CN1966683A

CN1966683A - 表达新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒

Info

Publication number: CN1966683A
Application number: CN 200510101271
Authority: CN
Inventors: 王尚武; 朱雅南
Original assignee: Individual
Current assignee: Guangzhou Caino Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2005-11-17
Filing date: 2005-11-17
Publication date: 2007-05-23
Anticipated expiration: 2025-11-17
Also published as: CN1966683B

Abstract

本发明为一种表达新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒的表达结构，其主要特征为1)野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突变成为精氨酸，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；2)该P53抑癌基因在其N－末端以内切酶Nhe1和C－末端以内切酶BamH1片段拼接于穿梭质粒pDC315超强启动子mMCV的下游；和3)重组的腺病毒载体为以Ad35纤突结取代Ad5型腺病毒的纤突结的复制缺陷型腺病毒载体。该新型p53抑癌基因腺病毒具有感染力更强、感染组织/细胞谱更广、表达新型p53抑癌基因更强、其产物具有更强细胞凋亡生物功能。

Description

表达新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒

技术领域

本发明涉及人新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒备制方法，其备制的重组腺病毒表达一种具有较野生型P53的细胞凋亡功能更强的新型肿瘤抑制基因p53蛋白，用于多种癌症的治疗。因此其所在的技术领域与生命医药和生物技术有关。

背景技术

P53基因是肿瘤抑制基因家族中的主要成员，是目前发现与人类肿瘤发生的相关性最高的基因。野生型p53基因在维持细胞正常生长、抑制恶性肿瘤细胞增生中起重要作用。环境中各种的因素，如紫外线、放射线和化学物质以及机体自身产生的某些代谢产物等都可导致细胞DNA损伤。在正常生理情况下，这些细胞DNA能在某些基因产物作用下进行修复或被降解清除，防止其遗传下去而保持正常DNA的复制，进而保护细胞的正常功能运作。否则损伤的DNA会继续复制、随染色体分离，导致染色体组中出现大量的DNA突变和染色体畸变。这些突变的进一步积聚将便正常细胞最终恶化，发展成癌细胞。

现有的大量研究表明野生型P53蛋白质在细胞内发挥着“基因卫士”的生物功能作用，监视着细胞基因组的完整性和稳定性。在细胞DNA受到损伤时，P53迅速活化P21基因的转录，抑制多种原癌基因，如c-Fos、c-jun、Rb和其他相关基因如IL-6、PCNA的转录，使细胞分裂停滞在G1期节点。同时，野生型P53蛋白质与复制因子(RPA)相互作用，参与DNA的复制和修复。更为重要的是，野生型P53蛋白质能启动细胞程序性死亡过程，诱导细胞自杀，防止具有恶变倾向的细胞进一步分裂、增殖，从而防止癌症的发生。

P53基因突变是人类恶性肿瘤中最常见的遗传变异。据统计，大约有50％的人类肿瘤发生与P53基因突变有关，有30％-40％的乳腺癌、50％的肺癌和70％的结肠癌存在P53基因突变；几乎100％的小细胞性肺癌有P53基因突变。此外，动物实验表明，表达异常P53基因蛋白的小鼠100％的发生肿瘤。

由于P53基因如此重要的生物学功能及其与人类肿瘤发生和恶性程度有密切关系，在八十年代以来，科学家就开始了应用外源野生型P53基因的生物学功能，启动P53基因缺陷型肿瘤细胞的细胞程序性凋亡过程，诱导肿瘤细胞自杀死亡的实验研究和临床肿瘤基因治疗研究。现在众多的研究报告以及临床研究结果证明，野生型P53基因冶疗安全、有效，而且毒副作用小。

临床研究结果表明，野生型P53基因对人头颈肿瘤、脑胶质细胞瘤、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤和肺癌有较好疗效。同时研究还表明野生型P53基因还具有抑制肿瘤组织内血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的作用，因而减少肿瘤组织内血管的形成，减少肿瘤组织的血供，起着进一步促进肿瘤细胞死亡的作用。

