CN105671082B - 一种表达外泌体标记物的慢病毒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达外泌体标记物的慢病毒载体，其是在pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑Puro的多克隆位点XbaI和NotI区域分别引入带SBP标签的CD63和CD9基因，同时在引入的CD63和CD9基因后面添加荧光能力极强的绿色荧光蛋白基因ZsGreen1，构建pCDH‑CMV‑CD63‑SBP‑ZsGreen1‑EF1‑Puro和pCDH‑CMV‑CD9‑SBP‑ZsGreen1‑EF1‑Puro重组慢病毒载体。本发明表达外泌体标记物的慢病毒载体具以下优势：成熟速度更快的荧光蛋白基因ZsGreen1具有更强的荧光效果便于即时观察，表达的外泌体携带SBP标签，可实现外泌体观察和纯化一体化。

Description

一种表达外泌体标记物的慢病毒载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及构建慢病毒表达的外泌体标记质粒及其应用。
背景技术
外泌体是细胞来源的小泡，存在于生物的体液中和细胞培养的培养基中，其直径在30nm到100nm之间。外泌体又被称为
Microvesicles,epididimosomes,argosomes,exosome-likevesicles,microparticles,promininosomes,prostasomes,dexosomes,texosomes,dex,tex,archeosomesandoncosomes。外泌体的形成途径有两个：其一，细胞内的泡体和细胞膜融合形成；其二，直接由细胞膜形成。(维基百科)。外泌体包含各种来源于细胞的成分，诸如蛋白质，RNA，双链DNA，脂肪，代谢分子。但不同的外泌体含有相同的组分。外泌体可通过和其他细胞膜的融合进而内吞来发挥作用，Rabs在细胞内吞途径和外泌体的形成中发挥重要作用。越来越多的研究发现外泌体在生物体正常生理状态下发挥重要作用；也参与各种疾病过程，可用于疾病的诊断，治疗和预后。在正常生理状态下，外泌体介导先天免疫反应和适应性免疫反应；病毒感染中，许多病毒(诸如HIV，HCMV，HSV1，HHV-6，ANDV，SeV，RSV，IAV)可以和外泌体相关蛋白发挥作用，影响Rabs来调节外泌体的形成进而帮助病毒自身复制，传播和修饰免疫。在白血病等癌症中，癌细胞分泌的外泌体通过和其他细胞相互融合，维持癌细胞的微环境，增加细胞的增值能力、运动能力、侵染特性和抗药性；而癌细胞的微环境在癌症的维持和发展中发挥重要作用，癌症来 源的外泌体通过以下途径维持肿瘤的微环境：帮助肿瘤细胞逃脱免疫系统和帮助起始免疫反应，促进纤维母细胞和间充质细胞分化为肌成纤维细胞，引起血管形成，促进肿瘤转移。在胃癌的发展过程中外泌体也发挥重要作用1。癌细胞分泌的外泌体可到达体液中，通过检测这些外泌体可帮助癌症的早期诊断。可以通过阻断癌细胞产生外泌体和外泌体-免疫系统，外泌体-其他细胞的相互作用来抑制外泌体介导的肿瘤转移；树突状细胞来源的外泌体可以显著刺激免疫系统的特性，进而攻击肿瘤细胞，抑制肿瘤生长、转移和进展3。由于外泌体是由膜包被的小泡，而且可以和细胞融合，进而可以作为药物载体。通过外泌体来呈递寄生虫的miRNAs给宿主细胞在严重免疫反应的治疗中具有很大潜力。在创伤性脑损伤中，外泌体可以作为实时诊断以及疾病进展的指标。可以通过外泌体来传递核酸形成以外泌体为基础的基因治疗。外泌体在疾病的诊断中十分方便，甚至可以用唾液来作为样品。通过外泌体给药还有一个很大的优势就是可以通过血脑屏障，解决了传统给药方式不容易透过血脑屏障，对于治疗脑部疾病具有重要价值。
病毒载体作为传递物质的一种工具，其在科学研究中具有诸多优点，比如：更容易传递DNA进入哺乳动物细胞、容易克隆和修饰。其中的慢病毒载体不仅可以整合进入分裂细胞的基因组，也可以整合入不分裂的细胞的基因组。
在科学研究中，为实时观察生物内的状态常常使用一些荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)。荧光蛋白的发现和使用极大促进了科学研究。但这些荧光蛋白由于其亮度较弱而在一定程度上阻碍了研究进展。
发明内容
本发明的一个目的是提供表达外泌体标记物的慢病毒载体：pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF 1-Puro，pCDH-CMV-CD9-SBP--ZsGreen1-EF1-Puro。
本发明采用如下方案：一种表达外泌体标记物的慢病毒载体，是以慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro为出发载体进行改进，所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体是在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的多克隆位点区域分别引入带SBP标签的CD63基因和CD9基因，同时在引入的CD63基因和CD9基因后面添加绿色荧光蛋白基因ZsGreen1。
在上述技术方案中，所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体为将慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的XbaI和NotI酶切位点之间分别包含CD63-SBP-ZsGreen1和CD9-SBP-ZsGreen片段的慢病毒载体。
