，EF-Tu·GTP协助aa-tRNA准确结合至核糖体A位点，GTP水解为GDP，EF-Tu与GDP结合，即为非活性状态，EF-Tu·GDP从核糖体上释放，完成一轮的蛋白合成。近来研究发现，结核分枝杆菌EF-Tu（MtbEF-Tu）蛋白不仅是调控蛋白合成的关键因子，还在缺氧和高盐条件下大量产生、与结核分枝杆菌细胞壁相关（结核分枝杆菌易产生耐药性的关键因素是具有独特的细胞壁成分）、参与结合人的血纤维蛋白溶酶原，成功进入宿主。因此，MtbEF-Tu蛋白可以作为极具潜力的抗结核病药物靶标。结核分枝杆菌蛋白表达与纯化较为困难，进而阻碍了相关蛋白生化功能的研究进展。本发明涉及的MtbEF-Tu蛋白的表达与纯化方法为该蛋白结构生物学研究提供了前提条件，也为后续抗结核病新药研发奠定一定的基础。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种高表达且构象正确折叠的结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法。

为此采用如下的技术方案：

一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白，所述蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQID NO.1-2所示。

所述的蛋白质为如下1)-2)所示的蛋白质：

1) 氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示组成的蛋白质；

2) 将SEQ ID NO.1-2所示的氨基酸序列和/或核苷酸序列进行一个和或几个

氨基酸/核苷酸序列的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质；

一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，采用如下步骤：

1) 以来源于结核分枝杆菌（菌株类型：H37Rv）的延伸因子EF-Tu的全长编码基因为模板，利用PCR技术获得结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的全长编码序列，利用Nde I与HindIII限制性内切酶同时双酶切产物与载体pET-28a，利用T4DNA连接酶进行连接，获得连接产物；

2) 制备DH5α感受态细胞，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至公司进行基因测序，测序成功，获得pET-28a-MtbEF-Tu重组质粒;

3)制备B834(DE3)感受态细胞，将2)获得的pET-28a-MtbEF-Tu重组质粒转化至B834(DE3)感受态细胞中，获得重组菌的单菌落；

4) 挑取单菌落于10 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基，在37℃条件下过夜培养，按照1：100的比列接入1L含有50 μg/mL卡那霉素的 LB培养基中，培养至OD_{600 nm}值为0.6-0.8之间，然后加入终浓度为0.5 mM的IPTG于25℃诱导8 h，收集菌体；

5) 将上述菌体重悬于裂解缓冲液中（pH 7.6，20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl， 10 mMMgCl₂，10 %甘油），超声破碎，离心，收集上清；

6) 将上清过滤后利用Ni-NTA柱亲和层析法纯化；

7) 将6)中获得的高纯度的MtbEF-Tu蛋白液置于浓缩管中浓缩，获得高浓度的MtbEF-Tu蛋白；

8) 利用圆二色谱技术（CD）测定步骤7)中获得MtbEF-Tu蛋白，实验结果表明：该重组蛋白的二级结构折叠较好，以β折叠为主。

9) 利用动态光散射技术（DLS）与核磁共振技术（NMR）测定步骤7)中获得MtbEF-Tu蛋白，实验结果表明：该重组蛋白在溶液中以单体形式存在，且折叠较好，具有很好的三级结构。

连接产物和DH5α感受态细胞的体积比为1:4；重组质粒和B834(DE3)感受态细胞体积比为1:70。

所述重组质粒pET-28a-MtbEF-Tu使用的酶切位点为Nde I与HindIII；MtbEF-Tu的基因片段长度为1188 bp，编码396个氨基酸。

本发明的优点在于：采用原核细胞B834(DE3)宿主菌诱导表达蛋白，能够稳定高效的表达结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白，且获得的蛋白具有纯度高，产量高，构象均一性好等特点。本发明所采用的结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法具有流程简便、周期短、成本低等优点。

附图说明

图1：琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果。（A）泳道M：DNA Marker；泳道1：PCR产物。

图2：SDS-PAGE鉴定MtbEF-Tu蛋白诱导表达情况与纯化结果。（A）泳道M：蛋白Marker；泳道1：诱导前全菌；泳道2：诱导后全菌；泳道3：破碎后，离心上清；泳道4：破碎后，离心沉淀。（B）泳道M：蛋白Marker；泳道1：Ni-NTA柱亲和层析获得高纯度的MtbEF-Tu蛋白。

图3：CD测定MtbEF-Tu蛋白二级结构折叠，实验结果表明：该蛋白在192 nm呈现正峰，在218 nm处有一个明显的负峰，说明MtbEF-Tu蛋白二级结构折叠较好，且主要以β折叠为主的构象存在。

