CN104630268A - 一种psa启动子介导荧光素酶基因表达的质粒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种前列腺特异性抗原(PSA)启动子介导荧光素酶基因表达的质粒。该质粒由PSA启动子pPSA-ZsGreen显性骨架和荧光素酶Firefly Luciferase基因片段连接而成。将质粒转染前列腺癌细胞，为构建前列腺癌的PSA荧光报告基因动物模型奠定基础。通过荧光定位前列腺癌动物模型中肿瘤的部位，可为前列腺癌的治疗和新型药物的研发提供一个可靠的动物模型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种PSA启动子介导荧光素酶基因表达的质粒。
背景技术
前列腺癌是男性生殖系统的恶性肿瘤之一，主要发生在西方发达国家的老年人当中，近年来在我国的发病率呈现上升趋势。前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）是前列腺上皮细胞分泌的一种特异蛋白，它在血清中含量的变化可以反应前列腺癌的发生、发展、侵袭转移和预后等情况，目前主要作为前列腺癌临床诊断、治疗及判断预后主要敏感指标。PSA主要存在于前列腺细胞与组织中，正常情况下血清中含量较低，当患有前列腺癌时，由于肿瘤细胞的大量增殖及破裂，PSA被大量释放入血，使得血清中PSA含量大幅升高，因此临床上以PSA浓度的异常升高作为诊断前列腺癌的一个重要依据。前列腺上皮细胞特异性的表达PSA，因此检测前列腺上皮细胞内PSA的表达改变水平，可以更方便、准确和直观的反应前列腺癌疾病的进展、侵袭转移及预后等。
荧光素酶作为一种常用的信号分子，目前被广泛地用于标记组织及细胞。与基于荧光素酶的生物发光技术在体内检测的灵敏度更高，在动物体内能检测到102数量级的细胞，而荧光成像技术只能检测到约106数量级的细胞。荧光素酶标记的肿瘤细胞经皮下、静脉或原位接种在动物体内成瘤后，借助于活体成像系统，通过检测荧光素酶的生物发光强度，可以间接反映出肿瘤生长的大小和肿瘤转移位置。
发明内容
本发明提供一种PSA启动子介导荧光素酶基因表达的质粒，该质粒由pPSA-ZsGreen显性骨架和荧光素酶Firefly Luciferase基因片段连接而成。将该质粒转染入前列腺癌细胞，为构建前列腺癌的PSA荧光报告基因小鼠模型奠定基础。通过荧光定位前列腺癌小鼠模型中肿瘤的部位，可为前列腺癌的治疗和新型药物的研发提供一个可靠的动物模型。
附图说明
图1是以前列腺癌LNCaP细胞株基因组DNA为模板，通过PCR扩增PSA启动子序列；
图2是pPSA-FL-Luc质粒的构建，（A）pZsGreen1-1质粒的图谱，（B）pPSA-FL-Luc质粒构建电泳结果：a、PSA-FL-Luc重组质粒；b、pPSA-FL-Luc酶切产物；c、DL5000 Marker；d、FL-Luc 的PCR扩增产物；
图3是不同浓度双氢睾酮对pPSA-FL-Luc报告质粒荧光活性强度影响；
图4是经G418筛选2周后所得到的高发光强度的前列腺癌LNCaP细胞；
图5是活体荧光显像系统观察前列腺癌瘤体移植，（A）前列腺癌肿瘤原位模型（B）去势处理模型小鼠：a、未去势处理组；b、去势处理组。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，本发明结合附图和实施例作进一步的说明。但这些具体实施方案不是要以任何方式限制所要求保护的发明范围。
实施例1
1. 细胞株及实验动物 人PCa细胞株LNCaP，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；人胚肾293T细胞株，由浙江省器官移植重点研究实验室保藏提供；SCID鼠购自斯莱克实验动物有限责任公司。
