CN109576231B - 分离的重组溶瘤腺病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途 - Google Patents

分离的重组溶瘤腺病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了分离的重组溶瘤腺病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。所述重组溶瘤腺病毒为选择复制型溶瘤腺病毒，并且该重组溶瘤腺病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中抑制PDL1表达的外源shRNA的编码序列。该病毒在正常原代细胞中的复制能力远远低于其在肿瘤细胞中的复制能力，并且所表达的shPDL1能够显著降低肿瘤细胞内高表达的PDL1蛋白水平，从而使溶瘤病毒的溶瘤杀伤作用和T淋巴细胞的抗肿瘤免疫刺激作用产生协同效果。

Description

分离的重组溶瘤腺病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌 症的药物中的用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及分离的重组溶瘤腺病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
背景技术
根据2013年1月世界卫生组织网站公布的人口死亡病因最新报告，2008年全世界约有760万人死于癌症，占全世界死亡总数的13％，而且这个数字每年还在迅猛增长，预计到2030年，这个数字将超过 1310万。在我国，恶性肿瘤发病率正以年均3％～5％的速度递增，2002年全国每年恶性肿瘤新发病例达219万，到2020年，每年新发病人数量将会超过300万人。癌症已经成为世界上的头号死因之一。而且肿瘤的治疗已经成为当今医学领域的重点和难点，也越来越受到人们的重视。
肿瘤发生(Tumorigenesis)是一个多因素和多步骤的过程，主要为细胞受到外界致癌因子(包括物理辐射、化学物质和病毒等)的刺激，细胞受到损伤导致细胞内部DNA等遗传物质发生改变，进而引起细胞内部信号转导通路的异常与紊乱，细胞表现为疯狂增殖、抵抗凋亡、停止分化和具备侵袭组织与迁移的能力，最终影响人体重要脏器功能危及生命。目前肿瘤的主要治疗方式包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、生物治疗和免疫治疗等。虽然这些治疗手段在一定程度上有助于肿瘤的控制，但还是不能从根本上解决问题。
溶瘤病毒疗法也属于生物治疗的范畴，溶瘤病毒的研究最早可以追溯到上个世纪五十年代。当时发现一名宫颈癌患者在感染狂犬病病毒后肿瘤随之消退。受某些肿瘤患者在感染病毒后出现自发性肿瘤缓解这一现象的启发，第一波溶瘤病毒研究热潮自此开始。溶瘤病毒是指感染肿瘤细胞后能够选择性地在靶细胞内复制，最终导致肿瘤细胞裂解和死亡的一类病毒。这类病毒依靠其本身的特异性在肿瘤细胞中复制来裂解肿瘤细胞，细胞裂解后释放出来的病毒又可以进一步感染周围的肿瘤细胞，同时对正常细胞和组织则没有破坏作用，或影响较小。溶瘤病毒一般分为二类：一类为野生型病毒和自然变异的弱毒病毒株，这类病毒天然就对某些肿瘤细胞有亲和力，如呼肠孤病毒、新城疫病毒以及自主复制的细小病毒等，这些病毒能够在某些肿瘤细胞中繁殖并裂解细胞，具有天然的特异性溶瘤活性；另一类是对病毒基因组进行改造后，只能在肿瘤细胞内复制的病毒。目前人们已经通过基因工程方法改造了腺病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒和人牛痘病毒等。其中腺病毒是溶瘤病毒研究开展相对较早溶瘤机理研究相对较为清楚的，腺病毒中又以5型腺病毒研究得更为清楚。腺病毒发现后不久曾被用来治疗头颈部恶性肿瘤，注射腺病毒后肿瘤有不同程度缩小，但治疗后肿瘤易复发，效果难以持久；直到1996年，Bischoff 等首次报道去除部分E1B的重组腺病毒Onyx-015能在p53异常的肿瘤细胞选择性复制引起肿瘤杀伤作用，溶瘤腺病毒研究才再次受到广泛关注并且发展迅速，因此出现了许多新型溶瘤腺病毒种类。我国在 2005年11月就批准上市了上海三维生物技术有限公司研发的一种具有溶瘤作用的重组人5型腺病毒(一种删除了E1B55K和E3基因的溶瘤腺病毒)，可以实现在p53突变型的肿瘤细胞中特异性复制并溶解肿瘤细胞。溶瘤腺病毒日益成为恶性肿瘤治疗的一种新手段。
除此之外，在与肿瘤的斗争过程中肿瘤免疫治疗也是一种非常重要的手段。它主要包括抗体疗法、T细胞疗法和肿瘤疫苗等。抗体被称为癌症的新靶分子“药物”，可通过打靶肿瘤周围的免疫细胞辅助激活效应细胞，促进更有效的抗肿瘤免疫；也可通过补体依赖细胞毒导致肿瘤细胞的杀伤，或通过诱导肿瘤细胞凋亡。T细胞疗法是通过静脉给药，把体外扩增的肿瘤特异性自体T细胞(例如：CAR-T) 注入体内的一种疗法。肿瘤疫苗治疗是通过调动机体的免疫系统产生特异性抗体及效应性T细胞的方法，称为主动特异性免疫治疗。大量的临床实验证明肿瘤免疫治疗在治疗肿瘤的过程中发挥了非常积极的作用，但是肿瘤免疫治疗过程中的最大问题还是肿瘤逃逸。肿瘤的免疫逃逸机制与机体对肿瘤的免疫应答之间存在着极为复杂的关系。肿瘤免疫治疗的过程中早期肿瘤特异性的CD8+T细胞是激活的，随着肿瘤生长到后期失去了杀伤的功能。通常T细胞的活化除了需要通过APC递呈MHC-抗原肽给抗原特异性T细胞提供第一信号外，还需要一系列协同刺激分子提供第二信号，进而才能使T细胞达到生理活化阈值产生正常的免疫应答。如果缺少共刺激分子提供的第二信号，将会导致T细胞的无反应性或特异性免疫耐受甚至进入凋亡。因此，正性和负性协同刺激信号的调节及两者之间的平衡在机体免疫应答的整个过程中起着重要的调节作用。
目前在肿瘤和/或癌症的免疫治疗中，仍然需要更加有效的治疗方案和由此开发出的药物。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了分离的重组溶瘤腺病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
具体而言，本发明提供了：
(1)一种分离的重组溶瘤腺病毒，其中该重组溶瘤腺病毒为选择复制型溶瘤腺病毒，并且该重组溶瘤腺病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中抑制PDL1表达的外源shRNA的编码序列。
(2)根据(1)所述的重组溶瘤腺病毒，其中所述外源shRNA 的编码序列如SEQ IDNOs.16、19和22中的任一者所示。
(3)根据(1)所述的重组溶瘤腺病毒，其中该重组溶瘤腺病毒的基因组中缺失了E1B19K基因、E1B55K基因、和全部E3区基因。
(4)根据(1)或(3)所述的重组溶瘤腺病毒，其中所述重组溶瘤腺病毒的基因组中包含E1A基因编码序列；优选的是，所述E1A 基因编码序列是在CMV启动子控制下的。
(5)根据(1)所述的重组溶瘤腺病毒，其中所述重组溶瘤腺病毒是对5型腺病毒进行基因改造而得到的。
(6)一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据(1)-(5)中任一项所述的重组溶瘤腺病毒，及可药用辅料。
(7)根据(6)所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含5 ×107-5×1012vp的所述重组溶瘤腺病毒。
(8)根据(6)所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤腺病毒通过瘤内注射给药或静脉给药。
(9)一种用于制备(1)-(5)中任一项所述的重组溶瘤腺病毒的载体，其中所述载体包含在启动子控制下的外源shRNA编码序列，该shRNA编码序列如SEQ ID NOs.16、19和22中的任一者所示。
(10)根据(9)所述的载体，其中所述载体采用pShuttle作为基本骨架，并且在该基本骨架中依次包含可操作地连接的、控制所述外源shRNA编码序列表达的启动子、所述外源shRNA编码序列、控制所述E1A基因编码序列表达的启动子、和所述E1A基因编码序列。
(11)一种含有(9)或(10)所述的载体的宿主细胞。
(12)根据(11)所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞稳定表达所述载体。
(13)一种分离的shRNA，其中该shRNA的编码序列如SEQ ID NOs.16、19和22中的任一者所示，并且该shRNA能够在肿瘤细胞中抑制PDL1的表达。
(14)根据(1)-(5)中任一项所述的重组溶瘤腺病毒在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
(15)根据(14)所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。
(16)一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据(1)-(5)中任一项所述的重组溶瘤腺病毒。
