CN1847401A - 一种特异靶向线粒体的真核表达载体，其构建方法及用途 - Google Patents

一种特异靶向线粒体的真核表达载体，其构建方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1847401A
CN1847401A CN 200510123793 CN200510123793A CN1847401A CN 1847401 A CN1847401 A CN 1847401A CN 200510123793 CN200510123793 CN 200510123793 CN 200510123793 A CN200510123793 A CN 200510123793A CN 1847401 A CN1847401 A CN 1847401A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rfp
pmito
ires
cox8
pcdnamito
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 200510123793
Other languages
English (en)
Inventor
陆应麟
郝好杰
徐元基
王妍
杜芝燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Original Assignee
Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Basic Medical Sciences of AMMS filed Critical Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority to CN 200510123793 priority Critical patent/CN1847401A/zh
Publication of CN1847401A publication Critical patent/CN1847401A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种靶向线粒体表达载体，还公开了其制备方法及用途。本发明的载体，含有COX的前导信号肽序列、HCMV增强子和启动子、多克隆位点和polyA信号、以及RFP红色荧光指示信号。本发明载体的制备方法包括pcDNAmito的制备、pcDNAmito－RFP的制备、pIRESmito及pIRESmito－RFP制备，及pmito－IRES－RFP的制备等步骤。本发明的载体可以将外源基因插入到载体多克隆位点，用于将外源基因输送至线粒体内部；还可用于将外源性插入基因与COX8、neo基因共表达，提高克隆筛选效率。

Description

一种特异靶向线粒体的真核表达载体，其构建方法及用途
技术领域
本发明涉及一种真核表达载体，具体地说涉及一种特异靶向线粒体的真核表达载体，还涉及其构建方法及用途。
背景技术
人线粒体DNA是哺乳动物核基因组外唯一有自主复制能力的细胞器，它通过氧化磷酸化过程产生机体所需的能量。1988年Wallace等第一次提出Leber遗传性视神经眼病是由线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突变引起。此后的研究发现约有上百种疾病与mtDNA突变有关，包括Leler遗传性视神经眼病、线粒体脑肌病、乳酸中毒、糖尿病、神经退行性疾病、肿瘤以及人类老化等。到目前为止，对于mtDNA突变相关疾病的治疗尚无有效的措施。由于线粒体疾病的根本原因为mtDNA的突变以及突变的mtDNA在细胞内的蓄积，因此一般的生化手段起不到相应的作用。治疗线粒体疾病，只有通过基因治疗的手段，输入正确的线粒体的基因去置换或修正突变的线粒体基因，从而根本上纠正线粒体疾病。
线粒体疾病的基因治疗，最关键是使其表达的基因或蛋白进入线粒体内部而发挥活性。De-Grey(Trends Biotechnol.2000，18：394-9)认为，线粒体疾病治疗途径大致可以分为直接输入核表达的蛋白或RNA到线粒体内、直接置换线粒体内的一个基因以及在一定范围内限制突变的mtDNA的复制或转录等。然而目前仍没有合适的载体能将DNA特别是mtDNA直接导入线粒体内部。
大多数线粒体多肽是在胞浆中合成，然后导入线粒体，在线粒体内正确的位置组装成最后的蛋白。这是通过位于外膜、膜内腔、内膜以及基质上若干元件组成的线粒体导入机制完成的。典型的靶向线粒体基质的蛋白的N端有20个～30个氨基酸的靶向信号肽，此信号肽形成含有大量负电荷的α螺旋。当其在胞浆内翻译后，此蛋白具有导入能力，并在胞浆分子“伴娘”的作用下维持非折叠状态，其靶序列与线粒体外膜受体结合，然后此蛋白在线粒体外膜转位酶机制的作用下穿过外膜上的亲水孔道，此时被拉成线状。在线粒体基质中，信号序列常被肽酶切掉，而多肽则被组装到最后的蛋白质中。利用这一短的信号肽足以将附着其上的多肽导向线粒体。在进行线粒体基因缺失疾病的治疗方法的体外细胞研究中，导入的正确编码基因的表达产物的N端连以信号序列，可成功地将其靶向导入线粒体。
