CN106978397A - 一种人dc-cik免疫活性细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人DC-CIK免疫活性细胞，其特征在于，负载了痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24，所述痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24通过痘苗溶瘤病毒融合IL-24基因得到，所述IL-24基因插入所述痘苗溶瘤病毒的TK酶基因区，所述人DC-CIK免疫活性细胞通过所述痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24与DC-CIK免疫活性细胞共培养得到。本发明的人DC-CIK免疫活性细胞将溶瘤病毒、细胞因子和免疫细胞的三重优势相结合，协同发挥高效的广谱杀肿瘤作用，其对肿瘤细胞的杀伤活性比DC-CIK提高160倍以上，且避免了血循环中中和抗体对溶瘤病毒入侵肿瘤细胞的抑制作用，提高了溶瘤病毒的体内疗效，减少了溶瘤病毒的副作用，为开发高效安全的临床抗肿瘤免疫细胞治疗技术或药物提供了新的方向。

Description

一种人DC-CIK免疫活性细胞及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人DC-CIK免疫活性细胞及其制备方法。
背景技术
近年来我国恶性肿瘤发病率和死亡率持续走高，在恶性肿瘤的治疗中，手术、放疗和化疗三大常规治疗，在控制肿瘤进展、延长患者生命、改善生存质量方面发挥了重要作用，但还远不够完善。
现代免疫学研究证明肿瘤的发生发展和机体免疫缺陷有关。随着上世纪八十年代重组细胞因子IFN-α被美国FDA批准用于毛细胞白血病的治疗，一系列细胞因子、单克隆抗体药物、多肽蛋白疫苗以及细胞免疫治疗技术等生物治疗手段进入肿瘤的临床治疗方案，成为手术、化疗和放疗之外的第四类治疗模式。
正常的机体免疫系统主要通过细胞免疫应答发挥抗肿瘤免疫效应，发挥免疫效应的细胞包括肿瘤抗原特异性的T淋巴细胞(CTL)以及固有免疫系统的NK细胞等非特异免疫细胞。研究证明固有免疫系统的NK细胞可以识别并杀伤对化疗和放疗均不敏感的肿瘤干细胞(Tallerico R et al,J Immunol.2013；190(5):2381-90)，因此，非特异免疫细胞治疗技术在肿瘤的综合治疗中显示出重要的作用。
CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine Induced Killer)，与其它免疫细胞制剂相比CIK具有细胞扩增数量多、抗肿瘤效果强而且毒副反应更小的优点。
DC细胞，即树突状细胞，是人体免疫系统中最为重要的高度专职化的主要抗原递呈细胞，在诱导针对相关抗原的高效、特异性T细胞免疫应答中起到关键作用。
大量关于DC-CIK的研究证明DC-CIK比CIK具有更强的细胞增值率，并能分泌更多的IL-12、IFNγ等细胞因子，对肿瘤细胞的杀伤活性也更为强大，也证明了DC-CIK细胞治疗在肿瘤治疗中的安全性和临床疗效，(Wang M et al，PLoS One.2014；9(11):e112662.Wang ZX et al，World J Gastroenterol.2014；20(4):1095–106.Wang D et al，BMC Cancer.2014；14:251.)。上海宇研生物技术有限公司经过多年研究，建立了一种人DC-CIK免疫活性细胞的制备方法(专利申请号201310102720.4)，在保证效应细胞比例和活力的情况下，制备更简便，可重复性和安全性更高。使用该方法诱导扩增出的免疫细胞含有30％以上的NKT细胞，对肿瘤细胞的杀伤活性显著高于CIK细胞。
然而，DC-CIK细胞治疗依然存在靶向性不能覆盖所有肿瘤细胞的问题。有些肿瘤细胞通过胞外小体分泌大量的可溶性NKG2D配体或在免疫压力下以其它方式改变细胞表面的分子表达，逃避NK细胞等非特异免疫细胞的攻击(Schmidt J et al,Cancer Immunol Immunother.2004；53(11):1018-26)。因而CIK细胞或DC-CIK细胞对肿瘤的控制效果仍然相当有限。
