CN117660367A - 一种ⅰ型单纯疱疹病毒毒株yd06、重组毒株及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于病毒毒株分离及改造技术领域，具体涉及一种Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06、重组毒株及其用途。针对现有单纯疱疹病毒标准毒株HSV‑1 17+感染肿瘤细胞能力、复制能力和杀伤肿瘤细胞能力还有待提高的问题，为了提高病毒基因组多样性，本发明提供了一种Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06，保藏编号为：CCTCC NO：V202271。本发明还提供了一种Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06进行基因改造后的重组病毒。通过对YD06毒株的筛选和改造，本发明获得了感染细胞能力、细胞内复制/裂解能力显著增强，溶瘤效果更好的标准毒株和重组毒株，为溶瘤病毒或病毒载体开发提供了一种新的可能性，具有很好的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于病毒毒株分离及改造技术领域，具体涉及一种Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06、 重组毒株及其用途。
背景技术
溶瘤病毒(Oncolytic Virus，OV)是一类天然的或经过基因工程技术改造的具有特异性 复制能力的病毒，能够选择性感染和杀伤肿瘤细胞，并能激发机体免疫应答，改善肿瘤免疫 抑制性微环境，产生抗肿瘤免疫反应。
相较于其它肿瘤免疫疗法，溶瘤病毒具有直接溶瘤作用、靶向性好、毒副作用小、激活 抗肿瘤免疫反应、作为外源基因表达载体、避免耐药性和成本低廉等优势。
溶瘤病毒疗法发展至今，全球已有4款溶瘤产品获得监管部门批准正式上市：Rigvir(一 种基因改造的ECHO-7肠道病毒，用于治疗黑色素瘤和其他恶性肿瘤)、安柯瑞(一种重组人 5型腺病毒，被批准用于对常规放疗无效的晚期鼻咽癌患者)、Imlygic(经过基因修饰的第二 代HSV-1，被批准用于局部治疗术后复发的晚期黑色素瘤)、Delytact(一种经过基因修饰的 第三代HSV-1、用于治疗恶性胶质瘤)。
I型单纯疱疹病毒(Herps simplex virus，HSV-1)是一种长约152kb的双链DNA病毒， 属于α疱疹病毒亚科。HSV-1通过HVEM(疱疹病毒进入介质，又被称为TNFRSF14)进入 细胞并在受感染宿主细胞核中复制。它是一种常用的溶瘤病毒。
HSV基因组包含长独特序列(UL)、短独特序列(US)及其两侧与复制、包装相关的反向重复序列。正常细胞通过阻断宿主细胞蛋白激酶R(PKR)/真核起始因子2(eIF2)信号 通路诱导的蛋白质合成关闭以响应病毒感染，当删除双拷贝ICP34.5的神经毒基因时，病毒蛋白在正常细胞中合成受阻，而大多数肿瘤细胞PKR/eIF2通路受损。因此，删除ICP34.5 基因的HSV病毒可以在肿瘤细胞内生长繁殖。ICP47基因表达抑制抗原递呈相关的运载体(Transporter，TAP)的功能，ICP47的缺失增强了肿瘤细胞中MHCⅠ的表达，从而促进肿 瘤抗原递呈和抗肿瘤免疫。另外，删除早期启动基因ICP47使下游的US11基因置于ICP47 基因早期启动子启动表达，可对抗PKR对病毒生长繁殖的抑制。由此可见，可通过改造HSV 基因来抑制肿瘤细胞的生长繁殖，达到抗肿瘤的作用。
HSV应用于抗肿瘤具有以下优点：(1)宿主细胞广泛；(2)感染效率高，可高效感染静 息期和非静息期细胞；(3)可插入大容量外源片段；(4)方便制备和纯化。然而，HSV也有自身的缺点：(1)野生毒株毒性较强；(2)给药方式具有局限性：瘤内注射使得病毒颗粒局限于注射区的病变部位，对转移癌症治疗效果较差；静脉给药病毒颗粒会遭受宿主的先天免 疫反应使病毒颗粒在到达靶细胞前被抗体中和。
针对上述HSV存在的缺点，研究者们主要进行了如下研究：(1)基因敲除减毒株：删除 病毒某些关键基因实现在肿瘤细胞中特异性复制，例如编码胸苷激酶基因UL23、编码核糖核 苷酸还原酶基因UL39、编码神经毒性基因ICP34.5、编码TAP蛋白转运抑制基因US12等； (2)外源基因表达毒株：在减毒株的基础上插入肿瘤特异性启动子或具有免疫调节作用的外 源基因，如加载粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、白介素2、PD-1抗体、CTLA-4抗体等。通过采用基因敲除减毒株、外源基 因表达毒株，得到的改造后的HSV毒性弱，能在更多的细胞中表达。
目前已经上市和临床试验的HSV毒株包括HF10、R3616、HG52、T-VEC(Talimogenelaherparepvec)、1716、NV1020、G207、G47Δ等都删除了HSV-1中的ICP34.5基因。G207 删除双拷贝ICP34.5、ICP47及ICP6基因，在治疗恶性胶质瘤治疗的临床试验中显示出良好 的治疗效果。T-VEC删除了基因组中的ICP34.5和ICP47基因，并在34.5删除位置插入了双 拷贝hGM-CSF，临床试验数据显示在恶性黑色素瘤治疗上客观缓解率为26.4％，具有较为显 著的治疗效果和良好的安全性。这些数据表明HSV-1在肿瘤的基因治疗具有良好安全性和巨大潜力。
疱疹病毒具有良好的复制能力和安全性，可以用于基因治疗或递送，在肿瘤治疗中受到 广泛重视，但目前进入临床试验的候选溶瘤产品主要由少数实验室毒株(例HSV-117+毒株、 F毒株、KOS毒株)改造而来，存在病毒基因组多样性不足及溶瘤活性欠佳等问题。
由于单纯疱疹病毒基因组较大，病毒在复制中容易发生多位点突变，从而造成不同患者 分离而来的毒株在感染肿瘤细胞能力、复制能力和杀伤肿瘤细胞能力存在较大差异，导致不 同来源的毒株的临床应用价值差异较大。因此，筛选和改造出溶瘤能力强、适合临床使用的 单纯疱疹病毒株是溶瘤病毒药物研发中至关重要的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：现有单纯疱疹病毒标准毒株HSV-1 17+感染肿瘤细胞能力、 复制能力和杀伤肿瘤细胞能力还有待提高，并且不能满足病毒基因组多样性要求等缺陷。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06。本 发明的Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06，其保藏编号为：CCTCC NO：V202271。保藏时间为2022年08月22日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，(简称：CCTCC)，保藏单位地址：中 国.武汉.武汉大学；邮编：430072；分类命名为：人单纯疱疹病毒1型HSV-1/YD06。
本发明还提供了一种Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株，所述重组毒株是在毒株YD06的基因序列中，敲除双拷贝的ICP34.5基因和/或单拷贝的ICP47基因而重组得到。
其中，上述Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株中，所述编码ICP34.5基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1编码ICP34.5基因的核苷酸序列
