CN102965372A - 一种干涉GDF9基因表达的 siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制水牛生长分化因子9（growthdifferentiationfactor9，GDF9）基因表达的siRNA，属于基因工程技术领域。本发明所述的siRNA正义链具有SEQ ID NO:1～3所示的任一序列。本发明还公开了含有该siRNA的shRNA编码基因及由其构建的慢病毒干扰质粒pshRNA-copGFPLentivector。通过实时定量Real-timePCR检测，相对表达量公式计算，其中两个siRNA片段分别对水牛GDF9mRNA抑制效率超过100%，ELISA检测GDF9蛋白表达量也相应降低。本发明的siRNA片段及其表达载体可用于制备抑制水牛GDF9表达的制剂，能够显著下调GDF9基因的表达量。

Description

一种干涉GDF9基因表达的 siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及生物工程技术领域，具体涉及抑制水牛生长分化因子9（GDF9）基因表达的siRNA片段。 

背景技术

RNAi（RNA interference），即RNA干扰，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。RNAi是通过双链RNA诱导与之同源的mRNA降解，导致目标基因转录后缄默的现象或机制。此现象于1998年在对线虫的研究中首次发现。siRNA是进入细胞内的外源dsRNA或内源产生的dsRNA，被Dicer酶切割成为2l-23nt长的小分子，这种siRNA是RNAi机制中的关键中间产物，具有非常强的RNAi效应。 

RNAi途径中，RISC（RNA induced silencing complex）的形成发挥了极大的作用。RISC是由小分子RNA(siRNA／miRNA)，Dicer，DadR蛋白和Argonaute家族蛋白组成的复合体，其作用是直接造成与复合体中siRNA高度互补的mRNA被降解。RISC作用过程中，mRNA的切割发生在对应的siRNA 5’端10～11位核苷酸间，切割将mRNA一分为二，切割后mRNA从RISC上释放。完成一次切割后，引导 siRNA仍然结合在RISC中，继续完成更多轮的切割。 

生长分化因子9（growth differentiation factor 9 ，GDF9）主要在卵泡中表达，同时在非性腺组织中有表达，能促进始基卵泡的发育，与FSH协同刺激卵泡生长，主要调控卵泡的生长发育和生殖功能。GDF9基因敲除小鼠因初级卵泡发育受阻，从而影响生殖。而体外给予生物活性的GDF9可诱导窦前卵泡生长和细胞分泌。以上表明GDF9对卵泡的生长发育影响是有阶段依耐性。Hanrahan等(2004)发现GDF9的FecGH突变（G8突变）能显著提高杂合绵羊的排卵率。 

siRNA作为一种新型的基因工具来抑制特定基因的表达，目前大规模应用于生物细胞、组织和个体，特别是用来制备基因敲低模式动物，从动物整体水平研究基因的功能，siRNA的抑制特定基因的优点是其他基因技术都无法比拟的。而对于水牛生长分化因子9的siRNA还未见研究报道。 

发明内容

本发明的目的在于通过下调GDF9基因的部分功能来提高水牛的繁殖率，由于水牛繁殖率普遍较低，本发明提供了一种抑制水牛生长分化因子9（GDF9）基因表达的siRNA。 

本发明通过以下技术方案实现上述目的： 

一种抑制水牛生长分化因子9（GDF9）基因表达的siRNA，分别命名为GDF9-1、GDF9-2和GDF9-3，其核苷酸双链中正义链序列如下：

GDF9-1： SEQ ID NO:1；

GDF9-2： SEQ ID NO:2；

GDF9-3： SEQ ID NO:3。

所述siRNA与GDF9基因mRNA反向互补，其长度为19~27bp。 

含有上述siRNA的shRNA。 

上述shRNA的编码基因，两端带有BamHⅠ和EcoR I酶切位点的序列，便于构建表达质粒，双链核苷酸序列如下： 

GDF9-1dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

GDF9-2dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

GDF9-3dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

一种表达载体，由上述shRNA的编码基因与出发载体构建的，即将shRNA编码基因插入出发载体上构建而成。 

慢病毒载体可以直接高效率地感染分裂期和非分裂期细胞，且转染效果更加稳定，作为上述出发载体中的优选方案，其中病毒载体最优选pshRNA-copGFP Lentivector。该载体具有完整的shRNA插入位点以及绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）报告基因，实现了靶基因shRNA的高效表达、病毒包装以及转基因的直观展示。 