野生型P53基因的某些氨基位点在自然状态下存在多态性，例如在47位点存在脯氨酸/丝氨酸多态性。研究发现野生型P53此47位点为脯氨酸，但在不足5％的非州藉美国人为丝氨酸。已知47位点脯氨酸介导的激酶p38MAPK使邻近的46位点丝氨酸磷酸化可大大增加诱导细胞凋亡的能力；而47位点为丝氨酸的变异，则使p53诱导细胞凋亡的能力下降2-5倍以上。同样，野生型P53基因的72位点存在常见的脯氨酸(P72，下同)/精氨酸(R72，下同)多态性，这种多态性对于野生型P53基因的细胞调亡诱导功能上有很大的意义。P53基因为R72型的，其细胞调亡能力比P72型的强2-15倍以上(Murphy M，et al：2003，3(3)：357-65，Nat.genetics)，其机理被认为至少部份是由于R72型p53基因增加了在线粒体的聚集，能直接与促细胞调亡蛋白BAK相互作用，破坏线粒体，使细胞缺乏能量而导致细胞调亡有关。通过对P53基因第72号密码子多态变异体功能性研究导致了检测这种多态性对人类癌症危险性和发展影响的许多研究。有些研究表明p53基因为P72型的，因其细胞调亡能力较弱，与增加的患癌危险性相关；另一报告表明在易于患结肠癌的家族中，p53基因为P72纯合子的个体比为R72纯合子的个体，其患癌的发病年龄较早，且倾向于多发肿瘤。上述研究结果为使用第72位点为精氨酸的野生型p53对肿瘤进行更有效地基因治疗奠定了基础。

毫无疑问，抗癌基因治疗的成败取决于整个表达结构三大元件的最佳组合。第一个元件为进入机体细胞内的腺病毒载体，要求安全、高效；第二个元件为治疗基因的有效性；第三个元件为驱动抗癌基因表达的启动子的强弱和组织/细胞特异性。

目前，将野生型P53基因导入体内的载体多为复制缺陷型腺病毒载体。这种载体具有感染能力强、靶细胞可以是处于分裂期或是非分裂期、转染细胞后腺病毒载体基因不整合进入人类基因组、可大量生产高滴度腺病毒及其瞬时表达等特点，故复制缺陷型腺病毒载体是目前在肿瘤基因治疗中的首选载体。在肿瘤基因治疗中有着广阔的应用前景。但同时由于这种病毒载体自身的原因，如因其感染细胞须与细胞上的受体结合才能起作用，故其感染与细胞膜上的受体数量呈正比。因此对某些组织细胞而言，由于受体数量少，尤其是肿瘤细胞表面的CAR受体偏少，Ad5对它们的感染有限，故这种病毒难以感染并进入细胞内，有效发挥其携带基因的治疗作用。为了克服这种载体的陷缺，近年研究人员通过基因突变技术，使5型腺病毒的纤突结突变或利用Ad35的纤突结(fiber knob)替代5型腺病毒的纤突结，使感染细胞的范围更广、感染效率更高，对各种造血细胞和肿瘤细胞的感染效率高于普通Ad5，外源基因表达量更多，包装系统高效且稳定。而且，使用的腺病毒数量呈至少一个数量级减少。因此，这应是新一代复制缺陷型腺病毒载体。

重组腺病毒驱动治疗基因表达的启动子可以有多种来源的启动子。目前使用较多是mCMV启动子，这是一种超强启动子，属一种突变型CMV启动子，比hCMV启动子的活性强若干倍，但没有组组织/细胞的特导性，对某些毒性作用较大的治疗基因不大适合。因此，研究人员发展了一些组织/细胞特殊性启动子，如与原发性肝癌有关的胎儿甲种球蛋白基因的启动子。此启动子仅在表达胎儿甲种球蛋白的原发性肝癌细胞内驱动治疗基因的表达，属于一种靶向性基因治疗。不过目前证明这种启动了活性较低，有待进一步研究。但无论如何，靶向性基因治疗是目前和将来癌症治疗研究的一个非常重要的发展方向。

综上所述，构建以新一代复制缺陷型腺病毒为表达载体，利用超强CMV启动子驱动表达R72型的肿瘤抑制基因P53的表达系统，为临床治疗恶性肿瘤提供一种新的、抗癌作用更强的肿瘤基因治疗的药物，将拥有巨大市场前景的，产生诱人的社会、经济效益。

