CN113186306A - 一种与羊的皮肤毛囊成熟相关的miRNA及应用 - Google Patents

一种与羊的皮肤毛囊成熟相关的miRNA及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与羊的皮肤毛囊成熟相关的miRNA及应用。与羊的皮肤毛囊成熟相关的miRNA靶向羊的WNT10A基因，所述WNT10A基因的NCBI序列号为XM_018059319.1，可以通过对靶基因的负调控来影响细胞的增殖、凋亡和分化，以及基体的新陈代谢等一系列生物学活动，可以更深入的了解内蒙古绒山羊胎儿期皮肤毛囊成熟阶段的调控网络，有利于今后对绒山羊的育种工作，从而促进绒山羊的产绒量。本发明还提供了miRNA在研究羊的皮肤毛囊成熟中的应用，miRNA抑制上皮细胞和成纤维细胞增殖。

Description

一种与羊的皮肤毛囊成熟相关的miRNA及应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种与羊的皮肤毛囊成熟相关的miRNA及应用。
背景技术
毛发由毛囊产生，毛囊是皮肤的附属物。在哺乳动物中，毛发具有多种功能，如人类的毛发对美观有着很大的影响，绒山羊的羊绒和绵羊的羊毛都是具有很高的经济价值。毛囊的各性状直接影响着绒毛的产量和品质，次级毛囊的性状特征在羊绒的产量和质量上有着直接的影响，从而对绒山羊毛囊生长变化分子调控机理的研究在提高羊绒的经济价值有着非同一般的作用。
miRNA是长度约为22nt的单链小RNA，由miRNA前体(Pre-miRNA)的短发卡结构产生。自从miRNA发现以来，陆续在动植物中发现了数千种miRNA。据研究表明miRNA通过调节大部分蛋白质编码基因来影响若干个主要的生物学途径。皮肤毛囊在发生发育的过程中miRNA及靶标形成了多样化的调节网络，作为一类维持稳态的物质，miRNA在毛囊不同细胞系里的基因表达程序中起关键作用。虽然有研究表明miRNA对皮肤毛囊的重要性，但是在内蒙古绒山羊胎儿期皮肤毛囊发生发育的研究至今未见报道。
发明内容
本发明致力于提供一种与羊的皮肤毛囊成熟相关的miRNA，可以通过对靶基因的负调控来影响细胞的增殖、凋亡和分化，以及基体的新陈代谢等一系列生物学活动，可以更深入的了解内蒙古绒山羊胎儿期皮肤毛囊成熟阶段的调控网络，有利于今后对绒山羊的育种工作，从而促进绒山羊的产绒量。
本发明第一方面提供了一种与羊的皮肤毛囊成熟相关的miRNA，所述miRNA靶向羊的WNT10A基因，所述WNT10A基因的NCBI序列号为XM_018059319.1。
本发明的发明人在前期内蒙古绒山羊胎儿期七个时期(45天、55天、65天、75天、95天、115天和135天)的体侧皮肤转录组数据进行WGCNA分析，筛选得到了内蒙古绒山羊胎儿期皮肤成熟阶段的关键基因为WNT10A，并通过生物信息学预测与其有靶向关系的miRNA。与羊的皮肤毛囊成熟相关的miRNA可以通过对靶基因的负调控来影响细胞的增殖、凋亡和分化，以及基体的新陈代谢等一系列生物学活动。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述miRNA选自chi-miR-130a-3p、chi-miR-301a-3p、chi-miR-532-3p、chi-miR-143-3p、chi-miR-130b-3p、chi-miR-301b-3p、chi-miR-19a、chi-miR-454-3p、chi-miR-19b-3p，其对应的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.1-9所示：
chi-miR-130a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1：CAGTGCAATGTTAAAAGGGCA。
chi-miR-301a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2：CAGTGCAATAGTATTGTCAAAGC。
chi-miR-532-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3：CCTCCCACACCCAAGGCTTGC。
chi-miR-143-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4：TGAGATGAAGCACTGTAGCTCG。
chi-miR-130b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.5：CAGTGCAATGATGAAAGGGCAT。
chi-miR-301b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.6：CAGTGCAATGATATTGTCAAAGC。
chi-miR-19a的核苷酸序列如SEQ ID NO.7：TGTGCAAATCTATGCAAAACTGA。
chi-miR-454-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.8：TAGTGCAATATTGCTTATAGGGT。