(17)根据(16)所述的方法，其中所述重组溶瘤腺病毒的施用剂量为5×107-5×1012vp，每天1-2次，连续施用1-7天。
(18)根据(16)所述的方法，其中所述溶瘤病毒通过瘤内注射给药或静脉给药。
(19)根据(16)所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。
(20)一种药物组合物，其中该药物组合物的活性成分包括根据 (1)-(5)中任一项所述的重组溶瘤腺病毒和NK细胞；优选的是，该药物组合物的活性成分由所述溶瘤腺病毒和NK细胞组成。
(21)根据(20)所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤腺病毒和所述NK细胞各自独立地存在于所述药物组合物中而互不混合。
(22)根据(20)所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含 5×107-5×1012vp/天剂量的所述重组溶瘤腺病毒，并且所述药物组合物包含1×109至3×109个细胞/天剂量的所述NK细胞。
(23)根据(20)所述的药物组合物，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
(24)根据(20)所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤腺病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞通过静脉给药。
(25)一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括分别独立地装有根据(1)-(5)中任一项所述的重组溶瘤腺病毒和NK细胞的独立容器，以及载明给药时机和给药方式的说明书。
(26)根据(25)所述的药盒，其中所述装有所述重组溶瘤腺病毒的独立容器包含5×107-5×1012vp/天剂量的所述重组溶瘤腺病毒，并且所述装有NK细胞的独立容器包含1×109至3×109个细胞/ 天剂量的所述NK细胞。
(27)根据(25)所述的药盒，其中所述NK细胞选自自体NK 细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
(28)根据(25)所述的药盒，其中所述重组溶瘤腺病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞通过静脉给药。
(29)一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括以下依次进行的步骤：
1)对肿瘤和/或癌症患者施用根据(1)-(5)中任一项所述的重组溶瘤腺病毒；
2)在施用所述重组溶瘤腺病毒之后的第24小时至48小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用NK细胞。
(30)根据(29)所述的方法，其中所述NK细胞选自自体NK 细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
(31)根据(29)所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。
(32)根据(29)所述的方法，其中所述重组溶瘤腺病毒的施用剂量为5×107-5×1012vp，每天1-2次，连续施用1-7天；并且所述NK细胞的施用剂量为1×109至3×109个细胞/天剂量，每天1次，连续施用1-6天。
(33)根据(29)所述的方法，其中所述重组溶瘤腺病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞通过静脉给药。
(34)一种分离的重组溶瘤腺病毒，其中该重组溶瘤腺病毒为选择复制型溶瘤腺病毒，并且该重组溶瘤腺病毒的基因组中缺失了 E1B19K基因、E1B55K基因、和全部E3区基因；优选的是，该重组溶瘤腺病毒的基因组中包含E1A基因编码序列；进一步优选的是，所述E1A基因编码序列是在CMV启动子控制下的。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明首次提出使溶瘤腺病毒缺失E1B19K基因、E1B55K基因、和全部E3基因的编码区，同时使其携带外源shRNA的编码序列，从而使所得的重组溶瘤腺病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制，并且表达能够在肿瘤细胞中抑制PDL1表达的shRNA。基于该构思而提供的溶瘤腺病毒具有较强的杀瘤能力，并且在正常细胞中的复制能力远远低于其在肿瘤细胞中的复制能力，因此对正常细胞的毒性小，提高了安全性；并且该病毒所表达的shRNA能够显著降低肿瘤细胞内的PDL1蛋白表达水平，从而降低了肿瘤细胞对T淋巴细胞的免疫抑制，因此增强了T淋巴细胞的抗肿瘤免疫刺激作用。本发明发现在溶瘤腺病毒中整合所述shRNA编码序列，能够使溶瘤病毒的溶瘤杀伤作用和T淋巴细胞的抗肿瘤免疫刺激作用产生协同效果。
此外，由于本发明的重组溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中选择性复制的同时表达能够在肿瘤细胞中抑制PDL1表达的shRNA，因此增强了T淋巴细胞的抗肿瘤免疫刺激作用，从而能够协同刺激机体的抗肿瘤免疫反应，进而使得本发明的重组溶瘤腺病毒能够与NK细胞得以联用。基于该构思而提供的药物组合物和方法能够充分发挥本发明的重组溶瘤腺病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞、以及进一步引起随后的机体免疫反应的作用，同时还能够充分发挥NK细胞杀伤肿瘤细胞的功能，并且巧妙地利用了本发明的重组溶瘤腺病毒选择性地在肿瘤细胞中复制的特点，使得含有本发明的重组溶瘤腺病毒的肿瘤细胞成为了NK细胞的特异性靶标。这样最终产生进一步加强的协同杀伤肿瘤的作用。
进一步地，本发明通过研究，使得本发明的重组溶瘤腺病毒和 NK细胞各自的施用剂量、施用顺序和施用间隔能够使两者的联合施用达到最大效率的协同作用，同时避免了两者之间的相互制约，从而达到有效地治疗肿瘤和/或癌症的效果。
附图说明
图1示出PCR扩增5型腺病毒的E1A基因的凝胶电泳图；其中泳道M为DNA分子量标记，泳道1为以H101基因组DNA为模板的PCR产物。
图2示出pShuttle-E1A质粒阳性克隆的PCR筛选结果；其中泳道M为DNA分子量标记，泳道1-3为候选克隆。
图3示出pShuttle-E1A质粒的构建过程和所构建的质粒的图谱。
图4示出从pShuttle-E1A质粒PCR扩增E1A表达框的示意图(左图)和凝胶电泳图(右图)；其中泳道M为DNA分子量标记，泳道 1-2为PCR产物。
图5示出pShuttle-MCS-E1A候选质粒的PCR筛选结果；其中泳道M为DNA分子量标记，泳道1-13为候选质粒，泳道NC为PCR 系统阴性对照(即，模板为水的PCR产物)，泳道PC为PCR系统阳性对照(即，模板为包含目的片段的pShuttle-E1A质粒DNA)。
图6示出pShuttle-MCS-E1A候选质粒的BglII酶切鉴定结果；其中泳道M为DNA分子量标记，样品1-3为候选质粒，每种样品两条泳道，分别为：泳道N为未酶切的候选质粒，泳道B为BglII酶切后的候选质粒。
图7示出pShuttle-MCS-E1A质粒的构建过程和所构建的质粒的图谱。
图8示出本发明的一个实施方案的三种shPDL1对U251和H460 细胞中人PDL1 mRNA的抑制情况。横坐标轴表示利用4种shRNA 处理U251和H460细胞后分别在24h和48h收取的4组细胞样品，纵坐标表示每种shRNA处理细胞后细胞中PDL1 mRNA的表达水平与对照shRNA处理细胞后其中PDL1 mRNA的表达水平的比率。
图9示出本发明的一个实施方案的三种shPDL1对293T细胞中外源hPDL1表达的抑制情况。左图为蛋白质印迹法(Western Blot) 结果，表示不同shPDL1处理细胞后细胞样品中hPDL1(含FLAG标签)的表达变化情况和细胞内的蛋白内参β-actin(β肌动蛋白)的表达情况；右图为根据Western Blot结果，以蛋白内参β-actin作为标准化对照获得的hPDL1条带的灰度扫描值，横坐标表示不同shPDL1 处理后的293细胞样品组，“对照”是指仅转染pcDNA3.3-hPDL1-FLAG 表达hPDL1(含FLAG标签)的对照组，纵坐标为利用β-actin标准化后的目的蛋白的灰度扫描值。
图10示出pShuttle-U6-shPDL1-CMV-E1A质粒的构建过程和所构建的质粒的图谱。
图11示出pShuttle-U6-shPDL1-CMV-E1A质粒的酶切鉴定结果；其中泳道M为DNA分子量标记，泳道C为KpnI/HindIII酶切后的对照质粒(pShuttle-MCS-E1A)，泳道1-7为KpnI/HindIII酶切后的候选质粒。
图12示出pShuttle-U6-shPDL1-CMV-E1A质粒在BJ5183细菌中与pAdEasy-1进行同源重组的过程示意图。
