CN110804621A - 一种内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法 - Google Patents

一种内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法。制备外囊泡时，具体包括：设计引物及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选和鉴定、重组载体的自连、连接目的miRNA、诱导目的miRNA表达和提取Evs等步骤。本申请以Lys‑tRNA的序列和pET‑31b(+)载体序列为基础，以特定miRNA为例，通过利用tRNA、rRNA的支架保护作用，重组构建了相关表达载体。初步实验结果表明，改造细菌较好实现了内源性、高效、大量表达功能性的miRNA的目的，同时较好实现了包含有miRNA的大肠杆菌Evs的高效收集，较好实现了以Evs作为miRNA载体的技术目标。

Description

一种内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法
技术领域
本申请属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法。
背景技术
细菌胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是细菌在生长过程中自发产生的一种纳米尺寸的球形磷脂双分子层蛋白。EVs的尺寸一般在20~300nm之间，其中包含有脂多糖（LPS）、蛋白质、脂质、DNA、RNA、毒力因子等物质。由于细菌分为革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两大类，其中革兰氏阳性细菌是单独的细胞壁结构，其胞外囊泡被称为EVs；而革兰氏阴性细菌有两层膜，外膜跟内膜，而革兰氏阴性细菌的EVs起源于外膜，因此也叫作（outer membrane vesicles，OMVs）。
由于细菌胞外囊泡的形成过程的特殊性，部分应用研究研究表明，利用细菌纳米胞外囊泡载药时，表现出较好的：获取成本低、容易通过基因工程的技术进行改造、磷脂双分子层的结构十分稳定、可以通过发酵的技术大量获得、可以穿过多重生理屏障等优点，因此以细菌胞外囊泡（EVs）作为药物递送系统的载体受到了越来越多研究和重视。
miRNA又称MicroRNA，是真核生物体内的一段非常短的内源性的非编码单链RNA分子，大小约为20-25个核苷酸。miRNA通过与mRNA的3’端非翻译区配对结合抑制mRNA翻译成蛋白质，或者诱导mRNA降解，从而在转录后调节很多基因的表达，参与生物体细胞增殖分化等多个重要的生物过程，是真核生物基因表达的重要调控者。当miRNA的靶基因是致癌基因或抑癌基因时，miRNA的表达可影响肿瘤细胞的生长和增殖，从而影响肿瘤的发生发展，越来越多的研究表明miRNA可以影响癌症的进程。但实际应用中，受限于miRNA的合成成本及生物体内分布、和吸收利用等特点，其应用前景尚不够明朗。
基于上述缺陷，发明人认为，如果能够在细菌细胞内部进行高效的内源性高表达miRNA，同时利用细菌胞外囊泡的低成本载药特点，则对于相关疾病的治疗和预防是具有十分重要的技术意义的。
发明内容
以部分特定miRNA为例，本申请目的在于提供一种将内源性高表达miRNA与大肠杆菌胞外囊泡进行技术结合的方法，从而为相关疾病的治疗和预防提供一定技术参考。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法，具体包括如下步骤：
（一）设计引物及PCR扩增
以Lys-tRNA的序列和pET-31b(+)载体序列为基础，设计PCR扩增用引物序列如下：
pET-31b(+)-F：
5’- AACTCGAGCATATGAATTCATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATT-3’，
pET-31b(+)-R：5’- TTCTCGAGGATCC GCAATAACTAGCATAACCCCTTG-3’；
tRNA-F：5’- TTGAATTCTGGCTGGGGTACCTGGATTCGAACCAG-3’，
tRNA-R：5’- AAGGATCCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTC-3’；