发明内容

本发明的目的以细胞调亡功能更强的R72型肿瘤抑制基因P53为治疗基因，以新一代复制缺陷型腺病毒载体和超强启动子mMCV为调控元件，构建新一代抗癌作用更强的肿瘤基因P53表达系统，使其成为临床恶性肿瘤的基因治疗的新一代产品。本发明的表达新型抑癌基因P53腺病毒表达结构，其主要特点为1)，野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突变成为精氨酸，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；2).该P53抑癌基因在其N-末端以内切酶Nhe1和C-末端以内切酶BamH1片段拼接于穿梭质粒pDC315超强启动子mMCV的下游；3).重组的腺病毒载体为以Ad35纤突结取代Ad5型腺病毒的纤突结的复制缺陷型腺病毒载体；4).该新型p53抑癌基因腺病毒表达系统具有感染力强、感染组织/细胞谱广、新型p53抑癌基因表达强、具有更强细胞凋亡生物功能。

附图说明

附图1人野生型肿瘤抑制因子P53基因的PCR产物：应用人工合成的特异性引物，以人正常组织cDNA为模板，进行PCR反应，其反应产物在1.5％琼脂糖电泳分离；纯化后进行克隆。第一泳道和第二泳道为PCR产物、第三泳道为Φ174/BsuRI DNA分子量标记物。PCR产物约为1200碱基对。

附图2肿瘤抑制因子P53突变型R72的内切酶图谱：R72突变型肿瘤抑制因子P53在突变位点形成新的核苷酸内切酶smal1位点。用内切酶smal1分别消化R72突变型和野生型肿瘤抑制因子P53后，R72突变型产生二个DNA片段；野生型仅产生一个DNA片段。图示电泳第一泳道为landa/Hind111 DNA分子量标记物，第二泳道为1kB DNA分子量标记物；第三泳道为为野生型肿瘤抑制因子P53；

第四泳道R72突变型肿瘤抑制因子P53。

附图3表达R72型肿瘤抑制因子P53重组腺病毒的工艺流程图：叙述了从人正常组织提取总核糖核酸、互补脱氧核糖核酸合成、人肿瘤抑制因子P53基因的克隆和突变、真核细胞表达质粒构建、腺病毒穿突变人肿瘤抑制因子P53穿梭质粒构建以及表达R72型肿瘤抑制因子P53重组腺病毒的整个工艺过程。附图4表达R72型肿瘤抑制因子P53重组腺病毒结构图：结构图中两瑞分别为腺病毒的左臂和右臂，表达盒由超强CMV启动子、R72型肿瘤抑制因子P53和SV40多聚腺苷酸组成。

具体实施方式

一、R72型肿瘤抑制因子P53的形成：其方法是采用基因突变技术，使野生型第72位脯氨酸的密码子ccc(P72)突变成精氨酸的密码子cgg(R72)，在突变区形成新的核苷酸内切酶smal1位点。

1).人野生型肿瘤抑制因子P53基因5’-端Nco1至笫72位密码子片段扩增：

以人野生型P72肿瘤抑制因子P53基因cDNA中N’-端-Nco1-突变区片

段作为模板，用人工合成的引物进行PCR扩增。

PCR引物设计如下：

引物1：

N端：5’-gccttccgggtcactg

aggagccg-3’

30mer Nco1

引物2：ccg为精氨酸密码子

N端：5’-gaatgccagaggctgctccc

gtggcccctgca-3’

35mer

PCR扩增产物经tailing加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体，转化细菌后，扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。

2).人野生型肿瘤抑制因子P53基因第72密码子区至C-端Nco1片段扩增：以上述的片段区cDNA为模板，用人工合成的下列引物进行PCR扩增。

PCR引物设计如下：

引物3：ccg为精氨酸密码子

N端5-aggggccac

gggagcagcctctggcattc-3

32mer

引物4：

N端5’-gtagatgg

cgcggacgcgggtg-3’

28mer Nco1

将PCR扩增的二个产物按1)的方法联接至T-easy载体，经DNA测序正确无误。

3).上述二个PCR片段产物的拼接，形成Nco1～Nco1片段

将1)和2)中含上述DNA片段的T-easy载体质粒DNA分别用Nco1和Smal1完全酶切，纯化后，再与经Nco1酶切的野生型p53基因cDNA进行连接。转化细菌、质粒抽提和经酶切检测拼接方向正确后，构建成R72型的野生型p53基因表达质粒pCMV-neo-p53

二、构建含R72型p53抑癌基因的腺病毒穿梭质粒

1).PCR扩增72型P53全长DNA片段：以R72型的野生型p53基因表达质粒pCMV-neo-p53为模板，用人工合成的引物进行PCR扩增。

引物设计如下：

引物5(在N-末端引入内切酶位点Nhe1)：

N端：5’-ta gctagctcactgccatggaggagccg-3’