本发明的另一目的是，提供一种上述表达外泌体标记物的慢病毒载体构建方法，按如下的步骤进行：
1)根据GeneBank中人CD63、CD9的mRNA上CDS序列、SBP标签序列、ZsGreen1标签蛋白，设计XbaI-CD63-SBP-ZsGreen1-NotI和XbaI-CD9-SBP-ZsGreen1-NotI两个DNA片段，送于上海Invitrogen公司合成双链DNA分子；
2)分别用限制性内切酶XbaI和NotI酶切步骤1合成的双链DNA分子，酶切体系：XbaI:1μL，NotI:1μL，缓冲液:3μL，合成的DNA序列:1μg，补充去离子水至30μL、37℃酶切4小时，回收酶切产物；
3)用限制性内切酶XbaI和NotI酶切出发载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，酶切体系：XbaI:1μL，NotI:1μL，缓冲液:3μL，pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒:1ug，补充去离子水至30μL、37℃酶切4小时，回收载体骨架；
4)将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，连接体系：T4DNA连接酶:1μL，缓冲液:1μL，回收的合成DNA序列:20ng，回收的质粒:10ng。16℃连接过夜后，转化大肠杆菌，筛选阳性菌并提取其质粒，得到重组载体pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro。
上述外泌体标记物慢病毒载体，CD63-SBP-ZsGreen1片段的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示；CD9-SBP-ZsGreen1片段的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示；
本发明同时提供一种上述的外泌体标记物慢病毒载体在生物技术领域中的应用。
上述外泌体标记物慢病毒载体在生物技术领域中的应用，利用上述的表达外泌体标记物的慢病毒载体在细胞感染和细胞系构建上的应用。
上述外泌体标记物慢病毒载体在生物技术领域中的应用，利用上述的表达外泌体标记物的慢病毒载体在CD63和CD9外泌体SBP亲和纯化上的应用。
本发明提供的质粒将绿色荧光基因Zsgreen克隆进细胞上，这些表达出来的荧光蛋白就会随着外泌体分泌出来，让载体表达的外泌体CD63、CD9带上绿色荧光，完美实现外泌体实时观察研究活体外泌体的变化，可用于研究外泌体的生物学功能以及其在医学诊断、治疗、预后和给药方式上的参考价值。
为构建上述质粒本发明在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上将合成的NheI-CD63-SBP-ZsGreen1-NotI、NheI-CD9-SBP-ZsGreen1-NotI插入到多克隆位点MCS处。
本发明采用的ZsGreen1基因所表达的荧光蛋白，比GFP荧光效果更强，同时设计了SBP位点使用链霉素亲和纯化。因为依据形态学，生物化学及不同细胞源的外泌体是有区别的，这些不同的理化性质有利于外泌体的提取所有在提取外泌体的过程中，本发明解决了现有技术汇总常常会遇到很多不便的地方和不能实时了解所提取的外泌体的质量和纯度的技术问题，本发明通过引入SBP位点外泌体经链酶亲和素纯化的技术方案，得到更纯的外泌体，纯化的外泌体作用于Western blot分析，RNA表达分析以及作为基因运载工具。
本发明构建的质粒：pCDH-CMV-CD63/CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro。不同之处：本发明采用的是ZsGreen1(绿色荧光蛋白)，比GFP荧光效果更强，还设计了SBP位点可以进行亲和纯化,能更好的观察活细胞，对于即时观察外泌体作为药物载体有重要的应用。通过不断的对外泌体作用的研究，本发明发现在各种疾病的诊断、治疗、预后，以及作为药物载体等将发挥越来越重要的作用，本发明的外泌体将作为“自然的纳米颗粒”进入临床，发挥其无可替代的作用。
本发明的表达外泌体标记物的慢病毒载体较常用的慢病毒载体具有更多优势：成熟速度更快的荧光蛋白基因ZsGreen1具有更强的荧光效果便于即时观察，表达的外泌体携带SBP标签，可以完美实现外泌体观察和纯化一体化。本发明的载体在于研究外泌体的生物学功能以及其在医学诊断、治疗、预后和给药方式上的参考价值上有良好的实用价值和应用前景。
附图说明
图1为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体结构示意图。
图2为pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro载体结构示意图。
其中图2A是pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro载体结构示意图，
图2B是pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro载体结构示意图，
图3为CD63、CD9外泌体标记物慢病毒载体荧光转染检测图。
其中图3A是pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro荧光转染检测图，