所述Lys-tRNA序列（85bp，如SEQ ID NO.1所示）为：GAATTCGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGCGGCCGCGGCCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCAAAGCTT
PCR扩增时，以大肠杆菌DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增完成后，提取备用；
（二）酶切、连接
利用EcoR 1、BamH 1限制性内切酶分别对步骤（一）中所回收PCR扩增产物（即pET-31b(+)载体和tRNA）进行双酶切，回收酶切片段后使用T4 DNA连接酶进行连接；
（三）转化、筛选和鉴定
将步骤（二）中的连接产物转化DH5a感受态细胞，并进行抗性筛选、菌落PCR鉴定和测序鉴定；
（四）重组载体的自连
对步骤（三）中测序正确的质粒，采用Xho I限制性内切酶酶切（37℃酶切过夜），回收酶切片段后，再利用T4 DNA连接酶进行连接（4℃连接过夜），然后再将连接产物转化DH5a感受态细胞，并进行菌落PCR鉴定，并将鉴定正确的阳性克隆接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中进行培养（37℃、220rpm过夜培养），此即为含有pET-31b(+)-tRNA载体的转化细菌，收集细菌并且保存菌种于40%的甘油中；或者直接提取质粒应用、或者将质粒-20℃保存；
需要解释的是，此操作步骤构建自连载体的目的，是为了后续使用该自连载体构建其他连接miRNA的载体，如果不构建该自连载体，后续在构建连接miRNA的重组载体时，需要再次进行上述（一）、（二）、（三）的操作，从而增加操作的复杂度；
（五）针对目的miRNA，设计引物并进行PCR扩增
所述目的miRNA，以miR-34a、miR-124、miR-126为例，具体PCR扩增时引物序列设计为：
miR-34a-F：5’-AACTCGAGGCCAGCTGTGAGTGTTTCTTTGGC-3’，
miR-34a-R：5’-AACATATGGGCCCCACAACGTGCAGCAC-3’；
miR-124-F：5’-AACTCGAGGTCTGCAGAAACCGTCGAACGA-3’，
miR-124-R：5’-AACATATGCATTCCGATCCTTACAAC-3’；
miR-126-F：5’-AACTCGAGCGCTGGCGACGGGACATTATTA-3’，
miR-126-R：5’-AACATATGTGCCGTGGACGGCGCATTA-3’；
然后以人基因组DNA为模板，分别利用上述引物对进行PCR扩增，电泳检测PCR扩增产物，并回收、纯化扩增产物获得；
（六）酶切、连接
利用Xho I、Nde I限制性内切酶，对步骤（四）中最终重新自连的pET-31b(+)-tRNA载体进行双酶切（37℃双酶切过夜），同时对步骤（五）中目的miRNA产物分别进行双酶切（37℃双酶切过夜），分别回收目的片段，并利用T4 DNA重新进行连接；
（七）转化、诱导目的miRNA表达和提取EVs
将步骤（六）中的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态细胞，利用IPTG作为诱导剂来诱导重组载体表达miRNA，诱导表达完成后，提取EVs，经过鉴定，所提取的EVs中包含有内源性表达的miRNA。
现有技术中，即使不考虑miRNA合成成本，在将外源性的将小RNA导入细菌Evs时，虽然有电穿孔法，诱导法等可以进行操作，但是这些方法都存在操作复杂、处理过程繁琐、依靠昂贵的仪器设备等弊端，因此进一步限定了Evs在作为miRNA载体中的应用。本申请中，为使人源miRNA能够在大肠杆菌中高效表达，同时为避免所表达RNA的降解，发明人以特定miRNA（miR-34a、miR-124、miR-126）为例，通过利用tRNA、rRNA的支架保护作用，结合相关基因工程技术，重组构建了相关表达载体。初步实验结果表明，改造细菌较好实现了内源性、高效、大量表达功能性的miRNA的目的，同时较好实现了包含有miRNA的大肠杆菌Evs的高效收集，也即，较好实现了以Evs作为miRNA载体的技术目标，进而可为相关疾病的预防或治疗奠定良好的技术基础。
附图说明
图1为大肠杆菌EVs粒径分析；
图2为大肠杆菌EVs投射电镜图；
