CN112011628A

CN112011628A - 一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的LncRNA标志物及其检测引物和应用

Info

Publication number: CN112011628A
Application number: CN202011030671.4A
Authority: CN
Inventors: 孙伟; 张卫博; 王善禾; 王利宏; 苏锐; 曹修凯
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2020-12-01

Abstract

本发明公开了一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的LncRNA标志物及其检测引物和应用，所述LncRNA标志物为LncRNA‑TCONS_00153891，其序列为SEQ ID NO.1。本发明在前期已经发现miRNA‑29a具有抑制湖羊肌肉细胞增殖作用的基础上，通过生物信息学预测能够结合miRNA‑29a的LncRNA，再利用双荧光素酶报告系统、RT‑qPCR、CCK‑8以及Western blot技术进一步验证了LncRNA‑TCONS_00153891在湖羊肌肉细胞增殖过程中表达起显著上调作用，本发明提出的LncRNA‑TCONS_00153891可作为生物标志物应用于鉴定湖羊肌肉细胞的增殖。

Description

一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的LncRNA标志物及其检测引物和应用

技术领域

本发明涉及一种与湖羊肌肉生长发育相关的LncRNA标志物及其检测引物和应用，具体地涉及LncRNA-TCONS_00153891在湖羊肌肉细胞增殖过程中的应用，属于畜牧兽医技术领域。

背景技术

湖羊是世界著名的绵羊品种，不仅繁殖性能优势突出，而且肉骨比高，肉质细嫩、多汁，深受大众喜爱。然而，由于湖羊屠宰性能较差，不断制约着湖羊肉质性状的开发利用。因此，科学地开展湖羊肉质性状调控机制的研究具有重大意义。

随着分子生物学及生物信息学的快速发展，肌肉生长发育的研究也逐步深入、细化。近年来研究发现，存在肌肉特异性LncRNA，能够竞争性结合与其相关的miRNA，阻止或抑制miRNA沉默其靶基因，形成相互作用的网络系统。具有这样功能的LncRNA被定义为ceRNA，参与肌肉生长发育过程。近年来，LncRNA参与肌肉发育的研究已有很多，但是多集中于模式动物研究上。目前，LncRNA作为一种调控性非编码RNA，对猪肌肉发育的调控作用已见报道，然而对肌肉发育存在显著差异的湖羊肌肉组织中LncRNA鲜有研究。

本发明研究发现，YAP1作为Hippo通道中的主效基因，在肌肉生长发起过程中扮演重要的角色；同时，通过生物信息学预测发现YAP1是miRNA-29a的一个关键靶标基因，LncRNA-TCONS_00153891与miRNA-29a也可能存在结合位点，且通过实验验证发现miRNA-29a已被证明与骨骼肌生长发育相关。于是本研究提出一种猜想：是否存在一种LncRNA，与miRNA-29a及YAP1可能形成ceRNA网络参与湖羊肌肉细胞增殖，为进一步探究湖羊肌肉细胞增殖的分子机制提供理论依据。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的LncRNA标志物及其检测引物。

本发明的目的之二在于提供LncRNA的应用，具体为一种鉴定湖羊肌肉生长拐点的手段，通过检测LncRNA分子标志物的表达水平来判断测定日龄是否到达湖羊肌肉的生长拐点。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的LncRNA标志物，该LncRNA标志物为LncRNA-TCONS_00153891，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了检测LncRNA-TCONS_00153891基因表达的试剂（即LncRNA标志物的检测引物）在鉴定湖羊肌肉生长拐点中的应用。

进一步，所述试剂选自：

特异性扩增LncRNA-TCONS_00153891的引物。

较佳的，所述的LncRNA-TCONS_00153891基因如SEQ IDNO.1所示，特异性扩增LncRNA-TCONS_00153891基因的上、下游引物分别如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3所示，YAP1的上、下游引物序列分别如SEQ IDNO.4、SEQ IDNO.5所示，miRNA-29a序列如SEQ IDNO.6所示。