28mer Nhe1

引物6(在N-末端引入内切酶位点BamH1)::

N端：5’-ggc ggatcctgtcagtctgagtgagg-3’

26mer BamH1

2).含R72抑瘤基因p53的腺病毒穿梭质粒的构建

腺病毒穿梭质粒pDC315含有超强启功子mMCV和病毒SV40的聚腺嘌吟核苷酸。为了构建含R72抑瘤基因p53的腺病毒穿梭质粒，分别以内切酶Nhe1和BamH1消化上述1)的T-easy质粒DNA和腺病毒穿梭质粒pDC315。经琼脂糖电泳分离、纯化后，将含R72抑瘤基因p53和腺病毒穿梭质粒的酶切片段进行拼接，转化感受态菌种，培养扩增、提取重组质粒DNA。最后再经酶切消化和DNA测序证实。

三、表达R72型抑癌基因p53的重组腺病毒

1).制备线性化含R72型的重组穿梭质粒pDC315-p53：取适量质粒DNA，经核苷酸内切酶LoxP消化、电泳分离、纯化loxP酶切线性化质粒DNA。备用。

2).培养胚胎肾293细胞，用预先混勺的腺病毒载体和线性化的穿梭质粒pDC315-p53共转染表达E1区基因的胚胎肾293细胞。

3).筛选阳性克隆，分离、纯化，并鉴定重组腺病毒。

序列表

Individual Applicant

--------------------

Street：科学城国际企业孵化器A区610房

City：广州市

State：广东省

Country：中国

PostalCode：510633

PhoneNumber：020-32290208

FaxNumber：020-38491559

EmailAddress：shangwu_w@yahoo.com

<110>LastName：王

<110>FirstName：尚武

<110>MiddleInitial：

<110>Suffix：

Application Project

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<120>Title：表达新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒

<130>AppFileReference：

<140>CurrentAppNumber：1

<141>CurrentFilingDate：2005-10-25

Sequence

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<213>OrganismName：Human noraml tissue

<400>PreSequenceString：

tagctagctc actgccatgg aggagccgca gtcagatcct agcgtcgagc cccctctgag 60

tcaggaaaca ttttcagacc tatggaaact acttcctgaa aacaacgttc tgtccccctt 120

gccgtcccaa gcaatggatg atttgatgct gtccccggac gatattgaac aatggttcac 180

tgaagaccca ggtccagatg aagctcccag aatgccagag gctgctcccc gggtggcccc 240

tgcaccagca gctcctacac cggcggcccc tgcaccagcc ccctcctggc ccctgtcatc 300

ttctgtccct tcccagaaaa cctaccaggg cagctacggt ttccgtctgg gcttcttgca 360

ttctgggaca gccaagtctg tgacttgcac gtactcccct gccctcaaca agatgttttg 420

ccaactggcc aagacctgcc ctgtgcagct gtgggttgat tccacacccc cgcccggcac 480

ccgcgtccgc gccatggcca tctacaagca gtcacagcac atgacggagg ttgtgaggcg 540

ctgcccccac catgagcgct gctcagatag cgatggtctg gcccctcctc agcatcttat 600

ccgagtggaa ggaaatttgc gtgtggagta tttggatgac agaaacactt ttcgacatag 660

tgtggtggtg ccctatgagc cgcctgaggt tggctctgac tgtaccacca tccactacaa 720

ctacatgtgt aacagttcct gcatgggcgg catgaaccgg aggcccatcc tcaccatcat 780

cacactggaa gactccagtg gtaatctact gggacggaac agctttgagg tgcatgtttg 840

tgcctgtcct gggagagacc ggcgcacaga ggaagagaat ctccgcaaga aaggggagcc 900

tcaccacgag ctgcccccag ggagcactaa gcgagcactg cccaacaaca ccagctcctc 960

tccccagcca aagaagaaac cactggatgg agaatatttc acccttcaga tccgtgggcg 1020

tgagcgcttc gagatgttcc gagagctgaa tgaggccttg gaactcaagg atgcccaggc 1080

tgggaaggag ccagggggga gcagggctca ctccagccac ctgaagtcca aaaagggtca 1140

gtctacctcc cgccataaaa aactcatgtt caagacagaa gggcctgact cagactgaca 1200

ggatccgcc 1209

<212>Type：DNA

<211>Length：1209

SequenceName：human P53

SequenceDescription：p53(R72)