图4：DLS测定MtbEF-Tu蛋白在溶液中的寡聚状态，实验结果表明：该蛋白的直径在3 nm左右，在溶液中以单体的形式存在。

图5：NMR测定MtbEF-Tu蛋白的折叠情况，实验结果表明：该蛋白的1D H谱在6.5ppm-10.5 ppm具有很宽的酰胺质子峰，表明该蛋白在溶液中具有较好的三级结构。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细的描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其他明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并非排除其他元件或其他组成部分。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

具体采用如下步骤：

1) 取编码结核分枝杆菌EF-Tu蛋白的cDNA1 μL，2×dNTP 10 μL，10×PCR buffer 2 μL，PCR DNA聚合酶 2 μL，ddH₂O 2 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1.5 μL混和均匀，对MtbEF-Tu基因进行PCR扩增，扩增条件为：95℃变性30s、60℃退火30 s、72℃延伸90 s，共计循环35次；PCR扩增使用的上游引物为：5’ATTATTCCATATGGTGGCGAAGGCG3’（酶切位点：NdeI），下游引物为：5’ GCGAAGCTTTCACTTGATGATCTTGG 3’（酶切位点：Hind III）。

PCR扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳（1%）对PCR产物进行鉴定，切取核苷酸片段大小为1200 bp左右的片段，使用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化。对于纯化后的PCR产物利用双酶切反应进行双酶切：PCR产物 15 μL，限制性内切酶Nde I（Takara）1.5 μL，限制性内切酶Hind III（Takara）1.5 μL，10×Buffer K（Takara）2 μL，混匀，于37℃反应3 h。对于载体pET-28a使用同样的双酶切步骤进行双酶切。对于双酶切后的PCR产物与载体分别使用PCR清洁试剂盒进行纯化，对于纯化后的产物进行连接，步骤为：双酶切后的PCR产物 8 μL，双酶切后的载体pET-28a 8 μL，T4 DNA连接酶（Takara） 2 μL，T4 DNA连接酶buffer（Takara） 2 μL，混匀，于16℃反应16 h。酶连结束后，取20 μL酶连产物转化至80μL DH5α超级感受态细胞中，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素抗性的琼脂糖平板上，培养过夜，挑取单菌落，于5 mL含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB培养基中，过夜培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒，进行双酶切验证。对于双酶切验证的阳性结果的重组菌，送至测序公司进行质粒测序。

2) 将1)中获得的测序正确的重组质粒pET-28a-MtbEF-Tu转化至B834(DE3)超级感受态细胞中，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素抗性的琼脂糖平板上，培养过夜，挑取单菌落，于10 mL含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB培养基中过夜培养，按照1:100的比列扩大培养于1L含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，生长2-3 h至OD_{600 nm}=0.6-0.8，加入终浓度为0.5 mM的IPTG，于25 ℃条件下诱导8 h，4000 rpm离心30分钟收集菌体，并利用裂解缓冲液（pH 7.6，20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl， 10 mM MgCl₂，10 %甘油）洗涤两次菌体，冻存于-80 ℃。

3) 将2)中收集到的菌体重悬于45 mL裂解缓冲液中（pH 7.6，20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，10 mM MgCl₂，10 %甘油），超声破碎（破碎条件为：工作3 s，停2 s，破碎时间为45 min），12000g离心20 min以分离上清与细胞碎片和沉淀等，收集上清，待纯化使用。

4)将3)中获得的上清用0.45 μm的滤膜进行过滤，然后利用Ni-NTA柱亲和层析纯化MtbEF-Tu蛋白，依次用50 mL的15 mM咪唑、15 mL的30 mM咪唑洗杂蛋白，最后使用12 mL的200 mM咪唑（pH 7.6，20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，10 mM MgCl₂，10%甘油，200 mM的咪唑）洗脱MtbEF-Tu蛋白。将洗脱获得的MtbEF-Tu蛋白进行SDS-PAGE鉴定，结果表明：利用200mM咪唑洗脱时，获得的MtbEF-Tu蛋白纯度可以达到98 %以上（如图2）。