本发明提供了一种鉴定湖羊肌肉细胞增殖的产品，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中LncRNA-TCONS_00153891基因的表达水平。其中，所述产品包括但不限于芯片、制剂或试剂盒。

进一步，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增或基于核酸序列的扩增。

本发明提供了上述LncRNA标志物（LncRNA-TCONS_00153891基因）在鉴定湖羊肌肉细胞增殖的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括LncRNA-TCONS_00153891基因的上调剂、下调剂。

较佳的，所述的上调剂为LncRNA-TCONS_00153891基因的过表达载体。所述的下调剂选自：以LncRNA-TCONS_00153891或其转录本为靶序列、且能够抑制LncRNA-TCONS_00153891基因表达或基因转录的干扰分子，包括：小干扰RNA(siRNA)或微小RNA；或，能表达或形成所述干扰分子（小干扰RNA或微小RNA）的构建物。优选的，下调剂为siRNA，其靶序列如SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8以及SEQ IDNO.9所示。

所述药物组合物还包括与所述下调剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料，如：FuGENE^® HD Transfection Reagent、Dual-Glo Luciferase-AssaySystem、双荧光素酶载体pmiRNA-RB-REPORT、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒等。

本发明提供了LncRNA标志物（LncRNA-TCONS_00153891基因）或鉴定湖羊肌肉细胞增殖的产品在鉴定湖羊肌肉生长拐点中的应用。

本发明还提供了一种鉴定湖羊肌肉细胞增殖效率的方法，该方法包括：

用候选物质处理表达或含有LncRNA-TCONS_00153891基因的体系；和检测所述体系中LncRNA-TCONS_00153891基因的表达；若LncRNA-TCONS_00153891基因的表达或活性最高，则表明湖羊肌肉细胞增殖效率最高。另外，若所述候选物质可降低LncRNA-TCONS_00153891基因的表达或活性，则表明该候选物质是鉴定湖羊肌肉细胞增殖效率的潜在物质；优选的，候选物质降低LncRNA-TCONS_00153891基因的表达或活性在20%以上，较佳的在50%以上，更佳的在80%以上。

所述潜在物质包括但不限于：针对LncRNA-TCONS_00153891基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明研究发现miRNA-29a具有抑制湖羊肌肉细胞增殖的作用，在此基础上通过生物信息学预测能够结合miRNA-29a的LncRNA，再利用双荧光素酶报告系统、RT-qPCR、CCK-8以及Western blot技术进一步验证了LncRNA-TCONS_00153891在湖羊肌肉细胞增殖过程中表达起显著上调作用，本发明提出的LncRNA-TCONS_00153891基因可作为生物标志物应用于鉴定湖羊肌肉细胞的增殖。

对市场实施可能性和经济效益预测分析发现：羊肌肉生长状况是肉羊养殖极为重视的一格性状，本发明提供了一种鉴定湖羊肌肉生长拐点的产品，可用于对湖羊肌肉生长发育状况进行鉴定，具有良好的经济效益。

附图说明：

图1是利用双荧光素酶报告系统检测LncRNA-TCONS_00153891和miRNA-29a是否存在结合位点的示意图；

图2是利用RT-qPCR检测LncRNA-TCONS_00153891过表达和干扰条件下miRNA-29a的表达情况图；

图3是利用双荧光素酶报告系统检测LncRNA-TCONS_00153891和miRNA-29a结合位点所在的示意图；

图4是利用RT-qPCR检测LncRNA-TCONS_00153891过表达和干扰条件下YAP1和与肌肉生长相关基因（MyoG、MyoD以及MyHC）的表达情况图；

图5是利用CCK-8法检测LncRNA-TCONS_00153891基因对湖羊肌肉细胞增殖的影响的示意图；

图6是利用Western Blot检测LncRNA-TCONS_00153891对YAP1、MyoG、MyoD以及MyHC的蛋白表达情况图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护权限不限于下述的实施例。本发明中除特殊情况以外，所提及的“%”表示质量体积百分比。