图3为菌液与EVs中tRNA表达量情况；
图4为miR-34a在菌体以及EVs中的表达量；
图5为miR-124在菌体以及EVs中的表达量；
图6为miR-126在菌体以及EVs中的表达量；
图7为EVs侵染MBA-MD-231细胞；
图8 为EVs侵染A549细胞；
图9 为EVs侵染H22细胞；
图10为MBA-MD-231细胞增殖曲线；
图11为 MBA-MD-231细胞增殖曲线；
图12为 H22细胞增殖曲线；
图13为MBA-MD-231细胞中的tRNA和pei-miR-126的变化量；
图14为A549细胞中的tRNA和pei-miR-124的变化量；
图15 为H22细胞中的tRNA和pei-miR-34a的变化量；
图16为MBA-MD-231细胞中的成熟的miR-126的变化量；
图17为A549细胞中的成熟的miR-124的变化量；
图18为H22细胞中的成熟的miR-34a的变化量；
图19为AS1411-EVs和DZ-AS1411-EVs对杀伤效果对比；
图20为不同组之间荷瘤肿瘤体积的变化；
图21为内膜囊泡与外膜囊泡内源性装载RNA的量比较；
图22为内膜囊泡载药与外膜囊泡载药杀伤癌细胞的效果比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
实验仪器：
纳米颗粒跟踪分析仪，德国，ZetaView；
透射电子显微镜，日立，T7700；
PCR仪D-8707，TAKARA BIO INC；
荧光定量PCR仪，Roche,Light Cycle96；
倒置荧光显微镜，OLYMPUS， CX31；
激光共聚焦显微镜，OLYMPUS，FV1000；
实验试剂：
氨苄青霉素、BCA蛋白浓度测定试剂盒、DNA marker、PCR高保真酶mix、1640培养基、胰酶、BL21感受态细胞、K12大肠杆菌菌株，北京索莱宝公司产品；
质粒小提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光量PCR试剂盒，郑州贝贝生物科技有限公司产品；
细胞膜绿色荧光探针，碧云天公司产品；
胎牛血清，Gibco公司产品；
A549细胞（腺癌细胞）、MBA-MD-231细胞（人乳腺癌细胞）、H22细胞（肝癌细胞），普诺赛公司；
CCK8试剂盒,日本同仁；
Hind III、Sal I、EcoR I、BamH I限制性内切酶、T4 DNA连接酶，北京NEB公司产品；
LB培养基、完全培养基（90ml 1640培养基中加入10ml胎牛血清）、PBS（pH=7.4）、氨苄青霉素（100mg/ml）母液、1mol/L IPTG、1×TAE、40%甘油等，常规配置备用。
大肠杆菌EVs的提取和鉴定：
就本申请中所涉及的大肠杆菌Evs的提取和鉴定过程简要介绍说明如下：
首先，将LB平板（100mg/ml氨苄青霉素）、37℃ 恒温培养12小时的菌株，接种于LB液体培养基中（100mg/ml氨苄青霉素），37℃、220rmp的条件下震荡培养12小时；
然后，取50ml菌液，l00000g 离心30min，弃沉淀；再用100000g离心60分钟；
最后，用10ml的PBS溶液（pH=7.4）重悬沉淀物，之后再次100000g离心60分钟，最终用1ml的PBS溶液（pH=7.4重悬，即得到大肠杆菌EVs溶液。
对于所制备大肠杆菌Evs的粒径进行分析时，采用纳米颗粒跟踪分析进行检测分析，结果如图1所示，可以看出，所制备大肠杆菌Evs的平均粒径在112.8nm左右。
对于所制备大肠杆菌Evs的形态鉴定，主要通过透射电镜（TME）进行鉴定，结果如图2所示，可以看出，其呈典型的“杯托”状形态。
实施例1
需要说明的是，通过基因工程直接表达RNA时，由于RNA结构不够稳定，如果直接将RNA序列插入到载体中，RNA可能会被随处可见的RNA酶直接降解，从而造成不会在大肠杆菌胞内表达，为解决这一技术问题，需要设计一段支架来保护RNA不被内源性的RNA酶降解。本申请即设计利用特定的“tRNA支架”，从而避免后续表达过程中的降解作用。本实施例即就含有“tRNA支架”的pET-31b(+)-tRNA载体的构建过程简要介绍说明如下。
（一）设计引物及PCR扩增
以大肠杆菌Lys-tRNA的序列和pET-31b(+)载体序列为基础，设计PCR扩增用引物。
Lys-tRNA序列（85bp）为：
GAATTCGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGCGGCCGCGGCCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCAAAGCTT。
具体引物序列设计如下：
pET-31b(+)-F：
5’- AACTCGAGCATATGAATTCATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATT-3’，
pET-31b(+)-R：5’- TTCTCGAGGATCC GCAATAACTAGCATAACCCCTTG-3’；
tRNA-F：5’- TTGAATTCTGGCTGGGGTACCTGGATTCGAACCAG-3’，
tRNA-R：5’- AAGGATCCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTC-3’。
PCR扩增时，以大肠杆菌DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，20 ul扩增体系设计如下：
E.coli DNA（或者人基因组DNA），1ul；
Fow primer，0.5ul；
Rew primer，0.5ul；
2×mix，10ul
ddH2O，8ul；
扩增程序如下：95℃、5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、5min，30个循环，72℃、 7min。
对PCR产物4℃保存备用，或者电泳检测后直接进行提取、纯化。
（二）酶切、连接
利用EcoR 1、BamH 1限制性内切酶分别对步骤（一）中所回收PCR产物（即pET-31b(+)载体和tRNA）进行双酶切，50 ul酶切体系设计如下：
pET-31b(+)（或者tRNA），25ul；
EcoR 1，1ul；
BamH 1，1ul；
10×buffer，5ul；
ddH2O，18ul；
37℃双酶切过夜。
对双酶切后双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳（tRNA插入片段很小，采用2%琼脂糖凝胶电泳，质粒载体采用1%琼脂糖凝胶电泳），然后利用胶回收试剂盒进行回收、纯化。
将回收得到的载体和tRNA目的片段（插入片段）使用T4 DNA连接酶进行连接，15ul连接体系设计如下：
pET-31b(+)载体，4ul；
tRNA片段，7.5ul；
T4连接酶，1ul；
10×buffer，1.5ul；
ddH2O，1ul；
4℃连接过夜。
（三）转化、筛选和鉴定
将步骤（二）中的连接产物转化DH5a感受态细胞，并进行抗性筛选、菌落PCR鉴定和测序鉴定。
转化操作时，具体操作参考如下：
将50ul的DH5a感受态细胞放于冰上2min，待其融化后，将15ul连接产物加入其中，轻轻混匀，冰上放置30min，42℃热激90s，冰上放置2min，加入500ul无抗LB培养基，放置恒温震荡培养箱于37℃、150rpm的条件下培养1h，之后吸取200ul菌液均匀涂到加入抗生素的LB固定培养板上，37℃倒置培养过夜。
菌落PCR鉴定时，挑取转化操作时的阳性单克隆菌落，然后将菌落稀释液加入到PCR管中作为模板，进行PCR反应，PCR反应时，具体用引物如下：
T-1 F：5’-TTGAATTCGCCCGGATAGCTCAGTC-3’，
R：5’-AAGGATCCTGGCGCCCGAACAGG-3’；
具体PCR反应体系及PCR反应过程参考前述内容即可。
对于菌落PCR鉴定正确的阳性克隆，进一步接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、220rpm过夜培养，然后提取质粒并进行测序鉴定，确保片段插入正确。
（四）重组载体的自连
对步骤（三）中测序正确的质粒，采用Xho I限制性内切酶37℃酶切过夜，回收酶切片段后，再利用T4 DNA连接酶4℃连接过夜，然后再将连接产物转化DH5a感受态细胞，并进行菌落PCR鉴定，并将鉴定正确的阳性克隆接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、220rpm过夜培养，此即为含有pET-31b(+)-tRNA载体的转化细菌，收集细菌并且保存菌种于40%的甘油中，同时提取质粒，将质粒保存在-20℃或者立即使用。
相关酶切、连接、PCR鉴定体系及操作参考前述操作即可，具体菌落PCR鉴定时采用如下引物序列：