5) 将4)中获得的高纯度的MtbEF-Tu蛋白置于浓缩管中浓缩，获得高浓度的MtbEF-Tu蛋白。

实施例2

具体采用如下步骤：

1)将获得的高纯度的MtbEF-Tu蛋白稀释至缓冲液pH 7.6，20 mM Tris-HCl

中，终浓度为：0.5 mg/mL，12000 g离心10 min，取上清待用。

2)打开圆二色谱仪（CD），室温静置30 min。

3)将步骤1)准备好的MtbEF-Tu蛋白样品放入石英比色皿中，进行测定，

记录谱图，实验结果表明：获得的MtbEF-Tu蛋白二级结构折叠较好，且以β折叠为主（如图3）。

实施例3

具体采用如下步骤：

1)将获得的高纯度的MtbEF-Tu蛋白稀释至缓冲液pH 7.6，20 mM Tris-HCl，

200 mM NaCl，10 mM MgCl₂中，终浓度为：10 mg/mL，12000 g离心10 min，移取上清待用。

2)打开马尔文粒度仪（DLS），室温静置30 min。

记录谱图，实验结果表明：获得的MtbEF-Tu蛋白在溶液中以单体的形式存在（如图4）。

实施例4

具体采用如下步骤：

1)将获得的高纯度的MtbEF-Tu蛋白更换至缓冲液pH 6.7，20 mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，130mM NaCl，10 mM MgCl₂中，浓缩至终浓度为：0.5 mM，12000 g离心10 min，移取上清待用，取450 μL蛋白样品与50 μL D₂O，混匀，装入核磁管中，准备测样。

2) 利用850 M的核磁谱仪进行1D H谱的采集。

3) 分析1D H谱，实验结果表明：该蛋白在6.5 ppm-10.5 ppm具有很宽的酰胺质子峰，表明该蛋白在溶液中具有较好的三级结构（如图5）。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明、不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明、对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说、在不脱离本发明构思的前提下、还可以做出若干简单推演或替换、都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 396