2. 主要试剂 RPMI-1640培养基，胎牛血清购自Gibco公司； pGL3-Basic Vector、pRL-TK Vector及Luciferase双荧光素酶报告基因试剂盒购自Promega公司；pZsGreen1-1 Vector购自clontech公司；BCA蛋白定量试剂盒，RIPA蛋白裂解液购自碧云天公司；pMD 18-T Vector购自Takara公司；lipofectamine 2000购自invitrogen公司；抗生素G418购自Sigma公司；荧光素酶底物D-Luciferin购自Biotium公司。
3. 细胞培养 人PCa细胞株LNCaP较难培养，选用Croning公司的培养瓶和培养板，采用RPMI-1640培养基加10%胎牛血清，加常规青霉素、链霉素双抗，置于5% CO2、37℃恒温培养箱常规培养。
4. 获取PSA启动子序列 收集前列腺癌细胞株LNCaP，采用浓盐法提取基因组DNA，经OD260定量后，以基因组DNA为模板，PCR扩增PSA启动子序列。根据Genbank提供的人类PSA基因序列（Gene ID：NC_000019.10）设计引物。上、下游引物序列为：Forward Primer：5’-CACATTGTTTGCTGCACGTTG-3’，Reverse Primer：5’-AGCTTGGGGCTGGGGAGCC-3’， PCR扩增产物长度为655bps。
5. 构建PSA荧光素酶报告基因质粒 将PCR产物连接至pMD 18-T载体，测序获得重组子并命名为pMD 18-PSA。SacI和HindIII双酶切 pZsGreen1-1载体及pMD 18-PSA载体，分别回收pZsGreen1-1线性骨架和PSA启动子片段，T4 DNA连接酶将两者连接，构建携带PSA启动子的真核表达载体，命名为pPSA-ZsGreen。设计两端分别带BamH1和NotI酶切位点引物，从pGL3-Basic Vector克隆Firefly Luciferase（FL-Luc）基因全长，利用BamH1和NotI双酶切FL-Luc片段和pPSA-ZsGreen载体，T4 DNA连接酶将pPSA-ZsGreen显性骨架和FL-Luc片段连接，构建由PSA启动的荧光酶素真核表达质粒，命名为pPSA-FL-Luc，经大量扩增后定量备用。
6. PSA荧光素酶报告基因质粒检测：取人胚肾293T细胞株，常规培养计数后铺12孔板，使转染前细胞密度达50%，采用lipofectamine 2000共转染pPSA-FL-Luc质粒和pRL-TK质粒至293T细胞，24hr后采用浓度分别为0.1、1.0、10、50及100nmol/L双氢睾酮（DHT）处理293T细胞48hr，收集细胞总蛋白，采用双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光表达情况。
7. 细胞转染及筛选 前列腺癌细胞株LNCaP铺24孔板，采用400、600、800、1000和1200（单位ug/ml）5个G418浓度筛选，以10-14天内LNCaP细胞全部死亡的最低浓度为最佳G418浓度。采用lipofectamine 2000转染pPSA-FL-Luc表达质粒至LNCaP细胞株，转染24hr后换含有G418的培养液，每隔3天换液，约2周后挑选单细胞克隆至96孔板中做荧光素酶活性检测，阳性细胞继续采用含G418的培养液培养，最终获得稳定表达荧光素酶基因的前列腺癌LNCaP/Luc/PSA稳定细胞系。
8. 构建前列腺癌动物模型 LNCaP/Luc/PSA稳定细胞株常规培养，取2×106对数生长期细胞注射SCID鼠背部靠近腋窝处。观察8周，等待背部长出肿瘤后将肿瘤取出，剪成1mm×1mm×1mm组织块，冰上放置备用。另准备SCID小鼠，乙醚麻醉，下腹部切开约0.8cm切口，牵开膀胱和精囊，可见前列腺背侧叶，将背侧叶被膜剪开1mm，将LNCaP肿瘤组织块放入被膜下，7-0可吸收线缝合2~3针将种植组织包埋固定。操作中防止损伤膀胱和输尿管，以免影响实验结果。
