CN111549028A - 一种shRNA及其应用 - Google Patents

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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种shRNA及其应用。本发明的shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供一种包含编码所述的shRNA的DNA片段的表达载体，包含该表达载体的细胞、包含所述的shRNA的细胞和药物，及其它们在抑制PEDV的M基因表达和制备治疗PEDV的药物中的应用。本发明的shRNA表达质粒安全无毒，能显著抑制猪流行性腹泻病毒的复制，使得PEDV的M基因表达抑制，具有广阔应用前景。

Description

一种shRNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种shRNA及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻(PED)是一种以急性肠炎、呕吐和严重水样腹泻为特征的破坏性疾病，传染性极强。给生猪产业带来巨大的威胁和巨大的经济损失。PEDV的M基因在各种毒株之间保守性较高，全长681bp，分子量为27ku-32ku。作为组成病毒的表面结构蛋白，在病毒组装过程中发挥着非常重要的功能。有研究表明，M蛋白可以与M蛋白自身、N蛋白以及S蛋白相互作用。在感染PEDV的细胞中，病毒的M基因呈高表达，且对病毒的复制起着非常重要的作用。
RNA干扰在抵抗病毒入侵过程中起着十分重要的作用。基因沉默机制通常为小干扰RNA或者短发夹RNA诱导实现靶mRNA降解，或者由小RNA抑制特定mRNA翻译。通过设计干扰RNA来抑制PEDV是一种值得研究的技术手段。
发明内容
本发明设计了一种沉默PEDV的M蛋白对应的基因的重组shRNA干扰质粒，以抑制猪流行性腹泻病毒的复制增殖。解决现有技术中猪流行性腹泻病毒变异多、增殖快、防疫困难的问题。
本发明以猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因(NCBI上下载，GenBank:EU302820.1)作为靶序列，根据shRNA设计的一般原则进行设计，获得多对基于miR30骨架的shRNA序列，人工合成干扰片段，与pPRIME-CMV-Neo-FF3载体连接，构建重组质粒pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M。并从细胞水平验证其干扰效果，从中筛选出可使M基因沉默的本发明的优势shRNA序列。
具体地，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
具体地，该shRNA的DNA序列如下：
正义链，如SEQ ID NO.1所示：
5’TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCTGGCGTACAGGTAAGTCAATTTAGTGAAGCCACAGATGTAAATTGACTTACCTGTACGCCATTGCCTACTGCCTCGG 3’；
其中，从5’端至3’端依次为XhoI酶切位点(TCGAG)、前导序列(AAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGC)、短反向重复序列的正义链(TGGCGTACAGGTAAGTCAATT)、loop结构(TAGTGAAGCCACAGATGTA)、短反向重复序列的反义链(AATTGACTTACCTGTACGCCA)、后导序列(TTGCCTACTGCCTCG)和EcoRI酶切位点(G)。
反义链，如SEQ ID NO.2所示：
5’AATTCCGAGGCAGTAGGCAATGGCGTACAGGTAAGTCAATTTACATCTGTGGCTTCACTAAATTGACTTACCTGTACGCCAGCGCTCACTGTCAACAGCAATATACCTTC 3’；
其中，从5’端至3’端依次为EcoRI酶切位点(AATTC)、后导序列的互补序列(CGAGGCAGTAGGCAA)、短反向重复序列的正义链(TGGCGTACAGGTAAGTCAATT)、loop结构(TACATCTGTGGCTTCACTA)、短反向重复序列的反义链(AATTGACTTACCTGTACGCCA)、前导序列的互补序列(GCGCTCACTGTCAACAGCAATATACCTT)和XhoI酶切位点(C)。
其中，在shRNA中，除短反向重复序列的正反义链外，为miR30骨架。
第二方面，本发明提供一种表达载体，其包括与至少一个表达控制序列可操作地连接的编码上述shRNA的DNA片段。
本发明所述的表达载体，其是病毒、真菌或细菌表达载体。
优选地，所述表达载体包含pPRIME-CMV-Neo-FF3载体。
shRNA在疾病的治疗研究中意义重大，载体表达shRNA的效率也是影响snRNA干扰效率的关键因素。常用的polⅢ表达载体对于snRNA的表达水平并不十分有效，本申请的干扰载体比通用型RNAi载体更接近生理情况，可以更有效地发挥干扰作用。
第三方面，本发明提供一种细胞，其包括上述shRNA。
第四方面，本发明提供一种细胞，其包括上述表达载体。
优选地，所述细胞为动物细胞或细菌细胞。