图13示出pAdEasy-U6-shPDL1-CMV-E1A质粒构建过程中 pShuttle相关质粒与pAdEasy-1之间的同源重组的示意图。
图14示出所构建的阳性pAdEasy-U6-shPDL1-CMV-E1A质粒的 PacI酶切鉴定结果；其中泳道M为DNA分子量标记，泳道1-8为不同质粒的PacI酶切产物，具体而言，泳道1为C-4.5K的PacI酶切产物，泳道2为1-4.5K的PacI酶切产物，泳道3为C-3K的PacI酶切产物，泳道4为1-3K的PacI酶切产物，泳道5为2-4.5K的PacI 酶切产物，泳道6为3-4.5K的PacI酶切产物，泳道7为2-3K的PacI 酶切产物，泳道8为3-3K的PacI酶切产物。
图15示出pAdEasy-U6-shPDL1-CMV-E1A质粒和 pAdEasy-CMV-E1A对照质粒分别在AD293细胞中完成病毒包装的过程示意图。
图16示出本发明的一个实施方案中12孔板样品布局示意图。按照图中所示分别选用OAd-shPDL1#1-4.5K(1-4.5K)、 OAd-shPDL1#2-4.5K(2-4.5K)、OAd-shPDL1#3-4.5K(3-4.5K)和对照溶瘤病毒OAd-C-4.5K(C-4.5K)以所示MOI值处理细胞。其中“NC”是指未进行任何处理的对照细胞组。
图17示出在一个实例中本发明所构建的溶瘤病毒OAd-shPDL1 (OAd-shPDL1#1-4.5K(1-4.5K)、OAd-shPDL1#2-4.5K(2-4.5K) 和OAd-shPDL1#3-4.5K(3-4.5K))在不同细胞中复制能力的比较结果，其中OAd-C-4.5K(C-4.5K)作为系统对照病毒。横坐标表示不同溶瘤病毒组，纵坐标为利用细胞中GAPDH基因作为标准化对照处理后的溶瘤腺病毒的特异性基因E1A的拷贝数的倍数。
图18示出在一个实例中本发明所构建的溶瘤病毒OAd-shPDL1 (OAd-shPDL1#1-4.5K(1-4.5K)、OAd-shPDL1#2-4.5K(2-4.5K) 和OAd-shPDL1#3-4.5K(3-4.5K))和系统对照病毒OAd-C-4.5K (C-4.5K)以及对照组H101和对照组紫杉醇(Paclitaxel)对U251 细胞的杀伤效果。横坐标表示处理细胞所用的不同的病毒感染量(单位为MOI)，纵坐标为病毒处理细胞后对细胞生长的抑制率(％)。左图为48小时实验结果，右图为72小时实验结果。“***”表示 p<0.001。
图19示出在一个实例中本发明所构建的溶瘤病毒OAd-shPDL1 (OAd-shPDL1#1-4.5K(1-4.5K)、OAd-shPDL1#2-4.5K(2-4.5K) 和OAd-shPDL1#3-4.5K(3-4.5K))和系统对照病毒OAd-C-4.5K (C-4.5K)以及对照组H101和对照组紫杉醇对A549细胞的杀伤效果。横坐标表示处理细胞所用的不同的病毒感染量(单位为MOI)，纵坐标为病毒处理细胞后对细胞生长的抑制率(％)。左图为48小时实验结果，右图为72小时实验结果。
图20示出在一个实例中本发明所构建的溶瘤病毒OAd-shPDL1 (OAd-shPDL1#1-4.5K(1-4.5K)、OAd-shPDL1#2-4.5K(2-4.5K) 和OAd-shPDL1#3-4.5K(3-4.5K))和系统对照病毒OAd-C-4.5K (C-4.5K)以及对照组H101和对照组紫杉醇对Hela细胞的杀伤效果。横坐标表示处理细胞所用的不同的病毒感染量(单位为MOI)，纵坐标为病毒处理细胞后对细胞生长的抑制率(％)。左图为48小时实验结果，右图为72小时实验结果。
图21示出在一个实例中本发明所构建的溶瘤病毒OAd-shPDL1 (OAd-shPDL1#1-4.5K(1-4.5K)、OAd-shPDL1#2-4.5K(2-4.5K) 和OAd-shPDL1#3-4.5K(3-4.5K))和系统对照病毒OAd-C-4.5K (C-4.5K)以及对照组H101对不同细胞的IC50(72h)剂量的比较结果。横坐标表示不同种类的肿瘤细胞组，纵坐标为病毒孵育细胞 72h时能够杀伤50％对应肿瘤细胞所用的病毒数量(单位为MOI)。
图22示出在一个实例中本发明所构建的溶瘤腺病毒 OAd-shPDL1(OAd-shPDL1#1-4.5K(1-4.5K)、OAd-shPDL1#2-4.5K (2-4.5K)和OAd-shPDL1#3-4.5K(3-4.5K))和系统对照病毒OAd-C-4.5K(C-4.5K)以及对照组H101对A549/hPD-L1-FLAG细胞株中过表达的hPD-L1的抑制情况。上图为Western blot结果，表示不同病毒处理细胞后细胞样品中hPDL1(含FLAG标签)的表达变化情况和细胞内的蛋白内参β-actin的表达情况，“对照”是指未进行任何处理的对照细胞组；下图为根据Western blot结果，以蛋白内参β-actin作为标准化对照获得的hPDL1条带的灰度扫描值。
图23示出在一个实例中本发明所构建的溶瘤腺病毒 OAd-shPDL1(OAd-shPDL1#1-4.5K(1-4.5K)、OAd-shPDL1#2-4.5K (2-4.5K)和OAd-shPDL1#3-4.5K(3-4.5K))以及对照组H101对 Hela/hPD-L1-FLAG细胞株中过表达的hPD-L1的抑制情况。上图为 Western blot结果，表示不同病毒处理细胞后细胞样品中hPDL1(含 FLAG标签)的表达变化情况和细胞内的蛋白内参β-actin的表达情况，“对照”是指未进行任何处理的对照细胞组；下图为根据Western blot结果，以蛋白内参β-actin作为标准化对照获得的hPDL1条带的灰度扫描值。
图24示出细胞的p53和Rb信号通路示意图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在本发明中，词语“肿瘤”、“癌症”、“肿瘤细胞”、“癌细胞”涵盖本领域通常认为的含义。
人体是一个复杂的系统，它是由呼吸、循环、消化等十大系统组成，这些系统协调配合，使人体内各种复杂的生命活动能够正常进行。当肿瘤发生后，机体可通过多种免疫效应机制发挥抗肿瘤作用，机体的抗肿瘤机制包括细胞免疫和体液免疫两个方面。它们联系密切，相互影响，涉及多种免疫效应分子和效应细胞。一般认为，细胞免疫在抗肿瘤过程中起到主导作用，体液免疫在某些情况下起协同作用。本发明提出利用溶瘤腺病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀伤肿瘤细胞的特点，同时使其携带能够在肿瘤细胞中抑制PDL1表达的外源shRNA的编码序列，从而使重组的溶瘤腺病毒协同发挥选择性溶瘤和增强机体抗肿瘤免疫效应的作用。基于该构思，本发明的发明人通过实验研究和理论摸索，发现同时使溶瘤腺病毒的E1B19K基因、 E1B55K基因、和全部E3基因的编码区缺失，并在基因组中整合所述外源shRNA的编码序列，能够很好地实现上述协同作用。
另外，许多种DNA病毒，如腺病毒等都可以改变宿主细胞细胞周期，其原因主要是病毒产生一些蛋白作用于宿主细胞细胞周期调节蛋白，使静止期细胞进入细胞周期以利于病毒DNA的复制。不同病毒影响细胞周期的机制不一，腺病毒主要通过Rb和p53细胞信号通路干扰宿主细胞细胞周期(图24)(参见文献：“陈建发等，溶瘤腺病毒的研究进展，肿瘤防治研究，2004,31(4)：243-245.”)。溶瘤腺病毒的溶瘤功能便是基于此原理通过改变腺病毒的调节宿主细胞细胞周期蛋白的表达来实现的。腺病毒的基因组包括4个具有调节功能的早期转录单位(early transcription unit，即E1、E2、E3和E4) 和1个晚期转录单位(latetranscription unit)。E1分为E1A和E1B 两部分，如图24所示，E1A与Rb结合释放游离E2F，细胞由G1期进入S期；腺病毒同时编码产生E1B55k和E1B19k两种蛋白分别抑制p53和Bax，使宿主细胞的分裂增殖不受p53细胞信号通路所抑制，大量宿主细胞由静止期进入分裂期，腺病毒得以大量复制繁殖。而去除E1A基因的腺病毒感染宿主细胞时不能编码产生E1A蛋白使游离 E2F释放，G1期细胞不能进入S期。同样，去除E1B基因的腺病毒即使可以产生E1A蛋白使宿主细胞由G1期进入S期，但进入分裂周期的细胞也会通过p53信号通路发生凋亡或分裂受阻。因此，去除 E1A或E1B基因的腺病毒在Rb和p53细胞信号通路正常的宿主细胞无法进行复制增殖，只有在Rb或p53信号通路异常的肿瘤细胞才能增殖。早期的溶瘤腺病毒Onyx-015和H101都是删除了腺病毒中的 E1B55K的表达(E3区序列部分或全部删除)来实现其在p53突变型的肿瘤细胞内选择性复制的。此类病毒感染正常宿主细胞时即使可以编码产生E1A蛋白使Rb-E2F结合物分离释放游离E2F，感染细胞由G1期进入S期，但由于不能编码产生p53抑制蛋白E1B55K，进入分裂期的感染细胞通过p53信号通路发生分裂受阻或细胞凋亡，细胞内的腺病毒不能得到有效复制。在p53信号通路功能异常的细胞中，进入分裂期的感染细胞不会通过p53信号通路发生分裂受阻或细胞凋亡，细胞大量增殖，细胞内腺病毒便大量复制从而使细胞溶解。但是后面的实验也证明了上述两类病毒在正常细胞中的选择性复制并没有预期的那样理想，分析原因可能是因为它们只是删除了 E1B55K，但是仍旧保留了E1B19K的正常表达，而根据图24，E1B55K 和E1B19K在p53信号通路中发挥着相似的作用，虽然删除了 E1B55K的表达不能抑制野生型p53的功能的发挥，但是E1B19K蛋白的正常表达仍能抑制p53下游Bax的功能从而使溶瘤腺病毒在正常细胞中也能完成复制。在本发明描述的溶瘤腺病毒中，除了删除 E3区外，也同时删除了E1B55K和E1B19K两个基因，因此该类病毒比现有技术中的溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中的选择复制性更好，在正常细胞中的复制能力更低，对正常细胞的安全性更好。