利用蛋白质导入机制，Partikian等(J Cell Biol.1998，140：821-829)构建了含有COX8前导序列的真核表达的靶向载体，并将绿色荧光蛋白转染到线粒体内部。Owen等(Hum Gene Ther.2000；11：2067-78)把前导序列插入到重组的腺相关病毒(rAAV)载体中，也成功将外源性绿色荧光蛋白导入到线粒体内部。Guy等(Annals of Neurology 2002；52：535-542)结合异位表达技术，构建了线粒体靶向的病毒载体，将人的mtDNA的ND4基因定点突变为核编码的基因，由信号肽引导成功进入线粒体内部，为纠正由ND4突变引起的疾病开辟了新的途径。
但目前的靶向线粒体的真核表达载体同样面临着像普通的基因治疗所用的真核表达载体的问题，那就是如何高效地将外源基因导入到细胞内部。病毒型载体尽管转染效率高，但其制备复杂，有免疫原性，不能体内反复应用，存在安全性隐患，因此必须进一步改善。而非病毒载体最大的问题是转染效率低，表达时间短暂，且插入的外源基因与选择标记基因由于采用各自独立的表达盒，选择压力施加在抗药基因的表达上，筛选出克隆的目的基因的表达往往不高，甚至检测不到。目前尚未见到将内部核糖体进入位点(IRES)的序列引入靶向载体中，建立允许插入基因与筛选基因同时表达的靶向线粒体的真核表达载体。
发明内容
本发明目的是构建特异靶向真核细胞线粒体的真核表达载体，为线粒体疾病的实验研究提供一种有用的工具。本发明公开了一种线粒体靶向的真核表达载体，该载体含有COX8的前导信号肽作为引导线粒体特异的信号肽，并提供了CMV立早增强子和启动子，多克隆位点和polyA信号，和RFP荧光指示信号。本发明的载体还包括内源性核糖进入位点IRES序列。
本发明的载体可以将一个外源性的蛋白、或线粒体蛋白通过异位表达，在胞浆转录后，与信号肽形成融合蛋白，在信号肽的引导下，进入线粒体内部而发挥效应。含有的IRES序列允许G418与目的蛋白共表达。利用本发明的载体，将外源性的红色荧光蛋白pDsREDnl中荧光蛋白基因序列克隆至构建的载体的多克隆位点，导入到肿瘤细胞内的线粒体中获得稳定表达。
本发明构建的pIRESmito和pmito-IRES-RFP载体质粒用于将外源性的由核表达的线粒体基因，或是由线粒体表达的线粒体基因通过异位表达输送至线粒体内部；本发明构建的pIRESmito和pmito-IRES-RFP载体质粒，含有IRES序列，允许COX8与外源性插入基因构成融合的蛋白与neo基因共同表达，提高克隆筛选效率。
本发明还公开了上述靶向线粒体的真核表达载体的制备方法，该方法包括如下步骤：
1.pcDNAmito及pcDNAmito-RFP的构建
首先选取COX8的前29个氨基酸作为前导序列，设计扩增其全长的PCR引物，通过RT-PCR方法，从人胚肺成纤维细胞中扩增全长靶向序列，插入到pcDNA3.1A中，构建pcDNAmito。然后将从pDsREDnl上切下来的RFP克隆至pcDNAmito，构建pcDNAmito-RFP。
2.pIRESmito及pIRESmito-RFP载体的构建
从pcDNAmito及pcDNAmito-RFP中获取COX8及COX8-RFP，分别插入pIRESneo载体，构建pIRESmito及pIRESmito-RFP。
3.pmito-IRES-RFP载体构建
将COX8克隆至pDsREDnl中，构建pmito-RFP。从pIRESneo中获取IRES片段，克隆至pmito-RFP中，构建pmito-IRES-RFP。
本发明还公开了上述靶向线粒体的真核表达载体在携带、表达外源基因，提高克隆筛选效率中的应用。
本发明利用蛋白质导入机制，构建了靶向线粒体的真核表达载体，它包含了来源于小RNA病毒科脑心肌炎病毒RNA 5’端的一段非翻译区的IRES序列。IRES序列具有内部核糖体进入位点的功能，即能在内部起始位点独立启动不依赖帽子的翻译，其优点在于将IRES与多个非相关基因连接在一起，可同时转录成一条单链RNA，但翻译又是各自独立的，这样就可保证用IRES序列连接的非相关基因各自独立的表达。利用这一特性，可以使前导信号与RFP形成的融合基因与筛选抗性基因共同表达，提高靶向载体转染克隆效率。
附图说明
图1为本发明所用的基本质粒载体pcDNAmito的构建图
图2为本发明构建pIRESmito的过程
图3为本发明构建pmito-IRES-RFP的过程
