CN104946602A - 具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用 - Google Patents
具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104946602A CN104946602A CN201510319233.2A CN201510319233A CN104946602A CN 104946602 A CN104946602 A CN 104946602A CN 201510319233 A CN201510319233 A CN 201510319233A CN 104946602 A CN104946602 A CN 104946602A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- e3gp
- seconds
- oncolytic adenovirus
- primer
- puc18
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 61
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 53
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 36
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 22
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 22
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 22
- 101100460704 Aspergillus sp. (strain MF297-2) notI gene Proteins 0.000 claims description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 20
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 18
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 16
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 16
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 15
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 15
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 6
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000009508 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p16 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010009392 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p16 Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 3
- 230000008676 import Effects 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 6
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 abstract description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 abstract description 2
- 230000018199 S phase Effects 0.000 abstract description 2
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 abstract description 2
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 abstract 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 4
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 3
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 3
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 3
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 230000010363 phase shift Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000008261 skin carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007761 synergistic anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用。溶瘤腺病毒是在腺病毒基础上经基因改造使其只能在肿瘤细胞内而不能在正常细胞内复制,从而具有肿瘤组织靶向性。P16是一种抑癌基因,其突变与缺失被发现与多种癌症的发生发展有着密切联系。正常组织中P16抑制基因组复制,阻止细胞从G1期向S期转化,而肿瘤细胞P16的缺失或突变导致细胞周期加速、失控,癌细胞恶性生长。本发明公开的溶瘤腺病毒Ad5-P16,将腺病毒原有的E3gpP16基因利用导入酶切位点突变技术替换为抑癌基因P16,使其兼具肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性,经体外MTT实验及小鼠颅内肿瘤抑制实验证明,具有高效抑制、杀伤肿瘤细胞的效果。
Description
技术领域
本发明涉及溶瘤腺病毒领域,具体地指一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用。
背景技术
溶瘤腺病毒能特异性识别肿瘤细胞并具有肿瘤细胞内自我复制能力。其能通过大量复制直接溶瘤,诱导肿瘤细胞发生凋亡、自噬、坏死,以及触发机体抗肿瘤免疫等多种机制发挥抗肿瘤效应,近年来得到了越来越广泛地关注。2005年,我国SFDA批准了世界上第一个溶瘤腺病毒H101用于鼻咽癌患者的治疗,成为全球首个获批上市的重组溶瘤腺病毒产品。目前溶瘤腺病毒或携带抗癌基因的溶瘤腺病毒产品更多的正在进行临床前和临床试验,其中包括ONYX-015、SG500、ZD55-TRAIL和ZD55-IL-24等。
目前,重组溶瘤腺病毒主要有这样几种方式:
1、剔除腺病毒在正常细胞中复制所必须而在肿瘤细胞中不需要的部分。如去除E1A或E1B的腺病毒只能在Rb或p53信号通路异常的肿瘤细胞内才能增殖,目前已构建对应的载体delta24和ZD55,并携带抗癌基因取得较好研究效果。
2、利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制必须的基因。如利用hTERT启动子替换E1A使得外源基因的表达具有肿瘤细胞特异性。
3、修饰腺病毒衣壳蛋白,使其表达特异识别肿瘤表面受体的配体蛋白,增强肿瘤细胞对其特异性识别能力,并增强感染效率。
尽管目前溶瘤腺病毒在体外杀伤肿瘤细胞及体内动物肿瘤抑制实验中均取得了较好的抗肿瘤效应,但多数尚在临床试验中,并未进入临床。究其原因,主要在于以下两点:
1.溶瘤腺病毒存在较高的免疫原性,容易被人体免疫系统识别而清除达不到抗癌效果。研究表明,去除病毒基因组E3区可以有效降低腺病毒的免疫原性,保护腺病毒感染的肿瘤细胞在病毒大量复制前不提前被T细胞识别清除,从而提高了病毒的感染效率。
2.肿瘤细胞耐药耐病毒性,由于肿瘤细胞生长迅速,原始组织功能丧失,细胞内易发生变异,导致单一肿瘤杀伤作用无法彻底杀灭肿瘤细胞,从而导致癌症复发。研究表明,经病毒杀伤后,部分残存的肿瘤细胞可通过上调PLSR1/STING/IR3等信号通路抑制病毒复制及杀伤作用。解决办法之一是,利用病毒本身即是一种有效地基因载体,携带外源抑癌基因或癌基因干扰序列,修复肿瘤细胞基因变异,抑制肿瘤细胞生长及诱发死亡,有效协同病毒自身杀伤作用,在耐病毒性突变出现前,彻底杀灭癌细胞。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是提供一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用。
为解决上述技术问题,本发明提供的一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16,所述重组溶瘤腺病毒Ad5-P16全基因组是由P16CDS基因替换原溶瘤腺病毒Ad5全基因组上的固有基因E3gp-19K得到。
进一步地,所述P16CDS基因序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种含有高效表达抗癌基因P16的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16的构建方法,包括以下步骤:
1)以pCMV p16INK4A为模板,设计含有酶切位点和保护碱基的引物上下游引物PF和PR,
PF:ctgatatgcatggagccggcggcggggag,
PR:gccgcggccgctcaatcggggatgtctgagg;
2)经PCR得到P16CDS序列
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火58℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
3)将PCR产物连接入TA载体,挑选单克隆,并鉴定出阳性克隆子;
4)然后在E3gp-19K上游启动子U6前方设计上游引物P1和E3gp-19K编码区终止密码子后方设计下游引物P6,分别为:
P1:cggaagcttacgtaccggtccaatccgtc,
P6:ggcgaattcaggtcgtaaacgtccacacgt;
并以Ad5腺病毒全基因组为模板,进行PCR;
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火58℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
得到含有E3gp-19K序列的PCR产物;将PCR产物和pUC18载体进行双酶切,连接后并转化大肠杆菌,挑选单克隆后进行酶切与测序鉴定,得到阳性克隆,即构建为pUC18-E3gp-19K;