ATGGCCCGCCGCCGCCGCCATCGCGGCCCCCGCCGCCCCCGGCCGCCCGGGCCCAC GGGCGCGGTCCCAACCGCACAGTCCCAGGTAACCTCCACGCCCAACTCGGAACCCGTG GTCAGGAGCGCGCCCGCGGCCGCCCCGCCGCCGCCCCCCGCCAGTGGGCCCCCGCCTT CTTGTTCGCTGCTGCTGCGCCAGTGGCTCCACGTTCCCGAGTCCGCGTCCGACGACGAC GACGACGACTGGCCGGACAGCCCCCCGCCCGAGCCGGCGCCAGAGGCCCGGCCCACC GCCGCCGCCCCCCGCCCCCGGTCCCCACCGCCCGGCGCGGGCCCGGGGGGCGGGGCTA ACCCCTCCCACCCCCCCTCACGCCCCTTCCGCCTTCCGCCGCGCCTCGCCCTCCGCCTGC GCGTCACCGCAGAGCACCTGGCGCGCCTGCGCCTGCGACGCGCGGGCGGGGAGGGGG CGCCGGAGCCCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCACGCGGGTGCGCTTCTC GCCCCACGTCCGGGTGCGCCACCTGGTGGTCTGGGCCTCGGCCGCCCGCCTGGCGCGC CGCGGCTCGTGGGCCCGCGAGCGGGCCGACCGGGCTCGGTTCCGGCGCCGGGTGGCGG AGGCCGAGGCGGTCATCGGGCCGTGCCTGGGGCCCGAGGCCCGTGCCCGGGCCCTGGC CCGCGGAGCCGGCCCGGCGAACTCGGTCTAACGTTACACCCGAGGCGGCCTGGGTCTT CCGCGGAGCTCCCGGGAGCTCCGCACCAAGCCGCTCTCCGGAGAGACGATGGCAGGAG CCGCGCATATATACGCTTGGAGCCGGCCCGCCCCCGAGGCGGGCCCGCCCTCGGAGGGC GGGACTGGCCAATCGGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCAGCGTCCGCCG AGTCGTCGGGGCCCGGCCCACTGGGCGGTAACTCCCGCCCAGTGGGCCGGGCCGCCCA CTTCCCGGTATGGTAATTAAA。
其中，上述Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株中，所述编码ICP47基因的核苷酸序 列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:2编码ICP47基因的核苷酸序列
CATAAAGGCCCGGCGCGACCGACGCCCGCAGACGGCGCCGGCCACGAACGACGG GAGCGGCTGCGGAGCACGCGGACCGGGAGCGGGAGTCGCAGAGGGCCGTCGGAGCGG ACGGCGTCGGCATCGCGACGCCCCGGCTCGGGATCGGGATCGCATCGGAAAGGGACAC GCGGACGCGGGGGGGAAAGACCCGCCCACCCCACCCACGAAACACAGGGGACGCACC CCGGGGGCCTCCGACGACAGAAACCCACCGGTCCGCCTTTTTTGCACGGGTAAGCACC TTGGGTGGGCGGAGGAGGGGGGACGCGGGGGCGGAGGAGGGGGCTCACCCGCGTTCG TGCCTTCCCGCAGGAGGAACGCCCTCGTCGAGGCGACCGGCGGCGACCGTTGCGTGGA CCGCTTCCTGCTCGTCGGGAAAAGCATGTCGTGGGCCCTGGAAATGGCGGACACCTTCC TGGACAACATGCGGGTTGGGCCCAGGACGTACGCCGACGTACGCGATGAGATCAATAAAAGGGGGCGTGAGGACCGGGAGGCGGCCAGAACCGCCGTGCACGACCCGGAGCGTCCC CTGCTGCGCTCTCCCGGGCTGCTGCCCGAAATCGCCCCCAACGCATCCTTGGGTGTGGC ACATCGAAGAACCGGCGGGACCGTGACCGACAGTCCCCGTAATCCGGTAACCCGTTGA GTCCCGGGTACGACCATCACCCGAGTCTCTGGGCGGAGGGTGGTTCCCCCCCGTGGCTC TCGAGATGAGCCAGACCCAACCCCCGGCCCCAGTTGGGCCGGGCGACCCAGATGTTTA CTTAAAAGGCGTGCCGTCCGCCGGCATGCACCCCAGAGGTGTTCACGCACCTCGAGGA CACCCGCGCATGATCTCCGGACCCCCGCAACGGGGTGATAATGATCAAGCGGCGGGGCA ATGTGGAGATTCGGGTCTACTACGAGTCGGTGCGGACACTACGATCTCGAAGCCATCTG AAGCCGTCCGACCGCCAACAATCCCCAGGACACCGCGTGTTCCCCGGGAGCCCCGGGTTCCGCGACCACCCCGAGAACCTAGGGAACCCAGAGTACCGCGAGCTCCCAGAGACCCC AGGGTACCGCGTGACCCCAGGGATCCACGACAACCCCGGTCTCCCAGGGAGCCCCGGT CTCCCCGGGAGCCCCGGACCCCACGCACCCCCCGCGAACCACGTACGGCTCGCGGGTC TGTATAGCCCGGGCAAGTATGCCCCCCTGGCGAGCCCAGACCCCTTCTCCCCACAACAT GGAGCATACGCTCGGGCCCGCGTCGGGATCCACACCGCGGTTCGCGTCCCGCCCACCGG AAGCCCAACCCACACGCACTTGCGGCAAGACCCGGGCGATGAGCCAACCTCGGATGAC TCAGGGCTCTACCCTCTGGACGCCCGGGCGCTTGCGCACCTGGTGATGTTGCCCGCGGA CCACCGGGCCTTCTTTCGAACCGTGGTCGAGGTGTCTCGCATGTGCGCTGCAAACGTGC GCGATCCCCCGCCCCCGGCTACAGGGGCCATGTTGGGCCGCCACGCGCGGCTGGTCCAC ACCCAGTGGCTCCGGGCCAACCAAGAGACGTCGCCCCTGTGGCCCTGGCGGACGGCGG CCATTAACTTTATCACCACCATGGCCCCCCGCGTCCAAACCCACCGACACATGCACGAC CTGTTGATGGCCTGTGCTTTCTGGTGCTGTCTGACACACGCATCGACGTGTTCGTACGCG GGGCTGTACTCGACCCACTGCCTGCATCTGTTTGGTGCGTTTGGGTGTGGGGACCCGGC CCTAACCCCACCCCTGTGCTAGGGCAATTTGTACCCTTAATAAATTTTACAAACAGATTT。
其中，上述Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株中，靶向ICP34.5基因gRNA核酸序列如SEQ ID NO:3所示，靶向ICP47基因gRNA核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
SEQ ID NO:3靶向ICP34.5基因gRNA核酸序列
GGAAGGCGGAAGGGGCGTGA。
SEQ ID NO:4靶向ICP47基因gRNA核酸序列
ACGCTCCGGGTCGTGCACGG。
进一步的，本发明还提供了一种Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株，在毒株YD06的基因序列中，敲除双拷贝的ICP34.5基因和单拷贝的ICP47基因，同时在ICP34.5缺失位置插入CMV-GFP表达盒重组得到。
其中，上述Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株中，所述的插入CMV-GFP表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
SEQ ID NO:5插入CMV-GFP的donor质粒核酸序列