另一方面，PD-L1(也称PDL1或B7-H1)属于B7家族，具有 IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区。该分子具有广泛的组织表达谱，在一些肿瘤细胞系上有较高的表达，许多研究均表明其与肿瘤的免疫逃逸机制相关。肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，且表达广泛，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长。肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的APCs表达的PD-L1与T细胞上的受体PD1 相互作用经PD-1/PD-L1信号通路抑制肿瘤抗原特异性T细胞的活化，下调T细胞介导的肿瘤免疫应答。另外也有研究表明通过阻断 PD-L1/PD-1信号通路可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增殖、上调浸润CD8+T细胞IFN-γ的分泌和有效抑制肿瘤生长，表明 PD-1/PD-L1信号通路的阻断在以诱导免疫应答为目的的肿瘤免疫应答中发挥重要的作用。而且还有实验证明选择抗PD-L1单抗配合肿瘤疫苗进行肿瘤免疫治疗可有效加强肿瘤疫苗的免疫激活作用，减弱肿瘤微环境对疗效的影响。
基于以上的理论研究和探索，本发明的溶瘤腺病毒除了改构溶瘤病毒基因组构成使其具备更高的溶瘤杀伤能力以外，还加入了一个可以表达shPDL1(抑制PDL1表达的shRNA)的编码框，期望借助shPDL1 可以高效降解细胞内PDL1的mRNA实现其基因沉默，进而降低肿瘤细胞内PDL1的表达，减弱PD1/PDL1信号通路向T细胞抑制信号的传递，加强T细胞对肿瘤的杀伤作用。因此，本发明的溶瘤病毒既可以单独作为溶瘤剂，又可以作为shPDL1的编码框的有效载体，使shPDL1 伴随病毒复制而大量表达，同时发挥病毒治疗和基因治疗的双重功能。
由此，本发明提供了一种分离的重组溶瘤腺病毒，其中该重组溶瘤腺病毒为选择复制型溶瘤腺病毒，并且该重组溶瘤腺病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中抑制PDL1表达的外源shRNA的编码序列。
优选地，所述外源shRNA的编码序列如SEQ ID NOs.16、19和 22中的任一者所示。
优选地，所述重组溶瘤腺病毒的基因组中缺失了E1B19K基因、 E1B55K基因、和全部E3区基因。
溶瘤病毒进入肿瘤细胞后导致肿瘤细胞裂解的可能作用机制还有：(1)病毒蛋白的直接细胞毒作用：如腺病毒产生的死亡蛋白和晚期蛋白都能有效地介导肿瘤细胞裂解。(2)产生抗肿瘤免疫反应：一方面，病毒可通过增强肿瘤细胞对多种细胞因子的敏感性而起到杀瘤作用，如腺病毒通过在感染的肿瘤细胞内复制和表达E1A蛋白，增强肿瘤坏死因子所介导的杀瘤作用；另一方面当肿瘤细胞被病毒感染后，肿瘤细胞表面的病毒抗原与主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原形成复合物，很容易被细胞毒性T淋巴细胞所识别，从而介导对病毒感染的肿瘤细胞的特异性攻击。(3)增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性：腺病毒E1A基因表达的产物就是一种强有力的化学增敏剂，在肿瘤细胞中E1A基因的表达产物可诱导p53蛋白的高水平表达，并以此增强化疗和放疗对DNA的损伤作用。
因此，优选地，所述重组溶瘤腺病毒的基因组中包含E1A基因编码序列。还优选地，所述E1A基因编码序列是在CMV启动子控制下的，从而通过增加E1A的表达来增强其对肿瘤细胞的溶瘤杀伤效果。
优选地，所述重组溶瘤腺病毒是对5型腺病毒进行基因改造而得到的。5型腺病毒的一个例子为H101。
在一个优选实施方案中，所述溶瘤腺病毒基因组在ES序列后整合了包括U6启动子和人PDL1shRNA(shPDL1)的编码框，以及包括CMV启动子、E1A编码区及其部分3’端UTR区和SV40polyA在内的E1A表达框。
本发明的重组溶瘤腺病毒对多种人肿瘤细胞(例如人神经胶质细胞瘤细胞U251、人肺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人大细胞肺癌H460等)具有较强的杀伤能力。该病毒在人正常原代细胞中的复制能力远远低于其在人肿瘤细胞中的复制能力(相差约2个数量级)。该病毒所表达的人shPDL1能够显著降低人肿瘤细胞内高表达的PDL1蛋白水平。
基于本发明开发的重组溶瘤腺病毒，本发明还提供了一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据本发明所述的重组溶瘤腺病毒，及可药用辅料。
优选地，所述药物组合物包含临床施用剂量的所述重组溶瘤腺病毒。更优选地，所述重组溶瘤腺病毒的临床施用剂量为5×107-5 ×1012vp。
所述溶瘤病毒可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
本发明的药物组合物还可以包含本领域已知的其它活性成分，例如白细胞介素-2(IL-2)、IL-15、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 等，其施用剂量和施用方式可以按照各自常规的方式进行。如果包含其它活性成分，那么所述重组溶瘤腺病毒应独立地存在于所述药物组合物中而不与其它活性成分相互混合。例如，将重组溶瘤腺病毒独立地装在独立容器中。
本领域的技术人员可以理解，本发明的药物组合物还可包含合适的可药用的辅料。
本发明另一方面还提供了一种用于制备本发明所述的重组溶瘤腺病毒的载体，其中所述载体包含在启动子控制下的外源shRNA编码序列，该shRNA编码序列如SEQ IDNOs.16、19和22中的任一者所示。
在一个具体实施方案中，所述载体采用pShuttle作为基本骨架，并且在该基本骨架中依次包含可操作地连接的、控制所述外源 shRNA编码序列表达的启动子、所述外源shRNA编码序列、控制所述E1A基因编码序列表达的启动子、和所述E1A基因编码序列。
本发明另一方面还提供了一种含有本发明所述的载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞稳定表达所述载体。
本发明另一方面还提供了一种分离的shRNA，其中该shRNA的编码序列如SEQ IDNOs.16、19和22中的任一者所示，并且该shRNA 能够在肿瘤细胞中抑制PDL1的表达。
本发明另一方面还提供了本发明所述的重组溶瘤腺病毒在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌等。
本发明另一方面还提供了一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据本发明所述的重组溶瘤腺病毒。
所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌等。
在本发明的一个优选实施方案中，所述重组溶瘤腺病毒的施用剂量为临床施用剂量，每天1-2次，连续施用1-7天。所述临床施用剂量优选为5×107-5×1012vp。
如果需要，还可以将本发明的重组溶瘤腺病毒与其它药物联合使用，例如白细胞介素-2(IL-2)、IL-15、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 等，其施用剂量和施用方式可以按照各自常规的方式进行。
可以根据实际情况和需要对患者进行一次或多次本发明的治疗肿瘤和/或癌症的方法。
所述溶瘤病毒可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
本发明另一方面还提供了一种分离的重组溶瘤腺病毒，其中该重组溶瘤腺病毒为选择复制型溶瘤腺病毒，并且该重组溶瘤腺病毒的基因组中缺失了E1B19K基因、E1B55K基因、和全部E3区基因；优选的是，该重组溶瘤腺病毒的基因组中包含E1A基因编码序列；进一步优选的是，所述E1A基因编码序列是在CMV启动子控制下的。
该溶瘤腺病毒具有较强的杀瘤能力，并且在正常细胞中的复制能力远远低于其在肿瘤细胞中的复制能力，因此对正常细胞的毒性小，提高了安全性。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