本发明的siRNA可以制备成基因药物或其他合适的制剂用于下调水牛生长分化因子9的表达，从而提高水牛的繁殖性能。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 

本发明的siRNA沉默效果好，能够特异性的下调GDF9基因的表达。通过实时定量Real-time PCR检测发现各干扰片段能使GDF9 mRNA表达量有的发生100%的抑制现象，ELISA检测GDF9蛋白表达量也相应降低。

发明人构建了含有上述siRNA的编码基因的pshRNA-copGFP Lentivector 慢病毒干扰质粒，并对其进行了体外细胞水平的实验，并制备了转基因小鼠模型，结果证明了pshRNA-copGFP Lentivector 慢病毒干扰质粒转入细胞后能表达shRNA，并对水牛GDF9基因进行特异性的抑制，从而在制备用于GDF9下调的生物制剂中有应用价值。 

附图说明

图1. pcDNA3.1(+/-)载体图； 

图2.pPUC19-GDF9酶切电泳图，M：DL15000 makeer，1：空质粒，2：: BamH I单酶切，3：BamH I/ EcoRⅠ双酶切；

图3. pcDNA3.1（-）载体酶切图，1：BamH I/ EcoRⅠ双酶切，2：BamH I单酶切，3：空质粒，M 15000bp make；

图4. 重组质粒pcDNA3.1- GDF9菌落鉴定电泳图，箭头所指GDF9基因扩增片段；

图5. pshRNA-copGFP Lentivector 载体图；

图6. pshRNA-copGFP Lentivector载体酶切图，1：空质粒，2：BamH I单酶切，3：BamH I/ EcoRⅠ双酶切；

图7.退火产物鉴定电泳图；

图8. 重组质粒Lv-shRNA鉴定，1、2：Lv-shRNA1,3、4：Lv-shRNA2,5：Lv-shRNA3，M：50bp maker；

图9. 细胞总RNA电泳检验图；

图10. 水牛pcDNA3．1(-)-GDF9及LV-siRNA共转染CHO细胞48h荧光显微镜图（40×）；

图11.慢病毒干扰质粒对水牛GDF9 mRNA表达水平的影响，其中*表示差异显著（P＜0.05）；

图12. 转染空质粒和慢病毒质粒后CHO细胞裂解液中GDF9蛋白浓度变化, 其中*表示差异显著（P＜0.05）。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。 

实施例1 构建pCDNA3.1- GDF9真核表达载体

1. 合成水牛生长分化因子9（GDF9）序列（GenBank登录号NM_174681），连接于载体pUC19上，酶切为点为EcoR I与BamH。双酶切（EcoR I与BamH）和测序证明合成片段正确（见图2）。

2. 构建pCDNA3.1-GDF9真核表达质粒 

（1）酶切反应

反应体系：EcoR I与BamHⅠ双酶切PCR产物。EcoR I与BamHⅠ双酶切pcDNA3.1(-)，酶切体系：10×Buffer K 2μL，EcoR I 1μL，BamHⅠ 1μL，质粒6μL，蒸馏水10μL，总体积20μL。反应条件：37℃作用1.2h，进行1%琼脂糖凝胶电泳。酶切产物用DNA纯化试剂盒纯化，最后各以30μL水洗脱DNA，-20℃保存。

（2）连接反应 

反应体系：线性化pcDNA3.1(-) 4μL，10×Ligation Buffer 2μL，T4 DNA Ligase 1μL，GDF9目的片段13μL，总体积为20μL。反应条件：16℃连接过夜，获得重组pCDNA3.1-GDF9真核表达质粒。

