CN116004630A - 一种调控tpd52基因表达的试剂在制备影响反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种调控TPD52基因表达的试剂在制备影响反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的产品中的应用，涉及功能miRNA技术领域。本发明针对TPD52基因对山羊卵巢颗粒细胞的作用，同时筛选到其调控元件miR‑216，miR‑216靶向TPD52基因3′‑UTR并抑制其表达水平，从而抑制卵巢颗粒细胞增殖；但当利用miR‑216的抑制剂时，则表现出提高TPD52基因表达，并促进卵巢颗粒细胞增殖，从而为培育高产山羊提供理论基础。
Description
技术领域
本发明属于功能miRNA技术领域，具体涉及一种调控TPD52基因表达的试剂在制备影响反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的产品中的应用。
背景技术
miRNA作为小非编码RNA，在RNA沉默和基因表达的转录后调控中发挥重要作用。研究发现几乎所有类型的细胞都能够分泌miRNA，一些细胞外miRNA也可能与细胞间通讯有关。对于卵巢颗粒细胞的研究发现，miRNA能够直接或间接调节卵泡功能的调节和颗粒细胞激素的分泌。绵羊卵巢的研究已发现miRNA不仅可以作为调控元件调节颗粒细胞增殖，而且能够控制TGF-β中的雌二醇分泌所影响的窦前颗粒细胞生长发育。许多miRNA已在绵羊中已经被验证，但在山羊卵巢颗粒细胞中的调控miRNA报道较少，且许多未报道过的未被命名的miRNA也能够对山羊卵巢颗粒细胞发挥调控作用。
肿瘤蛋白D52(TPD52 Gene ID:102178838)是一种原癌基因，属于D52蛋白家族的保守序列。最初，人们发现它在乳腺癌中由于基因扩增而过度表达。随后，该基因在结肠癌、前列腺癌、前列腺癌和卵巢癌中高表达。TPD52及其家族成员形成同源和异构体的相互作用，进而可能在钙介导的信号转导、细胞内脂质储存和细胞生存中发挥潜在作用。TPD52在蛋白质的两端含有D52基序、螺旋卷曲结构域和PEST序列。在以往研究中，人们对TPD52的结构和功能特性进行了较少试验验证，而目前对于反刍动物，特别是山羊卵巢中的研究并未报道过。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调控TPD52基因表达的试剂在制备影响反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的产品中的应用，TPD52基因表达量与反刍动物卵巢颗粒细胞增殖情况呈正相关，可应用于山羊新品种的培育。
本发明提供了一种调控TPD52基因表达的试剂在制备影响反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的产品中的应用。
优选的，所述试剂包括miR-novel-216、miR-novel-216的模拟物、miR-novel-216的抑制剂和/或miR-novel-216的激动剂中的一种或多种；
所述miR-novel-216的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述miR-novel-216的模拟物包括针对miR-novel-216成熟结构设计，化学合成的双链小RNA，在细胞内DICER酶作用下成为单链的miRNA；
所述miR-novel-216的抑制剂包括是针对miR-novel-216的互补单链，通过特异性抑制miRNA分子来减少基因沉默的效应。
本发明还提供了miR-novel-216、miR-novel-216的模拟物或miR-novel-216的激动剂在制备降低TPD52基因表达并抑制反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的制剂中的应用，所述miR-novel-216的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了miR-novel-216的抑制剂在制备增强TPD52基因表达并促进反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的制剂中的应用，所述miR-novel-216的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了miR-novel-216的抑制剂在培育高产反刍动物中的应用，所述miR-novel-216的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述反刍动物包括山羊。