本发明经过广泛而深入的研究，已经发现YAP1参与湖羊肌肉生长发育，通过使用多种生物信息学预测软件以及查阅大量相关文献，发现LncRNA-TCONS_00153891可能具有与YAP1竞争性结合miRNA-29a的结合位点，为确定其与湖羊肌肉生长发育之间的关系，从而为鉴定湖羊生长拐点寻找更好的途径和方法。实验证明，存在siRNA干扰沉默LncRNA-TCONS_00153891，能够有效地抑制湖羊肌肉细胞的增殖，为确定湖羊出栏日龄提供了新途径。

本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有SEQ ID NO.1指定的核苷酸序列。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明所涉及材料的来源如下：

LncRNA-TCONS_00153891基因—LncRNA-TCONS_00153891源于湖羊（登录号：NC_019458.2），其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中的LncRNA-TCONS_00153891基因包括野生型、突变型或其片段。

本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95～98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

检测技术—本发明的LncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和链置换扩增(SDA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

试剂盒及上、下调剂—本发明提供了检测中LncRNA-TCONS_00153891基因的表达水平的产品，均购自锐博生物公司。如本发明所用，所述的LncRNA-TCONS_00153891的上调剂为LncRNA-TCONS_00153891基因的过表达载体；作为本发明的一种优选方式，所述LncRNA-TCONS_00153891的下调剂是一种LncRNA-TCONS_00153891特异性的小干扰RNA分子。如本发明所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

所述LncRNA-TCONS_00153891基因的上、下调剂是指任何可上调或下调LncRNA-TCONS_00153891基因的表达以及LncRNA-TCONS_00153891基因转录的物质，这些物质作为对于上、下调LncRNA-TCONS_00153891有用的物质，可用于鉴定湖羊生长拐点。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

实施例1 鉴定LncRNA-TCONS_00153891对miRNA-29a表达的影响

1、生物信息学预测

根据生物信息在线软件（Findtar3与RNA22），预测miRNA-29a与绵羊LncRNA-TCONS_00153891基因存在的3个潜在结合位点。

2、RNA样品的制备（利用miRNA kit进行操作）

试验用细胞来自苏州种羊场初生湖羊的背最长肌，前期已完成湖羊肌卫星细胞的分离及鉴定。RNA提取步骤具体如下：

（1）细胞复苏与培养

将细胞冻存管从液氮中取出后迅速放入37℃水浴锅中融解，约2 min；800 rpm，离心5min，弃上清；加5 mL完全培养基（（90% DMEM（美国Gibco公司）+10% FBS（美国Sigma公司）+1%青霉素/链霉素双抗溶液（美国Gibco公司）），轻轻吹散混匀，将细胞悬液置于新的培养瓶中；37℃，饱和湿度，5% CO₂恒温培养箱中培养，48 h后更换新鲜的完全培养基。

（2）细胞转染

待复苏的湖羊肌卫星细胞生长至对数期时，用0.25%胰酶消化细胞并计数，按4×10⁵个/孔均匀转至6孔板中培养，使细胞在转染时的汇合度达80%左右。参照广州锐博生物科技有限公司的miRNA产品使用说明，将miRNA模拟物、抑制物配制成20 uM的储存液，用于转染实验。参照美国 Invitrogen公司的Lipofecta mine^® RNAiMAX Reagent说明书进行细胞转染，转染36 h提取细胞RNA。转染试验分组：过表达载体LNCRNA-TCONS_00153891组、pcDNA阴性对照组、siRNA组、siRNA阴性对照组。具体为：LNCRNA-TCONS_00153891、pcDNA；siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3以及siRNA-NC。每个样品组设3个平行试验组（NC为相应的阴性对照组）。