3. 重组质粒转化大肠杆菌 

筛选步骤2中pCDNA3.1-GDF9真核表达质粒的阳性克隆，通用引物（T7和BGH），序列号分别为：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；扩增有1300bp左右长度的插入片段释放出者视为阳性重组体（见图4）。从上述方法鉴定的阳性克隆中挑选2个克隆，接种于LA培养基中制备新鲜菌液，经测序鉴定插入片段正确，构建pCDNA3.1-GDF9真核表达载体成功。

实施例2 构建pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干扰质粒

1. 根据水牛生长分化因子9的mRNA序列设计方法和原则筛选出靶序列，设计siRNA，与水牛生长分化因子9基因mRNA反向互补，分别命名为GDF9-1、GDF9-2、GDF9-3，其正义链序列如下：

GDF9-1： SEQ ID NO:1；

GDF9-2： SEQ ID NO:2；

GDF9-3： SEQ ID NO:3。

2. 再根据siRNA靶序列设计构建抑制水牛生长分化因子9基因表达的siRNA载体所需的DNA序列：GDF9 shRNA模板，两端引入BamH I和EcoR I酶切位点，送上海生物工程技术服务有限公司合成。具体序列如下（F表示正义链，R表示反义链）： 

GDF9-1shRNA F： SEQ ID NO:4；

GDF9-1shRNA R： SEQ ID NO:5；

GDF9-2shRNA F： SEQ ID NO:6；

GDF9-2shRNA R： SEQ ID NO:7；

GDF9-3shRNA F： SEQ ID NO:8；

GDF9-3shRNA R： SEQ ID NO:9。

3. 将合成好的上述寡核苷酸序列溶解并稀释至浓度为1 μg/μL，将上述6条序列分成3对，其中GDF9-1shRNA F和GDF9-1shRNA R为1对，GDF9-2shRNA F和GDF9-2shRNA R为1对，GDF9-3shRNA F和GDF9-3shRNA R为1对。3对序列分别进行退火反应。退火反应体系如下：DNA模板单链1（GDF9-1shRNA F）1μl，DNA模板单链2（GDF9-1shRNA R）1μl，10×退火溶液 1μl，ddH₂O 17μl。反应条件：混匀，95℃加热10min；室温静置过夜；稀释至终浓度10ng/μl。-20℃备用。GDF9-2shRNA F和GDF9-2shRNA R，以及GDF9-3shRNA F和GDF9-3shRNA R的退火反应体系同上，DNA模板单链替换成相应核苷酸序列即可。 

4. LV-shRNA-GFP空质粒载体（即pshRNA-copGFP Lentivector空质粒，见图6）酶切，酶切体系如下：BamH I 1 μl，EcoR I 1 μl，10×Buffer K 2 μl，LV-shRNA-GFP空质粒6 μl，ddH₂O 10 μl。37℃作用1h，进行1 %琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图6。Omega凝胶片断回收纯化试剂盒回收载体片段。 

将步骤3所得的退火产物与酶切质粒载体连接，连接体系如下：双酶切质粒LV-shRNA-GFP（0.1μg/μl）1μl，退火产物 1μl，T4 DNA Ligase Buffer 2μl，T4 DNA Ligase 1μl，ddH₂O 15μl。充分混匀，16 ℃水浴连接，反应过夜。 

5. 转化与阳性克隆的PCR鉴定：转化连接产物，挑取单个菌落，接种到LA液体培养基中，37℃恒温振荡培养3h。PCR鉴定阳性克隆，采用引物设计软件Primer 5设计引物，其中上游引物序列为SEQ ID NO:12，下游引物序列为SEQ ID NO:13，由上海生物工程技术服务有限公司合成。扩增包括插入目的基因的DNA片段。 

PCR扩增片段为156bp，反应采用50μL反应体系。体系的组成为：10×PCR缓冲液5μL，2.5mM dNTP 4μL，上游引物(10pmol/μL)1μL，下游引物(10pmol/μL)1μL，步骤5中转化后的菌液3μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，补加ddH₂O至50μL。按以下条件进行PCR反应：94℃，5min；94℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，共35个循环；72℃，10min延伸后结束反应。分别取5μL PCR产物，2%琼脂糖凝胶电泳，检查目的基因的扩增效果，电泳结果见图8。 