MetGluGluProGlnSerAspProSerValGluProProLeuSerGlnGluThrPheSer

1 5 10 15 20

AspLeuTrpLysLeuLeuProGluAsnAsnValLeuSerProLeuProSerGlnAlaMet

25 30 35 40

AspAspLeuMetLeuSerProAspAspIleGluGlnTrpPheThrGluAspProGlyPro

45 50 55 60

AspGluAlaProArgMetProGluAlaAlaProArgValAlaProAlaProAlaAlaPro

65 70 75 80

ThrProAlaAlaProAlaProAlaProSerTrpProLeuSerSerSerValProSerGln

85 90 95 100

LysThrTyrGlnGlySerTyrGlyPheArgLeuGlyPheLeuHisSerGlyThrAlaLys

105 110 115 120

SerValThrCysThrTyrSerProAlaLeuAsnLysMetPheCysGlnLeuAlaLysThr

125 130 135 140

CysProValGlnLeuTrpValAspSerThrProProProGlyThrArgValArgAlaMet

145 150 155 160

AlaIleTyrLysGlnSerGlnHisMetThrGluValValArgArgCysProHisHisGlu

165 170 175 180

ArgCysSerAspSerAspGlyLeuAlaProProGlnHisLeuIleArgValGluGlyAsn

185 190 195 200

LeuArgValGluTyrLeuAspAspArgAsnThrPheArgHisSerValValValProTyr

205 210 215 220

GluProProGluValGlySerAspCysThrThrIleHisTyrAsnTyrMetCysAsnSer

225 230 235 240

SerCysMetGlyGlyMetAsnArgArgProIleLeuThrIleIleThrLeuGluAspSer

245 250 255 260

SerGlyAsnLeuLeuGlyArgAsnSerPheGluValHisValCysAlaCysProGlyArg

265 270 275 280

AspArgArgThrGluGluGluAsnLeuArgLysLysGlyGluProHisHisGluLeuPro

285 290 295 300

ProGlySerThrLysArgAlaLeuProAsnAsnThrSerSerSerProGlnProLysLys

305 310 315 320

LysProLeuAspGlyGluTyrPheThrLeuGlnIleArgGlyArgGluArgPheGluMet

325 330 335 340

PheArgGluLeuAsnGluAlaLeuGluLeuLysAspAlaGlnAlaGlyLysGluProGly

345 350 355 360

GlySerArgAlaHisSerSerHisLeuLysSerLysLysGlyGlnSerThrSerArgHis

365 370 375 380

LysLysLeuMetPheLysThrGluGlyProAspSerAspTer

385 390

Claims

1.一种表达新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒的表达结构。其主要特征为：

a).人野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突变成为精氨酸，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；

b).该P53抑癌基因在其N-末端以内切酶Nhe1和C-末端以内切酶BamH1片段拼接于穿梭质粒pDC315超强启动子mMCV的下游；

c).重组的腺病毒载体为以Ad35纤突结取代Ad5型腺病毒的纤突结的复制缺陷型腺病毒载体；

d).该新型p53抑癌基因腺病毒表达系统具有感染力更强、感染组织/细胞谱更广、新型p53抑癌基因表达更强、具有更强细胞凋亡生物功能。

2.根椐权利要求1的一种多肽，其含有下列氨基酸序列

a).与人肿瘤抑制基因P53的亲本多肽的氨基酸序列基本一致，仅有一个氨基酸的取代，即此肿瘤抑制基因P53的第72位氨基酸由精氨酸(R72)代替野生型P53同一位置的脯氨酸(P72)；

b).根椐权利1要求，所述肿瘤抑制基因P53亲本来源于人；

3.根椐权利要求1所述重组腺病毒，其特征在于，新型人肿瘤抑制基因p53表达盒中所含的启动子序列选自：巨细胞病毒启动子，包括其增强突变型；牛乳头瘤病毒启动子；肝胎儿甲型球蛋白启动子(AFP，胎甲球蛋白启动子)；人前列腺癌特异因子启动子和肿瘤特异性PEG-3基因启动子。