第五方面，本发明提供一种药物，其包括上述shRNA。
第六方面，本发明提供上述shRNA、上述表达载体、上述细胞或上述药物在抑制PEDV的M基因表达中的应用。
第七方面，本发明提供上述shRNA、上述表达载体、上述细胞或上述药物在制备治疗PEDV的药物中的应用。
具体地，作为本发明的一种实施方式，构建包含本发明shRNA的慢病毒的制备方法，包括如下步骤：
1、根据PEDV的M基因的保守序列信息，先设计针对PEDV的M基因的shRNA序列，其正义链及反义链DNA序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
2、将等量的正义链和反义链DNA混合，进行退火，形成DNA双链，得到shRNA模板；
3、用XhoI和EcoRI双酶切pPRIME-CMV-Neo-FF3载体，得到线性化载体；
4、将步骤2中的shRNA模板与步骤3中线性化的载体进行连接，得到重组质粒；
5、将上述重组质粒同pMD2.G和psPAX2通过lipofectamin2000共转染293T细胞，通过病毒空斑纯化，包装成完整病毒颗粒并进行收集。
本发明的有益效果至少在于：
本发明shRNA表达质粒安全无毒，能显著抑制猪流行性腹泻病毒的复制，使得PEDV的M基因表达抑制，具有广阔应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例2中筛选出的稳定转染实施例1的shRNA的Vero-E6细胞系M12的扩增结果，其中，编号4、6、7、9、10、11、14、16、19、23为稳定转染实施例1的shRNA的Vero-E6细胞系M12的扩增结果，PC为阳性对照，NC为阴性对照，M为Marker；
图2为本发明实施例3中攻毒前后细胞状态观察结果；
图3为本发明实施例3中荧光定量检测shRNA干扰质粒对M基因转录水平上的抑制作用结果图；
各图中，M12代表稳转实施例1的shRNA质粒的Vero-E6细胞系M12，M1代表稳转对比例1的pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M1质粒的Vero-E6细胞系M1，M11代表稳转对比例1的pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M11质粒的Vero-E6细胞系M11，空白对照代表正常Vero-E6细胞系。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例制备一种抑制猪流行性腹泻病毒的本发明的shRNA表达质粒。
具体方法如下：
S1人工合成干扰序列(生工生物工程股份有限公司(上海))，所述干扰序列的正义链(Top strand)如SEQ ID NO.1所示，反义链(Bottom strand)如SEQ ID NO.2所示；
S2配制反应体系：0.5ug/mL的Top strand与Bottom strand各20uL，Annealingbuffer(5×)10uL。该反应体系退火得到双链shRNA；
S2中退火温度为：95℃5min,80℃10min,5-7h从80℃降温至4℃(每2.5min降0.5℃)；
S3配制20uL反应体系：2uL的10x Buffer、1uL的XhoI、1uL的EcoRI、2uL的表达载体、14uL的H2O；该反应体系于37℃孵育4h，得到线性化表达载体；其中，表达载体的浓度为600ng/uL；
S3中表达载体为载体pPRIME-CMV-Neo-FF3(Addgene plasmid#11665)；
S4配制20uL反应体系：1uL的双链shRNA序列、100ng的线性化表达载体、2uL的ligase buffer、1uL的T4 DNA Ligase、剩余用ddH2O补齐至20uL，反应条件为22℃过夜连接。
制备好线性化表达载体后对该产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，将目的条带切胶回收。对制备得到的干扰质粒(pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M12)进行测序验证，结果证明与预期一致。
对比例1
本对比例制备两种对比shRNA表达质粒。该两种对比shRNA均是根据与本发明shRNA相同的方法设计而来的，即以与本发明相同的靶序列，根据shRNA设计的一般原则进行设计。
该两种对比shRNA表达质粒的制备方法与实施例1相同，区别在于：第一种对比shRNA表达质粒pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M1的人工合成干扰序列的正义链如SEQ IDNO.3所示，反义链如SEQ ID NO.4所示。
第二种对比shRNA表达质粒pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M11的人工合成干扰序列的正义链如SEQ ID NO.5所示，反义链如SEQ ID NO.6所示。
对制备好的两种对比shRNA表达质粒(pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M1和pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M11)以实施例1的方法进行测序验证，结果证明与预期一致。