溶瘤病毒是具有复制能力的肿瘤杀伤性病毒，通过基因改造的溶瘤病毒能够在恶性肿瘤细胞中特异性复制，并裂解肿瘤细胞，而对正常细胞没有伤害。由于单独的溶瘤病毒感染和裂解肿瘤细胞的效应达不到100％，而痘苗病毒(痘病毒科)具有很多用于溶瘤病毒疗法的理想病毒主链所必需的关键属性，包括：只在胞浆复制而不会整合到宿主基因组中，对人体应用安全性高，不会致癌；宿主范围广，可感染所有类型的哺乳动物细胞，可用于各种肿瘤的治疗；基因组容量大，接近200Kb，可插入25Kb的外源基因而不影响其遗传稳定性；复制能力强，体外扩增简便等。所以很多研究者研究溶瘤病毒携带外源基因以增强其抗肿瘤的效果：比如携带p53的重组痘苗病毒(rVV-p53)[Timiryasova TM,et al，J Gene Med 2001；3(5):468-77.]，携带双特异抗体(抗T细胞表面CD3分子以及肿瘤细胞表面EphA2抗原)基因的痘苗溶瘤病毒(Feng Yu et al，Molecular Therapy，10December 2013)，携带GM-CSF基因的Wyeth株痘苗病毒(JX594)等，后者已被美国Jennerex公司开发于2012年进入晚期肝癌治疗的II期临床研究，三个临床I期研究证明JX549静脉注射可以导致机体GM-CSF水平的增加，既有溶瘤的作用也具有免疫治疗的作用机制，能很好地激发肿瘤患者的免疫应答，并且可以通过增加剂量提高对结肠癌、黑色素癌、卵巢癌和肝癌等多种肿瘤患者的病情控制效果。
白介素-24(IL-24)是人体分泌的对肿瘤有抑制作用的细胞因子，对肿瘤细胞有特异性的生长抑制和凋亡诱导作用，可以促进血管内皮细胞分化从而抑制肿瘤血管形成，同时通过刺激免疫系统发挥免疫调节作用，而对正常细胞没有或只有很低的杀伤作用，被誉为肿瘤治疗的魔弹(Fisher PB，Cancer Res.2005Nov 15；65(22):10128-38.，Expert Opin Biol Ther.2007May；7(5):577-86.)。
总之，痘苗溶瘤病毒由于其安全性和溶瘤能力在肿瘤的治疗方面具有巨大的潜力，细胞免疫治疗和细胞因子治疗也都显示出巨大的临床应用前景，但是单独的痘苗溶瘤病毒治疗或细胞免疫治疗或细胞因子治疗的疗效都不够理想。
因此，研发一种人DC-CIK免疫活性细胞及利用高效的免疫杀伤细胞DC-CIK细胞携带插入IL-24基因的痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24定向杀伤恶性肿瘤的方法，将痘苗溶瘤病毒、细胞因子和免疫细胞的优势相结合，以产生显著的协同效应，为开发高效安全的临床肿瘤治疗技术或药物提供新的方向，具有重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的单独痘苗溶瘤病毒或免疫细胞或细胞因子治疗的疗效都不够理想的问题，本发明提供了一种人DC-CIK免疫活性细胞及人DC-CIK免疫活性细胞负载痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的方法，将痘苗溶瘤病毒、免疫细胞和细胞因子三者的优势相结合，产生显著的协同效应，从而发挥高效广谱杀肿瘤作用，为开发高效安全的临床肿瘤治疗技术或药物提供新的方向。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种负载痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的人DC-CIK免疫活性细胞。
本发明的第二个目的在于提供制备所述人DC-CIK免疫活性细胞的方法。
本发明第三个目的在于提供所述人DC-CIK免疫活性细胞在作为临床抗肿瘤免疫细胞治疗技术和制备抗肿瘤药物中的应用。
为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种人DC-CIK免疫活性细胞，其特征在于，负载了痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24。
所述痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24通过痘苗溶瘤病毒融合IL-24基因得到。
所述IL-24基因插入所述痘苗溶瘤病毒的TK酶基因区。
所述人DC-CIK免疫活性细胞通过所述痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24与DC-CIK免疫活性细胞共培养得到。
所述痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的制备包括以下步骤：
a、用双酶酶切pCB质粒及含有IL-24基因的质粒，然后通过T4连接酶连接，构建pCB-IL-24质粒；
b、向接种了痘苗病毒的293细胞中转染pCB-IL-24质粒，得到同源重组的痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24。
所述痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的制备还包括以下步骤：
c、痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的筛选；
d、用PCR方法分别取IL-24基因的上下游基因序列和TK酶基因的上游和中游基因序列设计引物对痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24进行鉴定；