（3）细胞RNA提取

加1mL/孔裂解液MZ裂解细胞，用枪吹打，使细胞充分裂解；室温放置匀浆样品5 min，确保核酸蛋白物完全分离；4℃ 12000 rpm，离心5 min，取上清，将其转至一个新的无RNase的离心管中；加入200 uL氯仿，充分震荡15 s，室温静置5 min；4℃ 12000rpm离心15 min，样品分层，取水相层转移至新的无RNase的离心管中，注意转移量；根据转移量，缓慢加入转移体积的0.43倍无水乙醇，混匀；将混匀液转至吸附柱miRspin中，室温12000 rpm离心30 s保留流出液；缓慢加0.75倍流出液体积的无水乙醇，混匀；将所得溶液及沉淀一起转至吸附柱miRelute中，室温离心30 s，弃废液，保留吸附柱；向吸附柱miRelute中加500 uL去蛋白液MRD，室温静置2 min，12000rpm，离心30 s，弃废液；加入500 uL漂洗液RW，室温静置2 min，12000 rpm离心30 s，弃废液；重复前一步骤；将吸附柱miRelute放置于新的2 mL收集管中，室温12000 rpm离心1 min，去废液；将吸附柱miRelute放于新的RNase Free 1.5 mL离心管中，向吸附柱miRelute中心滴加30 uL RNase-Free ddH₂O，室温静置2 min，12000 rpm离心2 min；重复上步操作一次；标注样品名称、提取时间；将提的细胞RNA置于-80℃保存待用。

3、miRNA cDNA第一链合成

采用加A法进行miRNA第一链cDNA的反转录。具体操作步骤参照天根生化科技有限公司的miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书进行：

（1）反转录体系的配制（冰上操作）：Total RNA 4 uL；2×miRNA RT Reaction Buffer10 uL；miRNA RT Enzyme Mix 2 uL；RNase-Free ddH₂O 4 uL（Total RNA为上一步骤所提取的细胞RNA，其余试剂为试剂盒自带）。

（2）反转录程序：42℃，6 min；95℃，3 min。

（3）将合成的cDNA置于-20℃保存。

4、RT-qPCR

miRNA-29a的上游引物由天根生化科技（北京）有限公司合成，上游引物为miRNA-29a：GCACCATCTGAAATCGGTTGT。下游通用引物由天根生化科技有限公司的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒自带。检测miRNA的表达量以湖羊U6基因作为内参。具体操作步骤如下：

（1）用RNase-Free ddH₂O将cDNA 稀释4倍备用；

（2）冰上配制反应体系(20 uL体系)：2×miRcute Plus miRNA Premix 10uL（试剂盒自带）；上游引物（F） 0.4uL；下游引物（R） 0.4uL；miRNA第一链cDNA 1.0uL；ddH₂O 8.2uL。

（3）反应条件：

5、数据分析

采用SPSS 16.0、Excel对数据进行差异显著性分析(*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著)，采用GraphPad Prism 6作图（如图1和图2）。

6、结果

如图1所示，过表达LNCRNA-TCONS_00153891组miRNA-29a相对表达量显著低于阴性对照组(P< 0.05)。如图2所示，siRNA-1与siRNA-3组miRNA-29a相对表达量极显著高于阴性对照组(P< 0.01)，siRNA-2组miRNA-29a相对表达量极与阴性对照组差异不显著(P> 0.05)。结果显示LNCRNA-TCONS_00153891过表达载体、siRNA-1与siRNA-3参与miRNA-29a的调控。

实施例2 双荧光素酶报告基因检测

1、LNCRNA-TCONS_00153891载体构建

（1）PCR反应体系（20uL）：2×GC 10.5 uL，dNTP mix 4 uL，上、下游引物（序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示）（10 uM）各1 uL，LA酶 0.2 ul，DNA模板1 uL（约100 ng），用灭菌水补足20 uL体系。反应条件为（降落PCR）：95℃ 5 min预变性，循环内94℃ 10s变性，从62℃每个循环降1℃退火，72℃延伸45 s，33个循环；72℃继续延伸10 min；扩增产物置于4℃冰箱保存。PCR反应完，取5uL PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳分析。

（2）按照天根生化科技（北京）有限公司的DNA纯化回收试剂盒说明书进行产物纯化。

（3）用限制性内切酶HindШ、MIUI对上述产物和载体进行双酶切，酶切反应体系为：10×H缓冲液2 uL，DNA约2 ug，内切酶（10U/uL）各1 uL，灭菌去离子水补足到20 uL，反应条件37℃，30min；85℃，5min。

