CN113711991A

CN113711991A - 一种以pap为靶点的药物筛选动物模型的构建方法和应用

Info

Publication number: CN113711991A
Application number: CN202011205174.3A
Authority: CN
Inventors: 安鸿; 廖鹏云; 周超; 周玲; 杜云彪
Original assignee: Jiangmen Saierkang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangmen Saierkang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-02
Filing date: 2020-11-02
Publication date: 2021-11-30

Abstract

本发明公开了一种以PAP为靶点的药物筛选动物模型，通过在雄性重度联合免疫缺陷小鼠皮下接种LNCaP.FGC细胞构建，并且通过CTL细胞有效性实验研究看出本发明构建的动物模型可以很好的应用于针对PAP靶点的药物筛选以及细胞治疗领域。而且本发明中的动物模型与传统的裸鼠模型相比，不会发生人源细胞排斥反应，更容易成瘤，可以不受任何限制的大规模开展试验。与PDX模型相比较，具有成功率高、周期短、成本低的优势。

Description

一种以PAP为靶点的药物筛选动物模型的构建方法和应用

技术领域

本发明属于动物模型领域，具体涉及一种以PAP为靶点的药物筛选动物模型的构建方法和应用。

背景技术

前列腺癌(prostate cancer，PC)是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，是老年男性多发病，具有较高的发病率和死亡率。2018年美国新增肿瘤患病人数中前列腺癌占男性肿瘤的19％，致死人数占男性恶性肿瘤的9％，仅次于肺癌。进展期浸润型前列腺癌的5年生存率仅为29％。10％～20％的前列腺癌经过18～24个月的内分泌治疗后可逐渐进展为转移性去势抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC)，化疗药物和分子靶向药物治疗可作为mCRPC患者的治疗选择，但容易出现耐药性，mCRPC患者平均中位生存时间少于2年。因此开发出新的、有效的前列腺癌治疗方案十分迫切。

细胞治疗作为肿瘤治疗的新手段成为了研究热点，尤其是基于树突状细胞(dendritic cell，DC)疫苗的前列腺癌治疗取得了较好的临床效果。前列腺癌表达多种肿瘤相关抗原(TAA)，如前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen，PSA)、前列腺特异性膜抗原(prostrate specific membrane antigen，PSMA)、前列腺酸性磷酸酶(prostaticacid phosphatase，PAP)、前列腺干细胞抗原(Prostate Stem Cell Antigen，PSCA)等，这些肿瘤相关抗原为免疫治疗提供了多种潜在靶点。通过前列腺癌相关抗原肽致敏DC，能诱导强效的抗肿瘤免疫效应。

PAP属于酸性磷酸酶家族。前列腺癌患者血清中PAP浓度增高，特别是已经发生骨转移的病人血清中PAP浓度显著升高，PAP在前列腺组织中的特异性表达使其成为前列腺癌免疫治疗的又一良好靶点。PAP—GM—CSF融合蛋白致敏自体抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells，APC)能够产生抗前列腺癌的免疫反应，而Sipuleucel—T就是以此为基础的产品。2010年，基于三项双盲随机三期临床试验，FDA批准Provenge(Sipuleucel-T)用于治疗激素难治性晚期前列腺癌，成为首个肿瘤治疗性疫苗产品，Provenge的获批开启了细胞免疫疗法治疗癌症的时代。而DC疫苗要达到的关键目标就是引发机体的细胞介导的免疫反应，主要是激活肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)特异性的杀伤性T淋巴细胞(Cytotoxic TLymphocyte，CTL)。利用表达纯化的前列腺癌肿瘤抗原PAP-GM-CSF融合蛋白刺激活化前列腺癌病人的DC细胞，并在体外通过致敏DC诱导PAP-GM-CSF抗原特异性CTL，从而获得大量高活性的抗原特异性的CTL细胞，用于前列腺癌的临床治疗，从而提高临床疗效。

而细胞治疗产品在用于临床之前，需要通过临床前的基础研究以及动物试验等进行改进和优化，所以建立一个合理的动物研究模型显得尤为重要。而人源肿瘤细胞系异种移植瘤模型(cell-line-derived xenograft，CDX)与人源肿瘤组织来源移植瘤模型(Patient-derived tumor xenograft，PDX)是我们现在应用最多的两种用于癌症治疗的动物模型。相对于CDX模型，PDX模型虽然使得肿瘤的生长微环境更接近实际情况，但PDX模型成功率低、费用高、周期长。所以现阶段主要还是选择CDX模型用于肿瘤治疗的动物模型。

