CN109777807A - 一种在线粒体中定位表达外源蛋白的方法 - Google Patents
一种在线粒体中定位表达外源蛋白的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一种在线粒体中定位表达外源蛋白的方法，属于分子遗传学领域，提供了一种编码多肽的DNA序列及其可在线粒体中定位表达外源蛋白的应用和相关方法。具体涉及一段来自毛竹基因组的序列，它所编码的一段多肽可以将外源蛋白表达在线粒体，可作为线粒体共定位的标记基因，为亚细胞定位的提供了一种可靠的比对方法。本发明首先克隆了一段毛竹基因的序列，将其连接在C端的黄色荧光蛋白导入了线粒体。将转运肽与荧光蛋白融合，能够在活细胞中进行观察，省时省力，是研究蛋白功能的一种基础方法。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，提供了一种编码多肽的DNA序列及其可在线粒体中定位表达外源蛋白的应用和相关方法。
背景技术
线粒体是几乎所有真核细胞中发现的必需细胞器，参与多种关键细胞过程，如能量转换，细胞信号传导，细胞周期调控和细胞分化[1]。绝大多数线粒体蛋白质组是细胞核编码，翻译在细胞质中，随后进入线粒体。靶向新合成的蛋白质并将其导入正确的细胞器需要存在细胞器特异性靶向信号，并涉及复杂的细胞内蛋白质运输机制，包括不同的细胞溶质因子，分子伴侣和细胞器特异性转位酶[1]。大多数用于导入线粒体基质的蛋白质在其N末端具有靶向信息。这些基质靶向序列(MTS)通常长度为20-60个氨基酸，并且在通过线粒体加工肽酶 (MPP)导入线粒体时被切割[2,3]。然而，线粒体输入信号也存在于蛋白质的其他位置，已知这种信号是存在的[4,5]。线粒体靶向肽富含带正电荷的残基(特别是精氨酸)，缺乏带负电的残基，并且具有形成双亲和性α-螺旋的能力[6]。双亲和性结构对于结合线粒体外膜中的受体很重要，并且在ΔΨ驱动的线粒体内膜导入过程中可能需要正电荷[7]。ScCOX4被发现是酵母细胞中线粒体的靶位信号后广泛被应用为线粒体marker基因[8]，本研究使用的CoxⅣ-mCherry荧光特异标记线粒体。
现有技术存在的问题：
蛋白的定位往往与蛋白的功能相关，目前还不能完全根据蛋白的序列来确定蛋白所表达的位置。需要通过实验来确定。在实验过程中对于在细胞中的点状分布的信号，很难确切的判断信号的表达位置。所以在亚细胞定位时通常需要一些亚细胞定位的marker来做对照，本研究报导了一段来自毛竹基因组的序列，它所编码的一段多肽可以将外源蛋白表达在线粒体，可用于线粒体表达的 marker基因。
参考文献：
[1].Neupert,W.,A Perspective on Transport of Proteins intoMitochondria:A Myriad of Open Questions.JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY,2015.427(6SIA):p. 1135-1158.
[2].Bohni,P.C.,G.Daum and G.Schatz,Import of proteins intomitochondria.Partial purification of a matrix-located protease involved incleavage of mitochondrial precursor polypeptides.The Journal of biologicalchemistry,1983.258(8):p. 4937-43.
[3].Hawlitschek,G.,et al.,Mitochondrial protein import:identificationof processing peptidase and of PEP,a processing enhancing protein.Cell,1988.53(5):p.795-806.
[4].Wiedemann,N.,N.Pfanner and M.T.Ryan,The three modules of ADP/ATPcarrier cooperate in receptor recruitment and translocation intomitochondria.The EMBO journal,2001.20(5):p.951-60.
[5].Lee,C.M.,et al.,The DNA helicase,Hmi1p,is transported intomitochondria by a C-terminal cleavable targeting signal.The Journal ofbiological chemistry,1999. 274(30):p.20937-42.
[6].von Heijne,G.,Mitochondrial targeting sequences may formamphiphilic helices. The EMBO journal,1986.5(6):p.1335-42.