Z-1 F：5’-AA TCTAGATAATCTGAGGGTCCAGGGTTCAAGTC-3’，
R：5’-AACTCGAGAAAGTCTGATGCTCTACCGACTGAGCTAT-3’。
实施例2
进一步以现有miRNA （miR-126、miR-124、miR-34a）为例，在实施例1所构建的自连重组载体基础上，利用基因工程，重组了相关表达载体，从而可以在大肠杆菌内进行高效内源表达，具体过程简介如下。
（一）引物设计及PCR扩增
针对现有miR-34a、miR-124、miR-126序列，设计PCR扩增用引物序列如下：
miR-34a-F：5’-AACTCGAGGCCAGCTGTGAGTGTTTCTTTGGC-3’，
miR-34a-R：5’-AACATATGGGCCCCACAACGTGCAGCAC-3’；
miR-124-F：5’-AACTCGAGGTCTGCAGAAACCGTCGAACGA-3’，
miR-124-R：5’-AACATATGCATTCCGATCCTTACAAC-3’；
miR-126-F：5’-AACTCGAGCGCTGGCGACGGGACATTATTA-3’，
miR-126-R：5’-AACATATGTGCCGTGGACGGCGCATTA-3’；
然后以人基因组DNA为模板，分别利用上述引物对进行PCR扩增，电泳检测PCR扩增产物，并回收、纯化扩增产物获得，具体操作参考前述内容即可。
（二）酶切、连接
利用Xho I、Nde I限制性内切酶，对实施例1中最终重新自连的pET-31b(+)-tRNA载体进行双酶切（37℃双酶切过夜），同时对步骤（一）中的扩增所得miR-34a、miR-124 、miR-126产物分别进行双酶切（37℃双酶切过夜），分别回收目的片段，并利用T4 DNA重新进行连接，具体操作参考前述操作即可。
（三）转化、诱导鉴定
为检测所构建重组载体是否可以成功内源表达以及EVs中是否含有miRNA，进一步地，发明人将步骤（二）中的连接产物转化了大肠杆菌BL21感受态细胞，而由于前述所构建载体中含有诱导性的T7启动子，因此，发明人以IPTG作为诱导剂来诱导重组载体表达miRNA。具体转化操作参考前述操作即可。
具体诱导过程和表达量检测情况简要介绍如下。
取转化、筛选后，重组正确的含有转化子的1mL菌液，转接于100ml加有氨苄青霉素的LB液体培养基中，加入40ul 1mol/L的IPTG，37℃、220rpm震荡培养，以诱导大肠杆菌表达含有tRNA骨架的miRNA。
在加入IPTG后第1~8小时，每隔一小时，取1ml菌液，提取菌体中的总RNA，并反转录为cDNA，以16sRNA作为内参，进行荧光定量PCR检测（具体操作参考试剂盒说明书或现有技术即可），以检测菌体的菌体细胞内部含有tRNA骨架的miRNA的表达情况。
具体情况如图3所示。从图中可以看出，前六个小时，菌体细胞内的tRNA量随着时间的增加逐渐增多，而从第六小时开始，菌体细胞内的tRNA量开始降低；EVs中tRNA变化量同菌体细胞中tRNA的变化量。
同时，在加入IPTG后第1~8小时，每隔一小时，取10ml菌液，提取大肠杆菌EVs，并进行荧光定量PCR检测，以检测含有tRNA骨架的miRNA在囊泡内含量情况。
由于提取体系略有不同，因此最终将换算成同一单位大小的细菌细胞内部的miRNA表（miR-126、miR-124、miR-34a）达情况与EVs中表达情况进行绘图，分别如图4、图5、图6所示。总体结果表明：在诱导第6小时，胞内和EVs中的含有tRNA骨架的miRNA的表达量最高，在第1-6小时，表达量逐渐升高，第6小时后，表达量逐渐降低。
实施例3
为验证所提取EVs中所包含的miRNA活性情况，发明人进一步提取了大肠杆菌EVs进行细胞侵染实验（空白对照）和细胞增殖实验，同时对miRNA表达量情况进行了检测，并结合其他检测情况进行了动物实验。具体实验情况简要介绍如下。
（一）侵染细胞实验
首先，参考前述操作，提取制备1ml大肠杆菌（未转染原始BL21菌株）EVs；
其次，加入10ul稀释后的细胞膜绿色荧光探针，37℃水浴30min；然后用10ml PBS溶液重悬EVs和染料，之后再次100000g离心60分钟，并用1ml的PBS溶液重悬，即得到染色后的大肠杆菌EVs溶液；
最后，将预先培养好的MBA-MD-231细胞 、A549细胞、H22细胞分别接种到激光共聚焦培养皿中，每个培养皿中接种6×105个细胞；接种完2~3小时后（或者待细胞贴壁后），，每个培养皿中加入200ug上述染色后的EVs，轻轻混匀，将培养皿放入37℃、CO2培养箱中培养，分别在培养24h、48h、72h后，拍摄激光共聚焦图片。