发明内容

本发明的第一个目的在于，针对现有技术中缺少以PAP为靶点的CDX模型的问题，提供一种以PAP为靶点的药物筛选动物模型的构建方法。

本发明的第二个目的在于，提供上述构建方法构建的动物模型在前列腺癌药物筛选中的应用。

本发明的第三个目的在于，提供上述方法构建的动物模型在免疫治疗有效性研究中的应用。

本发明的第四个目的在于，提供上述方法构建的动物模型在CTL细胞治疗有效性研究中的应用。

本发明的第五个目的在于，提供一种筛选前列腺癌药物的方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种以PAP为靶点的药物筛选动物模型的构建方法，通过在雄性重度联合免疫缺陷小鼠皮下接种LNCaP.FGC细胞构建。

根据本发明第一个方面所述的构建方法，所述LNCaP.FGC细胞浓度为0.5～2×10⁷cell/ml。

根据本发明第一个方面所述的构建方法，所述LNCaP.FGC细胞浓度为1×10⁷cell/ml。

根据本发明第一个方面所述的构建方法，所述接种的细胞数量为1～4×10⁶cell/只。

根据本发明第一个方面所述的构建方法，所述接种的细胞数量为2×10⁶cell/只。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的方法构建的动物模型在药物筛选中的应用。

根据本发明第二个方面所述的应用，所述药物为前列腺癌药物。

根据本发明第二个方面所述的应用，所述前列腺癌药物为以PAP为靶点的前列腺癌药物。

本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的方法构建的动物模型在免疫治疗有效性研究中的应用。

本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的方法构建的动物模型在CTL细胞治疗有效性研究中的应用。

本发明的第五个方面，提供一种筛选前列腺癌药物的方法，使用本发明第一个方面所述的方法制备的动物模型进行药物筛选。

根据本发明第五个方面所述的方法，包括以下步骤：

S1：向所述动物模型中注射待筛选的药物；

S2：检测所述动物模型中的肿瘤体积。

根据本发明第五个方面所述的方法，步骤S2所述检测肿瘤体积的具体操作为：每周测量两次肿瘤大小，具体为瘤体的长径和短径(与长径垂直的短径)，计算肿瘤体积，计算方法为：肿瘤体积＝0.5×长径×短径²。

本发明的有益效果是：

本发明通过在雄性重度联合免疫缺陷小鼠皮下接种LNCaP.FGC细胞构建以PAP为靶点的药物筛选动物模型。并且通过CTL细胞有效性实验研究看出本发明构建的动物模型可以很好的应用于针对PAP靶点的药物筛选，以及很好的应用于药物筛选以及细胞治疗领域。而且本发明中的动物模型与传统的裸鼠模型相比，不会发生人源细胞排斥反应，更容易成瘤，在本发明的一个实施中，用于实验的30只小鼠全部成瘤，成瘤率100％，且可以不受任何限制的大规模开展试验。与PDX模型相比较，具有成功率高、周期短、成本低的优势。

附图说明

图1为LNCaP.FGC细胞株中PAP表达量的检测图。

图2为给药后肿瘤体积变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实验动物：重度免疫缺陷小鼠购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。重度免疫缺陷小鼠(NOD-Prkdcscid IL2rgtm1/Bcgen，B-NDG)是百奥赛图公司自主开发的，NOD-scid遗传背景的IL2rg基因敲除小鼠，缺乏成熟的T、B淋巴细胞和NK细胞，是目前公认的免疫缺陷程度高、适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。

实验材料：LNCaP.FGC细胞，DC细胞直接诱导的CTL细胞，DC细胞+PAP-GM-CSF抗原诱导的CTL细胞。

DC细胞直接诱导的CTL细胞的制备：

1、血细胞分离机或Ficoll分离外周血单核细胞(PBMC)，通过磁珠分选法分离CD14+单核细胞，加入X-VIVOTM15(LONZA)淋巴细胞无血清培养基，37℃、5％CO₂条件下置于CO₂培养箱中培养，第5天加入20ng/mlTNF-α诱导DC成熟，继续培养48h。