5)在E3gp-19K编码区初始密码子前方设计下游以snaI酶切位点及其保护碱基为5‘末端的正向引物P2:ctgatatgcatatggacacaaggatgacga,
及其反相互补引物P3:tcgtcatccttgtgtccatatgcatatcag;
在E3gp-19K编码区终止密码子后方设计下游以notI酶切位点及其保护碱基为5’末端的正向P5引物:gccgcggccgcggggcggaattcgttat,
及其反向互补引物P4:ataacgaattccgccccgcggccgcggc;
6)以pUC18-E3gp-19K为模板,P1、P2为上下游引物,PCR得到以HindIII/snaI为首尾的含有E3gp-19K启动子增强子区域序列的DNA产物;
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火55℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
7)以pUC18-E3gp-19K为模板,P3、P4为上下游引物,PCR得到以snaI/notI为首尾的含有E3gp-19K编码区序列的DNA产物;
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火60℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
8)以pUC18-E3gp-19K为模板,P5、P6为上下游引物,PCR得到以notI/EcoRI为首尾的含有E3gp-19K编码后方3‘无义区的DNA产物;
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火58℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
9)将上述3种DNA产物分别以各自首尾酶切位点的内切酶进行双酶切,并将pUC18-E3gp-19K以HindIII及EcoRI进行双酶切并回收pUC18载体,经回收共得到4段两端均为粘性末端的DNA片段;
10)以连接酶将这4段DNA以HindIII/snaI/notI/EcRI的顺序连接成环,转入大肠杆菌并挑选单克隆,经过酶切鉴定及测序鉴定得到阳性克隆,即为导入有snaI/notI酶切位点的pUC18-E3gp-19K新序列;
11)将P16CDS序列的PCR产物及导入snaI/notI酶切位点的pUC18-E3gp-19K新序列用snaI以及notI双酶切;
12)连接酶连接,并转入大肠杆菌,经单克隆筛选、酶切与测序鉴定,阳性克隆即为含有E3gp-19K启动增强子及P16CDS序列的pUC18-P16;
13)将Ad5溶瘤腺病毒及上面得到的pUC18-P16用Pmel酶切,并于BJ5183细胞内进行同源重组,挑选单克隆,经酶切与测序鉴定得到鉴定为阳性的克隆,即为高效表达人P16基因的重组人溶瘤腺病毒Ad5-P16。
本发明还提供了一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16在肿瘤细胞内能特异性增殖并杀伤肿瘤细胞及其抗肿瘤的中应用。
本发明的原理
1)溶瘤腺病毒除了自身可以通过特异性在肿瘤组织中增殖达到裂解肿瘤细胞的作用外,其还可以作为载体,携带各种抑癌基因,在肿瘤细胞中高效表达,从而达到协同抗癌作用。
2)P16基因,也称为MTS(multiple tumor suppressor 1)多效肿瘤抑制一型基因,于1994年美国冷泉港实验室Kamb等人首次报道。P16基因参与细胞周期调控,控制细胞增殖速度,抑制细胞恶性快速生长,是一种重要的抑癌基因。约50%的肿瘤细胞株中发现有其纯合子缺失或突变。临床检查中,P16基因已经在肺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、骨癌、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、淋巴癌、黑素瘤中均有发现纯合子缺失及无义、错义及移码突变。这些发现提示P16基因的缺失、突变广泛地参与肿瘤的发生发展,肿瘤细胞P16基因的修复将具有十分重要的肿瘤治疗意义。
3)P16基因位于人第9染色体2区1带9p21上,包含2个内含子及3个外显子构成(长度分别为126、307、11bp)。其编码蛋白大小为16KD,即为其命名P16蛋白。P16是一直细胞核蛋白,能作用于细胞周期相关蛋白激酶之一CDK4,并抑制后者活性。CDK4与细胞周期蛋白Cyclin形成复合体参与G1期向S期的转化,启动细胞DNA复制。P16蛋白能抑制CDK4的活性,阻断细胞DNA复制过程。肿瘤细胞中P16基因的缺失或突变则会导致细胞加速复制、分裂,导致肿瘤恶性生长。
本发明的有益效果在于:
1)本发明提供一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的溶瘤腺病毒Ad5-P16,本发明在技术上利用导入酶切位点突变快速将腺病毒原有基因替换为抑癌基因,即能同时达到2种效果:
A.将腺病毒删除固有基因E3gp-19K,使其仅能在肿瘤细胞内复制,不能在正常细胞内复制,即成为具有肿瘤特异性的溶瘤腺病毒。
B.在删除位置插入外源抑癌基因P16,使溶瘤腺病毒具有修复抑癌基因的能力。
2)本发明提供的溶瘤腺病毒Ad5-P16,在设计上使P16基因的表达巧妙地利用保留的腺病毒原有基因E3gp-19K的启动增强子,而不用新增外源启动增强子,大大增强抑癌基因P16的表达效果并简化了实验流程。
3)本发明利用MTT法检测体外培养细胞活力,裸小鼠原位肿瘤移植术检测肿瘤体内生长情况的方法,验证携带P16抑癌基因的Ad5-P16溶瘤腺病毒,具有良好的体内体外肿瘤抑制作用,且效果与未携带P16的Ad5相比有进一步增强,即溶瘤腺病毒与抑癌基因P16能有效协同杀伤肿瘤细胞。