例子
以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用生物工程领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。
以下除非特别说明，否则各试剂的百分浓度(％)均指该试剂的体积百分浓度(％(v/v))。
制备例1：E1A基因表达载体构建
根据NCBI(即，美国国立生物技术信息中心，网址： https://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Genbank中的人5型腺病毒(AD5) 基因组DNA序列(ACCESSION：AC_000008)设计两条PCR引物(P1： GGAAGATCTGGACTGAAAATGAG(SEQ ID No.1)，P2：TGAGGTCAGATGTAACCAAGATTA(SEQ ID No.2)；注：引物P1 的5’端加入了BglII酶切位点，下划线标出)；提取上海三维生物技术有限公司生产的溶瘤病毒(H101)基因组DNA做为模板，进行高保真 PCR扩增AD5基因组DNA上551-1714之间1164bp的序列，实际大小为1173bp(见图1)，该段序列包括E1A基因的编码区(不包括E1A 启动子序列)和部分的3’UTR区。利用BglII酶切获得的PCR产物，并将其克隆至载体pShuttle-CMV(购自Agilent公司)上多克隆位点区 (MCS)中的BglII和EcoRV位点之间，获得中间载体pShuttle-E1A，所得pShuttle-E1A阳性克隆用P1和P2进行PCR筛选确认，结果见图 2，构建过程见图3。对获得阳性克隆进行测序，测序结果与AD5基因组DNA上的对应序列完全一致。
再次设计PCR引物P3和P4(P3： CGCGTCGACTACTGTAATAGTAATCAATTACGG(SEQ IDNo.3)和 P4：GACGTCGACTAAGATACATTGATGAGTTTGGAC(SEQ ID No.4)；注：两条引物的5’端均加入了SalI酶切位点，下划线标出)，以获得的pShuttle-E1A阳性克隆为模板进行高保真PCR扩增，PCR产物包含CMV启动子、E1A基因片段和SV40polyA在内的E1A表达框， PCR产物大小为2017bp(图4)。
将获得的E1A表达框的PCR产物进行SalI酶切后克隆到pShuttle 载体(购自Agilent公司)上MCS区中的SalI位点中，利用P3和P4 引物进行PCR筛选插入E1A表达框的阳性克隆(图5)，并用BglII 进行酶切进行确认，E1A表达框正向插入的克隆经BglII酶切后将产生 7200bp和1400bp两条片段，E1A表达框反向插入的克隆经BglII酶切后将产生7970bp和630bp两条片段(图6)，选择图6中#2质粒进行后续试验。最终获得中间载体pShuttle-MCS-E1A，构建过程见图7。对获得的pShuttle-MCS-E1A阳性克隆进行测序，结果与预期序列完全一致。
制备例2：shRNA表达载体构建
根据NCBI网站上Genbank中的人PDL1variant1序列(ACCESSION：NM_014143)设计了分别靶向其编码区mRNA的 168-190、430-452和589-611三个区域的三条shRNA序列(shPDL1-1 (或称shPDL1-#1)、shPDL1-2(或称shPDL1-#2)和shPDL1-3(或称shPDL1-#3)，分别为SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22)，除此之外，还设计了一个与人PDL1mRNA无关的一个阴性对照序列 shPDL1-NC。序列如下：
(1)shPDL1-1
合成正义序列(SEQ ID No.14)：
5'-CACCGGGAAATGGAGGATAAGAACA
Figure BDA0001422820950000191
TGTTCTTATCCTCCATTTCCC
Figure BDA0001422820950000192
-3'
合成反义序列(SEQ ID No.15)：
5'-AGCT
Figure BDA0001422820950000193
GGGAAATGGAGGATAAGAACA
Figure BDA0001422820950000194
TGTTCTTATCCTCCATTTCCC- 3'
shRNA DNA(SEQ ID No.16)：
GGGAAATGGAGGATAAGAACA
Figure BDA0001422820950000195
TGTTCTTATCCTCCATTTCCC
Figure BDA0001422820950000196
(2)shPDL1-2
合成正义序列(SEQ ID No.17)：
5'-CACCGGATCCAGTCACCTCTGAACA
Figure BDA0001422820950000197
TGTTCAGAGGTGACTGGATCC
Figure BDA0001422820950000198
-3'
合成反义序列(SEQ ID No.18)：
5'-AGCT
Figure BDA0001422820950000199
GGATCCAGTCACCTCTGAACA
Figure BDA00014228209500001910
TGTTCAGAGGTGACTGGATCC-3'
shRNA DNA(SEQ ID No.19)：
GGATCCAGTCACCTCTGAACA
Figure BDA00014228209500001911
TGTTCAGAGGTGACTGGATCC
Figure BDA00014228209500001912
(3)shPDL1-3
合成正义序列(SEQ ID No.20)：
5'-CACCGAGAATCAACACAACAACTAA
Figure BDA00014228209500001913
TTAGTTGTTGTGTTGATTCTC
Figure BDA00014228209500001914
- 3'
合成反义序列(SEQ ID No.21)：
5'-AGCT
Figure BDA00014228209500001915
GAGAATCAACACAACAACTAA
Figure BDA00014228209500001916
TTAGTTGTTGTGTTGATTCTC-3'
shRNA DNA(SEQ ID No.22)：
GAGAATCAACACAACAACTAA
Figure BDA00014228209500001917
TTAGTTGTTGTGTTGATTCTC
Figure BDA00014228209500001918
(4)shPDL1-NC
合成NC正义序列(SEQ ID No.23)：
5'-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGT
Figure BDA00014228209500001919
ACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3'合成NC反义序列(SEQ ID No.24)：
5'-AGCTCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGT
Figure BDA00014228209500001920
ACGTGACACGTTCGGAGAAC-3’shNC DNA(SEQ ID No.25):
GTTCTCCGAACGTGTCACGT
Figure BDA00014228209500001921
ACGTGACACGTTCGGAGAATT
利用shRNA序列两端预留的可以与BbsI和HindIII互补的粘性末端将四段序列连接到pSGU6/GFP/Neo载体(购自上海生工生物技术有限公司)上的BbsI和HindIII位点之间获得四个可以表达shPDL1的载体(pSGU6/GFP/Neo-shPDL1-NC、pSGU6/GFP/Neo-shPDL1-1、pSGU6/GFP/Neo-shPDL1-2和pSGU6/GFP/Neo-shPDL1-3)。
试验例1：shPDL1的抑制效果检测
在U251和H460细胞中检测shPDL1对hPDL1 mRNA(人PDL1 mRNA)的抑制效果。首先在12孔板中以每孔2×105个细胞提前12 小时接种U251和H460，每个孔以4μllipofectamin 2000:1.6μg shRNA 表达载体DNA的比例关系转染U251和H460，分别在24小时和48 小时收取两份细胞样品，提取总RNA并进行反转录后以GAPDH基因的mRNA水平作为对照进行Real-time PCR检测细胞中人PDL1 mRNA 的表达水平，结果显示与对照相比shRNA-#1、2、3均在一定时间内产生对hPDL1 mRNA的抑制作用，其中shPDL1-#1对hPDL1mRNA的抑制效果最显著(图8)。