GGGCGCCGTCCCAACCGCACAGTCCCAGGTAACCTCCACGCCCAACTCGGAACCC GCGGTCAGGAGCGCGCCCGCGGCCGCCCCGCCGCCGCCCCCCGCCGGTGGGCCCCCGC CTTCTTGTTCGCTGCTGCTGCGCCAGTGGCTCCACGTTCCCGAGTCCGCGTCCGACGAC GACGATGAGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCA CGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAA TCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTA GGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCC TGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTCTAGAGGATCCA CCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCC TGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGA GGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGC CCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGC TACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGT CCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTG AAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGG AGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTA TATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAAC ATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCG ACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAA AGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGG ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATGCGCTTCTCGCCCCACGTCCGGGTG CGCCACCTGGTGGTCTGGGCCTCGGCCGCCCGCCTGGCGCGCCGCGGCTCGTGGGCCC GCGAGCGGGCCGACCGGGCTCGGTTCCGGCGCCGGGTGGCGGAGGCCGAGGCGGTCAT CGGGCCGTGCCTGGGGCCCGAGGCCCGTGCCCGGGCCC。
更进一步的，本发明还提供了一种Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株，在毒株YD06 的基因序列中，敲除双拷贝的ICP34.5基因和单拷贝的ICP47基因，同时在ICP34.5缺失位 置插入antiB7H3/CD3双特异性抗体或antiPD-L1/CD3双特异性抗体表达盒重组得到。
其中，上述Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株中，所述的插入antiB7H3/CD3的donor 质粒核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
SEQ ID NO:6插入antiB7H3/CD3的donor质粒核酸序列
GGGCGCCGTCCCAACCGCACAGTCCCAGGTAACCTCCACGCCCAACTCGGAACCC GCGGTCAGGAGCGCGCCCGCGGCCGCCCCGCCGCCGCCCCCCGCCGGTGGGCCCCCGC CTTCTTGTTCGCTGCTGCTGCGCCAGTGGCTCCACGTTCCCGAGTCCGCGTCCGACGAC GACGATTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGG GGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCA ACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGC GTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTGACGGTTCAC TAAACAAGGAGACCGACACCATGCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCT GCCTCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGTTCAAGTGTAAGTCTCAT GCACTGGTACCAGCAGAAGTCGGACACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCA AACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTCGGTCTGGGACCTCTTATTCTC TCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGTCAGCAGTGGAGT GATAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGTACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCT CCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCGGCAGCGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAC CTGAGAAGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGATACACA TTCACTGAATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGAT TGGAGGTATTAATCCTAACAGTGGTGGTACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGG CCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACA TCTGAGGATTCTGCAGTCTATTACTGTACAAGAGTGGGGGGACCATGGCCCACGACGAGGGGTATGGACTACTGGGGTGAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCGAGTGAATTCCAGCCAT CAGAATTCCGACTCGAGAGCAGCGGCGGAGGCGGAAGCGACATCAAGCTGCAGCAGTC AGGGGCTGAACTGGCCAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACCTCTGGC TACACCTTCACCAGATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTG AGTGGATCGGATACATTAACCCTTCTAGAGGCTATACTAACTACAATCAAAAGTTCAAGG ACAAGGCCACATTGACTACCGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGC CTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCAGATATTACGACGACCACTATTGC CTGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGCTGACCGTCAGCAGCGTGGAGGGCGGTTCAG GCGGAAGCGGCGGGAGCGGTGGCAGCGGAGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGA GCCCAGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGTAGGGCCAG CTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGTACCAGCCCAAAGAGA TGGATCTACGACACATCCAAGGTGGCTTCTGGTGTGCCATACAGATTCAGCGGTAGCGGT AGCGGTACCAGCTACAGCCTCACCATCAGCAGCATGGAGGCTGAGGACGCCGCCACCT ACTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACTCACGTTCGGCGCTGGGACCAAGCTGGA ACTGAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTC GAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGC GATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGT GCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACC CCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAG GAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGT TCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGA CGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCA TGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGA GGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGC CCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACC CCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACT CTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATGCGCTTCTCGCCCCACGTCCGGGTGCGCCAC CTGGTGGTCTGGGCCTCGGCCGCCCGCCTGGCGCGCCGCGGCTCGTGGGCCCGCGAGC GGGCCGACCGGGCTCGGTTCCGGCGCCGGGTGGCGGAGGCCGAGGCGGTCATCGGGCC GTGCCTGGGGCCCGAGGCCCGTGCCCGGGCCC。
其中，上述Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株中，所述的插入antiPD-L1/CD3的donor 质粒核酸序列如SEQ ID NO:7所示。
SEQ ID NO:7插入antiPD-L1/CD3的donor质粒核酸序列
GGGCGCCGTCCCAACCGCACAGTCCCAGGTAACCTCCACGCCCAACTCGGAACCC GCGGTCAGGAGCGCGCCCGCGGCCGCCCCGCCGCCGCCCCCCGCCGGTGGGCCCCCGC CTTCTTGTTCGCTGCTGCTGCGCCAGTGGCTCCACGTTCCCGAGTCCGCGTCCGACGAC GACGATTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGG GGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCA ACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGC GTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTGACGGTTCAC TAAACAAGGAGACCGACACCATGGACACAACTGTGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCC ACATCAGTCGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTAGTA ATGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTAAATTACTGATTTACTGGGCAT CTACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACAGATCCT ACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAGGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACA TTATAGTAATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGGTGGTGGCG GTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG ACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTC AATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGT GGATGGGCTACATAACCTACAGTGGTAACACTAACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGA ATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAAATCTGTGACT ACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGATCGACTATGATTTCGACTGCCTGGTTT CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCCCAGCCATCAGAATTCCGACT CGAGAGCAGCGGCGGAGGCGGAAGCGACATCAAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACT GGCCAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACCTCTGGCTACACCTTCACCA GATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGATA CATTAACCCTTCTAGAGGCTATACTAACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACATT GACTACCGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGG ACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCAGATATTACGACGACCACTATTGCCTGGACTACTGGG GCCAAGGCACCACGCTGACCGTCAGCAGCGTGGAGGGCGGTTCAGGCGGAAGCGGCG GGAGCGGTGGCAGCGGAGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCAGCCATCAT GAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGTAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGT TACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGTACCAGCCCAAAGAGATGGATCTACGACA CATCCAAGGTGGCTTCTGGTGTGCCATACAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCAGC TACAGCCTCACCATCAGCAGCATGGAGGCTGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCA GTGGAGTAGTAACCCACTCACGTTCGGCGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCG ACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGG CAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCC TCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAG CAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTT CTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACC CTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGG GGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAG AAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGC AGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCC CGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGC GATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGA GCTGTACAAGTAA。
B7H3在黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤表面过表达，与肿瘤的生长、 转移、复发和预后不良密切相关。B7H3在适应性免疫中具有主要的抑制作用，抑制T细胞 激活、增殖和效应细胞因子的释放，有利于肿瘤细胞逃避免疫监视。因此，本发明尝试插入 antiB7H3/CD3，用来阻断B7H3信号，减少肿瘤细胞增殖、进展和转移，促进溶瘤病毒对B7H3 高表达肿瘤细胞的杀伤。
另外，本发明还插入antiPD-L1/CD3双抗，能够竞争性的结合肿瘤细胞表面的PD-L1， 影响PD-L1和PD-1的结合，解除PD-1和PD-L1结合所介导的免疫功能抑制，重新激活CD8+T 细胞，使肿瘤的微环境中活化的T细胞大量聚集，从而启动的抗肿瘤免疫反应，进一步增强 HSV的溶瘤作用。
本发明还提供了一种预防或治疗癌症的药物组合物，含有Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06 或Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株。
其中，上述预防或治疗癌症的药物组合物中，所述癌症包括胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、 头颈部癌症、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌或宫颈癌中的至少一种。
本发明还提供了一种Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06、Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒 株在制备预防或治疗癌症的药物中的用途。
本发明的有益效果为：
本发明通过采集多个病毒样本，建立了完整的毒株分离、扩增和改造方法。经过对临床 病毒样本扩增、纯化、测序、单克隆病毒的分离培养，建立了可靠的病毒株筛选方法。通过 多次筛选验证，比较了各临床病毒株在不同肿瘤细胞中的复制及对肿瘤细胞杀伤能力，最终 筛选出复制能力和溶瘤能力优于标准毒株的候选毒株：YD06，相对于实验室常用标准毒株HSV-1 17+，本发明的YD06病毒株感染细胞能力、细胞内复制/裂解能力显著增强，适合用 于溶瘤病毒或病毒载体开发。
进一步的，本发明通过基因编辑技术改造了YD06毒株，制备了YD06重组毒株，相比同等修饰的毒株HSV-1 17+，本发明的重组毒株溶瘤性能更佳，在肿瘤细胞系内的复制能力、 对肿瘤细胞的杀伤能力更强，在小鼠模型中也显示出较好的安全性。
附图说明
图1所示为HSV-1毒株YD06和验室病毒株HSV-1 17+在VERO细胞中的增殖能力比较。
图2所示为YD06重组毒株示意图。(A)利用CRISPR基因敲入技术将CMV-GFP表达 盒插入ICP34.5删除位置；(B)利用CRISPR基因敲入技术将抗B7H3/CD3双特异性抗体表 达盒插入ICP34.5删除位置；(C)利用CRISPR基因敲入技术将抗PD-L1/CD3双特异性抗体 表达盒插入ICP34.5删除位置。
图3所示为同时删除ICP34.5、ICP47基因，并在ICP34.5删除位置插入CMV-GFP表达盒的重组YD06-dICP34.5-GFP-dICP47毒株感染VERO细胞。
图4所示为删除ICP34.5和ICP47基因YD06毒株和相同修饰HSV-1 17+、F毒株感染不 同肿瘤细胞的杀伤效果。
图5所示为经过不同基因修饰后的YD06毒株和HSV-1 17+、F毒株在小鼠结直肠癌皮下 瘤模型中的药效学试验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06，其保藏编号为：CCTCC NO：V202271。 保藏时间为2022年08月22日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，(简称：CCTCC)， 保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；邮编：430072；分类命名为：人单纯疱疹病毒1型 HSV-1/YD06。
本发明筛选得到的Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06，与标准株HSV-1 17+株(NC_001806.2) 的病毒基因组序列比对，显示两者的基因组序列部分基因核苷酸序列存在较大差异，比对结 果参见下表1所示。
表1 Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06与标准株HSV-1 17+株基因组差异
SEQ ID NO:8 UL36的核苷酸序列