结果如图7、图8、图9所示。可以看出：针对不同细胞株（MBA-MD-231、A549、H22细胞），24h后EVs进入细胞，细胞内出现荧光；48h后荧光强度稍微增强，说明EVs仍在进入细胞；72h后荧光出现最强，说明随着时间的积累，EVs不断地进入细胞。
（二）细胞增殖实验
首先，以实施例2所制备转染并IPTG诱导表达6小时后BL21菌株为基础，提取EVs；
其次，将细胞（MBA-MD-231细胞 、A549细胞、H22细胞）接种到96孔板中，每个孔接种量为1000个细胞；每个时间段的细胞铺到一个板子上，每个样品重复6次；每个孔加入200ugEVs,对照组加入相同体积的PBS,放置37℃培养箱，24h、48h、72h后，分别在酶标仪下测定450nm波长下的吸光度值，统计数据。
具体结果分别如图10、图11、图12所示。结果表明，在MBA-MD-231、A549、H22三个不同的细胞系中，PT-tRNA对细胞没有任何毒性影响，同NC对照组的细胞增殖情况没有太大差别，而在加入PT-miR-126后，MBA-MD-231细胞的增殖受到了抑制，加入PT-miR-124后，A549细胞的增殖受到了抑制，加入PT-miR-34a后，H22细胞的增殖受到了抑制。
上述结果表明，在使用“PT-tRNA”支架连接miRNA杀伤癌细胞的过程中，不同的miRNA针对不同癌细胞都表现出了杀伤作用，而“PT-tRNA”支架本身对细胞无任何毒性影响。
（三）细胞内miRNA的量以及被细胞切割为成熟miRNA的量情况
上述EVs侵染细胞的实验验证了EVs能进入到细胞中，因此pri-miRNA会随着EVs也一起进入到了细胞中。而进入到细胞后，pri-miRNA会被Drosha进一步加工切割成为成熟的miRNA。本实验检测了0-72h内进入到细胞中的pri-miRNA的量，以及pri-miRNA在细胞内被加工为成熟的miRNA的量。具体实验检测过程为：
提取100ng EVs，加入到预先培养的细胞（MBA-MD-231细胞 、A549细胞、H22细胞）中，分别在24h、48h、72h后收集细胞，提取细胞的RNA，反转录成cDNA，最后进行荧光定量PCR。统计数据，并进行绘图。
细胞中pri-miRNA量统计结果如图13、图14、图15所示。可以看出，进入到不同细胞中（MBA-MD-231、A549、H22细胞）的pri-miRNA（miR-126、miR-124、miR-34a）量都随着时间的变化而逐渐增加，第三天进入到细胞中的pei-miRNA的量最多。
细胞内成熟的miRNA的量统计结果如图16、图17、图18所示。可以看出，不同细胞中（MBA-MD-231、A549、H22细胞）的pri-miRNA（miR-126、miR-124、miR-34a）被加工为成熟的miRNA的量都随着时间的变化而逐渐增加，第三天细胞内被加工为成熟的miRNA的量最多。
（四）细胞中靶基因的变化量
为了验证对癌细胞起杀伤作用的是EVs中的miRNA，进一步研究细胞中靶基因的变化量。针对现有技术中部分靶基因设计引物序列（具体引物序列可从Primerbank查询，不再详述），进行荧光定量PCR检测（以16S RNA为内参基因）。
实验检测时，提取相应EVs加入到细胞中，48h后收集细胞，提取细胞的RNA并反转录成cDNA作为模板，然后进行荧光定量检测。
具体靶基因在不同细胞中变化结果如下表所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
分析可以看出，A549细胞中STAT3基因明显降低；MBA-MD-231细胞中ADAM9、AKT1、RAF1、CXCR4基因降低，CXCR4基因降低的最明显，而Egfl-7、CXCL12基因变化量不明显；H22细胞中SATB2、E2f3、SIRT1、CCND1基因降低，SIRT4基因降低最明显，而E2f1、Bcl2基因变化量不明显；4T1细胞中CXCR4、CXCL12基因降低，而CXCR4基因降低最明显。
（五）EVs偶联核酸适配体实现肿瘤靶向
为了更好的实现EVs靶向肿瘤，提高EVs杀伤癌细胞的效率，发明人以胆固醇修饰的AS1411核酸适配体偶联EVs，从而来提高EVs的靶向性。
所述AS1411具体序列如下：
5'-Cholesteryl-TTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'。