有益效果：本发明提供了一种调控TPD52基因表达的试剂在制备影响反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的产品中的应用，并在实施例中验证了miR-novel-216(简称miR-216)、miR-novel-216的模拟物(mimics)以及miR-novel-216的抑制剂(inhibitor)与TPD52的表达量以及卵巢颗粒细胞增殖之间的关系，即miR-216靶向TPD52基因3′-UTR并抑制其表达水平，具体表现在miR-216在高产云上黑山羊中表达量极显著低于低产云上黑山羊(P<0.01)；TPD52基因在高产云上黑山羊中的表达量极显著高于低产云上黑山羊(P<0.01)；转染miR-216mimics与对照组相比，显著降低TPD52基因mRNA表达水平(P<0.05)，转染miR-216inhibitor与对照组相比，显著增加TPD52基因mRNA表达水平(P<0.05)；转染miR-216mimics与对照组相比显著抑制了颗粒细胞的增殖(P<0.05)；转染miR-216inhibitor与对照组相比，显著促进了颗粒细胞的增殖(P<0.05)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为miR-216和TPD52在高低产卵巢中的表达量对比图；
图2为miR-216和TPD52基因的双荧光活性检测结果图；
图3为miR-216调控TPD52对颗粒细胞增殖的影响结果图；其中A：转染miR-216mimics和miR-216mimics NC后TPD52表达量结果图；B：转染miR-216inhibitor和miR-216inhibitor NC后TPD52表达量结果图；C：转染miR-216mimics、miR-216mimics NC后CCK8的OD480值结果图；D转染miR-216inhibitor和miR-216inhibitorNC后CCK8的OD480值结果图；E转染miR-216mimics、miR-216mimics NC、miR-216inhibitor和miR-216inhibitorNC后EDU的染色结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种调控TPD52基因表达的试剂在制备影响反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的产品中的应用。
本发明从云上黑山羊高产组和低产组中筛选得到表达差异基因(TPD52)，并且在实施例中证实了降低TPD52的基因表达，可抑制卵巢颗粒细胞增殖；当增加TPD52基因的表达时，可促进卵巢颗粒细胞增殖。
本发明实施例中还通过转录组测序检测比对与TPD52基因相关的miR-nove l-216(SEQ ID NO.1：agaaaccgaacaaacuuuuug)，并通过软件Target Scan(http://www.targetscan.org/)和miRanda(http://www.microran.org/microrna/home.do/)预测结合位点，发现miR-216靶向TPD52基因3′-UTR并抑制其表达水平。
在本发明中，所述试剂优选包括miR-novel-216、miR-novel-216的模拟物、miR-novel-216的抑制剂和/或miR-novel-216的激动剂中的一种或多种；其中所述miR-novel-216的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述miR-novel-216的模拟物包括针对miR-novel-216成熟结构设计，化学合成的双链小RNA，在细胞内DICER酶作用下成为单链的miRNA；所述miR-novel-216的抑制剂包括是针对miR-novel-216的互补单链，通过特异性抑制miRNA分子来减少基因沉默的效应。
在本发明实施例中，miR-216在高产云上黑山羊中表达量极显著低于低产云上黑山羊(P<0.01)；TPD52基因在高产云上黑山羊中的表达量极显著高于低产云上黑山羊(P<0.01)；转染miR-216mimics与对照组相比，显著降低TPD52基因mRNA表达水平(P<0.05)，转染miR-216inhibitor与对照组相比，显著增加TPD52基因mRNA表达水平(P<0.05)；转染miR-216mimics与对照组相比显著抑制了颗粒细胞的增殖(P<0.05)；转染miR-216inhibitor与对照组相比，显著促进了颗粒细胞的增殖(P<0.05)，即可通过降低TPD52基因表达的方式抑制反刍动物卵巢颗粒细胞增殖，以及增强TPD52基因表达并促进反刍动物卵巢颗粒细胞增殖，从而应用于培育高产反刍动物。