2、血细胞分离机或Ficoll分离与DC来源相同的的PBMC，加入到成熟的DC中(DC：PBMC＝1:10)，37℃、5％CO2的培养箱内共孵育3～5天。

DC细胞+PAP-GM-CSF抗原诱导的CTL细胞的制备：

1、血细胞分离机或Ficoll分离外周血单核细胞(PBMC)，通过磁珠分选法分离CD14+单核细胞，加入X-VIVOTM15(LONZA)淋巴细胞无血清培养基，37℃、5％CO₂条件下置于CO₂培养箱中培养，第5天加入PAP-GM-CSF融合蛋白刺激活化DC，同时加入20ng/mlTNF-α诱导DC成熟，继续培养48h。

2、血细胞分离机或Ficoll分离与DC来源相同的的PBMC，加入到经PAP-GM-CSF刺激且成熟的DC中(DC：PBMC＝1:10)，37℃、5％CO2的培养箱内共孵育3～5天。

实施例1 LNCaP.FGC细胞株中PAP表达量的检测

通过蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)对LNCaP.FGC细胞株中PAP的表达量进行检测，检测结果见图1，可以看出，在LNCaP.FGC细胞株中PAP高表达故可以用来作为PAP靶点的动物模型构建。

实施例2一种以PAP为靶点的药物筛选动物模型的构建

一种以PAP为靶点的药物筛选动物模型的构建方法，包括以下步骤：

S1：收集对数生长期LNCaP.FGC细胞并调整细胞悬液浓度，用PBS稀释，调整浓度为1×10⁷cell/ml；

S2：选取30只SPF级雄性B-NDG小鼠，体重范围20±2g，适应性喂养结束后在右侧腹部皮下接种制备好的LNCaP.FGC细胞，2×10⁶cell/只，接种完成后，进行一般临床观察，包括肿瘤结节、肿瘤破溃情况、动物的外观体征、行为活动、呼吸、分泌物、排泄物等，每天进行观察，及时做好记录。每天观察接种部位是否成瘤，待接种小鼠确认成瘤后，每周测量两次肿瘤大小，具体为瘤体的长径和短径(与长径垂直的短径)，计算肿瘤体积，计算方法为：肿瘤体积＝0.5×长径×短径²。

实验中30只小鼠全部成瘤，成瘤率100％。

实施例3动物模型的有效性检测

1.待接种小鼠瘤体积达到60～100mm³时，将小鼠随机分为三组：溶剂组、DC细胞诱导的CTL细胞组和DC细胞+PAP-GM-CSF抗原诱导的CTL细胞组；

2.分别尾静脉注射生理盐水、DC细胞诱导的CTL细胞以及DC细胞+PAP-GM-CSF抗原诱导的CTL细胞，其中DC细胞诱导的CTL细胞以及DC细胞+PAP-GM-CSF抗原诱导的CTL细胞用生理盐水作为溶剂，调整浓度均为1×10⁸cell/ml；7天后重复注射一次；

3.注射完成后，每周测量两次肿瘤大小，具体为瘤体的长径和短径(与长径垂直的短径)，计算肿瘤体积，计算方法为：肿瘤体积＝0.5×长径×短径²，待其中一组小鼠平均瘤体积超过1000mm³时处死所有小鼠，结果如图2所示。

从图2可以看出相对于溶剂组和DC细胞诱导的CTL细胞组，DC细胞+PAP-GM-CSF抗原诱导的CTL细胞组对肿瘤生长有明显的抑制作用。

可见，本发明利用LNCaP.FGC细胞构建的靶向PAP靶点的前列腺癌治疗用CTL细胞有效性研究的动物试验方法是可行的，可作为对前列腺癌治疗用CTL细胞有效性研究的动物试验方法。

以上实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当限制本发明的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则以内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种以PAP为靶点的药物筛选动物模型的构建方法，在雄性重度联合免疫缺陷小鼠皮下接种LNCaP.FGC细胞。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述LNCaP.FGC细胞浓度为0.5～2×10⁷cell/ml。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，每只小鼠中接种的LNCaP.FGC细胞数量为1～4×10⁶cell/。

4.权利要求1至3任一所述的方法构建的动物模型在药物筛选中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗前列腺癌的药物。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为以PAP为靶点的治疗前列腺癌药物。

7.权利要求1至3任一所述的方法构建得到的动物模型在免疫治疗有效性研究中的应用。

8.权利要求1至3任一所述的方法构建得到的动物模型在CTL细胞的治疗有效性研究中的应用。

9.一种筛选前列腺癌药物的方法，其特征在于，使用权利要求1至3任一所述的方法制备的动物模型进行药物筛选。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：向所述动物模型中注射待筛选的药物；

S2：检测所述动物模型中的肿瘤体积。