e、痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的扩增。
所述步骤c中所述的IL-24基因的上下游基因序列设计的引物为：
上游引物：5'-CGCGCGTAATACGACTCACT-3'，
下游引物：5'-GAAGGCATCAGTCGGCTTGCG-3'，
所述的TK酶基因的上游和中游基因序列设计的引物为：
上游引物：5'-TGTGAAGACGATAAATTAATGATC-3'，
下游引物：5'-GTTTGCCATACGCTCACAG-3'。
所述步骤c中所述的PCR方法的反应体系为：
所述步骤c中所述的PCR方法的反应条件为：
所述的负载了痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的人DC-CIK免疫活性细胞在临床抗肿瘤细胞治疗技术和制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
1)负载痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的DC-CIK细胞与肿瘤细胞接触，可以通过DC-CIK细胞的杀瘤作用将病毒导入到肿瘤细胞发挥溶瘤作用并在肿瘤局部表达IL-24发挥IL-24的特异性抑癌作用，将痘苗溶瘤病毒的广谱溶瘤活性、细胞因子的抗癌功能和免疫细胞的非特异杀伤机制的三重优势相结合，协同发挥高效的广谱杀肿瘤作用(抗肿瘤作用不仅限于肝癌和肺癌，而适应于各种恶性肿瘤)，其对肿瘤细胞的杀伤活性为DC-CIK的160倍以上，而对正常细胞没有毒性。
2)通过DC-CIK细胞携带溶瘤病毒避免了血循环中的中和抗体对溶瘤病毒入侵肿瘤细胞的抑制作用，对提高溶瘤病毒的体内疗效，减少溶瘤病毒的副作用有重要意义，为开发高效安全的临床肿瘤治疗技术或药物提供新的方向。
附图说明：
图1：双酶切pCB质粒示意图。
图2：同源重组构建痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24流程图。
图3：痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24在肿瘤细胞和正常细胞(MRC-5)内的复制能力比较，图中pfu为plaque forming unit(空斑形成单位)，纵坐标代表pfu比率(肿瘤细胞/正常细胞)。
图4：痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24在肿瘤细胞和MRC-5中表达抗癌因子IL-24的能力比较，图中β-Tubulin为β微管蛋白。
图5：不同浓度痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24对肿瘤细胞和MRC-5的杀伤活性，图中，曲线从上至下，分别为MRC-5/1moi、MRC-5/0.5moi、A549/PBS、MRC-5/PBS、A549/0.5moi、A549/1moi。
图6：DC-CIK细胞中CD3+CD56+的NKT细胞比例检测结果，图中，横坐标代表CD3表面标记物阳性的细胞量，纵坐标代表CD56表面标记物阳性的细胞含量。
图7：DC-CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
图8：感染痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的DC-CIK与DC-CIK细胞的增值曲线比较；图中，由上至下，分别为感染0moi、0.1moi、1moi、0.5moi的DC-CIK细胞的增值曲线。
图9：痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24在DC-CIK细胞内的增殖能力分析，图中纵坐标pfu(plaque forming unit，空斑形成单位)表示病毒滴度。
图10：分别负载痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-241moi、10moi的DC-CIK细胞、痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24及DC-CIK细胞对肺癌肿瘤细胞的杀伤活性。
图11：分别负载痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-240moi、0.1moi、0.5moi、1moi的DC-CIK细胞，对肝癌肿瘤细胞的杀伤活性。