本发明还提供了miR-novel-216、miR-novel-216的模拟物或miR-novel-216的激动剂在制备降低TPD52基因表达并抑制反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的制剂中的应用，所述miR-novel-216的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：agaaaccgaacaaacuuuuug。
本发明所述应用中各项内容优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了miR-novel-216的抑制剂在制备增强TPD52基因表达并促进反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的制剂中的应用，所述miR-novel-216的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述应用中各项内容优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了miR-novel-216的抑制剂在培育高产反刍动物中的应用，所述miR-novel-216的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述反刍动物优选包括山羊，本发明对所述培育的方法并没有特殊限定，可通过遗传转化的方式进行。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种调控TPD52基因表达的试剂在制备影响反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的产品中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1方法
1.1样品采集
组织样本来自于云南省红河哈尼族彝族自治州的农场，所有云上黑山羊的年龄和体重相近，采用随机交配的方法繁殖，所有山羊在相同的饲养环境和营养条件下饲养。从高产山羊和低产山羊中各取5只(高产组平均产仔数为3.00±0.38只，低产组为1.32±0.19只)，采集卵巢组织并置于液氮，后放置于-80℃长期保存。
1.2细胞培养
从河北省廊坊市周边屠宰场获得山羊新鲜卵巢组织，置于37℃生理盐水(双抗：生理盐水＝1:49)中，运回实验室。使用75％医用酒精洗涤3次，37℃预热的生理盐水(含2％双抗)洗涤3次。使用5mL医用注射器抽取卵泡直径2～6mm的卵巢卵泡，收集至15mL离心管中。2000r/min离心5min去上清，加入DMEM/F12培养基(含2％双抗)重悬，1500r/min离心5min，去上清，重复2次。将获得的细胞沉淀物加入10mLDMEM/F12完全培养基(DMEM/F12：胎牛血清：双抗＝45:5:1)，接种于5cm2培养皿中，置于细胞培养箱中培养(37℃，5％CO2，饱和湿度)。颗粒细胞密度达到85％以上，置于10cm2培养皿中，同等条件培养。
1.3RNA提取和RT-qPCR
RNA的提取使用北京天根生化科技有限公司的动物组织/细胞RNA提取试剂盒，根据试剂说明书进行提取。提取完成后NanoDrop 2000和1.2％琼脂糖凝胶检测RNA样品的浓度和质量。然后根据反转试剂盒(日本Takara公司)说明书获得cDNA。以cDNA为模板，进行RT-qPCR。
RT-qPCR的体系为20μL：10μmol/μL上下游引物各0.8μL，10mL SYBR Green qPCR，50ng/μL cDNA2mL，6.4μLddH2O。qPCR程序为：95℃预变性5s，95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。以山羊RPL19为校正基因。使用相对模板量算法(2-△△CT)计算各基因的相对表达量。RT-qPCR的引物使用Primer 5软件设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列如表1所示。
表1RT-qPCR的引物信息
1.4载体构建和细胞转染
根据miR-216的序列设计合成miR-216的模拟物(mimic)(利用CMV启动子可以在众多哺乳动物细胞中快速、高效、持续表达pre-miRNA，经过Drosha(RNaseIII)作用形成smallhairpin pre-miRNAs；序列为F(SEQ ID NO.8):AGAAACCGAACAAACUUUUUG；R(SEQ ID NO.9)：AAAAGUUUGUUCGGUUUCUUU)和抑制剂(inhibitor)(确定产品是准确分子量大小的单链的MicroRNA Inhibitor，HPLC纯化并分析单链的MicroRNA Inhibitor纯度>95％，序列SEQ IDNO.10：CAAAAAGUUUGUUCGGUUUCU)，mimic和inhibitor在上海吉玛制药技术有限公司合成。根据NCBI提供的TPD52基因序列，设计合成TPD52基因的过表达载体和干扰载体，过表达(pIRES2-EGFP-TPD52)在上海生工生物工程股份有限公司合成，干扰(si-TPD52)(使用PCR制备siRNA长片段表达框)载体在上海吉玛制药技术有限公司合成，通常需要知道的是某一特定细胞在导入siRNA前后某一特定基因的表达变化情况来判断siRNA起到了GeneKnockdown作用。通常采用相对定量的方法来检测siRNA的Gene Knockdown作用。TPD52的siRNA序列为F(SEQ ID NO.11):GCCUCUUCCAGAGCAGACATT；R(SEQ ID NO.12)：UGUCUGCUCUGGAAGAGGCTT。