（4）酶切后回收纯化酶切产物。按照DNA纯化回收试剂盒说明书进行纯化。

（5）将回收产物与pmiRNA-REPORTTM载体（购自广州锐博生物科技有限公司）连接。连接反应体系为：目的片段DNA 1 uL (约150 ng)，载体1 uL(约80 ng)，2×SoSoo Mix （北京擎科SoSoo重组克隆试剂盒）5 uL，灭菌去离子水补足到10 uL，50℃连接15 min。

（6）取连接产物2uL加到100 uL DH5α感受态细胞（购自Takara公司）中混匀，冰浴25 min；将上述转化液置于42℃水浴45 s，取出后立即置于冰浴中放置2 min；向其中加入500 uL 37℃预热的LB培养基（不含抗生素），150 rpm、37℃振荡培养1 h；混匀菌液，取适量加到含Amp抗生素的LB固体琼脂培养基上（抗生素浓度100 ug/mL），用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12～16 h。

（7）挑取上述平板上的单菌落，溶到10 mL完全培养基中，37℃置培养箱中培养12～16h。取1 uL做模板，进行PCR。反应体系设计参考步骤（1）。PCR反应完，取5uL PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳分析。

（8）将阳性的克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序进一步鉴定。

（9）参照天根生化科技（北京）有限公司的无内毒素质粒大提试剂盒说明书，将测序成功的质粒进行大提，用于细胞转染实验。

2、细胞培养及转染

对冻存的P5代湖羊肌卫星细胞进行复苏与培养。待细胞生长至对数期时，用质量体积浓度为0.25%的胰酶消化细胞，加完全培养基终止消化，按2×10⁵的密度接种至24孔板，于37℃，饱和湿度，5% CO₂培养箱中进行培养。待细胞生长汇合度达80%时，进行细胞转染。具体转染步骤参照美国 Promega公司的FuGENE^® HD Tran-sfection Regeant说明书，按转染试剂：质粒的量=3：1的比例进行转染。实验分组设置：miRNA-29a mimic-NC + LncRNA-wild+ pRL-TK、miRNA-29a mimic + LncRNA-wild + pRL-TK、miRNA-29a inhibitor-NC+LncRNA-Mutant + pRL-TK、miRNA-29a inhibitor + LncRNA-Mutant + pRL-TK。

3、双荧光素酶检测

细胞转染24 h后，按照美国Promega公司的Dual-Glo Luciferase-Assay System试剂说明书进行双荧光素酶报告基因检测，具体步骤如下：

（1）吸弃旧培养基，用1×PBS缓冲液清洗细胞两次，加100uL/孔 1×PLB裂解液，室温震荡裂解15 min，使细胞充分裂解，得到细胞裂解液。

（2）吸取20uL细胞裂解液加到96孔酶标板中，加入100 uL Luciferase Reagent（萤火虫荧光素酶），检测萤火虫荧光素酶活性。

（3）吸取20uL细胞裂解液加到96孔酶标板中，加入100uL Stop & Glo Reagent（海肾荧光素酶），检测海肾荧光素酶的活性。

（4）测定荧光素酶活性时采用1～2 s延迟和5～10 s读数，海肾荧光值与萤火虫荧光值的比值为相对荧光素酶活性，将比值与对照孔的比值进行统计分析，每组实验做3个重复。

4、数据分析

采用SPSS 16.0软件进行独立样本t检验（*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著），采用GraphPad Prism 6作图（见图3）。