作为对照，以合成的随机序列DZ-AS1411作为对照，所合成的随机序列为：
5'-Cholesteryl-TTTTTTATAATAATAATTATAATAATAATTTAAAAT-3'。
具体实验时：
首先将5uM的AS1411与100ug EVs（miR-126）在4℃的PBS中孵育一夜，收集偶联上AS1411的Evs；加入到相同量1000个MBA-MD-231细胞中，细胞铺板在96孔板中，每个样品重复6次；24h之后在酶标仪下测定450nm波长下的吸光度值，统计数据。
比较AS1411-EVs和DZ-AS1411-EVs对MBA-MD-231细胞的杀伤能力。
结果如图19所示。可以看出，没有靶向功能的DZ-AH1411-EVs只能杀伤10%的MBA-MD-231细胞，而AS1411- EVs能杀伤74%的MBA-MD-231细胞。这一结果表明，使用适配体偶联EVs，可以进一步提高EVs杀伤癌细胞的能力。
（六）动物实验
上述系列实验表明EVs在体外细胞中具有杀伤作用，进一步地，发明人在动物体内验证了EVs的抗肿瘤功效。具体过程为：
从北京维通利华公司购买六周龄的裸鼠，待小鼠长到八周龄时，开始给小鼠荷瘤，每只小鼠注射106个MBA-MD-231细胞，两周后小鼠长瘤。
将荷瘤小鼠平均分成三组，PBS组、AS1411-EVs-tRNA组、AS1411-EVs-miR-126组。通过尾静注射，每周三次，连续注射21天。
给药结束，将小鼠麻醉后处死，收集肿瘤，比较各组之间的肿瘤差异。
实验结果如图20所示。可以看出，注射AS1411-EVs-tRNA后小鼠的肿瘤体积与注射PBS的小鼠肿瘤相比没有太大的差异，说明AS1411-EVs-tRNA对荷瘤小鼠没有治疗效果，而注射AS1411-EVs-miR-126后小鼠的肿瘤体积明显的减小，说明AS1411-EVs-miR-126对荷瘤小鼠有治疗功效。
（七）内源性载药与外源性载药的效率比较
进一步地，发明人针对现有技术中（专利CN 110037996A《内源性高表达miRNA的大肠杆菌内膜囊泡的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用》）的大肠杆菌内膜囊泡的制备方法，比较了外膜囊泡与内源囊泡装载miRNA的量以及杀伤肿瘤的效果。
（1）miRNA装载效率区别
根据发明专利CN 110037996A《内源性高表达miRNA的大肠杆菌内膜囊泡的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用》中的方法提取大肠杆菌内膜EVs（内源性表达miR-126），同时根据本发明提供的方法提取大肠杆菌外膜EVs。提取RNA并反转录为cDNA后，使用荧光定量PCR依次检测内膜囊泡与外膜中miR-126（内源性表达miR-126）的含量。
结果如图21所示，可以看出，相同量的外膜囊泡装载miRNA的量比内膜囊泡要高的多，说明外膜囊泡装载miRNA的效率要比内膜囊泡装载miRNA的效率高的多。
（2）肿瘤杀伤效果
分别取100ng的外膜囊泡与100ng的内膜囊泡加入到预先铺在96孔中的MBA-MD-231细胞中，铺板量为1000个细胞，24h后在酶标仪下测定450nm波长下的吸光度值，统计数据。
结果如图22所示。可以看出，相同条件的内膜囊泡与外膜囊泡加入到相同量的MBA-MD-231细胞中，内膜囊泡杀伤癌细胞的效率为14%，而外膜囊泡杀伤癌细胞的效率为72%，说明外膜囊泡对癌细胞的杀伤效率更高。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学
<120> 一种内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 1
gaattcgccc ggatagctca gtcggtagag cagcggccgc ggccgcgggt ccagggttca 60
agtccctgtt cgggcgccaa agctt 85

Claims (7)

1.一种内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（一）设计引物及PCR扩增
以Lys-tRNA的序列和pET-31b(+)载体序列为基础，设计PCR扩增用引物序列如下：
pET-31b(+)-F：
5’- AACTCGAGCATATGAATTCATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATT-3’，
pET-31b(+)-R：5’- TTCTCGAGGATCC GCAATAACTAGCATAACCCCTTG-3’；
tRNA-F：5’- TTGAATTCTGGCTGGGGTACCTGGATTCGAACCAG-3’，
tRNA-R：5’- AAGGATCCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTC-3’；
所述Lys-tRNA序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
GAATTCGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGCGGCCGCGGCCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCAAAGCTT；
PCR扩增时，以大肠杆菌DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增完成后，提取备用；
（二）酶切、连接
利用EcoR 1、BamH 1限制性内切酶分别对步骤（一）中所回收PCR扩增产物进行双酶切，回收酶切片段进行连接；
（三）转化、筛选和鉴定
将步骤（二）中的连接产物转化DH5a感受态细胞，并进行抗性筛选、菌落PCR鉴定和测序鉴定；
（四）重组载体的自连
对步骤（三）中测序正确的质粒，采用Xho I限制性内切酶酶切，回收酶切片段后，进行连接，然后再将连接产物转化DH5a感受态细胞，并进行菌落PCR鉴定，并将鉴定正确的阳性克隆进行培养，此即为含有pET-31b(+)-tRNA载体的转化细菌，备用；
（五）针对目的miRNA，设计引物并进行PCR扩增
以人基因组DNA为模板，PCR扩增完成后，回收、纯化扩增产物；
（六）酶切、连接
利用Xho I、Nde I限制性内切酶，对步骤（四）中最终重新自连的pET-31b(+)-tRNA载体进行双酶切，同时对步骤（五）中目的miRNA产物分别进行双酶切，分别回收目的片段，并进行连接；
（七）转化、诱导目的miRNA表达和提取EVs
将步骤（六）中的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态细胞，利用IPTG作为诱导剂来诱导重组载体表达miRNA，诱导表达完成后，提取EVs，经过鉴定，所提取的EVs中包含有内源性表达的miRNA。
2.如权利要求1所述内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法，其特征在于，步骤（五）中，所述目的miRNA，为miR-34a、miR-124或miR-126，具体PCR扩增时引物序列设计为：
miR-34a-F：5’-AACTCGAGGCCAGCTGTGAGTGTTTCTTTGGC-3’，
miR-34a-R：5’-AACATATGGGCCCCACAACGTGCAGCAC-3’；
miR-124-F：5’-AACTCGAGGTCTGCAGAAACCGTCGAACGA-3’，
miR-124-R：5’-AACATATGCATTCCGATCCTTACAAC-3’；
miR-126-F：5’-AACTCGAGCGCTGGCGACGGGACATTATTA-3’，
miR-126-R：5’-AACATATGTGCCGTGGACGGCGCATTA-3’。
3.利用权利要求1所述内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法所制备的Evs。
4.如权利要求3所述Evs，其特征在于，偶联有靶向肿瘤的适配体。
5.如权利要求4所述Evs，其特征在于，所述适配体为胆固醇修饰的AS1411核酸适配体，具体序列为：
5'-Cholesteryl-TTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'。
6.权利要求3所述Evs在制备抗肿瘤药剂中的应用。
7.如权利要求3所述Evs在制备抗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤为腺癌、乳腺癌或肝癌相关肿瘤。
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