附图说明
图1为Ad5-P16重组溶瘤腺病毒感染人神经胶质瘤细胞U251,96小时后,Western blotting检测P16基因的表达图;
图2为Ad5-P16重组溶瘤腺病毒感染不同肿瘤细胞系,72小时后,MTT法检测细胞活力图,(未感染病毒组活力定为100%);。
图3将稳定转染荧光素酶报告基因的人神经胶质瘤细胞U251原位接种于裸小鼠颅内,待肿瘤检出后(两周),颅内注射生理盐水(左),Ad5溶瘤腺病毒(中)以及Ad5-P16重组溶瘤腺病毒(右),两周后,腹腔注射荧光素底物并用小动物活体成像仪观察比较颅内肿瘤生长情况图。
图4为统计图3中颅内肿瘤荧光强度图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明,以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容,但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16的构建
1)以pCMV p16INK4A为模板,设计含有酶切位点和保护碱基的引物上下游引物PF和PR,
PF:ctgatatgcatggagccggcggcggggag,
PR:gccgcggccgctcaatcggggatgtctgagg;
2)经PCR得到P16CDS序列
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火58℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
3)将PCR产物连接入TA载体,挑选单克隆,并鉴定出阳性克隆子;
4)然后在E3gp-19K上游启动子U6前方设计上游引物P1和E3gp-19K编码区终止密码子后方设计下游引物P6,分别为:
P1:cggaagcttacgtaccggtccaatccgtc,
P6:ggcgaattcaggtcgtaaacgtccacacgt;
并以Ad5腺病毒全基因组为模板,进行PCR;
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火58℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
得到含有E3gp-19K序列的PCR产物;将PCR产物和pUC18载体进行双酶切,连接后并转化大肠杆菌,挑选单克隆后进行酶切与测序鉴定,得到阳性克隆,即构建为pUC18-E3gp-19K;
5)在E3gp-19K编码区初始密码子前方设计下游以snaI酶切位点及其保护碱基为5‘末端的正向引物P2:ctgatatgcatatggacacaaggatgacga,
及其反相互补引物P3:tcgtcatccttgtgtccatatgcatatcag;
在E3gp-19K编码区终止密码子后方设计下游以notI酶切位点及其保护碱基为5’末端的正向P5引物:gccgcggccgcggggcggaattcgttat,
及其反向互补引物P4:ataacgaattccgccccgcggccgcggc;
6)以pUC18-E3gp-19K为模板,P1、P2为上下游引物,PCR得到以HindIII/snaI为首尾的含有E3gp-19K启动子增强子区域序列的DNA产物;
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火55℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
7)以pUC18-E3gp-19K为模板,P3、P4为上下游引物,PCR得到以snaI/notI为首尾的含有E3gp-19K编码区序列的DNA产物;
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火60℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
8)以pUC18-E3gp-19K为模板,P5、P6为上下游引物,PCR得到以notI/EcoRI为首尾的含有E3gp-19K编码后方3‘无义区的DNA产物;
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火58℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
9)将上述3种DNA产物分别以各自首尾酶切位点的内切酶进行双酶切,并将pUC18-E3gp-19K以HindIII及EcoRI进行双酶切并回收pUC18载体,经回收共得到4段两端均为粘性末端的DNA片段;
10)以连接酶将这4段DNA以HindIII/snaI/notI/EcRI的顺序连接成环,转入大肠杆菌并挑选单克隆,经过酶切鉴定及测序鉴定得到阳性克隆,即为导入有snaI/notI酶切位点的pUC18-E3gp-19K新序列;
11)将P16CDS序列的PCR产物及导入snaI/notI酶切位点的pUC18-E3gp-19K新序列用snaI以及notI双酶切;
12)连接酶连接,并转入大肠杆菌,经单克隆筛选、酶切与测序鉴定,阳性克隆即为含有E3gp-19K启动增强子及P16CDS序列的pUC18-P16;
13)将Ad5溶瘤腺病毒及上面得到的pUC18-P16用Pmel酶切,并于BJ5183细胞内进行同源重组,挑选单克隆,经酶切与测序鉴定得到鉴定为阳性的克隆,即为高效表达人P16基因的重组人溶瘤腺病毒Ad5-P16。
实施例2重组溶瘤腺病毒Ad5-P16感染肿瘤细胞检测其感染效果及表达情况