5、结果

如图3，LNCRNA-TCONS_00153891-Mutant-3突变的位点为miRNA-29a与LNCRNA-TCONS_00153891的结合位点。

实施例3 RT-qPCR检测LNCRNA-TCONS_00153891对YAP1及与肌肉相关基因的影响

1、总RNA提取

按每10 cm²面积加1 mL裂解液RZ收集经转染36小时的湖羊肌卫星细胞，用枪吹打至溶液透明；于室温下静置5 min；加200 uL氯仿，在振荡器上剧烈震荡15 s室温静置3 min；4℃，12000 rpm离心10 min，转移上层水相于新的1.5 mL无酶管中；加0.5倍体积无水乙醇，混匀后转入RNase-Free吸附柱CR3中，4℃，12000 rpm离心30 s，弃废液；加500 uL去蛋白液RD，4℃，12000 rpm离心30 s，弃废液；加500 uL漂洗液RW，室温静置2 min，4℃，12000 rpm离心30 s，弃废液重复上步操作；将吸附柱放于新的2 mL收集管中，4℃，12000 rpm离心2min；将吸附柱转入新的1.5 mL无酶管中，加50 uL RNase-Free ddH₂O，室温静置2 min，4℃，12000 rpm离心2 min；重复上步操作；标注样品名称、时间，于-80℃保存。

2、cDNA第一链合成

参照天根生化科技（北京）有限公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明书进行（冰上操作）。

（1）配制gDNA去除反应体系混合液：

试剂组份	使用量
		5×gDNA Buffer	2 uL
Total RNA	1 ug
		RNase-Free ddH<sub>2</sub>O	补至10 uL

将混合液彻底混匀，并短暂离心后，于42℃放置3min，置于冰上。

（2）配置反转录反应体系：

试剂组份	体积 (uL)
		10×Fast RT Buffer	2
RT Enzyme Mix	1
		FQ-RT Primer Mix	2
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O	补至10 uL

（3）将步骤（2）的反应液加至步骤（1）的混合液中，充分混匀；

（4）42℃，孵育15 min；95℃，3 min，置于冰上，用于后续qPCR检测。

3、RT-qPCR

根据NCBI网站上公布的绵羊YAP1序列（登录号：100913160），利用Primer3web（http://primer3.ut.ee/）设计上、下游引物。

上游引物：GGACTAGTCCAACTATGACGACCAATAGCTCA

下游引物：CGACGCGTCGAAATAGTGGATGAAAGAA

按照SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）说明书检测YAP1基因的表达量，以绵羊的GAPDH基因作为内参，每个样品进行3次生物学重复，具体操作步骤如下：

（1）用RNase-Free ddH2O将cDNA 稀释4倍；

（2）冰上配制PCR反应体系：

（3）PCR反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环；95℃ 15s，60℃ 1 min，95℃ 15s。

4、数据分析

根据RT-qPCR测得的CT值，通过2^-ΔΔCT算法计算YAP1基因的相对表达情况，利用软件SPSS 16.0进行差异显著性分析，用GraphPad Prism 6软件作图（见图4）。

5、结果

如图4所示，siRNA-3干扰位点可能是LNCRNA-TCONS_00153891与miRNA-29a结合的主要位点；LNCRNA-TCONS_00153891可能作为ceRNA，通过竞争性结miRNA-29a，从而促进YAP1的表达。

实施例4 CCK-8法检测LncRNA-TCONS_00153891在过表达和干扰条件下对湖羊肌卫星细胞增殖的影响

1、细胞培养

将各组转染24小时后的肌卫星细胞用质量体积浓度为0.25%的胰酶消化，完全培养基终止消化后离心弃培养基，加适量完全培养基制备单细胞悬液，以100 uL/孔（约1×104个细胞）接种至96孔板，37℃，饱和湿度，5%CO₂培养箱进行培养。实验设置对照组（LncRNA-NC+miRNA-29a mimic-NC + pRL-TK、LncRNA-NC+miRNA-29a inhibitor-NC + pRL-TK）和实验组（LncRNA+miRNA-29a mimic + pRL-TK、LncRNA+miRNA-29a inhibitor + pRL-TK），每组设3个平行孔。