另外也在蛋白水平上对三个shPDL1的抑制效果进行了检测。将4 个质粒pSGU6/GFP/Neo-shPDL1-NC、pSGU6/GFP/Neo-shPDL1-1、 pSGU6/GFP/Neo-shPDL1-2和pSGU6/GFP/Neo-shPDL1-3分别与 pcDNA3.3-hPDL1-3×FLAG等摩尔比(1:1)瞬间转染293T细胞，其中质粒pcDNA3.3-hPDL1-3×FLAG可以表达融合了3×FLAG标签的人PDL1蛋白。48小时后收取细胞样品，裂解后进行Western blot分析，结果(见图9)证明shPDL1-#1能够显著降低过表达的hPDL1。
上述pcDNA3.3-hPDL1-3×FLAG质粒的构建过程如下：首先根据NCBI中人PDL1基因的mRNA序列设计两条引物(P11： CGCGTCGACATGAGGATATTTGCTGTCTTTAT(SEQ ID No.11)，P12：CCGCTCGAGCGTCTCCTCCAAATGTGTATCAC(SEQ ID No.12))，利用Trizol提取U251细胞的总RNA，以该RNA为模板进行RT-PCR获得hPDL1cDNA并将其克隆至pShuttle-IRES-hrGFP-1载体(购自Agilent公司)中，使hPDL1与下游的FLAG标签融合表达，获得中间载体pShuttle-HPDL1-IRES-hrGFP-1。再次设计一条引物 (P15：CGCCTATTACACCCACTCGTGCAG(SEQ IDNo.13))与P11 联合扩增pShuttle-hPDL1-IRES-hrGFP-1上的一段包括hPDL1 cDNA-FLAG-IRES-hrGFP的序列，将该段片段克隆至pcDNA3.3-TOPO 载体(购自Invitrogen公司)上，最后获得pcDNA3.3-hPDL1-FLAG载体。插入的片段经过测序确认序列完全正确。
制备例3：溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)的基因组DNA的制备
1.在确定了shPDL1的抑制效果后，将包括U6启动子和shPDL1 全部序列在内的编码框克隆到pShuttle-MCS-E1A中。首先利用SacI 酶切pSGU6/GFP/Neo-shPDL1载体，然后利用T4DNA聚合酶将SacI 酶切后形成的粘性末端进行切平处理后进行乙醇/乙酸铵沉淀回收，最后再用KpnI酶切后回收包括U6启动子和shPDL1序列在内的编码框序列；同时利用KpnI和EcoRV双酶切pShuttle-MCS-E1A载体并回收，最后将3个shPDL1编码框分别连接到pShuttle-MCS-E1A载体上得到最终的载体pShuttle-U6-shPDL1-CMV-E1A，过程见图10。选取几个菌落提取质粒后进行KpnI/HindIII酶切鉴定，正确克隆将产生一条大小为 370bp的条带(见图11)。选取酶切正确的 pShuttle-U6-shPDL1-CMV-E1A质粒进行测序，测序结果完全正确。
2.将获得的pShuttle-MCS-E1A(对照质粒)、 pShuttle-U6-shPDL1-1-CMV-E1A、pShuttle-U6-shPDL1-2-CMV-E1A和 pShuttle-U6-shPDL1-3-CMV-E1A四个质粒利用PmeI酶切将其线性化后转入BJ5183菌中，与其中包含AD5腺病毒基因组DNA(缺失E1 和E3区)的pAdEasy-1质粒(购自Agilent公司)进行同源重组，借此将CMV-E1A-SV40pA表达框和/或U6-shPDL1编码框整合到AD5腺病毒的基因组DNA中，从而获得可以表达目的基因的并能进行复制的溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)的基因组DNA(图12)。
具体实验过程如下：
(1)BJ5183感受态细胞的制备。
将本实验室-80℃保存的BJ5183(已转入pAdEasy-1质粒)接种于LB/Amp培养基中，37℃、200RPM过夜培养活化。利用生工生物工程股份有限公司的超级感受态细胞制备试剂盒(B529303-0040)制备BJ5183感受态细菌，每管分装100μl，保存于-80℃备用。
(2)pShuttle相关质粒与pAdEasy-1质粒之间的同源重组。
分别取pShuttle-MCS-E1A、pShuttle-U6-shPDL1-1-CMV-E1A、 pShuttle-U6-shPDL1-2-CMV-E1A和pShuttle-U6-shPDL1-3-CMV-E1A 质粒DNA各1μg，利用1μl的PmeI对其进行酶切，37℃反应1.5小时后加入1μl碱性磷酸酶对线性化的DNA片段进行脱磷处理。而后将酶切产物直接加入到100μl BJ5183感受态细菌中进行常规的转化实验，最后将转化后的菌液涂布于Kana抗性的LB平板上，37℃培养过夜。第二天挑取平板上出现的菌落接种于LB/Kana中过夜培养后提取质粒 DNA并进行常规的PacI酶切，酶切产物进行电泳分析。根据可能发生同源重组的位置不同，可能发生三种不同方式的同源重组(图13)，经PacI酶切后可以产生4.5Kb或3Kb片段的质粒均为发生正确同源重组的质粒。酶切产物的电泳结果(图14)证明：pShuttle-MCS-E1A， pShuttle-U6-shPDL1-1-CMV-E1A，pShuttle-U6-shPDL1-2-CMV-E1A和 pShuttle-U6-shPDL1-3-CMV-E1A与pAdEasy-1质粒间发生了正确的同源重组，成功获得了包装溶瘤腺病毒(统称为OAd-shPDL1)和其对照病毒的基因组DNA(pAdEasy-U6-shPDL1#1-CMV-E1A、 pAdEasy-U6-shPDL1#2-CMV-E1A、pAdEasy-U6-shPDL1#3-CMV-E1A 和pAdEasy-CMV-E1A)。对获得的阳性克隆中插入的shPDL1编码框和E1A表达框进行测序，序列完全正确。
制备例4：溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)的包装与扩增
(1)包装溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)的基因组DNA的准备
分别取2μg获得的pAdEasy-CMV-E1A、 pAdEasy-U6-shPDL1#1-CMV-E1A、pAdEasy-U6-shPDL1#2-CMV-E1A 和pAdEasy-U6-shPDL1#3-CMV-E1A质粒DNA，各加入2μl PacI酶， 37℃反应2小时后进行乙醇乙酸铵沉淀DNA，70％乙醇漂洗后将DNA 沉淀溶解于10μl洁净的ddH2O中，然后将其转染进入AD293进行病毒的包装。
(2)溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)的包装
提前一天将生长状态良好的AD293细胞接种于6孔板中，细胞接种数量以第二天进行转染实验时细胞覆盖率60-70％为宜。将准备好的约2μg线性化DNA与QIAGEN公司的6μlAttractene转染试剂混匀后加入AD293细胞中，十字混匀后放入细胞培养箱(37℃，5％CO2)中继续培养约10-14天，中间每隔2-3天观察细胞病变情况。待出现小片细胞变为“念珠状”，范围逐渐扩大直至细胞大量脱落即可轻轻吹打细胞回收细胞和培养上清，保存于-80℃冰箱或直接进行进一步扩增，过程见图15。
(3)溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)的扩增
同样提前一天将生长状态良好的AD293细胞接种于6cm细胞培养皿中，细胞接种数量以第二天进行转染实验时细胞覆盖率70-80％为宜。每个6cm细胞培养皿加入前面收集的病毒上清800-1000μl，同样十字混匀后放回细胞培养基继续培养。通常48小时后可见细胞大量变圆并脱落，此时可收集细胞和培养上清。接下来继续放大在10cm细胞培养皿中扩增病毒，接种病毒时细胞密度同样以约70％为宜，每个10cm 细胞培养皿加入前面收集的病毒上清1200-1500μl，同样48小时后可见细胞大量病变脱落，回收细胞和上清。最终放大到15cm培养皿中扩增病毒，细胞密度约为70％时加入10cm培养皿收集的病毒培养上清 2ml，混匀后继续培养48小时收集细胞和培养上清。后面可在15cm培养皿中循环扩增病毒至所需病毒量。
(4)溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)滴度的测定
目前腺病毒滴度的测定方法有VP法、GTU/BFU法、空斑法、 TCID50法和Hexon染色计数(试剂盒)法。较为准确且重复率高的方法为TCID50法和Hexon染色计数法。本实施例采用Hexon染色计数法测定了获得的病毒上清中的活性病毒颗粒数(单位：PFU/ml)。结果如下所示。本发明描述的3个pShuttle-U6-shPDL1-CMV-E1A质粒和1个对照质粒pShuttle-MCS-E1A与pAdEasy-1质粒同源重组后产生6个pAdEasy-U6-shPDL1-CMV-E1A质粒和2个pAdEasy-CMV-E1A(参见图13中每个质粒可产生2种正确方式的同源重组，并获得两种正确的质粒，经PacI酶切后可分别产生4.5K或3K的条带)，利用获得的8个同源重组质粒在AD293中包装病毒，共获得8个溶瘤病毒：OAd-C-4.5K、OAd-C-3K、OAd-shPDL1#1-4.5K、 OAd-shPDL1#1-3K、OAd-shPDL2#1-4.5K、OAd-shPDL1#2-3K、 OAd-shPDL1#3-4.5K和OAd-shPDL1#3-3K，8个病毒依次分别简写作：C-4.5K、C-3K、1-4.5K、1-3K、2-4.5K、2-3K、3-4.5K和3-3K。其中C-4.5K和C-3K是序列相同的同一种病毒、1-4.5K和1-3K是序列相同的同一种病毒、2-4.5K和2-3K是序列相同的同一种病毒、 3-4.5K和3-3K是序列相同的同一种病毒。