chi-miR-19b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.9：TGTGCAAATCCATGCAAAACTGA。
通过生物信息学筛选得到9个可能与WNT10A有靶向关系的miRNA(chi-miR-130a-3p、chi-miR-143-3p、chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p、chi-miR-301b-3p、chi-miR-19a、chi-miR-454-3p、chi-miR-19b-3p和chi-miR-532-3p)。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述miRNA选自chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p。
发明人通过QPCR验证发现chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p在内蒙古绒山羊胎儿期七个时期的相对表达量与WNT10A的相对表达量呈现极强负相关，斯皮尔曼相关系数(Rs)分别为-0.82、-0.86和-0.84，初步判断chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p与WNT10A存在靶向关系。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述miRNA为chi-miR-130b-3p。
进一步，所述羊为内蒙古绒山羊，优选羊处于胎儿期。
进一步，所述羊胎儿期七个时期包括45天、55天、65天、75天、95天、115天和135天。
本发明第二方面提供了所述的miRNA在研究羊的皮肤毛囊成熟中的应用。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述应用包括miRNA抑制上皮细胞和成纤维细胞增殖。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述应用miRNA促进上皮细胞凋亡。
进一步，所述miRNA包括chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明提供一种与羊的皮肤毛囊成熟相关的miRNA，可以通过对靶基因的负调控来影响细胞的增殖、凋亡和分化，以及基体的新陈代谢等一系列生物学活动，可以更深入的了解内蒙古绒山羊胎儿期皮肤毛囊成熟阶段的调控网络，有利于今后对绒山羊的育种工作，从而促进绒山羊的产绒量。
附图说明
图1所示为chi-miR-130b-3p和WNT10A在不同时期胎儿皮肤中的表达谱。两个变量之间的相关程度通过相关系数Rs来表示；Rs＝-0.82表示极强负相关。箭头指的是chi-miR-130b-3p。
图2所示为chi-miR-130a-3p和WNT10A在不同时期胎儿皮肤中的表达谱。Rs＝-0.80表示极强负相关。箭头指的是chi-miR-130a-3p。
图3所示为chi-miR-19a和WNT10A在不同时期胎儿皮肤中的表达谱。Rs＝-0.52表示中等负相关。箭头指的是
图4所示为chi-miR-19b-3p和WNT10A在不同时期胎儿皮肤中的表达谱。Rs＝0.25表示弱正相关。箭头指的是chi-miR-19b-3p。
图5所示为chi-miR-301a-3p和WNT10A在不同时期胎儿皮肤中的表达谱。Rs＝-0.86表示极强正相关。箭头指的是chi-miR-301a-3p。
图6所示为chi-miR-143-3p和WNT10A在不同时期胎儿皮肤中的表达谱。Rs＝-0.52表示中等负相关。箭头指的是chi-miR-143-3p。
图7所示为chi-miR-301b-3p和WNT10A在不同时期胎儿皮肤中的表达谱。Rs＝-0.78表示强负相关。箭头指的是chi-miR-301b-3p。
图8所示为chi-miR-532-3p和WNT10A在不同时期胎儿皮肤中的表达谱。Rs＝-0.84表示极强正相关。箭头指的是chi-miR-532-3p。
图9所示为chi-miR-454-3p和WNT10A在不同时期胎儿皮肤中的表达谱。Rs＝-0.80表示极强正相关。箭头指的是chi-miR-454-3p。
图10所示为内蒙古绒山羊WNT10A基因序列。
图11所示为pSI-checK2载体结构图谱。
图12所示为WNT10A-3'UTR片段克隆进pSI-checK2双荧光素酶报告基因载体的位置。
图13所示为chi-miR-130b-3p与WNT10A-3'UTR结合位点及突变位点。
图14所示为chi-miR-301a-3p与WNT10A-3'UTR结合位点及突变位点。
图15所示为chi-miR-532-3p与WNT10A-3'UTR结合位点及突变位点。
图16所示为与chi-miR-130b-3p和chi-miR-301a-3p有关的WNT10A-3'UTR wt测序结果比对。灰色区域为与目的序列匹配部分。
图17所示为与chi-miR-130b-3p和chi-miR-301a-3p有关的WNT10A-3'UTR mu测序结果比对。灰色区域为与目的序列匹配部分。
图18所示为与chi-miR-532-3p有关的WNT10A-3'UTR wt测序结果比对。灰色区域为与目的序列匹配部分。