图3B是pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro荧光转染检测图，
图4为CD63、CD9外泌体过表达验证电泳图，1和3为CD63，2和4为CD9的Westernblot结果。
具体实施方式
本发明实施例中，所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。
实施例1：
pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro载体的构建：
在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的基础之上构建pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro载体。
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体有CMV启动子，多克隆位点MCS，选择性的标记Puromycin，一个氨苄青霉素抗性基因等，形成7.4kb的DNA片段。在CMV启动子和Puromycin之间的多克隆位点处加上CD63-SBP-ZsGreen1序列，构建载体pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro。
载体具体构建过程为：
1、根据GeneBank中人CD63的mRNA上CDS序列、SBP标签序列、ZsGreen1标签蛋白序列的基因信息，设计XbaI-CD63-SBP-ZsGreen1-NotI基因DNA片段，送于上海invitrogen公司合成。
2、分别用限制性内切酶XbaI和NotI酶切步骤1合成的双链DNA分子(上海invitrogen公司合成)，酶切体系：Xba I:1μL，Not I:1μL，缓冲液:3μL，合成的DNA:1μg，补充水至30ul。37℃酶切4小时，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶XbaI和NotI酶切出发载体 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(AppliedBiosystems美国应用生物系统中国公司)，酶切体系：Xba I:1μL，Not I:1μL，缓冲液:3μL，pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒:1μg，补充水至30μL。37℃酶切4小时，回收载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，连接体系：T4DNA连接酶:1μL，缓冲液:1μL，回收的合成DNA:20ng，回收的质粒:10ng。16℃连接过夜后，转化进大肠杆菌，筛选阳性菌并提取其质粒，得到重组质粒pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro。重组质粒pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro的结构示意图见图2.根据测序结果，对重组质粒pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro测序结果描述如下：在载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的XbaI和NotI酶切位点之间插入序列表1的DNA分子。
实施例2：
pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro载体的构建：
在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的基础之上构建pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro载体。
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体有CMV启动子，多克隆位点MCS，选择性的标记Puromycin，一个氨苄青霉素抗性基因等，形成7.4kb的DNA片段。在CMV启动子和Puromycin之间的多克隆位点处加上CD9-SBP-ZsGreen1序列，构建载体pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro。
载体具体构建过程为：
1、根据GeneBank中人CD9的mRNA上CDS序列、SBP标签序列、ZsGreen1标签蛋白序列的基因信息，设计XbaI-CD9-SBP-ZsGreen1-NotI的DNA片段，送于上海invitrogen公司合成。