Figure BDA0001422820950000241
实施例1：溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)在细胞(肿瘤细胞和正常细胞)中的复制能力
接种细胞(HUVEC、MRC-5、Hela、A549和U251)于12孔板中，接种数量为每孔1.5×105个细胞，培养基体积为1ml。12hr后吸去培养基并以PBS漂洗细胞1次后按图16所示方式加入500μl病毒悬液，病毒感染复数(MOI)为10。病毒与细胞共孵育90分钟后吸去病毒悬液，以PBS漂洗细胞2次，以此时为0hr，胰酶消化收取一份细胞样品，48hr后收取第二份细胞样品。分别提取0hr和48hr收取的细胞样品的基因组DNA，利用针对5型腺病毒E1A(P5：TCCGGTTTCTATGCCAAACCT(SEQ ID No.5)和P6： TCCTCCGGTGATAATGACAAGA(SEQ ID No.6))、Hexon基因(P7： CCATTACCTTTGACTCTTGTGT(SEQ ID No.7)和P8： GGTAGTCCTTGTATTTAGTATC(SEQ ID No.8))、以及人GAPDH (P9：CATGCCTTCTTGCCTCTTGTCTCTTAGAT(SEQ ID No.9)和P10：CCATGGGTGGAATCATATTGGAACATGTAA(SEQ ID No.10)) 基因的特异性引物进行Q-PCR，根据Q-PCR结果分析病毒感染细胞 48hr后在细胞中的复制情况。溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)在不同细胞中复制能力的比较见图17。
如图17结果显示：本发明中构建的四类溶瘤腺病毒(对照病毒 C-4.5K、OAd-shPDL1病毒1-4.5K、2-4.5K和3-4.5K)在所检测的细胞中的复制能力差别较大。本发明的溶瘤病毒在所检测的肿瘤细胞中的复制能力非常强，包括在永生化的人胚肺成纤维细胞系中也表现出了较强的复制能力，但是在人原代细胞HUVEC中的复制能力非常低，在人正常细胞中的复制能力比在肿瘤细胞系或者有成瘤倾向的细胞系(例如：永生化的人胚肺成纤维细胞系MRC5)中的复制能力低约42-444倍。因此，可以认为本发明的溶瘤腺病毒在选择性复制方面有着很强的肿瘤细胞偏向性，在未来的临床溶瘤病毒应用方面具有更高的安全性，在病毒使用量方面具有更大的空间。
实施例2：溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)对肿瘤细胞的杀伤能力
本实施例通过CCK8实验检测本发明的溶瘤腺病毒 (OAd-shPDL1)的杀伤能力。接种细胞(U251、Hela和A549)于96 孔板中，接种数量为每孔1.5×103个细胞，每孔培养基体积为100μl。 12hr后吸去50μl培养基，并加入50μl的病毒与单纯培养基的混合物，感染复数(MOI)分别为1、3、10、30、100和300。每个感染复数设 3个复孔。分别在48hr和72hr 2个时间点加入10μl CCK8(购自东仁化学科技有限公司)继续孵育1hr后检测培养物在450nm处的光吸收值，根据获得的光吸收值判断不同病毒对细胞的杀伤能力。商业化的溶瘤腺病毒H101被用来作为对照，实验中使用相同MOI的病毒数量处理相同的细胞，在相同的时间点同时检测光吸收值。另外，1μM的紫杉醇溶液用来作为系统阳性对照。溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)对三种肿瘤细胞的剂量杀伤效果以及半杀伤剂量(IC50)结果如图18-21所示。
结果显示：本发明的溶瘤腺病毒(对照病毒C-4.5K、OAd-shPDL1 病毒1-4.5K、2-4.5K和3-4.5K)对U251、A549和Hela的杀伤存在着明显的剂量依赖关系，与商业化溶瘤腺病毒H101相比，本发明所述病毒有着相似的杀伤效果，对U251细胞的杀伤甚至优于H101，杀伤效果的统计学分析显示存在显著性差异。另外，对本发明的溶瘤病毒针对不同细胞在72h的半杀伤剂量(IC50)进行比较后发现，该类病毒对人脑胶质瘤细胞U251的IC50最低，提示其可能在对人脑胶质瘤的治疗方面具有更加重要的临床价值。
实施例3：溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)所表达的shPDL1的功效性
为了方便检测本发明的溶瘤腺病毒(OAd-shPDL1)所表达的 shPDL1的功效，本实施例特意构建了两个可以稳定表达带有FLAG标签的hPDL1的细胞系：A549/hPDL1-FLAG和Hela/hPDL1-FLAG。构建过程简述如下：将按照制备例2所示方法得到的 pcDNA3.3-hPDL1-FLAG载体(也称为 pcDNA3.3-hPDL1-FLAG-IRES-hrGFP载体)利用lipofectamin 2000转染至A549和Hela细胞中，因为该载体携带Neomycin基因，随后加入 G418进行三轮筛选，最终获得可以稳定表达带FLAG标签的hPDL1 和GFP蛋白的A549/hPDL1-FLAG和Hela/hPDL1-FLAG细胞株。
同样使用H101和本发明所述的四种溶瘤腺病毒处理上述两个细胞系，病毒感染复数(MOI)为10，病毒感染48hr后收取细胞样品，裂解后进行Western blot分析，利用Anti-FLAG抗体检测带有FLAG 标签的hPDL1的表达水平的变化。结果见图22和23。Western blot结果表明：在使用溶瘤腺病毒处理A549和Hela细胞后，hPDL1的表达水平都有了不同程度的提高，但是在使用3种OAd-shPDL1溶瘤病毒处理相同的细胞后，原本升高的hPDL1的表达都得到了不同程度的抑制，尤其OAd-shPDL1-1(1-4.5K)的抑制能力最为明显，与前面的Q-PCR结果和共转染后的Western blot结果相互印证。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州康万达医药科技有限公司
<120> 分离的重组溶瘤腺病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途
<130> FI-173597-59:52/C
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
ggaagatctg gactgaaaat gag 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
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tgaggtcaga tgtaaccaag atta 24
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<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
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cgcgtcgact actgtaatag taatcaatta cgg 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
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gacgtcgact aagatacatt gatgagtttg gac 33
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<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 5
tccggtttct atgccaaacc t 21
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<212> DNA
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tcctccggtg ataatgacaa ga 22
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<212> DNA
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ccattacctt tgactcttgt gt 22