图19所示为与与chi-miR-532-3p有关的WNT10A-3'UTR mu测序结果比对。灰色区域为与目的序列匹配部分。
图20所示为双荧光素酶报告基因检测chi-miR-130b-3p与WNT10A-3'UTR相互作用。注：**表示p＜0.01
图21所示为双荧光素酶报告基因检测chi-miR-301a-3p与WNT10A-3'UTR相互作用。
图22所示为双荧光素酶报告基因检测chi-miR-532-3p与WNT10A-3'UTR相互作用。
图23所示为上皮细胞MOI值测定。
图24所示为成纤维细胞MOI值测定。
图25所示为稳转上皮细胞系。图A：HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO稳转上皮细胞系；图D：HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO稳转上皮细胞系；图B：HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO稳转上皮细胞系；图E：HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO稳转上皮细胞系；图C：HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO稳转上皮细胞系；图F：HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO稳转上皮细胞系。
图26所示为稳转成纤维细胞系。图A：HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO稳转成纤维细胞系；图D：HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO稳转成纤维细胞系；图B：HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO稳转成纤维细胞系；图E：HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO稳转成纤维细胞系；图C：HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO稳转成纤维细胞系；图F：HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO稳转成纤维细胞系。
图27所示为羊胎儿期上皮细胞中不同试验组WNT10A相对表达量注：*表示p＜0.05；**表示p＜0.01。
图28所示为羊胎儿期成纤维细胞中不同试验组中WNT10A相对表达量。
图29所示为标准蛋白曲线。
图30所示为胎儿期上皮细胞细胞不同试验组WNT10A和β-actin蛋白表达量。1-8分别为空白组、阴性对照组、HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-130b-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-301a-ZsGREEN-PURO组和HBLV-chi-532-ZsGREEN-PURO组。WNT10A：46KD；β-actin：42KD。
图31所示为胎儿期上皮细胞不同试验组WNT10A蛋白相对表达量。
图32所示为胎儿期成纤维细胞不同试验组WNT10A和β-actin蛋白表达量。1-8分别为空白组、阴性对照组、HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-130b-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-301a-ZsGREEN-PURO组和HBLV-chi-532-ZsGREEN-PURO组。WNT10A：46KD；β-actien：42KD。
图33所示为胎儿期成纤维细胞不同试验组WNT10A蛋白相对表达量。
图34所示为胎儿期上皮细胞不同试验组细胞生长曲线。A-F分别为HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO组、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO组、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO组、HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO组、HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO组和HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO组；*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
图35所示为胎儿期成纤维细胞不同试验组细胞生长曲线