图12：被负载痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的DC-CIK细胞杀伤的肿瘤细胞中IL-24蛋白的表达，图中，M：Marker；N1：DC-CIK细胞；N2：A549细胞；T1：0.5moi-24小时；T2：0.5moi-48小时；T3：0.5moi-72小时；T4：1moi-24小时；T5：1moi-48小时；T6：1moi-72小时；T7：0moi-24小时；T8：0moi-48小时；T9：0moi-72小时。
具体实施方式
以下通过具体实施例，对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1、痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的构建
1.1、pCB-IL-24质粒的构建
合成IL-24蛋白的基因序列，并在IL-24基因序列的两端加入BglⅡ和XbaⅠ酶切位点，利用限制性内切酶BglⅡ和XbaⅠ，双酶切pCB质粒(顾懋治、江福美、蔡名杰、吴祥甫，重组质粒pCB的构建[J]，《生物化学与生物物理进展》，1980,7(4):46-48)及含有IL-24基因的质粒，利用胶回收方法回收pCB大片段及IL-24基因片段，并纯化，再将两种纯化后的基因片段按比例混合在一起，再加入T4连接酶，在4℃下过夜连接，构建pCB-IL-24质粒。然后通过转化DH5α感受态细胞，在37℃下过夜培养。挑取单克隆后，扩大培养并抽提相应质粒。选择经限制性内切酶BglⅡ和XbaⅠ双酶切鉴定为阳性的质粒。
1.2、同源重组构建痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24
在直径6cm的培养皿内接种适当数量的293细胞，向293细胞中接种1mlWR株痘苗病毒(美国ATCC，型号VR-119)，于37℃，5％CO2的培养箱中培养1-2小时，按Effectene公司试剂盒的说明书进行操作，转染上述pCB-IL-24质粒，具体流程见图1和图2。待细胞完全病变后，将培养瓶在-80℃与室温之间反复冻融，离心并收集上清液，得到同源重组构建痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24液。
1.3、痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的筛选
在直径6cm的培养皿中接种适当数量的293细胞，使之在24h内长满培养皿。将1.2步骤中所得的病毒液稀释不同的倍数，加入到培养皿中去感染293细胞。两个小时后吸去悬浮的病毒液，铺低熔点胶，9天后形成空斑。调取单个病毒空斑，在24孔板中小量扩增病毒，并采用Qiagen公司的Blood Kit提取病毒DNA。
实施例2、痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的鉴定
用PCR方法对同源重组的痘苗病毒中是否含有目的基因进行检测，同时也为鉴定同源重组的痘苗病毒是否被野生病毒的污染，设计两条引物，一条引物取IL-24基因的上下游基因序列，一条引物取TK酶基因的上游和中游基因序列。
1)鉴定目的基因的引物为：
上游引物：5'-CGCGCGTAATACGACTCACT-3'，
下游引物：5'-GAAGGCATCAGTCGGCTTGCG-3'，
2)鉴定野生型病毒的引物为：
上游引物：5'-TGTGAAGACGATAAATTAATGATC-3'，
下游引物：5'-GTTTGCCATACGCTCACAG-3'。
3)PCR反应体系为：
4)PCR反应条件为：
若病毒空斑的PCR产物含IL-24基因且不含有TK酶基因，则空斑纯化成功，所得痘苗溶瘤基因病毒重组成功，此过程重复一遍，得到痘苗溶瘤基因病毒OncopoxIL-24。
实施例3、痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的扩增
当293细胞长满到培养皿的80％左右时，加入一定量的痘苗病毒，然后继续放入37℃，5％CO2培养箱中培养。293细胞感染病毒2到3天后，收集293细胞，在-80℃和37℃之间反复冻融，裂解细胞，释放病毒。最后利用密度梯度纯化方法离心，并收集上清液。详见氯化铯梯度离心纯化病毒操作说明(Microbix Biosystem Inc)。
实施例4、痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的滴度测定
将293细胞铺于6孔板中，每孔加入1ml稀释后的痘苗溶瘤基因病毒OncopoxIL-24(稀释比例分别为10-4、10-5、10-6、10-7)。37℃，培养2小时后，铺低熔点胶(8ml)以移除培养基。两天后计算每孔中的空斑数，并算出对应的病毒滴度。
实施例5、痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24复制能力分析以及肿瘤细胞内IL-24表达能力的检测