将山羊颗粒细胞以1×106个/孔的密度接种于6孔板，每孔加入2mLDMEM完全培养基。待细胞密度至70％～80％时，进行细胞转染。弃培养基，加入2ml PBS(美国Gibco公司)洗涤两次。转染6孔板的体系为：取242μL Opti-MEM和8μL Lipofectamine 2000试剂充分混匀配成A管。取230μL Opti-MEM与20μL200nmol/μL的载体(miR-216mimic、miR-216mimicNC、miR-216inhibitor、miR-216inhibitorNC，NC为无义序列，上海吉玛制药技术有限公司合成)，充分混匀配成B管，静置5min。将B管加入A管，混匀后静置20min后加入6孔板中，之后加入1.5mL的Opti-MEM。每组设置3个重复，转染6小时后换为DMEM完全培养基培养。
1.5双荧光素酶活性检验
根据NCBI提供的序列合成TPD52基因3′-UTR-WT(SEQ ID NO.6：tgtcttttaataaggcaaaaatgGAGAAGatagCGGTTTCTttaaacaaaatatcctcaaatctt) 和3′-UTR-MUT ( SEQ IDNO.7 ：tgtcttttaataaggcaaaaatgCTCTTCatagGCCAAAGAttaaacaaaatatcctcaaatctt)(上海吉玛制药技术有限公司)连接至GP-miRGLO载体的SacI/XhoI位点，以突变位点左右15bp的序列为引物进行PCR，首先进行加样操作，加样完成后上机进行PCR，经过电泳和凝胶成像，得到结合位点突变的质粒，接着，切下含有对应目的片段的凝胶块，进行胶回收操作。此时使用DpnI酶，消化纯化的质粒，切掉原始质粒。随后再对酶切产物进行纯化处理，纯化得到的质粒直接进行转化并涂布平板,筛选阳性克隆并测序确认后，合成双荧光素酶报告所需质粒。与miR-216mimic和mimic NC分别共转染至293T细胞。培养48h后收集细胞至1.5mL离心管中，1500r/min离心5min，每孔加入75μL PBS重悬后，移至96孔白色细胞培养板中。加入75μL萤火虫，采用多功能酶标仪测定荧光值；加入75μL海肾后，测定荧光值。
1.6细胞凋亡检测
将山羊颗粒细胞以1×106个/孔的密度接种于6孔板，每孔加入2mL DMEM完全培养基。待细胞密度至70％～80％时，进行细胞转染。根据细胞凋亡试剂盒说明书进行细胞凋亡实验。转染后的颗粒细胞培养48小时后，PBS洗1次；使用4％多聚甲醛固定30min，使用PBS洗涤1次；收集细胞，涂片，使细胞粘附在载玻片上；使用甲醛配置的0.3％过氧化氢溶液中室温孵育20min，PBS洗涤3次；使用免疫染色洗涤液(P0106，北京碧云天生物技术有限公司)，冰上孵育2min，PBS洗涤1次；在载玻片上加50μL生物素标记液(TdT酶：Biotin-dUTP＝1:24)，37℃孵育60min，使用PBS洗涤1次，滴加100μL标记反应终止液终止反应，室温孵育10min；加入50μL Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30min；加入200μL DAB显色液，室温孵育5min；之后使用荧光倒置显微镜观察细胞形态。
1.7Cell Counting Kit-8(CCK8)
使用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测试剂盒，检测颗粒细胞增殖情况。根据CCK8试剂盒说明书，以每孔2×103/100μL的密度接种于96孔板，每组三个重复。根据试剂商说明书，转染相关载体后分别在细胞生长0、6、12、24、48小时时每孔加入10μL CCK8溶液，培养箱孵育2小时后使用酶标仪测定450nm的吸光度，之后计算颗粒细胞增殖速率。
1.8EDU