注：A-F分别为HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO组、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO组、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO组、HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO组、HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO组和HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO组；*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
图36所示为胎儿期上皮细胞不同试验组细胞凋亡测定。A-G分别为阴性对照、HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO和HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO稳转上皮细胞系；H为A-G组细胞凋亡柱状图。
图37所示为胎儿期成纤维细胞不同试验组细胞凋亡测定。A-G分别为阴性对照、HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO和HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO稳转成纤维细胞系；H为A-G细胞凋亡柱状图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
实施例1筛选与WNT10A具有靶向关系的miRNA
一、实验材料
内蒙古绒山羊胎儿期7个时期(45天、55天、65天、75天、95天、115天和135天)体侧皮肤(相同时期3个样本做生物学重复)的转录组数据，样本简称为FP-45d、FP-55d、FP-65d、FP-75d、FP-95d、FP-115d、FP-135d。
本发明所用的转录组数据来源于课题组前期的试验结果，试验动物由内蒙古自治区呼和浩特市金莱牧业有限责任公司提供，根据配种记录，对不同妊娠期母羊进行剖腹产手术，共采集7个时期内蒙古绒山羊胎儿样品(45天、55天、65天、75天、95天、115天、135天)，每个时期3只胎儿作为生物学重复，共21组样品，对其进行RNA-Seq，得到基因各样本的基因表达量数据，使用FPKM(Fragments per kilobase of exon per million fragmentsmpped)值来衡量基因的表达水平。
通过对内蒙古绒山羊胎儿期七个时期转录组测序结果和目前应用较广的在线预测网站(TargetScan、MiRanda和miPDB)进行筛选。根据生物信息学分析软件获得9个(chi-miR-130b-3p、chi-miR-130a-3p、chi-miR-19a、chi-miR-19b-3p、chi-miR-301a-3p、chi-miR-143-3p、chi-miR-301b-3p、chi-miR-532-3p、chi-miR-454-3p)可能调控了与绒山羊胎儿期皮肤毛囊发育相关的基因。
实施例2初步验证与WNT10A具有靶向关系的miRNA
采用QPCR对WNT10A和chi-miR-130b-3p、chi-miR-130a-3p、chi-miR-19a、chi-miR-19b-3p、chi-miR-301a-3p、chi-miR-143-3p、chi-miR-301b-3p、chi-miR-532-3、chi-miR-454-3p进行研究。
本试验按照RiboBio公司的Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR试剂盒说明书步骤进行操作，按照测定RNA的浓度加入不同体积的反转录试剂(表1)，反转录程序为42℃60min、70℃10min。再将反转录成功后的cDNA模板根据QPCR反应体系(表2)按照miRNA QPCR反应程序(表3)进行。miRNA引物序列见(表4)。
表1 MiRNA反转录反应体系
Figure BDA0003112026570000051
注：冰上配制
表2 MiRNAQPCR反应体系
Figure BDA0003112026570000052
Figure BDA0003112026570000061
注：冰上配制
表3 MiRNAQPCR反应程序
Figure BDA0003112026570000062
表4 miRNA引物序列
Figure BDA0003112026570000063
Figure BDA0003112026570000071
(备注：由于miRNA序列长度较短，约为20bp，无法根据其设计引物并进行检测，故需在反转录阶段通过RT-Primer延长miRNA，使miRNA加上一个环状片段，这样就使得原来在20bp左右的片段延伸到了80bp左右。最后以这个80bp左右的片段设计上下游引物来进行定量检测。故miRNA的定量检测一共需要三段引物。)
结果发现，WNT10A和chi-miR-130b-3p(图1)、chi-miR-130a-3p(图2)、chi-miR-19a(图3)、chi-miR-19b-3p(图4)、chi-miR-301a-3p(图5)、chi-miR-143-3p(图6)、chi-miR-301b-3p(图7)、chi-miR-532-3(图8)、chi-miR-454-3p(图9)在绒山羊胎儿7个时期均有表达，从结果中均可看出各组数据呈相反表达趋势。