6. 阳性克隆测序：挑选阳性克隆菌液测序(由Invitrogen公司进行3730型测序仪进行测序分析)。利用生物分析软件DNAMAN进行同源性分析。构建成功的三种慢病毒干扰质粒分别命名为LV-siRNAⅠ、LV-siRNAⅡ和LV-siRNAⅢ（LV-siRNA是对于用pshRNA-copGFP Lentivector构建的干扰质粒的简称，里面插入了RNA干扰的dsDNA的序列）。 

实施例3  RNA干扰有效靶点的筛选

1. 三种慢病毒干扰质粒转染真核细胞

将pcDNA3.1-GDF9分别和LV-siRNAⅠ、LV-siRNAⅡ和LV-siRNAⅢ共转染入CHO细胞进行表达。设pcDNA3.1- GDF9和LV-shRNA-GFP空质粒共转染CHO细胞作为对照，目的为与处理组转染背景一致，每个处理设6个重复。其中pcDNA3.1- GDF9与慢病毒干扰质粒的比例为1：1。

脂质体转染，按照Polyfect（购自QIAGEN公司）试剂说明书进行。 

(1) 转染前一天，在新六孔板培养皿中接种细胞，完全吹散细胞以保证细胞均匀的分布。当转染时细胞最好铺满培养皿的40-90％。 

(2) 将pcDNA3.1- GDF9和慢病毒干扰质粒按1:1共4ug，加RPMI-1640培养基补至100ul，温柔地上下颠倒混匀6-8次，室温孵育5min； 

(3) 取10ul 的Polyfect加入到100ul DNA/RPMI-1640培养基中温柔地上下颠倒混匀6-8次，室温孵育10min。

(4) 在第3步孵育形成转染混合物的同时，用不含血清和抗生素的RPMI-1640洗细胞一次，然后加入1.5mL含10％血清和1%抗生素的RPMI-1640完全培养基。 

(5) 将第3步中产生的DNA/ RPMI-1640试剂混合物逐滴加入第4步中处理的六孔板培养皿中，轻轻地将混合物和培养基混匀，CO2培养箱中37℃培养48小时，荧光倒置显微镜观察转染效率，部分细胞用Trizol收集，-70℃保存，用于RNA提取。 

2. 转染细胞总RNA提取 

采用Invitrogen公司TRIzol Reagent提取转染细胞总RNA。所用器材均经0.1%DEPC水浸泡过夜，高压灭菌后在鼓风干烤箱中烤干，操作过程均在超净台中进行。具体操作步骤如下：

(1) 在六孔板中立刻加入1mlTrizol/孔，裂解5 min后转移到RNase-free的1.5ml的离心管中；

(2) 每管加入200 ul氯仿；

(3) 旋涡振荡器上混匀2min，室温静置10min，4℃12000rpm离心15min；

(4) 离心后分三层，吸取上层清液(小心尽量不要吸到中层蛋白)到新的离心管中，加入等体积的异戊醇；

(5) 混匀，-20℃静置沉淀40min，4℃12000rpm离心15min；

(6) 离心后可见白色沉淀于管底，小心弃掉上清，加入500ul75%乙醇，4℃，7500rpm离心5min；

(7) 弃去乙醇后再洗涤一次，干燥，加入适量RNase-free水溶解；

(8) RNA定量：取lu1RNA样品，加入99ul无RNA酶水中，混匀，稀释100倍，用无RNA酶水做空白对照，于核酸蛋白分析仪中测OD值，RNA浓度；

(9) RNA电泳检测：取1ul样品上样，电压90V，跑30min，照胶。

为了防止质粒DNA的污染，提取的RNA用无RNase的DNA酶消化(10×buffer 2μL，DNA酶0.1uL，17.9μL RNA，反应总体系20uL，37℃，1h)。然后按加入酚－氯仿抽提，去除DNA酶，异丙醇沉淀，最后用0.1%DEPC水溶解。1％琼脂糖凝胶电泳，结果拍照。（见图9）。 