实施例2
本实施例提供一种分别包含上述实施例1、对比例1中干扰质粒的单克隆细胞。
主要试剂：大肠杆菌菌株DH5α、限制性内切酶XhoI和EcoRI、T4连接酶、质粒DNA抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、琼脂糖、琼脂粉、DNA ladder、DMEM+10％FBS、Trypsin-EDTASolution(0.25％Trypsin-EDTA，Gibco)、细胞培养孔板、DEPC处理的枪头及EP管、TrizolReagent、异丙醇(分析纯)、三氯甲烷(分析纯)、DEPC-H2O、Reverse Transcriptase、QPCRmix。
具体方法如下：
1、细胞培养
Vero-E6细胞在含有10％胎牛血清以及1％双抗的高糖DMEM细胞培养液中，于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。细胞生长密度达到90％时，按照1：3的比例进行传代培养。
2、构建稳转细胞系
细胞与质粒：
Vero-E6细胞；
干扰载体：pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M12；
pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M11；
pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M1。
转化(感受态细胞：DH5α)：将构建的表达质粒分别转化至氯霉素抗性平板，37℃培养过夜后挑菌，37℃220r/min摇菌16h。收集菌液测序以验证阳性克隆，进行高纯度质粒抽提。
将表达质粒分别包装成慢病毒(上海吉凯基因化学技术有限公司)。
在24孔板中培养Vero E6细胞，待汇合度达到50％左右时，用纯化好的慢病毒通过直接加入到培养基中分别感染Vero E6细胞，MOI＝5。
慢病毒感染后4h、10h分别观察细胞。感染后24h以内更换为新的不含慢病毒的培养基。感染2天后开始添加终浓度为1000ug/mL G418。筛选14天后分别挑取单克隆细胞。跨Neo基因及miR30的引物进行DNA水平的鉴定，所用引物见表1：
表1
引物名称 序列(5′→3′)
NeomiR30-F1 F：GCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTG(SEQ ID NO.7)
NeomiR30-R1 R：CCAAGATGTGCAGGCAACGATTCT(SEQ ID NO.8)
DNA水平鉴定方式为：
收集细胞后提取DNA，利用表1中的引物进行PCR扩增。以筛选出稳定转染实施例1的shRNA的Vero-E6细胞系M12和稳定转染对比例1的两种shRNA的Vero-E6细胞系M1(稳转pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M1质粒)、M11(稳转pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M11质粒)。
筛选出的稳定转染实施例1的shRNA的Vero-E6细胞系M12的扩增结果见图1。从图1中可看出稳定转染实施例1的shRNA的Vero-E6细胞系M12扩增后的大小约为597bp，与目的片段大小一致。
实施例3
本实施例对实施例2筛选得到的稳定转染实施例1的shRNA质粒的Vero-E6细胞系M12(稳转细胞系M12)和稳定转染对比例1的两种shRNA质粒的Vero-E6细胞系M1、M11(稳转细胞系M1、M11)对PEDV复制的抑制作用进行了验证。
具体方法为：
细胞以及病毒：稳转shRNA质粒的Vero-E6细胞系(M12、M1、M11)、猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777。
主要试剂：高糖DMEM、特级胎牛血清、胰酶、双抗(青霉素、链霉素)、PrimeScriptTMRT reagent Kit和gDNA Eraser(大连宝生物技术有限公司)
1、PEDV接种
将各稳转细胞系与正常Vero-E6细胞系(未转染病毒，作为空白对照)按照MOI＝1分别接种CV777。接毒后24h、48h时分别在倒置显微镜下观察细胞状态，观察结果如图2所示。经观察，正常Vero-E6细胞系(空白对照)、稳转细胞系M1、M11接毒48h后，细胞均产生较多CPE。稳转细胞系M12接毒48h后，虽产生CPE，但数量很少。
2、实时定量PCR试验检测病毒mRNA表达
用TRIzol裂解法提取细胞总RNA。在六孔板中加入1mL TRIzol，反复吹打吸取液体至1.5mL EP管中静置5min，加入200uL氯仿混合均匀静置2min，4℃、10000rpm离心15min，吸取上清液转移至新的EP管，加入等体积异丙醇，-20℃静置30min，4℃、10000rpm离心10min，预冷的75％乙醇洗涤两遍，待沉淀干燥后加入70uL RNasefree H2O。检测RNA质量以及浓度。以RNA总量为1ug为模板，加入5x gDNA Eraser Buffer 2uL，gDNA Eraser 1uL，RNasefree ddH2O补齐至10uL，室温下静置10min；在反应管中再加入RNase free ddH2O 1uL，5xPrimeScript Buffer 2(for real time)4uL，RT Primer Mix 4uL，PrimeScript RTEnzyme Mix I 1uL。反应程序为：37℃15min，85℃5秒。