2、细胞处理

分别在培养1、2、3、4天后弃去旧培养基，无菌PBS缓冲液清洗2遍，然后于每孔中加入10uL CCK-8溶液（避免产生气泡），继续置于37℃培养箱孵育2小时。

3、OD值测定

用酶标仪在450 nm处测定OD值，以OD值代表肌卫星细胞的相对增殖水平，并绘制细胞增殖曲线（见图5）。

4、结果

如图5所示，LNCRNA-TCONS_00153891对湖羊骨骼肌卫星细胞的增殖起促进作用，进而对湖羊肌肉细胞的增殖起促进作用。

实施例6 Western Blot 蛋白检测

1、细胞培养及转染

参照实施例3的方法进行湖羊肌卫星细胞培养与转染。待细胞转染至36 h，进行蛋白样品的制备。

2、蛋白样本提取制备

配制冷Lysis Buffer：每1 mL冷Lysis Buffer中加10uL磷酸酶抑制剂（购自碧云天生物技术），1 uL蛋白酶抑制剂（购自碧云天生物技术）、5 uL 100 mM PMSF，混匀，于冰上保存；从细胞培养箱中取出已转染36 h的细胞，于净化工作台中吸去旧培养基，加入2 mL预冷的1×PBS，振摇数次，清洗细胞两次；用细胞刮刮下细胞，将细胞转移至离心管中，800 rpm离心5 min ，弃废液；每个离心管加1 mL 冷Lysis Buffer，在4℃环境下剧烈振荡30 s，冰上放置4 min，重复5次；4℃，12000 rpm离心5 min，吸取上清蛋白提取物，测定蛋白浓度。

3、蛋白含量测定

（1）绘制标准曲线：取酶标板，按下表加入试剂：

孔号	0	1	2	3	4	5	6	7
									蛋白标准溶液（uL）	0	1	2	4	8	12	16	20
去离子水（uL）	20	19	18	16	12	8	4	0
									对应蛋白含量（ug）	0	0.5	1.0	2.0	4.0	6.0	8.0	10.0

（2）根据样品数量，按BCA试剂A：BCA试剂B=50：1配制BCA工作液，充分混匀；

（3）每孔加200 uL BCA工作液；

（4）将酶标板置于振荡器震荡30 s，37℃静置30 min，562 nm比色测定；以蛋白含量（ug）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线；

（5）稀释待测样品，使样品总体积达20 uL，加200 uL BCA工作液，充分混匀，37℃静置30 min，以标准曲线0号管做参比，于562 nm波长下比色，记录吸光值；

（6）根据所测样品吸光值，在标准曲线上查得相应蛋白含量（ug），除以稀释液总共体积（20 uL），乘以稀释倍数即为样品试剂浓度（ug/uL）。

4、Western Blotting

（1）SDS-PAGE的制备

5%浓缩胶（5mL）：30％Acr/Bis溶液（0.83 mL）；1.0mol/L Tris-HCl（0.63 mL）；10%SDS（50 uL）；去离子水（3.4 mL）；10%过硫酸胺（50 uL）；TEMED（7 uL）。

10%分离胶(10mL)：30％Acr/Bis溶液（3.4 mL）；1.5mol/L Tris-HCl（2.0 mL）；10%SDS（100 uL）；去离子水（3.8 mL）；10%过硫酸胺（100 uL）；TEMED（7 uL）。

（2）样品准备和上样电泳

将样本用裂解缓冲液稀释相同浓度，取等量上样缓冲液于试管中，蛋白量为70 g，并于95～100℃ 5 min后冰上冷却上样。电泳条件：浓缩胶恒压80V约20 min，分离胶100V约80min。

（3）湿电转移

转膜准备：取出凝胶，置于转移缓冲液中平衡15 min。准备滤纸及PVDF膜，分别置入转移缓冲液及去离子水中。

湿电转移：平放底部电极(阳极)，在上面分别放置滤纸、PVDF膜、凝胶和滤纸，排除各层气泡后将上方电极(阴极)放于夹层物上。按恒流200 mA通电，电转移1 h。

（4）封闭

PVDF膜在5％脱脂奶粉封闭液中封闭(室温，1 h)，弃去封闭液，不洗。

（5）抗体与靶蛋白结合

按照约0.1 mL/cm²的量加入5％脱脂奶粉封闭液和适量一抗YAP1 (1:500)， β-actin抗体（1:4000）。摇床摇荡孵育(4℃，过夜)。PBST漂洗滤膜4次，每次5 min。