3. Real time-PCR检测细胞内GDF9的表达丰度 

GDF9的引物如下，GDF9上游引物SEQ ID NO:14，下游引物SEQ ID NO:15，PCR扩增片段为151bp。同体系设仓鼠β-actin基因为内参（β-actin上游引物SEQ ID NO:16，下游引物SEQ ID NO:17），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增片段为428bp。

以提取的总RNA为模板，以Oligo-dT为引物(工作浓度为10pmol/μL)进行RT反应。取总RNA 10μL，65℃水浴10min，加Oligo-dT引物1μL，70℃预变性5min，立即冰浴5min；在冰浴状态下加入5×AMV缓冲液6μL，Rnasin 0.4μL(40U，Promega)，dNTP 1.5μL，AMV 0.2μL(8U，Promega)，用水补足至总体积30μL，混匀后于42℃反应1h，80℃灭活5min。所有反转录产物用1×TE稀释4倍，-20℃保存备用。 

以RT反应产物为模板，进行PCR反应 (GDF9扩增片段151bp；β-actin扩增片段428bp)，体系的组成为：10×PCR缓冲液5μL，2.5mM dNTP 4μL，上、下游引物(10pmol/μL)各1μL，模板2μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，补加ddH₂O至50μL。反应条件：95℃预变性5min；95℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃，30sec，35个循环；72℃延伸10min。。 

首先在荧光定量PCR专用96孔PCR板(置于冰上)的每个孔里分别加入1μl模板(样本的RT产物或系列标准品)，然后加入19μl预混溶液(包括10μl Realtime PCR Master Mix、1.2 μl10μM引物、7.8μl灭菌双蒸水)，总反应体系为20μl。用小心将荧光定量PCR专用的96孔PCR板封口膜(ABgene公司，英国)覆盖在PCR板上，压紧，保证每个孔不透气，短暂离心。 

每个处理设3个重复，并在每块板上同时设阴性对照(以水为模板)。按ABI7500型荧光定量PCR仪的操作说明放入96孔PCR板，设置PCR反应条件为95℃/1min预变性；95℃/15s变性，56℃/15s退火，72℃延伸40s，循环40圈。在确认目的基因与内参照β-actin基因实时荧光定量PCR扩增效率基本接近时(差异小于5％)，目的基因GDF9的扩增效率为93%，内参β-actin的扩增效率为91.3%。目的基因mRNA表达丰度可以用 

计算得到。转染CHO细胞系荧光图见图10。 

结果发现，与共转染pcDNA3.1-GDF9质粒和pshRNA-copGFP Lentivector 空质粒48h后相比，细胞共转染pcDNA3.1-GDF9和慢病毒干扰质粒 LV- siRNA以后，GDF9 mRNA表达极显著下降（见图11）。结果显示三个慢病毒干扰质粒都一定程度抑制了GDF9的表达，数据分析表明LV- siRNAⅠ和LV- siRNAⅡ抑制效率为均达到100%，LV- siRNAⅢ抑制效率为90%以上（见图11）。转染慢病毒质粒后的CHO细胞裂解液中GDF9蛋白浓度明显下降（见图12）。 

综上所述，体外细胞实验表明本发明涉及的GDF9 shRNA干扰质粒可有效地干预GDF9基因的表达，可用于制造下调水牛生长分化因子9基因表达的制剂，提高水牛繁殖率。 

〈110〉华南农业大学

〈120〉一种抑制水牛生长分化因子9基因表达的siRNA

 

〈160〉17

 

〈210〉1

〈211〉21

〈212〉siRNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉GDF9-1

〈400〉1

 AAGTCAGTCT TGCTATATAC T               21

 

〈210〉2

〈211〉21

〈212〉siRNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉GDF9-2

〈400〉2

  AAGCTGCTGA GGGTGTAAGA T               21

 