<212> PRT

<213> MtbEF-Tu蛋白

<400> 1

Met Ala Lys Ala Lys Phe Gln Arg Thr Lys Pro His Val Asn Ile Gly

1 5 10 15

Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Ala Ile

20 25 30

Thr Lys Val Leu His Asp Lys Phe Pro Asp Leu Asn Glu Thr Lys Ala

35 40 45

Phe Asp Gln Ile Asp Asn Ala Pro Glu Glu Arg Gln Arg Gly Ile Thr

50 55 60

Ile Asn Ile Ala His Val Glu Tyr Gln Thr Asp Lys Arg His Tyr Ala

65 70 75 80

His Val Asp Ala Pro Gly His Ala Asp Tyr Ile Lys Asn Met Ile Thr

85 90 95

Gly Ala Ala Gln Met Asp Gly Ala Ile Leu Val Val Ala Ala Thr Asp

100 105 110

Gly Pro Met Pro Gln Thr Arg Glu His Val Leu Leu Ala Arg Gln Val

115 120 125

Gly Val Pro Tyr Ile Leu Val Ala Leu Asn Lys Ala Asp Ala Val Asp

130 135 140

Asp Glu Glu Leu Leu Glu Leu Val Glu Met Glu Val Arg Glu Leu Leu

145 150 155 160

Ala Ala Gln Glu Phe Asp Glu Asp Ala Pro Val Val Arg Val Ser Ala

165 170 175

Leu Lys Ala Leu Glu Gly Asp Ala Lys Trp Val Ala Ser Val Glu Glu

180 185 190

Leu Met Asn Ala Val Asp Glu Ser Ile Pro Asp Pro Val Arg Glu Thr

195 200 205

Asp Lys Pro Phe Leu Met Pro Val Glu Asp Val Phe Thr Ile Thr Gly

210 215 220

Arg Gly Thr Val Val Thr Gly Arg Val Glu Arg Gly Val Ile Asn Val

225 230 235 240

Asn Glu Glu Val Glu Ile Val Gly Ile Arg Pro Ser Thr Thr Lys Thr

245 250 255

Thr Val Thr Gly Val Glu Met Phe Arg Lys Leu Leu Asp Gln Gly Gln

260 265 270

Ala Gly Asp Asn Val Gly Leu Leu Leu Arg Gly Val Lys Arg Glu Asp

275 280 285

Val Glu Arg Gly Gln Val Val Thr Lys Pro Gly Thr Thr Thr Pro His

290 295 300

Thr Glu Phe Glu Gly Gln Val Tyr Ile Leu Ser Lys Asp Glu Gly Gly

305 310 315 320

Arg His Thr Pro Phe Phe Asn Asn Tyr Arg Pro Gln Phe Tyr Phe Arg

325 330 335

Thr Thr Asp Val Thr Gly Val Val Thr Leu Pro Glu Gly Thr Glu Met

340 345 350

Val Met Pro Gly Asp Asn Thr Asn Ile Ser Val Lys Leu Ile Gln Pro

355 360 365

Val Ala Met Asp Glu Gly Leu Arg Phe Ala Ile Arg Glu Gly Gly Arg

370 375 380

Thr Val Gly Ala Gly Arg Val Thr Lys Ile Ile Lys

385 390 395

<210> 2

<211> 1188

<212> DNA

<213> MtbEF-Tu蛋白的核苷酸序列

<400> 2

gtggcgaagg cgaagttcca gcggaccaag ccccacgtca acatcgggac catcggtcac 60

gttgaccacg gcaagaccac cctgaccgcg gctatcacca aggtcctgca cgacaaattc 120

cccgatctga acgagacgaa ggcattcgac cagatcgaca acgcccccga ggagcgtcag 180

cgcggtatca ccatcaacat cgcgcacgtg gagtaccaga ccgacaagcg gcactacgca 240

cacgtcgacg cccctggcca cgccgactac atcaagaaca tgatcaccgg cgccgcgcag 300

atggacggtg cgatcctggt ggtcgccgcc accgacggcc cgatgcccca gacccgcgag 360

cacgttctgc tggcgcgtca agtgggtgtg ccctacatcc tggtagcgct gaacaaggcc 420

gacgcagtgg acgacgagga gctgctcgaa ctcgtcgaga tggaggtccg cgagctgctg 480

gctgcccagg aattcgacga ggacgccccg gttgtgcggg tctcggcgct caaggcgctc 540

gagggtgacg cgaagtgggt tgcctctgtc gaggaactga tgaacgcggt cgacgagtcg 600

attccggacc cggtccgcga gaccgacaag ccgttcctga tgccggtcga ggacgtcttc 660

accattaccg gccgcggaac cgtggtcacc ggacgtgtgg agcgcggcgt gatcaacgtg 720

aacgaggaag ttgagatcgt cggcattcgc ccatcgacca ccaagaccac cgtcaccggt 780

gtggagatgt tccgcaagct gctcgaccag ggccaggcgg gcgacaacgt tggtttgctg 840

ctgcggggcg tcaagcgcga ggacgtcgag cgtggccagg ttgtcaccaa gcccggcacc 900

accacgccgc acaccgagtt cgaaggccag gtctacatcc tgtccaagga cgagggcggc 960

cggcacacgc cgttcttcaa caactaccgt ccgcagttct acttccgcac caccgacgtg 1020

accggtgtgg tgacactgcc ggagggcacc gagatggtga tgcccggtga caacaccaac 1080

atctcggtga agttgatcca gcccgtcgcc atggacgaag gtctgcgttt cgcgatccgc 1140

gagggtggcc gcaccgtggg cgccggccgg gtcaccaaga tcatcaag 1188

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attattccat atggtggcga aggcg 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgaagcttt cacttgatga tcttgg 26

Claims

1.一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸和核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

2.权利要求1所述的一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

a)通过结核分枝杆菌EF-Tu基因的获取和克隆以及重组质粒pET-28a-MtbEF-Tu的构建；

b)制备B834(DE3)感受态细胞，将a)获得的重组质粒转入该感受态细胞中，获得重组菌株；

c)在25℃、200 rpm、0.5 mM异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）条件下诱导b)获得的重组菌株8 h，获得MtbEF-Tu蛋白的大量上清表达；

d) 采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化c)获得MtbEF-Tu重组蛋白；最后利用浓缩管浓缩蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

1) 以结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu的全长编码基因为模板，利用PCR技术获得结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的全长编码序列，利用Nde I与Hind III限制性内切酶同时双酶切产物与载体pET-28a，利用T4DNA连接酶进行连接，获得连接产物；

2) 制备DH5α感受态细胞，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，获得pET-28a-MtbEF-Tu重组质粒；

3)制备B834(DE3)的感受态细胞，将2)获得的pET-28a-MtbEF-Tu重组质粒转化至B834(DE3)感受态细胞中，获得重组菌的单菌落；

4) 挑取单菌落于10 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基，在37℃条件下过夜培养，按照1：100的体积比例接入1L含有50 μg/mL卡那霉素的 LB培养基中，培养至OD_{600 nm}值为0.6-0.8之间，然后加入终浓度为0.5 mM的IPTG于25℃诱导8 h，收集菌体；

5) 将上述菌体重悬于裂解缓冲液中，超声破碎，离心，收集上清；

6) 将上清过滤后利用Ni-NTA柱亲和层析法纯化；

7) 将6)中获得的高纯度的MtbEF-Tu蛋白液置于浓缩管中浓缩，获得高浓度的MtbEF-Tu蛋白。

4.根据权利要求3所述的一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，其特征在于：连接产物和DH5α感受态细胞的体积比为1:4；重组质粒和B834(DE3)感受态细胞体积比为1:70。

5.根据权利要求3所述的一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，其特征在于：所述裂解缓冲液含20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，10 mM MgCl₂，10 %甘油，pH 7.6。