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GGGCGGCTGTGGGCGGGTGTGGCCCCGGGCCCCCTACCCCCTCCCGGGGGCCCACGCC GACGCAGGGCTCCCCCAGGCCCGCGATCTCGCCCCGCAGGGGGTGCGTGATGGCCACG CGCCGTTCGCTGAACGCTTCGTCCTGCAGGTAAGTCTCGCTGGCCCCGTAAAGATGCAG AGCCGCGGCCGTCAAGTCCGCAGGAGCCGCGGGTTCCGGGCCCGACGGCACGAAAAA CACCATGGCTCCCGCCCACCGTACGTCCGGGCGATCGCGGGTGTAATACGTCAGGTATG GATACATGTCCCCCGCCCGCACTTTGGCGATGAACGCGGGGGTGCCCTCCGGAAGGCCG TGCGGGTCAAAAAGGTATGCGGTGTCGCCGTCCCTGAACAGCCCCATCCCTAGGGGGCC AATGGTTAGGAGCGTGTACGACAGGGGGCGCAGGGCCCACGGGCCGGCGAAGAACGT GTGTGCGGGGCATTGTGTCTCCAGCAGGCCCGCCGCGGGCTCCCCGAAGAAGCCCACC TCGCCGTATACGCGCGAGAAGACACAGCGCAGTCCGCCGCGCGCCCCTGGGTACTCGA GGAAGTTGGGGAGCTCGACGATCGAACACATGCGCGGCGGCCCAGGGCCCGCGGTCGC GCGCGTCCACTCGCCCCCCTCGACCAAACATCCCTCGATGGCCTCCGCGGACAGGACGT CGCGAGGGCCCACATCAAATATGAGGCTGAGAAAGGACAGCGACGAGCGCATGCACGATACCGACCCCCCCGGCTCCAGGTCGGGCGCGAACTGGTTCCGAGCACCGGTGACCACG ATGTCGCGATCCCCCCCGCGTTCCATCGTGGAGTGCGGTGGGGTGCCCGCGATCA。
SEQ ID NO:9US1的核苷酸序列
CATAAAGGCCCGGCGCGACCGACGCCCGCAGACGGCGCCGGCCACGAACGACGGGAG CGGCTGCGGAGCACGCGGACCGGGAGCGGGAGTCGCAGAGGGCCGTCGGAGCGGACG GCGTCGGCATCGCGACGCCCCGGCTCGGGATCGGGATCGCATCGGAAAGGGACACGCG GACGCGGGGGGGAAAGACCCGCCCACCCCACCCACGAAACACAGGGGACGCACCCCG GGGGCCTCCGACGACAGAAACCCACCGGTCCGCCTTTTTTGCACGGGTAAGCACCTTG GGTGGGCGGAGGAGGGGGGACGCGGGGGCGGAGGAGGGGGCTCACCCGCGTTCGTGC CTTCCCGCAGGAGGAACGCCCTCGTCGAGGCGACCGGCGGCGACCGTTGCGTGGACCG CTTCCTGCTCGTCGGGGGGGGGGAGCCACTGTGGTCCTCCGGGACGTTTTCTGGATGGC CGACATTTCCCCAGGCGCTTTTGCGCCTTGTGTAAAAGCGCGGCGTCCCGCTCTCCGATC CCCGCCCCTGGGCACGCGCAAGCGCAAGCGCCCTGCCCGCCCCCTCTCATCGGAGTCTG AGGTCGAATCCGAGACAGCCTTGGAGTCTGAGGTCGAATCCGAGACAGCATCGGATTC GACCGAGTCTGGGGACCAGGAGGAAGCCCCCCGCATCGGTGGCCGTAGGGCCCCCCGG AGGCTTGGGGGGCGGTTTTTTCTGGACATGTCGGCGGAATCCACCACGGGGACGGAAA CGGATGCGTCGGTGTCGGACGACCCCGACGACACGTCCGACTGGTCTTGTGACGACATT CCCCCACGACCCAAGCGGGCCCGGGTAAACCTGCGGCTCACTAGCTCTCCCGATCGGCG GGATGGGGTTATTTTTCCTAAGATTGGGCGGGTCCGGTCTACCCGGGAAACGCAGCCCC GGGCCCCCACCCCGTCGGCCCCAAGCCCAAATGCAATGCTCCGGCGCTCGGTGCGCCA GGCCCAGAGGCGGAGCAGCGCACGATGGACCCCCGACCTGGGCTACATGCGCCAGTGT ATCAATCAGCTGTTTCGGGTCCTGCGGGTCGCCCGGGACCCCCACGGCAGTGCCAACCG CCTGCGCCACCTGATACGCGACTGTTACCTGATGGGATACTGCCGAGCCCGTCTGGCCCC GCGCACGTGGTGCCGCTTGCTGCAGGTGTCCGGCGGAACCTGGGGCATGCACCTGCGC AACACCATACGGGAGGTGGAGGCTCGATTCGACGCCACCGCAGAACCCGTGTGCAAGC TTCCTTGTTTGGAGGCCAGACGGTACGGCCCGGAGTGTGATCTTAGTAATCTCGAGATTC ATCTCAGCGCGACAAGCGATGATGAAATCTCCGATGCCACCGATCTGGAGGCCGCCGGT TCGGACCACACGCTCGCGTCCCAGTCCGACACGGAGGATGCCCCCTCCCCCGTTACGCT GGAAACCCCAGAACCCCGCGGGTCCCTCGCTGTGCGTCTGGAGGATGAGTTTGGGGAG TTTGACTGGACCCCCCAGGAGGGCTCCCAGCCCTGGCTGTCTGCGGTCGTGGCCGATAC CAGCTCCGTGGAACGCCCGGGCCCATCCGATTCTGGGGCGGGTCGCGCAGCAGAAGAC CGCAAGTGTCTGGACGGCTGCCGGAAAATGCGCTTCTCCACCGCCTGCCCCTATCCGTG CAGCGACACGTTTCTCCGGCCGTGAGTCCGGTCGCCCCGACCCCCTTGTATGTCCCCAA AATAAAAGACCAAAATCAAA。
SEQ ID NO:10US4的核苷酸序列
CACAAAAAGACCCCGACCCGCGTCTGTGGTGTTTTTGGCATCATGTCGCCGGGCGCCAT GCGTGCCGTTGTTCCCATTATCCCATTCCTTTTGGTTCTTGTCGGTGTATCGGGGGTTCCC ACCAACGTCTCCTCCACCACCCAACCCCAACTCCAGACCACCGGTCGTCCCTCGCATGA AGCCCCCAACATGACCCAGACCGGCACCACCGACTCTCCCACCGCCATCAGCCTTACCA CGCCCGACCACACACCCCCCATGCCAAGTATCGGACTGGAGGAGGAGGAGGAAGAGGA GGAGGGGGCCGGGGATGGCGAACATCTTAAGGGGGGAGATGGGACCCGTGACACCCTA CCCCAGTCCCCGGGTCCAGCCGTCCCGTTGGCCGGGGATGACGAGAAGGACAAACCCA ACCGTCCCGTAGTCCCACCCCCCGGTCCCAACAACTCCCCCGCGCGCCCCGAGACCAGT CGACCGAAGACACCCCCCACCAGTATCGGGCCGCTGGCAACTCGACCCACGACCCAAC TCCCCTCAAAGGGGCGACCCTTGGTTCCGACGCCTCAACATACCCCGCTGTTCTCGTTC CTCACTGCCTCCCCCGCCCTGGACACCCTCTTCGTCGTCAGCACCGTCATCCACACCTTA TCGTTTGTGTGTATTGTTGCGATGGCGACACACCTGTGTGGTGGTTGGTCCAGACGCGG GCGACGCACACACCCTAGCGTGCGTTACGTGTGCCTGCCGCCCGAACGCGGGTAGGGTA TGGGGCGGGGATGGGGAGAGCCCACACGCGGAAAGCAAGAACAATAAAGGCGGCGGG ATCTAGTTG。
由上表可以发现，YD06中与病毒复制相关的基因RL1、UL36与17+株的核苷酸序列差 异分别为4.58％、2.34％，提示了YD06与17+株在病毒复制、扩增的不同。
US1基因调节细胞和病毒转录，通过抑制宿主基因转录、使细胞周期失调和抑制抗病毒 反应，将细胞转录因子招募到病毒基因组中，以实现病毒基因的有效转录延伸，在YD06与 17+株中该基因核苷酸序列差异达到了5.58％。