[7].Voos,W.,et al.,Mechanisms of protein translocation intomitochondria. Biochimica et biophysica acta,1999.1422(3):p.235-54.
[8].Kohler,R.H.,et al.,The green fluorescent protein as a marker tovisualize plant mitochondria in vivo.The Plant journal:for cell and molecularbiology,1997.11(3): p.613-21
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供了一段来自毛竹基因组的序列PSBR1，它所编码的一段多肽可以将外源蛋白表达在线粒体，并通过N端连接的YFP融合蛋白的黄色荧光信号进行证明。为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种信号肽及其编码序列，其序列如下：
1.PSBR1 DNA序列：
ATGGAGGAAGATGGTAGTGGTACGCTTCTACGGCGTATGCTGCATAAGGCA GTATGGGCAGCGAGAGCCATAGCTCACCTCCGTCCATCTCCGACGACGAC GACGACACCGGCAACGACGCCCAGCCGGCTCCCACCGAGCCTGCTGGAC TGCACCGACGACGACGACGCCGCGTCGACTGCCGGGTGTCCGAGCTTCCA CACGGCGAGCAGCACCCCGGACTGGGCCGTCCACTCGTGGCTGCCCAGCC CCGGCGCCGTCGAGGTCGACGGCGACAGGCGCGCCGAGGAGTTCATCGA GAGGTTCTGGCGCAACGTGTCCCTGGAGCTGCGGTACTGCTCGCCGGTTA CGCCCGCCAGGCCGCCCGTGTCGCCGGACACGTACTTCAACCTCTCGAGG CTTAGTCATAGGATCTGCCTTGATTGA
2.PSBR1氨基酸序列
MEEDGSGTLLRRMLHKAVWAARAIAHLRPSPTTTTTPATTPSRLPPSLLD CTDDDDAASTAGCPSFHTASSTPDWAVHSWLPSPGAVEVDGDRRAEEFIERF WRNVSLELRYCSPVTPARPPVSPDTYFNLSRLSHRICLD
一种外源蛋白在线粒体中定位表达的方法：包括如下步骤：
1.信号肽C端连接YFP黄色荧光的载体的构建PSBR1-YFP
克隆PSBR1：在BambooGDB数据库(http://www.bamboogdb.org/)中搜索PH01000831G0490序列,将其命名为PSBR1。根据毛竹中PSBR1序列的开放阅读框(ORF)设计设计引物PSBR1-F：5'-ATGGAGGAAGATGGTAGTGG-3'和 PSBR1-R：5'-ATCAAGGCAGATCCTATGAC-3'。使用总RNA提取试剂盒 (Tiangen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China)根据制造商的方案制备来自Moso 竹叶的总RNA。
使用GoScript TM逆转录系统(Promega Biotech，Co.，Ltd.，Beijing，China)，用1μg总RNA合成第一链cDNA。将cDNA用作PCR的模板，使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TakaraBiotech，Co.，Ltd.，Dalian，China)用引物PSBR1-F 和PSBR1-R进行扩增。然后将PCR片段克隆到pEntry中，随后通过测序 (BioSune Biotech，Co.，Ltd.，Shanghai，China)确认。
进一步地，所述植物总RNA提取，采用试剂盒(Tiangen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China)，根据制造商的方案制备来自Moso竹叶的总RNA。提取步骤如下：(1)匀浆处理:50-100mg毛竹叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μ lRL(操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1％，如1ml RL中加入10μlβ -巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。)，涡旋剧烈震荡混匀。(2)将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心 2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。(3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(通常为225μl)，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1， 12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(5)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的 RNase-Free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀。(6)向吸附柱CR3 中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。