图4激光共聚焦显微镜鉴定结果。其中a为罗丹明123激发绿光荧光，b为RFP激发红色荧光，c为重合图。
具体实施方式
实施例1  靶向线粒体载体的构建
一、材料
pDsREDl-nl、pIRESneo载体为CLONTECH公司产品。RT-PCR及连接试剂盒购于MBI公司。pcDNA3.1/myc-HisA购自Invitrogen公司。宿主菌DH5α、限制性内切酶、DNA聚合酶klenow片段购自Takara公司。pGEM-T-Easy载体为Promega公司产品。质粒DNA纯化、凝胶回收试剂盒为上海申能博彩公司产品。
二、方法与结果
1.pcDNAmito及pcDNAmito-RFP的构建
(1)用PCR扩增COX8信号肽序列
根据线粒体蛋白细胞色素C氧化亚单位VIII(COX8)的信号肽序列(Genebank GI：1311703)，选取COX8的前29个氨基酸作为前导序列，其cDNA序列如序列表中序列1所示，设计扩增COX8前导序列全长的PCR引物，并在其5’端加上KpN I内切酶酶切位点，3’端加上EcoR I内切酶酶切位点，分别如序列表中序列2和序列3所示。
从人胚肺成纤维细胞中纯化总RNA，反转录成cDNA，用特异引物进行PCR扩增。PCR扩增条件：94℃变性5min，94℃40s，57℃40s，72℃40s，30循环，72℃5min。琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现100bp左右的扩增带，符合设计长度。将PCR产物用无水乙醇沉淀后，溶于TE中。
(2)连接PCR产物到pGEM-T-Easy载体中
将PCR产物在T4DNA连接酶的作用下，克隆至pGEM-T-Easy载体中，经X-gal/IPTG筛选，获得阳性克隆，经酶切鉴定符合大小。
(3)构建重组的pcDNAmito及pcDNAmito-RFP
从构建的含COX8的pGEM-T-Easy载体中用KpNI及EcoR工双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收COX8序列，插入到pcDNA3.1A中的KpN I，EcoR I位点，获得重组质粒pcDNAmito，经内切酶、DNA序列分析证实插入片段正确(图1)。然后将从pDsREDnl(Clontech公司)上用Not I及EcoR I双酶切切下来的RFP克隆至pcDNAmito，构建pcDNAmito-RFP。
2.构建pIRES-mito及pIRESmito-RFP重组质粒
首先，KpN I酶切pcDNAmito及pcDNAmito-RFP质粒，再用DNA聚合酶Klenow片段补平粘末端后，用Not I酶切，琼脂糖凝胶电泳回收COX8及COX8-RFP片段，分别插入到pIRESneo的EcoR V，Not I酶切位点，克隆筛选，获得pIRESmito及pIRESmito-RFP质粒，经酶切、PCR鉴定符合(图2)。
本发明所构建的载体的特征是，包含线粒体特异的靶向信号肽序列，可以将克隆于多克隆位点的目的基因形成融合蛋白而进入线粒体内部。含有IRES序列，可以使目的基因与G418基因实现共同表达，提高克隆筛选的效率。
3.pmito-IRES-RFP的构建及特征
(1)构建pmito-RFP
将pcDNAmito载体用HindIII及EcoR I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收含COX8片段，在T4连接酶作用下，克隆至pDsREDnl中，构建pmito-RFP。
(2)构建pmito-IRES-RFP
用Sam I及EcoR I酶切pIRESneo，琼脂糖凝胶电泳回收IRES片段，同时用Sam I及EcoR I酶切pmito-RFP，将IRES片段插入到pmito-RFP中的Sam I，EcoR I酶点，构建pmito-IRES-RFP(图3)
(3)特征
本发明构建的线粒体特异的真核载体pmito-IRES-RFP，具有能特异导向真核细胞线粒体的靶向信号序列，并含有红色荧光的指示信号。含有IRES序列，允许插入片段与红色荧光蛋白同时稳定表达，且红色荧光蛋白定位于胞浆中减少外源性蛋白进入线粒体的不利因素。
实施例2  pIRES-mito及pIRES-mito-RFP在肿瘤细胞系Hela中的表达
一、材料
lipofectamine2000脂质体购自Invitrgene公司，DMEM购自Gibco BRL公司，罗丹明123，G418为Sigma公司产品，Radiance2000型激光共聚焦显微镜(LSCM)系美国Bio-Rad公司产品。
二、方法
1.采用SDS碱裂解-聚乙二醇沉淀法纯化pIRESmito-RFP，pcDNAmito-RFP及pDsREDnl质粒DNA。
2.转染Hela细胞