5.1、将正常细胞(MRC-5人胚肺成纤维细胞)和肿瘤细胞SW620(人结肠癌细胞)、A549(人肺腺癌细胞)和SKOV-3(人卵巢腺癌细胞)铺于小瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，接种1moi(病毒与细胞数量的比值)的痘苗基因病毒Oncopox-IL-24，感染48小时后，收集细胞，并在-80℃和37℃反复冻融3次，离心取上清液，检测病毒滴度，结果如图3所示。
图3的结果显示Oncopox-IL-24可以选择性地在肿瘤细胞中复制，而在正常细胞中不复制或者少复制。
5.2、将5.1步骤收集的正常细胞MRC-5和肿瘤细胞A549的细胞沉淀并进行western blot分析，检测正常细胞MRC-5和肿瘤细胞A549中IL-24蛋白的表达水平，结果如图4所示。
图4的结果显示感染Oncopox-IL-24的肿瘤细胞和正常细胞都有表达β微管蛋白，Oncopox-IL-24可以在肿瘤细胞中大量表达抗癌因子IL-24，而在正常细胞中则几乎检测不出IL-24。
5.3、用不同剂量的Oncopox-IL-24感染人正常或者肿瘤细胞，分别于24、48、72小时检测病毒对细胞的杀伤力，具体步骤如下：
按每孔10000个分别将正常细胞和肿瘤细胞铺入96孔板，培养4小时后分别加入1moi、0.5moi的病毒或PBS，24小时后用CCK8试剂盒(日本同仁化学研究所)检测细胞的存活数，并计算杀伤率，结果如图5所示。
图5的结果显示Oncopox-IL-24对肿瘤细胞有明显的杀伤活性，随着病毒剂量的增加和时间的延长肿瘤细胞存活率显著下降，而正常人胚肺成纤维细胞的存活率没有下降。
实施例6、非特异免疫活性细胞DC-CIK的体外诱导
采用上海宇研生物技术有限公司建立的一种人DC-CIK免疫活性细胞的制备方法(专利申请号201310102720.4)。
6.1DC-CIK细胞制备
采集患者外周血，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心分离出单个核细胞(PBMC)，将PBMC接种到GT551无血清培养液(购自日本Takara公司)，调整细胞浓度为1×106(U/ml)，添加IFN-γ(1000U/ml)、IL-2(500U/ml)、抗CD3单抗(20ng/ml)、IL-4(1000U/ml)、GM-CSF(500U/ml)，在37℃，5％CO2条件下培养5天后即可诱导出未成熟的DC细胞，再加入TNFα(500U/ml)使DC成熟。7天后加入含IL-2(500U/ml)的培养液隔天传代培养7天，收集得到DC-CIK细胞。
6.2DC-CIK细胞表型测定
将培养15天的DC-CIK细胞应用FITC标记抗人CD分子单抗，然后与DC-CIK细胞表面CD结合，测试DC-CIK免疫效应细胞CD3+CD56+的百分率，具体操作如下：
取一定体积的细胞(细胞总数为1×106/ml)悬液于流式细胞仪测试管中，离心，弃上清液，保留细胞。按照美国Becton Dickinson公司的标记抗体使用说明，将抗人的CD3-FITC、抗CD56-PE加入测试管中，混匀，4℃、孵育30分钟，然后1000rmp离心3min，用PBS洗涤细胞三次，然后再悬浮于0.5ml PBS中，经流式细胞仪测试，结果见图6。
图6表明，诱导的DC-CIK细胞中CD3+CD56+的NKT细胞比例为37.76％。
6.3DC-CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性测定
按每孔10000个将A549细胞铺入96孔板，培养4小时后，分别加入效靶比为5、10和20的DC-CIK细胞，24小时后用CCK8试剂盒检测肿瘤细胞的存活数，并计算杀伤率，结果见图7。
由图7可以看出，DC-CIK细胞对肿瘤细胞有显著的杀伤作用，在10：1的效靶比(DC-CIK细胞与肿瘤细胞的比值)时，对肿瘤细胞的杀伤率为38％。
实施例7、痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24入侵DC-CIK细胞后病毒和DC-CIK细胞的复制能力的分析
7.1取诱导培养到第11天的DC-CIK细胞，调整到2×106个细胞/毫升分装到培养瓶中，分别将Oncopox-IL-24以1moi、0.5moi、0.1moi及0moi的浓度感染DC-CIK细胞，加入GT551无血清培养液(购自日本Takara公司)和500U/ml的IL-2，放入37℃的5％CO2培养箱中分别培养24、48、72、96、120和144小时，分别取出2×106个细胞，离心，并使细胞重悬在1ml新鲜培养基中。同时记录感染病毒与未感染病毒的免疫细胞的增殖曲线，结果见图8。
由图8可以看出，Oncopox-IL-24感染DC-CIK细胞后，DC-CIK细胞的增值在前四天基本没有变化，至第六天略有下降，但显微镜下细胞形态基本没有变化，说明痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24对DC-CIK细胞的生长没有显著的不良影响。