将PVDF膜与HRP结合的二抗（辣根过氧化酶标记抗体，二抗用封闭液1:5000稀释）室温下摇荡孵育1-2 h，然后用PBST充分洗膜，漂洗5次，每次5 min。

（6）显影和图像分析

按0.1 mL/cm²显影液计算用量，将显影液加于PVDF膜上，室温放置1 min。用保鲜膜将膜包好(尽量避免气泡)。暗室中迅速将膜蛋白贴在X光胶片上曝光，洗片机中显影、洗像。调整曝光时间，直至出现最佳条带（见图6）。

4、结果

过表达LNCRNA-TCONS_00153891组中YAP1及与肌肉相关基因蛋白表达水平均高于阴性对照组中蛋白水平；在转染miRNA-29a inhibitor条件下，YAP1及与肌肉相关基因的蛋白水平显著高于在转染miRNA-29a mimic条件下的蛋白水平。

以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的LncRNA标志物及其检测引物和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 710

<212> DNA

<213> 湖羊(Ovis aries)

<400> 1

gtctctggag cgggcgcctg gcctccctgg gcctcccccg gcagctctcg ctgttgacat 60

ggctgctgtg actggaataa gccgcctgcc tgcctctgag gccgggagaa aggtgttcgg 120

ttgagtgtga ttactggcct tggaccagag gggcacaggg caggcgtgtc cacatgtctt 180

ttgggtctca gttgttggag tgttctttgg ggttttgttt ttgatgaccc tgtctgcgtg 240

taactccaca acaaagcaga cagtacctac aggaagctgg aatcacagag ggtctgggta 300

tatgctcaca ttcaggaagc tggaatcaca ggggttctgg gtggtactca ggttcaggaa 360

gctggaatca cgggttctgg gtgtgtgctc aggtacacag gagggtctgg gtggtgctca 420

gattcaggaa gctggaatca caggagggtc tggttgtgtg ctgaggttca ggaagctgga 480

atcacagggg ttctgggtgg tgctcaggtt caggaagctg gaatcacagg agggtctgag 540

tggtgctgag gttcaggaag ctggaatcac tggggttctg ggtgtgtgct caggtacgca 600

ggagggtctg ggtggtgctc aggtacacag gagggaccgg gtggtgctca ggttcaggaa 660

gctggaatcc caggggcttt gggtggtgct gggagttgag atgaagagtg 710

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caatgaaaag atcctttatt aagcttgtct ctggagcggg cg 42

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagctcatag gccggcatag acgcgtcact cttcatctca actcccag 48

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caatgaaaag atcctttatt aagcttgcct acaatttgcc attaagcc 48

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagctcatag gccggcatag acgcgtaatg ccacccaata caacca 46

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

uagcaccauc ugaaaucggu u 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcagcttatt gcttcgaaa 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgatcaggtt ccagttcca 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggattatgct gctgttata 19

Claims

1.一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的LncRNA标志物，其特征在于，该LncRNA标志物为LncRNA-TCONS_00153891，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的LncRNA标志物即LncRNA-TCONS_00153891的检测引物，其特征在于，该检测引物选自：

特异性扩增LncRNA-TCONS_00153891的引物。

3.一种鉴定湖羊肌肉细胞增殖的产品，其特征在于，所述产品通过生物信息学预测技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测权利要求1所述LncRNA-TCONS_00153891基因的表达水平。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增或基于核酸序列的扩增。

5.权利要求1所述LncRNA标志物在鉴定湖羊肌肉细胞增殖的药物组合物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括LncRNA-TCONS_00153891的上、下调剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的上调剂为过表达载体，下调剂为siRNA。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括与所述下调剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

9.权利要求1所述LncRNA标志物或权利要求3所述产品在鉴定湖羊肌肉生长拐点中的应用。

10.一种鉴定湖羊肌肉细胞增殖效率的方法，其特征在于，所述方法包括：

用候选物质处理表达或含有LncRNA-TCONS_00153891基因的体系；检测所述体系中LncRNA-TCONS_00153891基因的表达；若LncRNA-TCONS_00153891基因的表达或活性最高，则表明湖羊肌肉细胞增殖效率最高。