基因US4编码包膜蛋白gG，与病毒侵染、释放直接相关，在YD06株与17+株中的US4基因核苷酸序列差异为3.60％。
YD06与17+株中参与宿主免疫抑制反应的极早期基因US12核苷酸序列差异达到了5.73％，与病毒早期基因的表达和DNA合成差异相关。
本发明的毒株YD06，具有比实验室标准毒株更强的感染细胞能力、细胞内复制/裂解能 力，并且能够有效感染人类靶细胞，适合用于溶瘤病毒或病毒载体开发。
如本文所用，术语“单纯疱疹病毒载体”指插入外源基因的单纯疱疹病毒。对需要改善 病毒特性的野生型HSV-1毒株经测序鉴定病毒基因的核苷酸序列通过基因编辑技术进行工程 改造，使其改造后能够选择性地杀伤肿瘤细胞，或作为外源基因的表达载体。
如本文所用，术语“双特异性抗体(bispecific monoclonal antibody,BsAb)”是一种人工 构建的可以同时结合两种不同抗原的特殊抗体，其具有介导免疫细胞杀伤的作用。双特异性 抗体的两条抗原结合臂，一条与靶抗原结合，另一条与效应细胞上的标志抗原结合，后者可 以激活效应细胞，使其靶向杀灭肿瘤细胞。
病毒杀伤肿瘤细胞的能力可以通过以相同MOI(multiplicity of infection)感染细胞后收 集存活细胞进行计数定量，也可以使用流式细胞计数(FACS)、MTT、CCK-8等方法进行测 定，也可以通过体内实验测定，例如测量由病毒给药后引起的肿瘤体积的减小。
为了测定本发明病毒的特性，使用实验室毒株HSV 17+作为对照。所述参比毒株通常与 本发明毒株具有等同修饰，例如基因缺失和/或异源基因插入。
为了开发溶瘤性能增强的溶瘤病毒，本发明制备了一种HSV-1YD06-dICP34.5-dICP47基 因缺失的重组毒株，所述毒株经过三轮纯化筛选出dICP34.5和/或dICP47基因敲除的重组病 毒。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的 保护范围限制在实施例所述范围内。所述实施例中所用到的动物实验方法和材料已获(四川 大学华西医院医学伦理委员会)批准，实验所用的仪器和材料均为普通市售产品。
实施例1 YD06病毒株的分离与扩增
a)病毒采集
经口唇疱疹患者志愿者同意后，清洁皮肤表面，用无菌的针头和注射器吸取唇部疱疹病 变部位的脓液，收集完成后置于VERO细胞内扩增培养。加入病毒感染2h后，吸弃病毒上 清，更换成2％DMEM培养基，继续放入培养箱培养，镜下观察待细胞全部变圆后，收集细 胞悬液，使细胞在-80℃和37℃条件下反复冻融三次，用0.45M过滤器过滤，冻存于-80°冰 箱。
b)病毒滴度测定
VERO细胞铺板：以5×105cells/ml铺24孔板，1ml/孔；从-80℃冰箱取出病毒液室温融 化，用DMEM培养基进行梯度稀释，梯度设置为10-2～10-7，每孔分别加入100l梯度稀释 的病毒液，感染2h；配置agrose medium(4ml 10％FBS的DMEM培养基加2ml 1％agrose混匀)；感染2h后吸弃原病毒液，每孔加入1ml agrose medium，放CO2培养箱培养；72h后 统计空斑数量，计算滴度。
c)病毒株的筛选
比较分离毒株与实验室毒株的溶瘤能力，选择溶瘤性能最佳的毒株。以HSV-1 17+毒株 为对照，将不同病毒株以相同的MOI感染六孔板中VERO的细胞，并在感染48小时之后观 察病毒引起的CPE效应现象并结合结晶紫染色后的空斑数量，评价不同毒株的毒性(如图1 所示)。CPE指细胞感染病毒后变圆并由感染中心往外扩散形成的空斑。
经前述方法筛选出溶瘤效果最强的毒株，命名为YD06毒株。
实施例2 YD06病毒株的生物学特性分析
(1)YD06病毒株基因组DNA测序结果分析
利用酚-氯仿法提取YD06病毒基因组DNA，将该毒株基因组DNA交由上海探普生物科技有限公司进行三代测序分析，比对YD06毒株与标准模式株17+(NC_001806.2)的病 毒基因组序列，结果显示两者的基因组序列存在1147个核苷酸的差异，并存在365个片段的缺失或插入。
(2)YD06病毒株的保藏
将YD06病毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，名称为“人单纯疱疹病毒Ⅰ型HSV-1/YD06毒株”，保藏编号为CCTCC NO：V202271。
实施例3野生型HSV-1YD06、17+毒株的基因修饰
针对HSV-1毒株YD06和17+毒株实施了基因敲除和外源基因插入，具体方法为：先利 用CRISPR/Cas9基因敲除技术敲除双拷贝的ICP34.5基因，经筛选纯化后再敲除ICP47基因， 经测序验证敲除成功后，搭建ICP34.5基因的同源臂，作为外源插入基因的donor质粒，插入 外源基因包括antiB7H3/CD3双特异性抗体和antiPD-L1/CD3双特异性抗体编码基因。
在插入antiB7H3/CD3双特异性抗体和antiPD-L1/CD3双特异性抗体编码基因之前，先插 入CMV-GFP表达盒，所述CMV-GFP表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示(如图2所 示)。
插入CMV-GFP表达盒后，使得HSV毒株带上了GFP绿色荧光标记(如图3所示)，方 便后续筛选，也验证了本实验中基因敲除和插入方法的可行性。
病毒株ICP34.5基因敲除技术路线为：293T铺板-筛选靶向ICP34.5基因的sgRNA稳转 株-感染YD06/F/17+毒株-收集病毒-单克隆病毒挑选-PCR鉴定-阳性重组克隆扩增-滴度检测- 获得YD06-dICP34.5克隆、F-dICP34.5克隆和17+-dICP34.5克隆。
病毒株ICP47基因敲除技术路线为：293T铺板-筛选靶向ICP47基因的sgRNA稳转株- 感染YD06/F/17+毒株-收集病毒-单克隆病毒挑选-PCR鉴定-阳性重组克隆扩增-滴度检测-获 得YD06-dICP47克隆、F-dICP47克隆和17+-dICP47克隆。
病毒株ICP34.5和ICP47双基因敲除技术路线为：293T铺板-筛选靶向ICP47基因的sgRNA稳转株-感染YD06-dICP34.5/F-dICP34.5/17+-dICP34.5克隆-收集病毒-单克隆病毒挑 选-PCR鉴定-阳性重组克隆扩增-滴度检测-获得YD06-dICP34.5-dICP47、F-dICP34.5-dICP47 和17+-dICP34.5-dICP47克隆。
插入CMV-GFP技术路线：293T铺板-筛选靶向ICP34.5基因的sgRNA稳转株-CMV-GFPdonor质粒转染-感染YD06-dICP47/F-dICP47/17+-dICP47毒株-收集阳性病毒-单克隆病毒挑 选-PCR鉴定-阳性重组克隆扩增-滴度检测-获得YD06-dICP34.5-GFP-dICP47、 F-dICP34.5-GFP-dICP47和17+-dICP34.5-GFP-dICP47。
插入外源基因技术路线：293T铺板-筛选靶向sgRNA稳转株-antiB7H3/CD3或antiPD-L1/CD3 donor质粒转染-感染YD06-dICP34.5-dICP47克隆-收集病毒-单克隆病毒挑选 -PCR鉴定-阳性重组克隆扩增-滴度检测-获得YD06-dICP34.5-dICP47-antiB7H3/CD3或 YD06-dICP34.5-dICP47-antiPD-L1/CD3克隆。
3.1 gRNA慢病毒包装
1)293T细胞密度长满至70％左右，以10cm的细胞培养皿为例，质粒及转染试剂用量 如下：
质粒总量：8μg
目的质粒：psPAX2：pMD2.G＝5:2:1
Opti-MEM：700μl
PEI：质粒总量的3倍体积。
取灭菌的1.5ml EP管，加入600μl Opti-MEM培养基，加入对应量质粒，涡旋混匀后加PEI，再次涡旋混匀，静置20min左右，将其加入到293T细胞培养皿中。
8h后，将上述含有转染混合液的细胞培养基换成新鲜的DMEM完全培养基，72h后将收集病毒上清，置于4℃保存。
3.2稳转细胞系的构建