按6×104个细胞/孔将Hela细胞接种24孔扳上，待细胞长至50％融合时用于转染。pIRESmito-RFP及pDsREDnl分别按1∶3加lipofectamin2000脂质体，混匀并置室温下孵育30min后，加于培养板中，置37℃，30％CO2孵箱培养5h，弃含质粒DNA/脂质体的培养基，加入10％小牛血清DMEM，继续培养。
3.瞬时转染在16、24、48、72h于荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达；稳定表达在72h时按1∶8-1∶10传代，加入200μg/ml的G418压力筛选，至克隆出现，挑取克隆继续用100μg/ml的G418维持。
4.激光共聚焦显微镜进一步鉴定
将克隆细胞传代至6孔板内，内含有小盖玻片，至50％单层时，弃培养基并用PBS冲洗细胞，加1mg/ml罗丹明123，37℃避光温育15min，吸去标记液，用PBS冲洗后封片，激光共聚焦显微镜观测。罗丹明123在激发波长504nm激发绿光，作为线粒体的示踪剂，RFP在激发波长558nm激发红色荧光。
5.G418筛选阳性率
转染的Hela细胞经G418筛选，20天后培养板中清晰可见克隆形成。在倒置荧光显微镜下分别用普通光和荧光记数克隆数和产生荧光的克隆数，结果pIRES-mito-RFP转染的Hela细胞中共获得11个克隆，获得8个红色荧光克隆，而转染pcDNAmito-RFP的Hela细胞孔中共有9个克隆，只有2个克隆中有红色荧光。pIRES-mito-RFP的转染的形成克隆的基因表达率明显高于pcDNAmito-RFP。
三、结果
1.表达蛋白的检测
在荧光显微镜下，pIRES-mito-RFP在16h观察到散在的红色荧光，荧光定位于胞浆呈散在颗粒，至72h时荧光最强，荧光信号弥散于整个胞浆，胞核没有荧光出现；而对照质粒pDsREDnl产生的红色荧光均匀充满整个细胞。
2.激光共聚焦显微镜鉴定
结果红色荧光蛋白的散在颗粒的位置与罗丹明123激发的绿色荧光的位置相同，证明在信号肽的引导下，信号肽与RFP产生的融合蛋白特异进入线粒体内内部(图4)。
3.G418筛选阳性率
在倒置荧光显微镜下分别用普通光和荧光记数克隆数和产生荧光的克隆数，结果pIRES-mito-RFP转染的Hela细胞中共获得11个克隆，获得8个红色荧光克隆，而转染pcDNAmito-RFP的Hela细胞孔中共有9个克隆，只有2个克隆中有红色荧光。pIRES-mito-RFP的转染的形成克隆的基因表达率明显高于pcDNAmito-RFP。
实施例3  pmito-IRES-RFP在肿瘤细胞系Hela中的表达
一、材料
lipofectamine2000脂质体购自Invitrgene公司，DMEM购自Gibco BRL公司，罗丹明123、G418为Sigma公司产品，Radiance2000型激光共聚焦显微镜(LSCM)系美国Bio-Rad公司产品。
二、方法
1.采用SDS碱裂解-聚乙二醇沉淀法纯化pmito-IRES-RFP，pmito-RFP质粒DNA。
2.转染Hela细胞
按6×104个细胞/孔将Hela细胞接种24孔扳上，待细胞长至50％融合时用于转染。Pmito-IRES-RFP及pmito-RFP分别按1∶3加lipofectamin2000脂质体，混匀并置室温下孵育30min后，加于培养板中，置37℃，3％CO2孵箱培养5h，弃含质粒DNA/月旨质体的培养基，加入10％小牛血清DMEM，继续培养。
3.瞬时转染在16、24、48、72h于荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达；稳定表达在72h时按1∶8-1∶10传代，加入200μg/ml的G418压力筛选，至克隆出现，挑取克隆继续用100μg/ml的G418维持。
4.G418筛选阳性率
转染的Hela细胞经G418筛选，20天后培养板中清晰可见克隆形成。在倒置荧光显微镜下分别用普通光和荧光记数克隆数和产生荧光的克隆数。
三、结果
1.表达蛋白的检测
在荧光显微镜下，24h观察到散在的红色荧光，pmito-RFP荧光定位于胞浆呈散在颗粒，至72h时荧光最强，荧光信号弥散于整个胞浆，胞核没有荧光出现；而pmito-IRES-RFP在24h只有个别的荧光产生，至72h时荧光信号最强，红色荧光均匀分布整个细胞。
3.G418筛选阳性率
转染的Hela细胞经G418筛选，20天后培养板中清晰可见克隆形成。在倒置荧光显微镜下分别用普通光和荧光记数克隆数和产生荧光的克隆数，结果pmito-IRES-RFP转染的Hela细胞中共获得8个克隆，获得6个红色荧光克隆，而转染pmito-RFP的Hela细胞孔中共有15个克隆，只有4个克隆中有红色荧光。Pmito-IRES-RFP的转染的形成克隆的基因表达率明显高于pmito-RFP。