1.将培养的2皿U251细胞,1:100分别加入Ad5,Ad-P16病毒(滴度为1:100)。
2.培养72小时后,收集细胞裂解蛋白,进行Western blot实验用P16抗体检测Ad5-P16的表达情况,Beta-Actin抗体作为内参抗体。
如图1所示,重组溶瘤腺病毒Ad5-P16感染后的人神经胶质瘤U251细胞,与腺病毒Ad5感染相比,P16基因的表达水平极显著增强。
实施例3MTT法检测比较细胞活力
1.将图示不同组织来源的肿瘤细胞按2000/100uL每孔的密度接种于96孔板中。
2.培养过夜,待细胞贴壁后,每种癌细胞分为1个对照组及2个实验组,每个组至少设置3个复孔,每组分别加入磷酸缓冲液PBS,Ad5,以及Ad5-P16各1uL。
3,培养72小时后,加入10uL 5mg/mL MTT溶液,继续培养4小时后,每孔加入100uL 10%SDS-0.1N HCl溶液。
4,培养过夜后,用酶标仪在570nm处读取吸光度,即为相对细胞活力,将对照组设置为100。
如图2所示,重组溶瘤腺病毒Ad5-P16,在Ad5肿瘤细胞杀伤作用基础上,对多种肿瘤细胞系均有进一步杀伤效果,即P16基因的修复,对腺病毒杀伤肿瘤细胞,具有协同作用。实施例4颅内肿瘤生长情况实验
将表达荧光素酶的人神经胶质肿瘤U251细胞按1×105个于10微升PBS中的密度,原位接种于裸小鼠脑室内。2周后,原位脑室注射生理盐水、Ad5或Ad-P16病毒。2周后,腹腔注射荧光素酶底物,小动物活体成像仪观察
如图3~4所示:Ad5病毒能显著抑制神经胶质瘤在小鼠颅内生长,重组溶瘤腺病毒Ad5-P16所携带P16基因与病毒溶瘤作用,协同抑制了肿瘤的体内生长,抑制效果显著增强。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (4)
1.一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16,其特征在于:所述重组溶瘤腺病毒Ad5-P16全基因组是由P16CDS基因替换原溶瘤腺病毒Ad5全基因组上的固有基因E3gp-19K得到。
2.根据权利要求1所述具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16,其特征在于:所述P16CDS基因序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种权利要求1所述含有高效表达抗癌基因P16的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16的构建方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)以pCMV p16 INK4A为模板,设计含有酶切位点和保护碱基的引物上下游引物PF和PR,
PF:ctgatatgcatggagccggcggcggggag,
PR:gccgcggccgctcaatcggggatgtctgagg;
2)经PCR得到P16CDS序列
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火58℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
3)将PCR产物连接入TA载体,挑选单克隆,并鉴定出阳性克隆子;
4)然后在E3gp-19K上游启动子U6前方设计上游引物P1和E3gp-19K编码区终止密码子后方设计下游引物P6,分别为:
P1:cggaagcttacgtaccggtccaatccgtc,
P6:ggcgaattcaggtcgtaaacgtccacacgt;
并以Ad5腺病毒全基因组为模板,进行PCR;
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火58℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
得到含有E3gp-19K序列的PCR产物;将PCR产物和pUC18载体进行双酶切,连接后并转化大肠杆菌,挑选单克隆后进行酶切与测序鉴定,得到阳性克隆,即构建为pUC18-E3gp-19K;
5)在E3gp-19K编码区初始密码子前方设计下游以snaI酶切位点及其保护碱基为5‘末端的正向引物P2:ctgatatgcatatggacacaaggatgacga,
及其反相互补引物P3:tcgtcatccttgtgtccatatgcatatcag;
在E3gp-19K编码区终止密码子后方设计下游以notI酶切位点及其保护碱基为5’末端的正向P5引物:gccgcggccgcggggcggaattcgttat,
及其反向互补引物P4:ataacgaattccgccccgcggccgcggc;
6)以pUC18-E3gp-19K为模板,P1、P2为上下游引物,PCR得到以HindIII/snaI为首尾的含有E3gp-19K启动子增强子区域序列的DNA产物;
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火55℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
7)以pUC18-E3gp-19K为模板,P3、P4为上下游引物,PCR得到以snaI/notI为首尾的含有E3gp-19K编码区序列的DNA产物;
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火60℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
8)以pUC18-E3gp-19K为模板,P5、P6为上下游引物,PCR得到以notI/EcoRI为首尾的含有E3gp-19K编码后方3‘无义区的DNA产物;