(7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(8)向吸附柱CR3中加入500μ l漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000 rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(9)重复步骤8。(10)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(11) 将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心 2min，得到RNA溶液。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA样品请在-70℃中保存。掉收集管中的废液，将吸附柱CR3 放回收集管中。
进一步地，采用GoScript TM逆转录系统(Promega Biotech，Co.，Ltd.， Beijing，China)用1μg总RNA合成第一链cDNA。具体如下：(1)使用前将每种组分混合并短暂离心。混合以下内容：
(2)在70℃加热5分钟。立即将冰水冷却至少5分钟。在微量离心机中离心10秒钟。存放在冰上直至添加逆转录混合物。
(3)制备逆转录反应混合物，每个cDNA反应15μl。按照顺序在冰上添加。
(4)将15μl逆转录混合物与5μl RNA和引物混合物混合。
(5)在25℃的加热块中退火5分钟。
(6)在42℃的加热块中延伸长达一小时。
(7)在70℃的加热块中逆转录酶15分钟。
进一步地，将合成的cDNA用作PCR的模板，使用PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶(Takara Biotech，Co.，Ltd.，Dalian，China)用引物PSBR1-F和PSBR1-R 进行扩增。
(1)PCR反应液的配制
(2)PCR反应条件
预变性：98℃30sec；变性：98℃10sec，退火：55℃15sec，延伸：68℃10sec，30Cycles；终延伸：68℃10min。
进一步地，加A反应在PCR产物中加入1μl TaKaRa r Taq酶72℃处理30 min。将PCR连接到pEntry(Gateway entry vector)载体中，随后通过测序确认，测序公司博尚(中国福州)。
进一步地，pEntry-T载体使用方法如下：
(1)用XcmI限制性内切酶消化pEntry-T质粒，(2)电泳胶回收，(3) 用T4DNA连接酶PCR加A后的产物和步骤2的产物，(4)转化Dh5α感受态细胞，(5)LB培养基培养18小时后挑单克隆，(6)提取质粒，(7)PCR 鉴定并测序。
进一步地，质粒提取采用天根质粒小提试剂盒步骤，操作步骤如下：
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl 的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)
(2)取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
(4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
(5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。注意： P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(7)可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm (～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。
(8)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(9)重复操作步骤8。
(10)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
(11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。
2.构建表达载体
通过TA反应将PCR片段克隆到pEntry中，然后通过LR反应与目的载体pEarleyGate 101载体(35S：C-YFP)(Earley等，2006)重组(Invitrogen) 获得pEarleyGate101-PSBR1质粒(35S∷PSBR1-YFP)。将所有构建体转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101中。
进一步地，根癌农杆菌转化采用100μl农杆菌细胞加小于1μl的质粒，混匀后加入电击杯中，冰上放置5分钟，擦干电击杯外部的水分，放入电击转化仪中(BTX，Model ECM630)。
进一步地，电击转化条件为：模式：2.5kV/RESISTANCE High Voltage(HV)；电击杯类型：BTX Disposable Cuvette P/N 610(1mm gap)；电容：50μF；电阻： 125Ω；电压：1.4kV；额定场强(供参考)：14.4kV/cm；额定脉冲长度(供参考)： 5.0msec；转化后的菌液加入1ml的无抗LB在28℃摇床培养2小时，40000g 离心2分钟，弃部分上清混匀后涂在含有kana抗性的培养基上，置于28℃培养 48h。
3.重组质粒烟草瞬时表达