                     序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
<120>一种特异靶向线粒体的真核表达载体，其构建方法及用途
<130>
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>87
<212>DNA
<213>
<400>1
atgtccgtcc tgacgccgct gctgctgcgg ggcttgacag gctcggcccg gcggctccca    60
gtgccgcgcg ccaagatcca ttcgttg                         87
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>
<400>2
cggggtacca tgtccgtcct gacgccg                         27
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>
<400>3
ggccttaagc aacgaatgga tcttggcgc                       29

Claims (4)

1.一种特异靶向线粒体的真核表达载体，其特征在于含有COX8的前导信号肽、HCMV增强子和启动子、多克隆位点和polyA信号，以及RFP红色荧光指示信号。
2.根据权利要求1所述真核表达载体，其特征在于含有内源性核糖进入位点IRES序列。
3.权利要求1或2所述真核表达载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将COX8的前导序列插入到pcDNA3.1A中，构建pcDNAmito载体；
(2)从pDsREDn1中制备RFP，克隆至pcDNAmito，制备pcDNAmito-RFP；
(3)从上述制备的两载体中制备COX8及COX8-RFP，分别克隆至pIRESneo中，制备pIRESmito及pIRESmito-RFP载体；
(4)将COX8克隆至pDsREDn1中制备pmito-RFP，从pIRESneo中制备IRES片段，将其克隆至pmito-RFP中，制备pmito-IRES-RFP。
4.权利要求1或2所述pIRESmito及pmito-IRES-RFP载体在携带、表达外源基因，提高克隆筛选效率中的应用。
CN 200510123793 2005-03-30 2005-11-24 一种特异靶向线粒体的真核表达载体，其构建方法及用途 Pending CN1847401A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200510123793 CN1847401A (zh) 2005-03-30 2005-11-24 一种特异靶向线粒体的真核表达载体，其构建方法及用途

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200510011500 2005-03-30
CN200510011500.6 2005-03-30
CN 200510123793 CN1847401A (zh) 2005-03-30 2005-11-24 一种特异靶向线粒体的真核表达载体，其构建方法及用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1847401A true CN1847401A (zh) 2006-10-18

Family

ID=37077140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200510123793 Pending CN1847401A (zh) 2005-03-30 2005-11-24 一种特异靶向线粒体的真核表达载体，其构建方法及用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1847401A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974560A (zh) * 2010-10-19 2011-02-16 南开大学 植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T构建及启动子活性鉴定
CN101497875B (zh) * 2008-12-29 2011-05-18 浙江大学 红色荧光特异性标记线粒体细胞系的建立及应用
CN109777807A (zh) * 2018-12-11 2019-05-21 福建农林大学 一种在线粒体中定位表达外源蛋白的方法