4.根椐权利要求1所述重组腺病毒，其特征在于，该复制缺陷型腺病毒为Ad5、Ad2和/或突变型Ad5型腺病毒载体，后者即为Ad5型腺病毒的纤突结突变的复制缺陷型腺病毒载体-Ad35；以及R72型p53在腺相关病毒(AAVs)或其它病毒载体的表达。

5.人肿瘤抑制基因P53基因第72位氨基酸密码子核苷酸突变方法、设计引物、真核细胞表达载体及其腺病毒穿梭质粒，其特征在于，该方法包括：采用基因突变技术，使野生型第72位脯氨酸的密码子(P72)突变成精氨酸的密码子(R72)。

a).以人肿瘤抑制基因P53基因cDNA为模板，用人工合成的，人肿瘤抑制基因P53基因N-末端序列核苷酸的正向引物和含有编码第72位氨基酸核苷酸序列的反向引物进行PCR扩增，进行人肿瘤抑制基因P53基因克隆及其N-未端的改建。

PCR引物设计如下：

引物1：

N端：5’-gccttccgggtcactg aggagccg-3’

30mer Nco1

引物2：

N端：5’-gaatgccagaggctgctccccgggtggcccctgca-3’

35mer

b).人野生型肿瘤抑制因子P53基因第72密码子区至C-端Ncol片段扩增：以上述的片段区cDNA为模板，用人工合成的下列引物进行PCR扩增。

PCR引物设计如下：

引物3：

N端5-aggggccacccggggagcagcctctggcattc-3

32mer

引物4：

N端5’-gtagatgg cgcggacgcgggtg-3’

28mer Nco1

c).上述二个PCR片段产物的拼接，形成Nco1~Nco1片段以及完整R72突变型p53基因cDNA的拼接：

将上述a)项和b)项中T-easy载体质粒DNA分别用Nco1和Smal1完全酶切，纯化后，再与经Nco1酶切的野生型p53基因cDNA进行连接。转化细菌、质粒抽提和经酶切检测拼接方向正确后，构建成R72型的野生型p53基因表达质粒pCMV-neo-p53。

d).构建含R72型p53抑癌基因的腺病毒穿梭质粒

引物设计如下：

引物5(在N-末端引入内切酶位点Nhe1)：

N端：5’-ta gctagctcactgccatggaggagccg-3’

28mer Nhe1

引物6(在N-末端引入内切酶位点BamH1)：：

N端：5’-ggatccgaatgtcagtctgagtcagg-3’

26mer

2).含R72型抑瘤基因p53的腺病毒穿梭质粒的构建

腺病毒穿梭质粒pDC315含有超强启功子mMCV和病毒SV40的聚腺嘌吟核苷酸。为构建含R72型抑瘤基因p53的腺病毒穿梭质粒，分别以内切酶Nhe1和BamH1消化上述1)的T-easy质粒DNA和腺病毒穿梭质粒pDC315。经琼脂糖电泳分离、纯化后，将含R72抑瘤基因p53和腺病毒穿梭质粒的酶切片段进行拼接，转化感受态菌种，培养扩增、提取重组质粒DNA。最后再经酶切消化和DNA测序证实。

6.一种用于治疗多种癌症疾病的基因治疗药物，其特征在于权利要求1所述的表达R72型人P53基因的重组腺病毒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

7.如权利要求6所述的基因治疗药物，其特征在于，该重组腺病毒为Ad5型的纤突结突变型-Ad35，即Ad-p53(R72)；所述的有效抗癌成份为R72型人P53基因的表达蛋白质。

8.如权利要求1、6和7的基因治疗组合药物，其特征除权利要求1所述的表达R72型人P53基因重组腺病毒之外，还包括含有其他具有抗癌治疗效果的细胞因子和/或免疫调节因子通过内部核糖体结合位点(IRES)与R72型人P53基因相连接的表达盒的重组腺病毒。

9.一种制备表达人R72型人P53基因的重组腺病毒的方法，其特征在于，该方法包括：

a).提供复制缺陷型以及纤突结突变的腺病毒；

b).提供线性化的上述第5款d项的pDC315-p53(R72)；

c).应用磷酸钙或脂质体将a)的腺病毒和b)pDC315-p53(R72)共转染表达E1区基因缺失的胚胎肾293细胞；

d).筛选阳性克隆；

e).从阳性克隆中分离纯化重组腺病毒Ad-p53(R72)；

f).用从e)中的重组腺病毒感染正常细胞或肿瘤细胞，观察人p53(R72)的表达及其功能。