(1)用5ml的LB液体培养基28℃培养12小时左右。(2)室温5000g 离心10min，弃上清，沉淀用3ml MgCL2(10mM)液悬浮。(3)测浓度，用 OD600。(4)用10mM MgCL2稀释农杆菌悬浮液至，10ml总体积，每个菌的浓度为OD600＝0.5。(5)加150μM乙酰丁香酮。(6)注射器注射至烟草背面， 24后可观察荧光。(7)用倒置的Leica TCS SP8X DLS显微镜进行观察和成像。对于YFP和mCherry的激发，分别使用488和594nm激光。检测发射波长为 520至580(YFP)，600至630(mCherry)。
附图说明
图1为本发明烟草叶表皮细胞轮廓图。
图2为本发明烟草叶表皮细胞中PSBR1定位在线粒体效果图。其中，图中较亮处在显微镜下为黄色信号。
图3为本发明线粒体标记基因(CoxⅣ-mCherry)红色荧光信号。其中，图中较亮处在显微镜下为红色信号。
图4为本发明叠加图层。其中，图4为图2和图3的叠加图。
图5为本发明PSBR1 PCR扩增条带。
具体实施方式
为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
该实施例提供一种信号肽及其编码序列，其序列如下：
1.PSBR1 DNA序列：
ATGGAGGAAGATGGTAGTGGTACGCTTCTACGGCGTATGCTGCATAAGGCA GTATGGGCAGCGAGAGCCATAGCTCACCTCCGTCCATCTCCGACGACGAC GACGACACCGGCAACGACGCCCAGCCGGCTCCCACCGAGCCTGCTGGAC TGCACCGACGACGACGACGCCGCGTCGACTGCCGGGTGTCCGAGCTTCCA CACGGCGAGCAGCACCCCGGACTGGGCCGTCCACTCGTGGCTGCCCAGCC CCGGCGCCGTCGAGGTCGACGGCGACAGGCGCGCCGAGGAGTTCATCGA GAGGTTCTGGCGCAACGTGTCCCTGGAGCTGCGGTACTGCTCGCCGGTTA CGCCCGCCAGGCCGCCCGTGTCGCCGGACACGTACTTCAACCTCTCGAGG CTTAGTCATAGGATCTGCCTTGATTGA
2.PSBR1氨基酸序列
MEEDGSGTLLRRMLHKAVWAARAIAHLRPSPTTTTTPATTPSRLPPSLLDCTD DDDAASTAGCPSFHTASSTPDWAVHSWLPSPGAVEVDGDRRAEEFIERFWRN VSLELRYCSPVTPARPPVSPDTYFNLSRLSHRICLD
实施例2
该实施例提供一种外源蛋白在线粒体中定位表达的方法：包括如下步骤：
1.信号肽C端连接YFP黄色荧光的载体的构建PSBR1-YFP
克隆PSBR1：在BambooGDB数据库(http://www.bamboogdb.org/)中搜索PH01000831G0490序列,将其命名为PSBR1。根据毛竹中PSBR1序列的开放阅读框(ORF)设计设计引物PSBR1-F：5'-ATGGAGGAAGATGGTAGTGG-3'和PSBR1-R：5'-ATCAAGGCAGATCCTATGAC-3'。使用总RNA提取试剂盒 (Tiangen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China)根据制造商的方案制备来自Moso 竹叶的总RNA。
使用GoScript TM逆转录系统(Promega Biotech，Co.，Ltd.，Beijing，China)，用1μg总RNA合成第一链cDNA。将cDNA用作PCR的模板，使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TakaraBiotech，Co.，Ltd.，Dalian，China)用引物PSBR1-F 和PSBR1-R进行扩增。然后将PCR片段克隆到pEntry中，随后通过测序 (BioSune Biotech，Co.，Ltd.，Shanghai，China)确认。
进一步地，所述植物总RNA提取，采用试剂盒(Tiangen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China)，根据制造商的方案制备来自Moso竹叶的总RNA。提取步骤如下：(1)匀浆处理：50-100mg毛竹叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μl RL(操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1％，如1ml RL中加入10μ lβ-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。)，涡旋剧烈震荡混匀。(2)将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。(3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(通常为225μl)，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1， 12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(5)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的 RNase-Free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀。(6)向吸附柱CR3 中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。(7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(8)向吸附柱CR3中加入500μ l漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(9)重复步骤8。(10)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(11) 将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心 2min，得到RNA溶液。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA样品请在-70℃中保存。掉收集管中的废液，将吸附柱CR3 放回收集管中。