2、分别用限制性内切酶XbaI和NotI酶切步骤1合成的双链 DNA分子(上海invitrogen公司合成)，酶切体系：Xba I:1μL，Not I:1μL，缓冲液:3μL，合成的DNA:1ug，补充水至30ul。37℃酶切4小时，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶XbaI和NotI酶切出发载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(AppliedBiosystems美国应用生物系统中国公司)，酶切体系：Xba I:1μL，Not I:1μL，缓冲液:3μL，pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒:1μg，补充水至30μL。37℃酶切4小时，回收载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，连接体系：T4DNA连接酶:1μL，缓冲液:1μL，回收的合成DNA:20ng，回收的质粒:10ng。16℃连接过夜后，转化进大肠杆菌，筛选阳性菌并提取其质粒，得到重组质粒pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro。重组质粒pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro的结构示意图见图2.根据测序结果，对重组质粒pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro测序结果描述如下：在载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的XbaI和NotI酶切位点之间插入序列表2的DNA分子。
实施例3：
pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro载体在细胞感染和细胞系的构建上的应用
1、瞬时转染
(1)细胞：从液氮中取出冷冻保存的HEK 293T细胞，迅速放在37℃水浴锅内溶解，然后离心收集细胞，用培养基稀释后培养在多聚赖氨酸包被的细胞培养皿中。当密度达到60％-70％时，可用于后续的转染实验。
(2)转染：将不含有内毒素的30–40μg DNA(pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro或 pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro载体：15μg，pLP-1:10μg，pLP-2：10μg，pLP-VSVG：5μg)转染到上述细胞内。向培养的细胞中加入DNA-钙磷酸盐混合物，培养8-12小时之后更换培养基，继续培养60小时之后，收集细胞培养液，4000g离心5分钟，收集上清，用0.45-micro的滤膜过滤。50000g超速离心2小时，弃去上清，用PBS重悬沉淀；重复一次，然后将病毒保存于-80℃。
(3)Real-time定量PCR法检测滴度检测
第1天，HEK 293T细胞按1×105/孔接种于24孔板中。第2天，转染时，将保存于-80℃冰箱中病毒液37℃水浴融解，用含有体积分数5％胎牛血清FBS的细胞培养基进行10倍梯度稀释，从10-1稀释到10-10。从对应的培养孔吸弃90μl培养液并加入经倍数稀释的病毒液,于CO2培养箱孵育48小时,加入完全培养基500μl。4天后，根据Invitrogen公司的TRIZOL操作说明书进行RNA抽提，RNA逆转录后获得cDNA，最后在Bio-Rad的iQ5上进行Real-time定量PCR法检测，获得较高滴度的病毒为3X106TU/ml。
(4)病毒检测：
293T细胞以浓度2×105cells/m L接种于24孔板中，每孔加500μL含10％FCS的DMEM培养液培养过夜。测时将4μL病毒液加到500μL含2％FCS的DMEM培养液中混合均匀，然后换掉原有的培养液，培养过夜后在换回10％FCS的DMEM培养液培养，72h观察绿色荧光蛋白表达情况，结果如图3所示，表明新构建的pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro载体和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro载体均可以用于外泌体标记物荧光检测，并获得了较强的绿色荧光和红色荧光检测效果图，同时也说明构建的载体可以高效启动外泌体基因CD63、CD9和高效荧光基因ZsGreen1的表达。
2、稳定转染
(1)细胞：从液氮中取出冷冻保存的HEK 293T细胞，迅速放在37℃水浴锅内溶解，然后离心收集细胞，用培养基稀释后培养在多聚赖氨酸包被的细胞培养皿中。当密度达到60％-70％时，可用于后续的转染实验。
(2)转染：将不含有内毒素的30–40μg DNA(pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro或pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro：15μg，pLP-1:10μg，pLP-2：10μg，pLP-VSVG：5μg)转染到上述细胞内。转染方法可采用：电穿孔转染，脂质体转染。
脂质体转染：转染前一天将HEK 393T细胞培养长至90％汇合时,取四种质粒各1μg，脂质体的量为质粒的2.5倍，共转染至293T细胞，培养8-12小时之后更换培养基。弃去培养液，用PBS冲洗，然后蛋白酶消化为单个细胞。按每孔200μL的量将消化后的细胞转移至96孔板中。24h后，加入抗性浓度的完全培养液筛选。大约两周后，开始有细胞克隆长出，待其长至96孔板的60％时，转移至24孔板。之后将细胞分成两份，其中一份用于阳性克隆的检测，得到的阳性克隆继续扩大培养至培养瓶中，并冻存在-80℃留作备用。
电穿孔转染：转染前一天将HEK 393T细胞培养长至90％汇合时，用PBS冲洗，加入蛋白酶消化为单细胞，离心，收集沉淀，用PBS洗沉淀，然后将细胞重悬于DMEM中，使终浓度为0.5-2×107个细胞/ml。细胞悬液和质粒混合后放于电击杯中，冰浴10min，电转，在室温下放置10min后,用完全培养基稀释细胞并转入4个96孔板中。24h后,加入抗性浓度的抗生素完全培养液筛选。大约两周后,开始有细胞克隆长出，待其长至孔板的60％时，扩增至24孔板。之后将细胞分成两份，其中一份用于阳性克隆的检测，经检测为阳性的细胞克隆继续扩人培养至培养瓶中，并冻存在-80℃留作备用，说明构建的表达外泌体标记物的慢病毒载体可有效用于细胞感染和细胞系的构建。