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ggtagtcctt gtatttagta tc 22
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<212> DNA
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cgcgtcgaca tgaggatatt tgctgtcttt at 32
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ccgctcgagc gtctcctcca aatgtgtatc ac 32
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<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
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cgcctattac acccactcgt gcag 24
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<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 14
caccgggaaa tggaggataa gaacattcaa gagatgttct tatcctccat ttcccttttt 60
tg 62
<210> 15
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 15
agctcaaaaa agggaaatgg aggataagaa catctcttga atgttcttat cctccatttc 60
cc 62
<210> 16
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 16
gggaaatgga ggataagaac attcaagaga tgttcttatc ctccatttcc ctt 53
<210> 17
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 17
caccggatcc agtcacctct gaacattcaa gagatgttca gaggtgactg gatccttttt 60
tg 62
<210> 18
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 18
agctcaaaaa aggatccagt cacctctgaa catctcttga atgttcagag gtgactggat 60
cc 62
<210> 19
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 19
ggatccagtc acctctgaac attcaagaga tgttcagagg tgactggatc ctt 53
<210> 20
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 20
caccgagaat caacacaaca actaattcaa gagattagtt gttgtgttga ttctcttttt 60
tg 62
<210> 21
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 21
agctcaaaaa agagaatcaa cacaacaact aatctcttga attagttgtt gtgttgattc 60
tc 62
<210> 22
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
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gagaatcaac acaacaacta attcaagaga ttagttgttg tgttgattct ctt 53
<210> 23
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 23
caccgttctc cgaacgtgtc acgtcaagag attacgtgac acgttcggag aattttttg 59
<210> 24
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 24
agctcaaaaa attctccgaa cgtgtcacgt aatctcttga cgtgacacgt tcggagaac 59
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 25
gttctccgaa cgtgtcacgt caagagatta cgtgacacgt tcggagaatt 50

Claims (19)

1.一种分离的重组溶瘤腺病毒，其中该重组溶瘤腺病毒为选择复制型溶瘤腺病毒，并且该重组溶瘤腺病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中抑制PDL1表达的外源shRNA的编码序列；其中该重组溶瘤腺病毒的基因组中缺失了E1B19K基因、E1B55K基因、和全部E3区基因；其中所述重组溶瘤腺病毒的基因组中包含E1A基因编码序列，并且所述E1A基因编码序列的表达是在启动子控制下的。
2.根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒，其中所述外源shRNA的编码序列如SEQ IDNO.16、19和22中的任一者所示。
3.根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒，其中所述E1A基因编码序列是在CMV启动子控制下的。
4.根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒，其中所述重组溶瘤腺病毒是对5型腺病毒进行基因改造而得到的。
5.根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒，其中用于制备所述重组溶瘤腺病毒的载体包含在启动子控制下的外源shRNA编码序列，该shRNA编码序列如SEQ ID NO.16、19和22中的任一者所示。
6.根据权利要求5所述的重组溶瘤腺病毒，其中所述载体采用pShuttle作为基本骨架，并且在该基本骨架中依次包含可操作地连接的、控制所述外源shRNA编码序列表达的启动子、所述外源shRNA编码序列、控制所述E1A基因编码序列表达的启动子、和所述E1A基因编码序列。
7.根据权利要求5或6所述的重组溶瘤腺病毒，其中含有所述载体的宿主细胞稳定表达所述载体。
8.一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据权利要求1-7中任一项所述的重组溶瘤腺病毒，及可药用辅料。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含5×107-5×1012vp的所述重组溶瘤腺病毒。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤腺病毒被配制成通过瘤内注射给药或静脉给药。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的重组溶瘤腺病毒在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。
13.一种药物组合物，其中该药物组合物的活性成分包括根据权利要求1-7中任一项所述的重组溶瘤腺病毒和NK细胞。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中该药物组合物的活性成分由所述溶瘤腺病毒和NK细胞组成。
15.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤腺病毒和所述NK细胞各自独立地存在于所述药物组合物中而互不混合。
16.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含5×107-5×1012vp/天剂量的所述重组溶瘤腺病毒，并且所述药物组合物包含1×109至3×109个细胞/天剂量的所述NK细胞。
17.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
19.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤腺病毒被配制成通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞被配制成通过静脉给药。
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