PCR条件为:预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火58℃30秒,延伸72℃30秒,循环34次,最后延伸72℃10分钟;
9)将上述3种DNA产物分别以各自首尾酶切位点的内切酶进行双酶切,并将pUC18-E3gp-19K以HindIII及EcoRI进行双酶切并回收pUC18载体,经回收共得到4段两端均为粘性末端的DNA片段;
10)以连接酶将这4段DNA以HindIII/snaI/notI/EcRI的顺序连接成环,转入大肠杆菌并挑选单克隆,经过酶切鉴定及测序鉴定得到阳性克隆,即为导入有snaI/notI酶切位点的pUC18-E3gp-19K新序列;
11)将P16CDS序列的PCR产物及导入snaI/notI酶切位点的pUC18-E3gp-19K新序列用snaI以及notI双酶切;
12)连接酶连接,并转入大肠杆菌,经单克隆筛选、酶切与测序鉴定,阳性克隆即为含有E3gp-19K启动增强子及P16CDS序列的pUC18-P16;
13)将Ad5溶瘤腺病毒及上面得到的pUC18-P16用Pmel酶切,并于BJ5183细胞内进行同源重组,挑选单克隆,经酶切与测序鉴定得到鉴定为阳性的克隆,即为高效表达人P16基因的重组人溶瘤腺病毒Ad5-P16。
4.一种权利要求1所述具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16在肿瘤细胞内能特异性增殖并杀伤肿瘤细胞及其抗肿瘤的中应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510319233.2A CN104946602A (zh) | 2015-06-11 | 2015-06-11 | 具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510319233.2A CN104946602A (zh) | 2015-06-11 | 2015-06-11 | 具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104946602A true CN104946602A (zh) | 2015-09-30 |
Family
ID=54161668
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510319233.2A Pending CN104946602A (zh) | 2015-06-11 | 2015-06-11 | 具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104946602A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114317462A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-04-12 | 武汉凯德维斯生物技术有限公司 | 一种携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体、其构建方法及应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001002540A2 (en) * | 1999-07-02 | 2001-01-11 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Adenoviral vectors for treating disease |
CN1966683A (zh) * | 2005-11-17 | 2007-05-23 | 王尚武 | 表达新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒 |
CN101702918A (zh) * | 2007-03-14 | 2010-05-05 | 卡塔拉肿瘤研究所 | 具有e3-19k蛋白的内质网滞留结构域内突变的腺病毒及其在癌症治疗中的应用 |
CN102325887A (zh) * | 2009-02-02 | 2012-01-18 | 昂克斯治疗有限公司 | 非-Ad5腺病毒载体及与其相关的方法和用途 |
CN104195117A (zh) * | 2014-09-16 | 2014-12-10 | 武汉百奥京生物医药有限公司 | 一种携带靶向分裂期磷蛋白1基因的小发夹rna的重组溶瘤腺病毒 |
-
2015
- 2015-06-11 CN CN201510319233.2A patent/CN104946602A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001002540A2 (en) * | 1999-07-02 | 2001-01-11 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Adenoviral vectors for treating disease |
CN1966683A (zh) * | 2005-11-17 | 2007-05-23 | 王尚武 | 表达新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒 |
CN101702918A (zh) * | 2007-03-14 | 2010-05-05 | 卡塔拉肿瘤研究所 | 具有e3-19k蛋白的内质网滞留结构域内突变的腺病毒及其在癌症治疗中的应用 |