WO2021136347A1 (zh) * 2019-12-30 2021-07-08 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种哺乳动物表达系统使用的高表达载体
CN117844863A (zh) * 2024-03-06 2024-04-09 云南师范大学 一种马铃薯线粒体靶向表达载体、构建方法及应用

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101497875B (zh) * 2008-12-29 2011-05-18 浙江大学 红色荧光特异性标记线粒体细胞系的建立及应用
CN101974560A (zh) * 2010-10-19 2011-02-16 南开大学 植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T构建及启动子活性鉴定
CN109777807A (zh) * 2018-12-11 2019-05-21 福建农林大学 一种在线粒体中定位表达外源蛋白的方法
CN109777807B (zh) * 2018-12-11 2020-09-15 福建农林大学 一种在线粒体中定位表达外源蛋白的方法
WO2021136347A1 (zh) * 2019-12-30 2021-07-08 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种哺乳动物表达系统使用的高表达载体
CN114901828A (zh) * 2019-12-30 2022-08-12 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种哺乳动物表达系统使用的高表达载体
CN117844863A (zh) * 2024-03-06 2024-04-09 云南师范大学 一种马铃薯线粒体靶向表达载体、构建方法及应用
CN117844863B (zh) * 2024-03-06 2024-05-17 云南师范大学 一种马铃薯线粒体靶向表达载体、构建方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1159445C (zh) 能在心脏中组织特异性表达的重组腺病毒
Kim et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice
CN1177046C (zh) 增强的病毒介导的dna转移
CN1236390A (zh) 血管形成因子及其在治疗心血管疾病中的用途
CN1335890A (zh) 含有位于固有基因起始密码子上游的外源启动子和完整5′非翻译区作为转录调控位点的高效哺乳动物
CN1847401A (zh) 一种特异靶向线粒体的真核表达载体，其构建方法及用途
CN105802997A (zh) 一种人类及哺乳动物细胞附着体表达载体、构建方法和应用
CN102584975B (zh) 一种核仁定位信号肽及其编码基因和应用
CN112813099A (zh) 一种在活化的t细胞中具有高活性的启动子
CN1654667A (zh) 减毒hsv－1基因治疗载体
CN1869242A (zh) 一种重组腺病毒及其应用
CN1869217A (zh) 以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法
CN100335631C (zh) 三股螺旋蛋白的稳定表达
CN1629288A (zh) 表达ctb和人胰岛素融合蛋白的重组家蚕杆状病毒及其应用
CN1966683A (zh) 表达新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒
CN100338220C (zh) 一种肝脏高效表达调控序列及其应用
CN103160501B (zh) 基因表达盒及其构建方法和应用
CN114480392B (zh) 一种用于真核基因表达的启动子及其载体和应用
CN1908169A (zh) 人食管癌细胞ezrin基因启动子
CN1778919A (zh) 一种人mdr1基因表达调节剂筛选系统及其筛选基因表达调节剂的方法
CN1300321C (zh) 对肿瘤细胞有促凋亡功能的Survivin突变体重组腺病毒及获得方法
CN1544637A (zh) mB7.1-GPI融合蛋白的制备及其应用
CN1686566A (zh) Cark基因在制备治疗心肌肥厚药物中的应用及一种抑制心肌肥厚的药物
CN1183959C (zh) 抑瘤多肽tsf及其基因治疗载体组合物
CN1664099A (zh) 用于转基因青鳉鱼的基因片段

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication