CN102260672A - 抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA，属于基因工程技术领域。本发明所述的siRNA正义链具有SEQIDNO:1~3所示的任一序列。本发明还公开了含有该siRNA的shRNA编码基因及由其构建的慢病毒干扰质粒pshRNA-copGFPLentivector。通过实时定量Real-timePCR检测发现，各siRNA片段能使猪生长抑素受体2mRNA表达量显著降低约70%以上，ELISA检测SSTR2蛋白表达量降低30%以上。本发明的siRNA片段及其表达载体可用于制备抑制猪生长抑素受体2表达的制剂，能够显著下调SSTR2基因的表达量。

Description

抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA

技术领域

本发明涉及分子生物学以及生物工程技术领域，具体涉及抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA片段。

背景技术

shRNA即短发夹RNA（short hairpin RNA）。在RNAi干扰过程中，产生dsRNA的一个有效方法就是在体内表达一个短发夹RNA，这种shRNA包含两个短反向重复序列（其中一个与目的基因互补），中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。在体内shRNA可以加工成siRNA(small interfering RNAs，siRNA)，从而降解目的基因抑制其表达。

RNAi(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。因此，RNA技术又被形象地称为基因沉默 (gene silencing)。RNA是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默（post-transeriptional gene sileneing PTGS)。

siRNA是RNAi机制中最重要的发现。生物学研究证实，siRNA为3′端突出2-3nt，长为19-23 nt的双链RNA，5′端为磷酸基，3′端为羟基，这种结构特点说明dsRNA被与RNaseIII相似的酶加工过。RNA干扰包括起始阶段和效应阶段 (initiation and effecting steps)。在起始阶段，加入的双链RNA被切割为21-23个核苷酸的小分子干扰RNA (small interfering RNAs，siRNA)。研究表明:Dicer酶是RNaseIII家族中能特异识别双链RNA的一种，它以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的dsRNA，将dsRNA降解为21bp左右的双链RNA，每个片段的3′端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced  silencing complex，RISC)。 激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，mRNA与siRNA的反义链结合，置换出正义链，然后RISC上的核酸酶以一定的间隔，在被识别的2个核酸中间进行切割，以核酸内切酶作用方式对mRNA进行核酸内切割，导致mRNA降解。

在体外(in vitro)可用不同的方法将siRNA导入靶细胞，一般来讲化学合成和体外酶法合成的siRNA可用电转移、微注射和转染的方法引入细胞。而表达质粒则常通过转染的方法导入靶细胞然后再表达siRNA。向体内(in vivo)导入siRNA的方法，有研究者用静脉注射的方法将合成的siRNA引入动物体内进行基因功能的研究(Elbashir et al., 2001)，但这些方法所产生的抑制效应都很短暂。如果以病毒为载体则能进一步提高转染效率。以逆转录病毒载体的shRNA在抑制HIV及丙肝病毒等方面的研究，显示了较好的效果。慢病毒载体是常用的病毒载体之一，其特点为免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，能将自身携带片断整合入宿主细胞基因组。目前研究表明慢病毒载体能在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA，长期抑制基因表达。

猪的生长速度是在生产中一个很重要的评定指标。动物生长过程受多种激素的调节，其中生长激素（GH）和胰岛素类生长因子（IGFS）是调节动物生长的核心。而GH的释放又主要受正负两种因子调控，其中正性调控因子生长激素释放因子（Growth Hormone Releasing Factor，GRF）又称生长激素释放激素（Growth Hormone Releasing Hormone，GHRH）是存在于人和动物体内的一种生物活性物质，主要由下丘脑合成并分泌，能特异诱导生长激素的合成与分泌；负调控因子生长激素释放抑制因子（Somatostatin，SST）又称生长抑素，是抑制动物生长的主要因素，是一种抑制脑垂体分泌生长激素的神经调节肽，广泛分布于脊椎动物中枢和外周神经系统，胰腺和胃肠道等组织的一类结构相关肽，以14肽为主，包括28肽、12肽及SST原等多种形式。SST与GRF一起，调节人和动物体内生长激素的浓度。SST多种生物学作用的发挥，是通过应答细胞膜上高特异性、高亲和力的SST受体（SSTRs）而介导的。SSTR基因中存在着5种不同的亚型，即SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5。不同亚型的SSTRs主要分布于脑、胰腺、垂体等多种组织中，其各自的功能也有差别。SSTR2在脑组织、甲状腺、胃肠、肝、胰等均有不同程度的表达，通过shRNA技术抑制SSTR2的表达，SSTR2蛋白表达量下降，SST与SSTR的结合下降，间接促进GH的释放，达到促进动物的生长。

siRNA作为一种新的基因干预工具，具有高效、特异、快速等优点，国际上大量研究表明基因表达干预效果优于反义技术，更具有应用价值。但是对于猪生长抑素受体基因的siRNA还未见研究报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中还没有对猪生长抑素基因进行控制的产品这一缺陷，提供一种猪生长抑素受体2（简称SSTR2）基因表达的siRNA。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种抑制猪生长抑素受体2（简称SSTR2）基因表达的siRNA，分别命名为SSTR2-1、SSTR2-2和SSTR2-3，其核苷酸双链中正义链序列如下：

SSTR2-1： SEQ ID NO:1；

SSTR2-2： SEQ ID NO:2；

SSTR2-3： SEQ ID NO:3。

所述siRNA与SSTR2基因mRNA反向互补，其长度为19~27bp。

含有上述siRNA的shRNA。

上述shRNA的编码基因，两端带有BamHⅠ和EcoR I酶切位点的序列，便于构建表达质粒，双链核苷酸序列如下：

SSTR2-1dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

SSTR2-2dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

SSTR2-3dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

一种表达载体，由上述shRNA的编码基因与出发载体构建的，即将shRNA编码基因插入出发载体上构建而成。

病毒载体可以直接高效率地感染细胞，且转染效果更佳稳定，作为上述出发载体中的优选方案，其中病毒载体最优选pshRNA-copGFP Lentivector。该载体具有完整的shRNA插入位点以及GFP报告基因，实现了靶基因shRNA的高效表达、病毒包装以及转基因的直观展示。

本发明的siRNA可以制备成基因药物或其他合适的制剂用于抑制猪生长抑素受体2的表达，从而提高猪的生长性能，促进其生长。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的siRNA沉默效果好，能够下调SSTR2基因的表达。通过实时定量Real-time PCR检测发现各干扰片段能使SSTR2 mRNA表达量显著降低约70%以上，ELISA检测SSTR2蛋白表达量降低30%以上。

发明人构建了含有上述siRNA的编码基因的pshRNA-copGFP Lentivector 慢病毒干扰质粒，并对其进行了体外细胞水平的实验，结果证明了pshRNA-copGFP Lentivector 慢病毒干扰质粒转入细胞后能表达shRNA，并对SSTR2基因进行特异性的抑制，从而在制备用于SSTR2下调的转基因制剂中有应用价值。

附图说明

图1. pcDNA3.1(+/-)载体图；

图2. 实验流程图；

图3. SSTR2 PCR电泳结果，箭头所指为猪SSTR2克隆片段；M：DL2000 Maker；

图4. 克隆基因同猪SSTR2基因比对，Query为猪SSTR2基因，Sbjet为克隆得到的测序结果；

图5. 猪SSTR2-pcDNA3．1(-)的酶切鉴定电泳图，M：DL15000，1：EcoRⅠ单酶切的质粒，2：EcoRⅠ、HindⅢ双酶切质粒产物，3：猪SSTR2基因PCR产物，4：pcDNA3.1(-)双酶切大片段回收产物；

图6. pshRNA-copGFP Lentivector 载体图；

图7. pshRNA-copGFP Lentivector 空质粒酶切图，1：EcoR I单酶切，2：空质粒，3：EcoRI和BamH I双酶切，M：λ-EcoT14；

图8. LV-shRNA-SSTR2菌液PCR检验， 1：水，2：空质粒，3-9 LV-shRNA-SSTR2菌液，M：DL50；

图9. 细胞总RNA电泳检验图；

图10. 荧光定量PCR结果的电泳检测图，1-10：定量PCR的片段， 11：水，M：DL50；

图11. 猪SSTR2-pcDNA3．1(-)及LV-shRNA共转染CHO细胞48h荧光显微镜图（40×），（a）为明视野和荧光，（b）荧光视野；

图12. 慢病毒干扰质粒对猪SSTR2 mRNA表达水平的影响，其中b表示差异显著（P＜0.05）；

图13. 转染空质粒和慢病毒质粒后CHO细胞裂解液中SSTR2蛋白浓度变化。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

实施例1 构建pCDNA3.1-SSTR2真核表达载体

1. 以本实验室保存的正常猪垂体总RNA为模板合成cDNA第一链；

2. 根据猪生长抑素受体2（SSTR2）序列（GenBank登录号 NM001011694），设计一对引物，引入酶切位点EcoR I和Hind III，上游引物序列SEQ ID NO:10，下游引物序列SEQ ID NO:11。以cDNA第一链为模板，PCR扩增SSTR2基因。反应体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL，上游引物（10pmol/μL）1μL，下游引物（10pmol/μL）1μL，cDNA模板3μL，Ex Taq DNA聚合酶（5U/μL）1μL，补加ddH₂O至50μL。反应条件：94℃，5min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，1min，共35个循环； 72℃，10min延伸后结束反应。以上PCR产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定（见图3），用PCR产物纯化试剂盒回收，得到SSTR2目的片段。测序证明扩增片段正确（见图4）。

3. 构建pCDNA3.1-SSTR2真核表达质粒

（1）酶切反应

反应体系：EcoR I与Hind Ⅲ双酶切PCR产物。EcoR I与Hind Ⅲ双酶切pcDNA3.1(-)，酶切体系：10×Buffer M 2μL，EcoR I 1μL，Hind Ⅲ 1μL，质粒6μL，蒸馏水10μL，总体积20μL。反应条件：37℃作用1h，进行1%琼脂糖凝胶电泳。酶切产物用DNA纯化试剂盒纯化，最后各以30μL水洗脱DNA，-20℃保存。

（2）连接反应

反应体系：线性化pcDNA3.1(-) 4μL，10×Ligation Buffer 2μL，T4 DNA Ligase 1μL，SSTR2目的片段13μL，总体积为20μL。反应条件：16℃连接过夜，获得重组pCDNA3.1-SSTR2真核表达质粒。

4. 重组质粒转化大肠杆菌

筛选步骤3中pCDNA3.1-SSTR2真核表达质粒的阳性克隆，用EcoR I与Hind Ⅲ双酶切50μL pCDNA3.1-SSTR2重组质粒，酶切后产物取50μL在1%琼脂糖凝胶中电泳，有1100bp左右长度的插入片段释放出者视为阳性重组体（双酶切鉴定电泳见图5）。从上述方法鉴定的阳性克隆中挑选2个克隆，接种于LA培养基中制备新鲜菌液，经测序鉴定插入片段正确，构建pCDNA3.1-SSTR2真核表达载体成功。

实施例2 构建pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干扰质粒

1. 根据猪生长抑素受体2的mRNA序列设计方法和原则筛选出靶序列，设计siRNA，与生长抑素受体2基因mRNA反向互补，分别命名为SSTR2-1、SSTR2-2、SSTR2-3，其正义链序列如下：

SSTR2-1： SEQ ID NO:1；

SSTR2-2： SEQ ID NO:2；

SSTR2-3： SEQ ID NO:3。

2. 再根据siRNA靶序列设计构建抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA载体所需的DNA序列：SSTR2 shRNA模板，两端引入BamH I和EcoR I酶切位点，送上海生物工程技术服务有限公司合成。具体序列如下（F表示正义链，R表示反义链）：

SSTR2-1shRNA F： SEQ ID NO:4；

SSTR2-1shRNA R： SEQ ID NO:5；

SSTR2-2shRNA F： SEQ ID NO:6；

SSTR2-2shRNA R： SEQ ID NO:7；

SSTR2-3shRNA F： SEQ ID NO:8；

SSTR2-3shRNA R： SEQ ID NO:9。

3. 将合成好的上述寡核苷酸序列溶解并稀释至浓度为1 μg/μL，将上述6条序列分成3对，其中SSTR2-1shRNA F和SSTR2-1shRNA R为1对，SSTR2-2shRNA F和SSTR2-2shRNA R为1对，SSTR2-3shRNA F和SSTR2-3shRNA R为1对。3对序列分别进行退火反应。退火反应体系如下：DNA模板单链1（SSTR2-1shRNA F）1μl，DNA模板单链2（SSTR2-1shRNA R）1μl，10×退火溶液 1μl，ddH₂O 17μl。反应条件：混匀，95℃加热10min；室温静置1小时；稀释至终浓度10ng/μl。-20℃备用。SSTR2-2shRNA F和SSTR2-2shRNA R，以及SSTR2-3shRNA F和SSTR2-3shRNA R的退火反应体系同上，DNA模板单链替换成相应核苷酸序列即可。

4. LV-shRNA-GFP空质粒载体（即pshRNA-copGFP Lentivector空质粒，购自Invitrogen公司，见图6）酶切，酶切体系如下：BamH I 1 μl，EcoR I 1 μl，10×Buffer K 2 μl，LV-shRNA-GFP空质粒 6 μl，ddH₂O 10 μl。37℃作用1h，进行1 %琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图7。博大泰克凝胶片断回收纯化试剂盒回收载体片段。

将步骤3所得的退火产物与酶切质粒载体连接，连接体系如下：双酶切质粒LV-shRNA-GFP（0.1μg/μl）1μl，退火产物 1μl，T4 DNA Ligase Buffer 2μl，T4 DNA Ligase 1μl，ddH₂O 15μl。充分混匀，16 ℃水浴连接，反应过夜。

5. 转化与阳性克隆的PCR鉴定：转化连接产物，挑取单个菌落，接种到LA液体培养基中，37℃恒温振荡培养3h。PCR鉴定阳性克隆，采用引物设计软件Primer 5设计引物，其中上游引物序列为SEQ ID NO:12，下游引物序列为SEQ ID NO:13，由上海生物工程技术服务有限公司合成。扩增包括插入目的基因的DNA片段。 

PCR扩增片段为156bp，反应采用50μL反应体系。体系的组成为：10×PCR缓冲液5μL，2.5mM dNTP 4μL，上游引物(10pmol/μL)1μL，下游引物(10pmol/μL)1μL，步骤5中转化后的菌液3μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，补加ddH₂O至50μL。按以下条件进行PCR反应：94℃，5min；94℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，共35个循环；72℃，10min延伸后结束反应。分别取5μL PCR产物，2%琼脂糖凝胶电泳，检查目的基因的扩增效果，电泳结果见图8。

6. 阳性克隆测序：挑选阳性克隆菌液测序(由Invitrogen公司进行3730型测序仪进行测序分析)。利用生物分析软件DNAMAN进行同源性分析。构建成功的三种慢病毒干扰质粒分别命名为LV-siRNA1、LV-siRNA2和LV-siRNA3（LV-siRNA是对于用pshRNA-copGFP Lentivector构建的干扰质粒的简称，里面插入了RNA干扰的dsDNA的序列）。

实施例3  RNA干扰有效靶点的筛选

1. 三种慢病毒干扰质粒转染真核细胞

将pcDNA3.1-SSTR2分别和LV-siRNA1、LV-siRNA2和LV-siRNA3共转染入CHO细胞进行表达。设pcDNA3.1-SSTR2和LV-shRNA-GFP空质粒共转染CHO细胞作为对照，目的为与处理组转染背景一致，每个处理设3个重复。其中pcDNA3.1-SSTR2与慢病毒干扰质粒的比例为1：5。

脂质体转染，按照Lipofectamine^TM 2000试剂说明书进行。

(1) 转染前一天，在新培养皿中接种细胞，完全吹散细胞以保证细胞均匀的分布。当转染时细胞最好铺满培养皿的60-70％。

(2) 将pcDNA3.1-SSTTR2和慢病毒干扰质粒按1：5共4μg，加入到250μl OPTI-MEM培养基中，轻轻上下颠倒混匀6-8次，室温孵育5min；

(3) 取8μl 的Lipofect amine^TM 2000加入到250μl OPTI-MEM培养基中轻轻上下颠倒混匀6-8次，室温孵育5 min。

(4) 将稀释的Lipofectamine^TM 2000试剂逐滴加入到DNA/OPTI-MEM混合液中，轻轻上下颠倒混匀，室温孵育20 min。

(5) 在第4步孵育形成转染混合物的同时，用不含血清和抗生素的D-MEM洗细胞一次，然后加入9mL含2％血清不含抗生素的D-MEM培养基。

(6) 将第4步中产生的DNA/Lipofectamine^TM 2000试剂混合物逐滴加入第5步中处理的培养皿中，轻轻地将混合物和培养基混匀，CO₂培养箱中37℃培养5h。

(7) 用新鲜完全培养基替换掉含有转染混合物的培养基，CO₂培养箱中继续培养48h。

转染后48h，部分细胞用Trizol收集(一般用6孔培养板)，-70℃保存，用于RNA提取。

2. 转染细胞总RNA提取

采用Invitrogen公司TRIzol Reagent提取转染细胞总RNA。所用器材均经0.1%DEPC水浸泡过夜，高压灭菌后在鼓风干烤箱中烤干，操作过程均在超净台中进行。为了防止质粒DNA的污染，提取的RNA用无RNase的DNA酶消化(10×buffer 2μL，DNA酶0.1μL，17.9μL RNA，反应总体系20μL，37℃，1h)。然后加入酚－氯仿抽提，去除DNA酶，异丙醇沉淀，最后用0.1%DEPC水溶解。1％琼脂糖凝胶电泳，结果拍照（见图9）。

3. Real time-PCR检测细胞内SSTR2的表达丰度

SSTR2的引物如下，SSTR2上游引物SEQ ID NO:14，下游引物SEQ ID NO:15，PCR扩增片段为107bp。同体系设仓鼠β-actin基因为内参（β-actin上游引物SEQ ID NO:16，下游引物SEQ ID NO:17），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增片段为95bp。

以提取的总RNA为模板，以Oligo-dT为引物(工作浓度为10pmol/μL)进行RT反应。取总RNA 10μL，65℃水浴10min，加Oligo-dT引物1μL，70℃预变性5min，立即冰浴5min；在冰浴状态下加入5×AMV缓冲液6μL，Rnasin 0.4μL(40U，Promega)，dNTP 1.5μL，AMV 0.2μL(8U，Promega)，用水补足至总体积30μL，混匀后于42℃反应1h，80℃灭活5min。所有反转录产物用1×TE稀释4倍，-20℃保存备用。

以RT反应产物为模板，进行PCR反应 (SSTR2扩增片段107bp；β-actin扩增片段95bp)，体系的组成为：10×PCR缓冲液5μL，2.5mM dNTP 4μL，上、下游引物(10pmol/μL)各1μL，模板2μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，补加ddH₂O至50μL。反应条件：95℃预变性5min；95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃，30sec，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定（见图10）。

连接、转化同上，从阳性克隆中挑选2个克隆，接种于LA中制备新鲜菌液，测序鉴定插入片段的正确性。

在荧光定量PCR专用96孔PCR板(置于冰上)(ABI公司，美国)的每个孔里分别加入2μl模板(样本的RT产物或系列标准品)，然后加入23μl预混溶液(包括12.5μl Realtime PCR Master Mix、0.8 μl10μM引物、9.7μl灭菌双蒸水)，总反应体系为25μl。用小心将荧光定量PCR专用的96孔PCR板封口膜(ABgene公司，英国)覆盖在PCR板上，压紧，保证每个孔不透气，短暂离心。

每个处理设3个重复，并在每块板上同时设阴性对照(以水为模板)。按ABI7500型荧光定量PCR仪的操作说明放入96孔PCR板，设置PCR反应条件为95℃，1min；95℃，15s，60℃，10sec，72℃，40sec，循环40圈。在确认目的基因与内参照U6基因实时荧光定量PCR扩增效率基本接近时(差异小于5％)，各目的基因mRNA表达丰度可以用2-ΔCt法进行计算，ΔCt＝(目的基因Ct - U6Ct)。转染CHO细胞系荧光图见图11。

结果发现，与共转染pcDNA3.1-SSTR2质粒和pshRNA-copGFP Lentivector 空质粒48h后相比，细胞共转染pcDNA3.1-SSTR2和慢病毒干扰质粒 LV- siRNA以后，SSTR2 mRNA表达极显著下降（见图12）。结果显示三个慢病毒干扰质粒显著抑制了SSTR2的表达，数据分析表明LV- siRNA1抑制效率为90.8%，LV- siRNA2抑制效率为56.6%，LV- siRNA3抑制效率为71.6%（见图12）。转染慢病毒质粒后的CHO细胞裂解液中SSTR2蛋白浓度明显下降（见图13）。

综上所述，体外细胞实验表明本发明涉及的SSTR2 shRNA干扰质粒可有效地干预SSTR2基因的表达，可用于抑制猪生长抑素受体2表达的制剂。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  抑制猪生长抑素受体2基因表达的小干扰RNA

 

<130> 

 

<160>  17   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gaugaagaca aucaccaac                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

caucuacauc cucaaccug                                                  19

 

 

<210>  3

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gaugaucaau guggccgug                                                  19

 

 

<210>  4

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gatccgatga agacaatcac caacttcaag agagttggtg attgtcttca tcttttttg      59

 

 

<210>  5

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

aattcaaaaa agatgaagac aatcaccaac tctcttgaag ttggtgattg tcttcatcg      59

 

 

<210>  6

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gatcccatct acatcctcaa cctgttcaag agacaggttg aggatgtaga tgttttttg      59

 

 

<210>  7

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

aattcaaaaa acatctacat cctcaacctg tctcttgaac aggttgagga tgtagatgg      59

 

 

<210>  8

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

gatccgatga tcaatgtggc cgtgttcaag agacacggcc acattgatca tcttttttg      59

 

 

<210>  9

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

aattcaaaaa agatgatcaa tgtggccgtg tctcttgaac acggccacat tgatcatcg      59

 

 

<210>  10

<211>  35

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

ggaattcgga attcatggat atggcgtatg agcta                                35

 

 

<210>  11

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

cccaagcttc ccaagctttc agatactggt ctggaggtc                            39

 

 

<210>  12

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

aatgtctttg gatttgggaa tcttat                                          26

 

 

<210>  13

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

tggtctaacc agagagaccc agta                                            24

 

 

<210>  14

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

agtcggccaa gtggaggaga                                                 20

 

 

<210>  15

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  15

tcgaagcccg gcatatatca                                                 20

 

 

<210>  16

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  16

tttccagcct tccttctt                                                   18

 

 

<210>  17

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  17

ggtctttacg gatgtcaacg                                                 20

 

 

Claims (6)

1.一种抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链具有以下任一序列：

SSTR2-1：SEQ ID NO:1；

SSTR2-2：SEQ ID NO:2；

SSTR2-3：SEQ ID NO:3。

2.一种shRNA，其特征在于含有权利要求1所述的siRNA。

3.权利要求2所述shRNA的编码基因，其特征在于是下述任一双链核苷酸序列：

SSTR2-1dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

SSTR2-2dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

SSTR2-3dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于是由权利要求3所述的shRNA编码基因与出发载体构建而成。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述出发载体为慢病毒载体pshRNA-copGFP Lentivector。

6.权利要求1所述的siRNA在制备抑制猪生长抑素受体2表达的药物中的应用。

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