CN102325887A (zh) * | 2009-02-02 | 2012-01-18 | 昂克斯治疗有限公司 | 非-Ad5腺病毒载体及与其相关的方法和用途 |
CN104195117A (zh) * | 2014-09-16 | 2014-12-10 | 武汉百奥京生物医药有限公司 | 一种携带靶向分裂期磷蛋白1基因的小发夹rna的重组溶瘤腺病毒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MA J ET AL.: "E2F promoter-regulated oncolytic adenovirus with p16 gene induces cell apoptosis and exerts antitumor effect on gastric cancer", 《DIG DIS SCI》 * |
苏长青 等: "腺病毒介导p16基因的表达及其对肺癌细胞的周期阻滞作用", 《中国肿瘤生物治疗杂志》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114317462A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-04-12 | 武汉凯德维斯生物技术有限公司 | 一种携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体、其构建方法及应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lin et al. | Oncolytic virotherapy: basic principles, recent advances and future directions | |
CN109576231B (zh) | 分离的重组溶瘤腺病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途 | |
Dey et al. | Cancer stem cells: the final frontier for glioma virotherapy | |
JP5975352B2 (ja) | 癌幹細胞を標的とするウイルスベクター | |
CN103614416A (zh) | 一种携带人穿膜肽p53与GM-CSF基因的重组溶瘤腺病毒及其用途 | |
CN101381742A (zh) | 晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体及其构建方法与应用 | |
Yoon et al. | CRISPR-Cas12a with an oAd induces precise and cancer-specific genomic reprogramming of EGFR and efficient tumor regression | |
Aurelian | Oncolytic virotherapy: the questions and the promise | |
CN108342366B (zh) | 靶向癌症的重组溶瘤基因-腺病毒及其构建方法和应用 | |
CN101565718A (zh) | 三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法及其应用 | |
CN101058809B (zh) | 人源化改造的鼠ing4基因及其腺病毒表达载体在制备治疗肺癌的药物中的应用 | |
CN103562386A (zh) | Reic表达腺病毒载体 | |
CN105755043A (zh) | 一种双拷贝人p53基因重组腺病毒及其制备方法 | |
Lu et al. | Viral-based gene delivery and regulated gene expression for targeted cancer therapy | |
CN104946602A (zh) | 具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用 | |
CN111041001B (zh) | 治疗kras突变型肿瘤的安全型柯萨奇病毒及其药物组合物 | |
Ma et al. | E2F promoter-regulated oncolytic adenovirus with p16 gene induces cell apoptosis and exerts antitumor effect on gastric cancer | |
CN101173299A (zh) | 肿瘤靶向性腺相关病毒载体的构建和应用 | |
CN1793343A (zh) | 具有肿瘤靶向性和肿瘤自杀性的溶瘤性抗癌重组腺病毒 | |
KR102169798B1 (ko) | 아데노바이러스의 감염 및 복제가 가능한 중간엽 줄기세포주 | |
CN1952160B (zh) | 智能腺病毒载体与khp53基因的重组体及其应用 | |
CN102399777B (zh) | 一种重组质粒及应用其制备的重组溶瘤腺病毒 | |
CN101219222B (zh) | Pdcd4重组表达载体在制备治疗卵巢癌药物中的应用 | |
CN101643750B (zh) | 靶向性溶肿瘤腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法及应用 | |
CN105002145B (zh) | 利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150930 |