使用EDU细胞增殖检测试剂盒(北京碧云天生物技术有限公司)，检测颗粒细胞的增殖情况。根据EDU细胞增殖检测试剂盒说明书，将山羊颗粒细胞以1×106个/孔的密度接种于6孔板，载体转染后培养12小时，待细胞状态正常后等体积加入37℃预热的EdU工作液(10μM)，孵育3小时。EdU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1ml固定液(免疫染色固定液，P0098，北京碧云天生物技术有限公司)，室温固定15分钟。洗涤液洗涤3次，每次5分钟。去除洗涤液，每孔用1ml通透液(免疫染色强力通透液P0097，北京碧云天生物技术有限公司)通透，室温孵育15分钟。去除通透液，加入1ml洗涤液洗涤2次，每次3分钟。封闭液室温孵育20分钟，洗涤液洗涤3次，每次2分钟。每孔加入0.5ml Click反应液，室温避光孵育30分钟，洗涤液洗涤3次，每次5分钟。每孔加入200μl Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30分钟。洗涤液洗涤3次，每次2分钟。荧光显微镜下观察并拍照记录。
2试验结果
2.1miR-216和TPD52基因在云上黑山羊卵巢组织中的表达
采用RT-qPCR技术检测miR-216和TPD52基因的相对表达量。结果如图1所示，miR-216在高产云上黑山羊中表达量极显著高于低产云上黑山羊(P<0.01)；TPD52基因在高产云上黑山羊中的表达量极显著低于低产云上黑山羊(P<0.01)。
2.2miR-216靶向TPD52基因3′-UTR
利用软件Target Scan和miRanda在线软件预测miR-216的结合位点，初步筛选TPD52作为候选靶基因。为了进一步确定miR-216与TPD52之间的靶向关系，构建了psiCHECKTM Vector-TPD52-WT和psiCHECKTM Vector-TPD52-MUT双荧光素酶报告基因载体，并与miR-216mimics和mimics NC共同转染至293T细胞中。
双荧光素酶活性检验结果如图2所示，TPD52-WT+miR-216mimic共转染组的双荧光素酶活性显著低于其他3组(P<0.05)。综上所述，miR-216靶向TPD52基因3′-UTR并抑制其表达水平。
2.3miR-216调控TPD52对颗粒细胞增殖的影响
将miR-216mimics、miR-216mimics NC、miR-216inhibitor和miR-216inhibitorNC转染进颗粒细胞。采用qRT-PCR技术检测miR-216对TPD52基因mRNA表达的影响，结果如图3所示，转染miR-216mimics与对照组相比，显著降低TPD52基因mRNA表达水平(P<0.05)，转染miR-216inhibitor与对照组相比，显著增加TPD52基因mRNA表达水平(P<0.05)。通过EDU和CCK8结果表明，转染miR-216mimics与对照组相比显著抑制了颗粒细胞的增殖(P<0.05)；转染miR-216inhibitor与对照组相比，显著促进了颗粒细胞的增殖(P<0.05)。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (7)
1.一种调控TPD52基因表达的试剂在制备影响反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂包括miR-novel-216、miR-novel-216的模拟物、miR-novel-216的抑制剂和/或miR-novel-216的激动剂中的一种或多种；
所述miR-novel-216的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述miR-novel-216的模拟物包括针对miR-novel-216成熟结构设计得到并化学合成的双链小RNA，在细胞内DICER酶作用下成为单链的miRNA；
所述miR-novel-216的抑制剂包括针对miR-novel-216的互补单链，通过特异性抑制miRNA分子来减少基因沉默的效应。
4.miR-novel-216、miR-novel-216的模拟物或miR-novel-216的激动剂在制备降低TPD52基因表达并抑制反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的制剂中的应用，其特征在于，所述miR-novel-216的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.miR-novel-216的抑制剂在制备增强TPD52基因表达并促进反刍动物卵巢颗粒细胞增殖的制剂中的应用，其特征在于，所述miR-novel-216的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.miR-novel-216的抑制剂在培育高产反刍动物中的应用，其特征在于，所述miR-novel-216的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求1、4或6所述应用，其特征在于，所述反刍动物包括山羊。
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