进一步地，采用GoScript TM逆转录系统(Promega Biotech，Co.，Ltd.， Beijing，China)用1μg总RNA合成第一链cDNA。具体如下：(1)使用前将每种组分混合并短暂离心。混合以下内容：
(2)在70℃加热5分钟。立即将冰水冷却至少5分钟。在微量离心机中离心10秒钟。存放在冰上直至添加逆转录混合物。
(3)制备逆转录反应混合物，每个cDNA反应15μl。按照顺序在冰上添加。
(4)将15μl逆转录混合物与5μl RNA和引物混合物混合。
(5)在25℃的加热块中退火5分钟。
(6)在42℃的加热块中延伸长达一小时。
(7)在70℃的加热块中逆转录酶15分钟。
进一步地，将合成的cDNA用作PCR的模板，使用PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶(Takara Biotech，Co.，Ltd.，Dalian，China)用引物PSBR1-F和PSBR1-R 进行扩增。
(1)PCR反应液的配制
(2)PCR反应条件
预变性：98℃30sec；变性：98℃10sec，退火：55℃15sec，延伸： 68℃10sec，30Cycles；终延伸：68℃10min。
进一步地，加A反应在PCR产物中加入1μl TaKaRa r Taq酶72℃处理30 min。将PCR连接到pEntry(Gateway entry vector)载体中，随后通过测序确认，测序公司博尚(中国福州)。
进一步地，pEntry-T载体使用方法如下：
(1)用XcmI限制性内切酶消化pEntry-T质粒，(2)电泳胶回收，(3) 用T4DNA连接酶PCR加A后的产物和步骤2的产物，(4)转化Dh5α感受态细胞，(5)LB培养基培养18小时后挑单克隆，(6)提取质粒，(7)PCR 鉴定并测序。
进一步地，质粒提取采用天根质粒小提试剂盒步骤，操作步骤如下：
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl 的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)
(2)取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
(4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
(5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。注意： P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(7)可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm (～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。
(8)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(9)重复操作步骤8。
(10)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
(11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。
2.构建表达载体
通过TA反应将PCR片段克隆到pEntry中，然后通过LR反应与目的载体pEarleyGate 101载体(35S：C-YFP)(Earley等，2006)重组(Invitrogen) 获得pEarleyGate101-PSBR1质粒(35S∷PSBR1-YFP)。将所有构建体转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101中。
进一步地，根癌农杆菌转化采用100μl农杆菌细胞加小于1μl的质粒，混匀后加入电击杯中，冰上放置5分钟，擦干电击杯外部的水分，放入电击转化仪中(BTX，Model ECM630)。
进一步地，电击转化条件为：模式：2.5kV/RESISTANCE High Voltage(HV)；电击杯类型：BTX Disposable Cuvette P/N 610(1mm gap)；电容：50μF；电阻：125Ω；电压：1.4kV；额定场强(供参考)：14.4kV/cm；额定脉冲长度(供参考)： 5.0msec；转化后的菌液加入1ml的无抗LB在28℃摇床培养2小时，40000g 离心2分钟，弃部分上清混匀后涂在含有kana抗性的培养基上，置于28℃培养 48h。
3.重组质粒烟草瞬时表达
(1)用5ml的LB液体培养基28℃培养12小时左右。(2)室温5000g 离心10min，弃上清，沉淀用3ml MgCL2(10mM)液悬浮。(3)测浓度，用OD600。(4)用10mM MgCL2稀释农杆菌悬浮液至，10ml总体积，每个菌的浓度为OD600＝0.5。(5)加150μM乙酰丁香酮。(6)注射器注射至烟草背面，24后可观察荧光。(7)用倒置的Leica TCS SP8X DLS显微镜进行观察和成像。对于YFP和mCherry的激发，分别使用488和594nm激光。检测发射波长为520至580(YFP)，600至630(mCherry)，其结果如附图1-4所示。