实施例4：
SBP亲和纯化
(1)将构建的载体pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro分别转染入细胞，经过一段时间的培养，收集细胞并裂解。
(2)向79mg净重的细胞中加入1ml链霉亲和素结合缓冲液。
(3)将上述样品加入固定相为链霉亲和素的柱子中，4度放置30分钟。
(4)用40ml的链霉亲和素结合缓冲液洗脱柱子。
(5)用2ml含有2mM生物素的链霉亲和素结合缓冲液洗脱柱子10分钟，并重复两次，收集洗脱液，获得高纯度外泌体，取收集液直接用于Western Blot分析检测结果如图4所示，表明外泌体具有明显的过表达效果。
本申请中涉及的核苷酸或氨基酸序列表如下：
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Figure DEST_PATH_GDA0000951414530000121
Figure DEST_PATH_GDA0000951414530000131
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Figure DEST_PATH_GDA0000951414530000161
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (6)

1.一种表达外泌体标记物的慢病毒载体，是以慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro为出发载体进行改进，其特征在于，所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体是在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的多克隆位点区域分别引入带SBP标签的CD63基因和CD9基因，同时在引入的CD63和CD9基因后面添加荧光能力强的绿色荧光蛋白ZsGreen1基因，所述的CD63-SBP-ZsGreen1片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述的CD9-SBP-ZsGreen1片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体，其特征在于所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体为将慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的XbaI和NotI酶切位点之间分别包含CD63-SBP-ZsGreen1和CD9-SBP-ZsGreen片段的慢病毒载体。
3.如权利要求2所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1)根据GeneBank中人CD63、CD9的mRNA上CDS序列、SBP标签序列、ZsGreen1标签蛋白，设计XbaI-CD63-SBP-ZsGreen1-NotI和XbaI-CD9-SBP-ZsGreen1-NotI两个DNA片段，送于上海Invitrogen公司合成；
2)分别用限制性内切酶XbaI和NotI酶切步骤1合成的双链DNA分子，酶切体系：XbaI:1μL，NotI:1μL，缓冲液:3μL，合成的DNA序列:1μg，补充无菌水至30μL， 37℃酶切4小时，回收酶切产物；
3)用限制性内切酶XbaI和NotI酶切出发载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，酶切体系：XbaI:1μL，NotI:1μL，缓冲液:3μL，pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒:1ug，补充无菌水至30μL，37℃酶切4小时，回收载体骨架；
4)将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，连接体系：T4DNA连接酶:1μL，缓冲液:1μL，回收的合成DNA序列:20ng，回收的质粒:10ng； 16℃连接过夜后，转化大肠杆菌，筛选阳性菌并提取其质粒，得到重组载体pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro。
4.权利要求1所述的外泌体标记物慢病毒载体在生物技术领域中的应用。
5.根据权利要求4所述的外泌体标记物慢病毒载体在生物技术领域中的应用，其特征在于：利用权利要求1所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体在细胞感染和细胞系构建上的应用。
6.根据权利要求4所述的外泌体标记物慢病毒载体在生物技术领域中的应用，其特征在于：利用权利要求1所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体在CD63和CD9外泌体SBP亲和纯化上的应用。
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