7.2将7.1收集的痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24入侵的DC-CIK细胞在-80℃和37℃之间反复冻融，裂解细胞，释放病毒，离心并收集上清液，检测上清液中的病毒滴度，结果见图9。
由图9可以看出，以感染1moi病毒后的DC-CIK细胞内的病毒总量为例，病毒在感染到DC-CIK细胞的前48小时基本没有增殖，至第72至96小时发生较大的增殖，120小时以后由于细胞数量扩增至5倍以上，病毒滴度显示下降，说明病毒不再显著增殖。
实施例8、负载痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的DC-CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力分析
8.1对肺癌细胞A549杀伤能力的分析
取已刺激成熟的DC-CIK细胞，按照不同的效靶比分装到几个培养瓶中，将Oncopox-IL-24分别以10moi、1moi、和0moi三个剂量感染DC-CIK细胞，然后将感染后的DC-CIK细胞放入37℃5％CO2培养箱中培养72小时后，用CCK8法检测其对肺癌A549细胞的杀伤活性，并与单纯的Oncopox-IL-24对肺癌A549细胞的杀伤活性进行比较，结果见图10。
由图10可以看出，DC-CIK细胞最高效靶比40：1时(即40个DC-CIK细胞比1个肿瘤细胞)对肿瘤细胞的杀伤率只能达到85％，而负载1moi痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的DC-CIK细胞在10：1效靶比即可全部杀伤肿瘤细胞，负载10moi痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的DC-CIK细胞在5：1效靶比也可全部杀伤肿瘤细胞。
比较负载不同剂量Oncopox-IL-24的DC-CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，可以看出，DC-CIK细胞杀伤42％肿瘤细胞(最高杀伤率的50％)的效靶比为10：1，负载1moi Oncopox-IL-24的DC-CIK细胞杀伤42％肿瘤细胞的效靶比为0.5：1，而负载10moi Oncopox-IL-24的DC-CIK细胞杀伤42％肿瘤细胞的效靶比为0.0625：1，由此计算，负载1moi和10moi痘苗溶溜基因病毒Oncopox-IL-24的DC-CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性比DC-CIK细胞分别提高了20和160倍。
8.2对肝癌细胞Huh7杀伤能力的分析
取已刺激成熟，并培养到第11天的DC-CIK细胞，按照不同的效靶比分装到几个培养瓶中。将Oncopox-IL-24分别以1moi、0.5moi和0.1moi三个剂量感染DC-CIK细胞，然后将感染后的DC-CIK细胞放入37℃，5％CO2培养箱中培养，72小时后检测其对肝癌细胞Huh7的杀伤活性，并与单纯的DC-CIK细胞对肝癌细胞Huh7的杀伤活性进行比较，结果见图11。
由图11可以看出，低于1moi的Oncopox-IL-24感染的DC-CIK细胞对肝癌Huh7细胞仍有显著的杀伤力，其中0.5moi和1moi感染的DC-CIK细胞在2.5倍效靶比时可以杀伤90％以上的肿瘤细胞，而单独的DC-CIK细胞在2.5倍效靶比时的杀伤力低于5％。
实施例9、负载Oncopox-IL-24的DC-CIK对肿瘤细胞的杀伤过程中，肿瘤细胞IL-24蛋白表达量的分析
取适量已刺激成熟，并培养到第11天的DC-CIK细胞，平均分装到10个培养瓶中，将Oncopox-IL-24以1moi和0.5moi剂量感染DC-CIK细胞，然后将感染后的DC-CIK细胞放入37℃，5％CO2培养箱中培养，72小时后，以10倍效靶比的比例加入铺有A549肿瘤细胞的96孔板中，分别于24、48、72小时后，裂解所有细胞并离心收集上清液，得到样本T1(0.5moi-24小时)、T2(0.5moi-48小时)、T3(0.5moi-72小时)、T4(1moi-24小时)、T5(1moi-48小时)、T6(1moi-72小时)、T7(0moi-24小时)、T8(0moi-48小时)、T9(0moi-72小时)。以未感染Oncopox-IL-24病毒(0moi)的DC-CIK细胞的杀伤样品作为阴性对照(N1、T7、T8和T9)，以A549细胞作为空白对照N2，用Westblot方法检测细胞IL-24蛋白的表达含量，结果见图12。
图12的结果显示，负载Oncopox-IL-24的DC-CIK细胞与肿瘤细胞共培养后，在肿瘤细胞裂解液和分泌上清液中均可以检测到IL-24，且随着Oncopox-IL-24病毒剂量的增加和杀伤时间的延长，IL-24的表达量也有所上升。