〈210〉3

〈211〉21

〈212〉siRNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉GDF9-3

〈400〉3

 AACTGAAGTG GGACAACTGG A               21

 

〈210〉4

〈211〉59

〈212〉shRNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉GDF9-1dsDNA-sense

〈400〉4

GATCCGTCAG TCTTGCTATA TACTCTCAAG AGAAGTATAT AGCAAGACTG ACTTTTTTG               59

 

〈210〉5

〈211〉59

〈212〉shRNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉GDF9-1dsDNA-antisense

〈400〉2

AATTCAAAAA AGTCAGTCTT GCTATATACT TCTCTTGAGA GTATATAGCA AGACTGACG              59

 

〈210〉6

〈211〉59

〈212〉shRNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉GDF9-2dsDNA-sense

〈400〉6

GATCCGCTGC TGAGGGTGTA AGATCTCAAG AGAATCTTAC ACCCTCAGCA GCTTTTTTG              59

 

〈210〉7

〈211〉29

〈212〉shRNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉GDF9-2dsDNA-antisense

〈400〉7

AATTCAAAAA AGCTGCTGAG GGTGTAAGAT TCTCTTGAGA TCTTACACCC TCAGCAGCG              29

 

〈210〉8

〈211〉60

〈212〉shRNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉GDF9-3dsDNA-sense

〈400〉8

GATCCGCTGA AGTGGGACAA CTGGATTCAA GAGATCCAGT TGTCCCACTT CAGTTTTTTG               60

 

〈210〉9

〈211〉60

〈212〉shRNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉GDF9-3dsDNA-antisense

〈400〉9

AATTCAAAAA ACTGAAGTGG GACAACTGGA TCTCTTGAAT CCAGTTGTCC CACTTCAGCG           60

 

〈210〉10

〈211〉20

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉构建pCDNA3.1-GDF9真核表达载体检测GDF9序列的上游引物

〈400〉10

 TAATACGACT CACTATAGGG               20

 

〈210〉11

〈211〉18

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉构建pCDNA3.1-GDF9真核表达载体检测GDF9序列的下游引物

〈400〉11

 CCTCGACTGT GGCTTCTA               18

 

〈210〉12

〈211〉21

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉转化与阳性克隆的PCR鉴定sence

〈400〉12

 TATTTGCATG TCGCTATGTG T             21

 

〈210〉13

〈211〉21

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉转化与阳性克隆的PCR鉴定Antisense

〈400〉13

 AAGCTGCAAT AAACAAGTTC C               21

 

〈210〉14

〈211〉21

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉Real time-PCR检测细胞内GDF9的表达丰度上游引物GDF9 F

〈400〉14

 CCTAACTCAT TCCCACCTCT C               21

 

〈210〉15

〈211〉21

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉Real time-PCR检测细胞内GDF9的表达丰度下游引物GDF9 R

〈400〉15

 GAACTCACGA ACCTCACTAC C               21

 

〈210〉16

〈211〉24

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉β-actin F

〈400〉16

 TAAGGCCAAC CGTGAAAAGA TGAC               24

 

〈210〉17

〈211〉23

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉β-actin R

〈400〉17

 ACCGCTCGTT GCCAATAGTG ATG               23

 

Claims (7)

1.一种抑制水牛生长分化因子9基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链具有以下任一序列：

GDF9-1：SEQ ID NO:1；

GDF9-2：SEQ ID NO:2；

GDF9-3：SEQ ID NO:3。

2.一种shRNA，其特征在于含有权利要求1所述的siRNA。

3.如权利要求2所述shRNA，其特征在于，是以下任一双链核苷酸序列：

GDF9-1dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

GDF9-2dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

GDF9-3dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于是由权利要求3所述的shRNA编码基因与出发载体构建而成。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述出发载体为慢病毒载体pshRNA-copGFP Lentivector。

6.如权利要求1所述的siRNA在制备抑制水牛生长分化因子9表达的药物中的应用。

7.如权利要求1所述的siRNA在提高水牛繁殖率上的应用。

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