实施例3
信号肽PSBR1的DNA序列和氨基酸序列在线粒体中定位表达外源蛋白的应用。
有益效果：通过氨基酸序列预测的蛋白质的亚细胞定位信息目前还没有很高准确性,而大规模的蛋白质组学方法由于较难分离低丰度蛋白质,在制备蛋白样品是避免不了污染,也存在一定的局限性。对于细胞内的点状的结构很难判断具体是什么细胞器，而且由于线粒体在某些组织的细胞中含量非常高，在细胞的任何地方都有分布，这是往往会被错误的判断为表达在细胞的任何区域。所以有一个线粒体定位的标记基因作为对照是至关重要的，本研究克隆了一段毛竹基因的序列，将其构建到表达载体上，并转化农杆菌后在烟草叶片表皮细胞瞬时表达，使用激光共聚焦显微镜观察发现PSBR1荧光信号与线粒体标记基因的荧光信号重合，说明PSBR1可以将连接在C端的黄色荧光蛋白导入线粒体。类似的将转运肽与荧光素蛋白融合,能够进行活细胞中观察,省时省力，是研究蛋白功能的基础的方法。同时，本研究给出的PSBR1-YFP融合蛋白可做为一个线粒体定位的标记基因，为亚细胞定位的提供了一种可靠的比对方法。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
<110> 福建农林大学
<120> 一种在线粒体中定位表达外源蛋白的方法
<140> 201811512195.2
<141>2018-12-12
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211>426
<212> DNA
<213> 毛竹（Phyllostachys edulis）
<400> 1
ATGGAGGAAGATGGTAGTGGTACGCTTCTACGGCGTATGCTGCATAAGGCAGTATGGGCAGCGAGAGCCATAGCTCACCTCCGTCCATCTCCGACGACGACGACGACACCGGCAACGACGCCCAGCCGGCTCCCACCGAGCCTGCTGGACTGCACCGACGACGACGACGCCGCGTCGACTGCCGGGTGTCCGAGCTTCCACACGGCGAGCAGCACCCCGGACTGGGCCGTCCACTCGTGGCTGCCCAGCCCCGGCGCCGTCGAGGTCGACGGCGACAGGCGCGCCGAGGAGTTCATCGAGAGGTTCTGGCGCAACGTGTCCCTGGAGCTGCGGTACTGCTCGCCGGTTACGCCCGCCAGGCCGCCCGTGTCGCCGGACACGTACTTCAACCTCTCGAGGCTTAGTCATAGGATCTGCCTTGATTGA
<210> 2
<211>141
<212> PRT
<213> 毛竹（Phyllostachys edulis）
<400> 2
MEEDGSGTLLRRMLHKAVWAARAIAHLRPSPTTTTTPATTPSRLPPSLLDCTDDDDAASTAGCPSFHTASSTPDWAVHSWLPSPGAVEVDGDRRAEEFIERFWRNVSLELRYCSPVTPARPPVSPDTYFNLSRLSHRICLD
Claims (7)
1.信号肽PSBR1的DNA序列，其特征在于，所述信号肽PSBR1的DNA序列如序列表SEQ IDNO：1所示。
2.信号肽PSBR1的氨基酸序列，其特征在于，所述信号肽PSBR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
3.信号肽PSBR1的DNA序列和氨基酸序列在线粒体中定位表达外源蛋白的应用。
4.一种将外源蛋白定位到线粒体中的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)信号肽C端连接YFP黄色荧光的载体的构建PSBR1-YFP；(2)构建表达载体；(3)重组质粒烟草瞬时表达。
5.根据权利要求4所述的一种将外源蛋白定位到线粒体中的方法，其特征在于，步骤1信号肽C端连接YFP黄色荧光的载体的构建PSBR1-YFP包括：克隆PSBR1、总RNA提取、合成第一链cDNA、PSBR1-R扩增、PCR片段克隆到pEntry载体。
6.根据权利要求4所述的一种将外源蛋白定位到线粒体中的方法，其特征在于，步骤2构建表达载体包括：通过TA反应将PCR片段克隆到pEntry中，然后通过LR反应与目的载体pEarleyGate 101载体(35S：C-YFP)重组获得pEarleyGate 101-PSBR1质粒(35S∷PSBR1-YFP)；将所有构建体转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101中。
7.根据权利要求4所述的一种将外源蛋白定位到线粒体中的方法，其特征在于，步骤3重组质粒烟草瞬时表达包括：(1)用5ml的LB液体培养基28℃培养12小时左右；(2)室温5000g离心10min，弃上清，沉淀用3ml MgCl2(10mM)液悬浮；(3)测浓度，用OD600；(4)用10mMMgCl2稀释农杆菌悬浮液至，10ml总体积，每个菌的浓度为OD600＝0.5；(5)加150μM乙酰丁香酮；(6)注射器注射至烟草背面，24后可观察荧光；(7)用倒置的Leica TCS SP8X DLS显微镜进行观察和成像，对于YFP和mCherry的激发，分别使用488和594nm激光；检测发射波长为520至580(YFP)，600至630(mCherry)。
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- 2018-12-11 CN CN201811512195.2A patent/CN109777807B/zh active Active
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