293T细胞以5×105cells/ml铺板，6孔板中加入1ml细胞悬液，培养过夜，以MOI＝0.5 感染慢病毒，置于37℃、5％CO2孵箱中继续培养，待12h之后将更换成新鲜的完全培养基， 继续培养48h小时后加入嘌呤霉素筛选7天，直至90％以上的细胞皆为慢病毒感染的细胞。
3.3 donor质粒的转染
293T细胞以1×106cells/ml铺板，6孔板中加入1ml细胞悬液，培养过夜。以6孔板为 例，质粒及转染试剂用量如下：
donor质粒总量：2μg
Opti-MEM：200μl
PEI：质粒总量的3倍体积
取灭菌的1.5ml EP管，加入200μl Opti-MEM培养基，加入对应量质粒，涡旋混匀后加 PEI，再次涡旋混匀，静置20min左右，将其加入到293T细胞培养皿中。
3.4 HSV病毒感染
用2％FBS DMEM培养基稀释已知滴度的HSV-1病毒液，将感染donor质粒12h后的293T 细胞上清弃掉，加入100μl病毒稀释液感染。
3小时后，将病毒液更换成2ml 2％FBS DMEM培养基，放入37℃CO2培养箱中培养。
3.5病毒液收取
病毒感染293T细胞48h，细胞大部分变圆、漂浮，收集细胞悬液，在-80℃和37℃条件 下反复冻融三次，用0.45μM过滤器过滤，冻存于-80°冰箱。
3.6病毒空斑分离及鉴定
VERO细胞铺于96孔板中，每孔2×104个细胞。每种病毒铺2个96孔板。
利用流式分选带荧光标记的病毒细胞，进行梯度稀释，梯度设置为10-2～10-9。将其加 到铺板VERO的六孔板板中，37℃培养箱72h，挑取由单个病毒形成的空斑孔，取病毒液进 行PCR鉴定。
实施例4重组型YD06和HSV-1 17+毒株溶瘤效果比较
本实施例提供重组型YD06和17+在不同肿瘤中杀伤效果对比。实验细胞包括：U87(人 胶质瘤细胞)、A375(人黑色素瘤细胞)、MCF-7人乳腺癌细胞、A549人肺癌细胞、CT26小鼠结肠癌细胞。
实验方法如下：
基因修饰后的F-dd((F-dICP34.5-dICP47)、17+-dd(17+-dICP34.5-dICP47)、YD06-dd (YD06-dICP34.5-dICP47)毒株分别感染不同肿瘤细胞，通过MTT法测定细胞的相对活率。
取处于对数生长期的U87、A375、MCF-7、A549、CT26细胞，消化后按每孔2×104个细胞，每种细胞设置3个复孔，铺板至96孔板中培养，12小时后弃去旧培养基，设置空白 对照(只有培养基)、MOI＝0组、MOI＝0.1组，每孔总培养基为200μl，放入37℃，5％CO2培养箱培养48小时后取出每孔加入20μl MTT溶液(5mg/mL)，细胞培养箱放置3-4h。每孔 加150μlDMSO，溶解甲瓒，摇床孵育10min。使用酶标仪，490nm处读取各孔的吸光度值。 按如下公式计算细胞活力：
细胞活力×(％)＝[A(MOI＝0.1)-A(空白)]/[A(MOI＝0)-A(空白)]×100
结果如图4所示，由图4可看出，同等基因修饰的条件下，基因改造后的重组YD06毒株溶瘤效果比改造后的17+和F株更好。
实施例5重组YD06毒株药效学试验
5.1 CT26小鼠建模
取25只Balb/c小鼠，每只小鼠注射单侧注射1×106个细胞，分为5组，每组5只。
5.2注射野生或基因修饰后的病毒液。
待小鼠肿瘤长至直径约0.5厘米时，以PBS组设为对照组，分别于第7、10、13天进行瘤内给药200μl，病毒滴度为(1×108pfu/ml)，病毒液分别是F-dd((F-dICP34.5-dICP47)、17+-dd (17+-dICP34.5-dICP47)、YD06-dd(YD06-dICP34.5-dICP47)、YD06 antiB7H3/CD3(YD06-dICP34.5-dICP47-antiB7H3/CD3)、YD06 antiPD-L1/CD3 (YD06-dICP34.5-dICP47-antiPD-L1/CD3)。从第七天开始每天测量肿瘤体积。
实验结果如图5所示，由图可知，在CT26肿瘤模型中YD06-dd组相较于F-dd、17+-dd组在抗肿瘤作用上均具有统计学上的显著性差异(P<0.05)，YD06 antiB7H3/CD3、 antiPD-L1/CD3组相较于F-dd、17+-dd组在抗肿瘤作用上均具有统计学上的显著性差异 (P<0.001)，可见重组的YD06 antiB7H3/CD3、antiPD-L1/CD3相比现有的重组毒株具有更 好的抗肿瘤效果。
Claims (9)
1.Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06，其特征在于，其保藏编号为：CCTCC NO：V202271。
2.Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株，其特征在于：在权利要求1所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06基因序列中，敲除双拷贝的ICP34.5基因和/或单拷贝的ICP47基因而重组得到。
3.根据权利要求2所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株，其特征在于：满足下列任意一项，
所述ICP34.5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或
所述ICP47基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；或
靶向ICP34.5基因gRNA核酸序列如SEQ ID NO:3所示；或
靶向ICP47基因gRNA核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求2或3任一项所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株，其特征在于：在毒株YD06的基因序列中，敲除双拷贝的ICP34.5基因和单拷贝的ICP47基因，同时在ICP34.5缺失位置插入CMV-GFP表达盒重组得到，所述CMV-GFP表达盒的核苷酸序列如SEQID NO:5所示。
5.根据权利要求2或3任一项所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株，其特征在于：在毒株YD06的基因序列中，敲除双拷贝的ICP34.5基因和单拷贝的ICP47基因，同时在ICP34.5缺失位置插入antiB7H3/CD3双特异性抗体或antiPD-L1/CD3双特异性抗体表达盒重组得到。
6.根据权利要求5所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株，其特征在于：所述的插入antiB7H3/CD3的donor质粒核酸序列如SEQ ID NO:6所示；或所述的插入antiPD-L1/CD3的donor质粒核酸序列如SEQ ID NO:7所示。
7.预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于：含有权利要求1所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06或权利要求2-6任一项所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株。
8.根据权利要求7所述的预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于：所述癌症包括胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、头颈部癌症、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌或宫颈癌中的至少一种。
9.权利要求1所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06或权利要求2-6任一项所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒毒株YD06重组毒株在制备预防或治疗癌症的药物中的用途。
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