综上所述，本发明的人DC-CIK免疫活性细胞负载痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的方法，是向痘苗溶瘤病毒TK酶基因区插入抑癌因子IL-24基因，得到痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24，并将痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24与高效的免疫杀伤DC-CIK细胞联合应用，利用痘苗病毒TK酶缺失后只能在高度增殖的细胞中复制的特性，将溶瘤病毒、细胞因子和免疫细胞的优势相结合，具有显著的协同效应，同时通过DC-CIK细胞携带溶瘤病毒避免了血循环中的中和抗体对溶瘤病毒入侵肿瘤细胞的抑制作用，提高了溶瘤病毒的体内疗效，减少了溶瘤病毒的副作用，为开发高效安全的临床肿瘤治疗技术或药物提供新的方向。
虽然以上实施例仅对肺癌和肝癌细胞的杀伤力及肿瘤细胞IL-24蛋白表达量进行了分析，但由于痘苗病毒的广谱溶瘤活性和DC-CIK细胞的非特异杀伤机制，本发明的方法制备的负载痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的人DC-CIK免疫活性细胞的作用不限于肝癌和肺癌，其杀伤肿瘤的范围适应于各种恶性肿瘤，这是显而易见的。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种人DC-CIK免疫活性细胞，其特征在于，负载了痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24。
2.如权利要求1所述的人DC-CIK免疫活性细胞，其特征在于，所述痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24通过痘苗溶瘤病毒融合IL-24基因得到。
3.如权利要求2所述的人DC-CIK免疫活性细胞，其特征在于，所述IL-24基因插入所述痘苗溶瘤病毒的TK酶基因区。
4.如权利要求1所述的人DC-CIK免疫活性细胞，其特征在于，所述人DC-CIK免疫活性细胞通过所述痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24与DC-CIK免疫活性细胞共培养得到。
5.如权利要求1所述的人DC-CIK免疫活性细胞，其特征在于，所述痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的制备包括以下步骤：
a、用双酶酶切pCB质粒及含有IL-24基因的质粒，然后通过T4连接酶连接，构建pCB-IL-24质粒；
b、向接种了痘苗病毒的293细胞中转染pCB-IL-24质粒，得到同源重组的痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24。
6.如权利要求1所述的人DC-CIK免疫活性细胞，其特征在于，所述痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的制备还包括以下步骤：
c、痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的筛选；
d、用PCR方法分别取IL-24基因的上下游基因序列和TK酶基因的上游和中游基因序列设计引物对痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24进行鉴定；
e、痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的扩增。
7.如权利要求6所述的人DC-CIK免疫活性细胞，其特征在于，所述步骤c中所述的IL-24基因的上下游基因序列设计的引物为：
上游引物：5'-CGCGCGTAATACGACTCACT-3'，
下游引物：5'-GAAGGCATCAGTCGGCTTGCG-3'，
所述的TK酶基因的上游和中游基因序列设计的引物为：
上游引物：5'-TGTGAAGACGATAAATTAATGATC-3'，
下游引物：5'-GTTTGCCATACGCTCACAG-3'。
8.如权利要求6所述的人DC-CIK免疫活性细胞，其特征在于，所述步骤c中所述的PCR方法的反应体系为：
9.如权利要求6所述的人DC-CIK免疫活性细胞，其特征在于，所述步骤c中所述的PCR方法的反应条件为：
10.如权利要求1-9任一项所述的负载了痘苗溶瘤基因病毒Oncopox-IL-24的人DC-CIK免疫活性细胞在临床抗肿瘤细胞治疗技术和制备抗肿瘤药物中的应用。
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