9. 观察激素敏感性前列腺癌动物模型对去势治疗的反应 肿瘤原位模型建立后，从第6周起，每隔1周腹腔注射荧光素底物，放入活体荧光显像系统观察SCID鼠体内荧光发光部位及强度。将荧光显像已经证实前列腺癌SCID鼠行睾丸去势切除，通过整体荧光成像系统在1、3及5周观察全身肿瘤生长和转移的变化，并观察与未去势组相比去势小鼠的改变情况。
结果如下：
1. 获取PSA启动子序列
以前列腺癌LNCaP细胞株基因组DNA为模板，通过PCR扩增PSA启动子序列，从图1中可以看出，PSA的PCR产物大小片段长度介于500bps与750bps之间，初步证实得到目的条带，大小为655bps。
2. 构建PSA荧光素酶报告基因质粒
首先我们将PSA的PCR产物连接至TA克隆载体pMD 18-T上，经测序验证了PSA的启动子序列的正确性，并将PSA启动子序列连接至pZsGreen1-1载体上（参见图2A）。接下来我们以pGL3-Basic Vector为模板，通过PCR 扩增Firefly Luciferase（FL-Luc）基因全长（1653bps），酶切后将携带PSA启动序列的pZsGreen显性骨架和FL-Luc片段连接，构建由PSA启动的荧光酶素真核表达质粒，命名为pPSA-FL-Luc（参见图2B）。
3. PSA荧光素酶报告基因质粒功能鉴定
采用293T细胞株，铺12孔板使转染前细胞密度达50%左右，采用lipofectamine 2000共转染pPSA-FL-Luc质粒和pRL-TK质粒海肾荧光素酶内对照质粒至293T细胞，24hr后采用浓度分别为0.1、1.0、10、50及100nmol/L双氢睾酮（DHT）处理293T细胞，48hr后收集细胞总蛋白，以0.1 nmol/L的DHT荧光强度为对照，双荧光素酶报告基因试剂盒检测不同浓度DHT处理后的荧光强度情况。结果显示，随着DHT浓度的增加，luciferase荧光报告基因活性逐步增强，证明构建的pPSA-FL-Luc报告基因质粒具有正常的功能（参见图3）。
4. 前列腺癌LNCaP/Luc/PSA稳定细胞系的筛选
将pPSA-FL-Luc报告质粒转染入前列腺癌LNCaP细胞株，G418筛选2周后挑取单细胞克隆转移至96板中，添加荧光素底物显色，可见所挑取的细胞发出较强荧光（参见图4）。选取发光强度高的细胞继续培养，同时加G418维持压力，经多次传代后，冻存再复苏培养，LNCaP细胞株仍能稳定表达荧光素酶基因。
5. 激素敏感性前列腺癌动物模型对去势治疗的反应
在肿瘤原位模型小鼠建立后第6周起，于模型小鼠的腹腔每隔1周注射荧光素酶底物，通过活体荧光显像系统观察，可看到模型小鼠前列腺部位出现荧光，为移植的肿瘤组织包块（图5A）。之后，我们将前列腺癌SCID模型小鼠行睾丸去势切除，通过整体荧光成像系统，在去势切除后第1、3及5周观察模型小鼠全身肿瘤生长和转移的变化情况发现，与未去势模型小鼠相比，去势切除后第3周起，肿瘤包块的增长明显受到抑制（图5B）。
Claims (2)
1.一种PSA启动子介导荧光素酶基因表达的质粒，其特征在于，该质粒由pPSA-ZsGreen显性骨架和荧光素酶Firefly Luciferase基因片段连接而成。
2.根据权利要求1所述的质粒转染前列腺癌细胞后应用于前列腺癌动物模型的建立。
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| CN105861550A (zh) * | 2016-04-19 | 2016-08-17 | 湖南中医药大学 | 抗滤过道瘢痕化的药物高通量筛选体系及其构建方法 |
| CN113711991A (zh) * | 2020-11-02 | 2021-11-30 | 江门赛尔康生物科技有限公司 | 一种以pap为靶点的药物筛选动物模型的构建方法和应用 |
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Non-Patent Citations (1)
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