上步试验所得为cDNA。实时定量PCR反应总体系为20uL，SYBR Mix 10uL，cDNA2uL，上下游引物各1uL，ddH2O 6uL，扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火10s，72℃收集荧光20s，共40个循环。
所选持家基因为ACTB(AY550069)。
上下游引物序列如下：
F：TGCGGCATCCACGAAACTAC(SEQ ID NO.9)
R：AGGGCCGTGATCTCCTTCTG(SEQ ID NO.10)。
采用2-ΔΔCt方法对qPCR所得的数据进一步处理，采用SPSS19.0软件中单因素方差分析(one-way ANOVA)程序进行方差分析。P<0.05和P<0.01分别为差异显著和极显著水平。用GraphPad Prism 5软件绘制图表，结果参见图3。
由图3可知，稳转细胞系M12中M基因的表达被极显著抑制，抑制效率达到86％。稳转细胞系M1中M基因的表达抑制效率仅达到19％左右，稳转细胞系M11中M基因的表达抑制效率为26％，干扰效率明显差于M12。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种shRNA及其应用
<130> KHP201111625.9
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgagaaggt atattgctgt tgacagtgag cgctggcgta caggtaagtc aatttagtga 60
agccacagat gtaaattgac ttacctgtac gccattgcct actgcctcgg 110
<210> 2
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattccgagg cagtaggcaa tggcgtacag gtaagtcaat ttacatctgt ggcttcacta 60
aattgactta cctgtacgcc agcgctcact gtcaacagca atataccttc 110
<210> 3
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgagaaggt atattgctgt tgacagtgag cgcacacctt agaaactgga attttagtga 60
agccacagat gtaaaattcc agtttctaag gtgtttgcct actgcctcgg 110
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<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<211> 118
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<400> 6
aattccgagg cagtaggcaa aggttgctac tggcgtacag gtaagtacat ctgtggcttc 60
actacttacc tgtacgccag tagcaacctg cgctcactgt caacagcaat ataccttc 118
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcaggatctc ctgtcatctc accttg 26
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccaagatgtg caggcaacga ttct 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcggcatcc acgaaactac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agggccgtga tctccttctg 20

Claims (8)

1.一种shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种表达载体，其包括与至少一个表达控制序列可操作地连接的编码权利要求1所述的shRNA的DNA片段。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其是病毒、真菌或细菌表达载体。
4.一种细胞，其包括权利要求1所述的shRNA。
5.一种细胞，其包括权利要求2或3所述的表达载体。
6.一种药物，其包括权利要求1所述的shRNA。
7.权利要求1所述的shRNA、权利要求2或3所述的表达载体、权利要求4所述的细胞、权利要求5所述的细胞或权利要求6所述的药物在抑制PEDV的M基因表达中的应用。
8.权利要求1所述的shRNA、权利要求2或3所述的表达载体、权利要求4所述的细胞、权利要求5所述的细胞或权利要求6所述的药物在制备治疗PEDV的药物中的应用。
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