利用R语言分析各组的斯皮尔曼相关系数，其中chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p、chi-miR-532-3p分别与WNT10A在胎儿7个时期表达谱的相关系数(Rs)表现为极强负相关，Rs分别为-0.82、-0.86和-0.84。因此，最终选取chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p、chi-miR-532-3p与WNT10A进行进一步研究。
实施例3双荧光素酶报告基因系统验证
(1)载体的构建
根据Genbank中基因序列信息设计WNT10A和WNT10A-3'UTR的扩增引物，并以293T细胞基因组DNA为模板PCR扩增基因的3'UTR序列，将其克隆到pSI-checK2双荧光素酶报告基因载体(图10)中构建野生型质粒。然后把chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p、chi-miR-532-3p在WNT10A基因中的靶标序列突变掉，构建突变载体。
最后检测荧光素酶报告的表达情况并分析转染3'UTR中是否含有miRNA的靶位点。载体由上海汉恒生物科技有限公司合成。
(2)细胞的转染
在转染前24h，取对数生长期的293T细胞，按1×104个/孔接种于96孔板中，每孔总体积为100μl，置于37℃5％CO2的培养箱中培养，待细胞密度汇合到50％-60％为宜。将10μl的培养基(DMEM)与0.16ug的WNT10A-3’UTR目的质粒以及5pmol的chi-miR-130b-3p/Negative.Control(NC)、chi-miR-301a-3p/NC和chi-miR-532-3p/NC分别充分混匀后室温放置(溶液A1/A2/A3)，之后将10ul DMEM与0.3μl的转染试剂(转染试剂为汉恒生物产品，浓度为0.8mg/ml)充分混匀(溶液B)，室温静置5min。将溶液A1/A2/A3与溶液B充分混匀，室温静置20min。在转染前将细胞培养液弃掉，换成新鲜培养液，然后将转染混合物轻轻加入细胞中混匀，于37℃5％CO2培养箱中培养。转染6h后换取新鲜培养液，转染48h后收集细胞检测。
(3)双荧光素酶报告基因活性检测
转染48h后，弃去旧培养液，用PBS清洗两遍，将5×的被动裂解液用蒸馏水稀释至1×的被动裂解液，每孔加入100μl的量于96孔板中，用移液枪轻轻吹打细胞，在室温条件下，置于摇床上慢摇15min，之后将细胞裂解液吸至1.5ml离心管中，4℃12000rpm离心10min，吸取上清移入新的离心管中。在96孔板中加入100μl的萤光素酶分析试剂II(LAR II)工作液。加入20ul的细胞裂解液，用移液枪轻轻吹打，充分混匀2-3次，测定并记录Fireflyluciferase值，此值为内参值。加入100ul Stop&
Figure BDA0003112026570000072
Reagent(Luciferase AssayReagent)，用移液枪吹打混匀2-3次，测定记录Renilla luciferase值，此值即为报告基因发光值。
实验结果：
通过分析miRNA和WNT10A-3’UTR的序列信息(图10)，预测到了chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p与WNT10A-3’UTR的结合位点，这表明WNT10A是这三个miRNA的潜在靶基因。再将合成好的WNT10A-3’UTR序列克隆到pSI-checK2双荧光素酶报告基因载体(图11)中的特定位置(图12)，然后再对miRNA与WNT10A-3’UTR的结合位点利用PCR突变的方法进行突变(图13、图14、图15)，构建突变载体。最后将阳性克隆菌液进行测序，三个WNT10A-3’UTR wt质粒和三个WNT10A-3’UTR mu质粒与目的序列一致(图16、图17、图18、图19)，表明载体构建成功。标记黑色下划线部分为chi-miR-130b-3p和chi-miR-301a-3p与WNT10A-3'UTR预测结合位点；加粗标记黑色下划线部分为chi-miR-532-3p与WNT10A-3'UTR预测结合位点。
在chi-miR-130b-3p试验组(图20)中，chi-miR-130b-3p显著下调WNT10A-3’UTR的luciferase的表达，说明两者间存在结合作用。突变后这种下调作用消失，说明突变成功。在chi-miR-301a-3p试验组中(图21)，实验结果显示：chi-miR-301a-3p未能下调WNT10A-3UTR的luciferase的表达，说明本实验中两者间不存在结合作用。在chi-miR-532-3p试验组中(图22)，实验结果显示：chi-miR-532-3p未能下调WNT10A-3UTR的luciferase的表达，说明本实验中两者间不存在结合作用。
实施例4miRNA在内蒙古绒山羊胎儿期上皮细胞和成纤维细胞的功能验证
一、实验操作
(1)构建HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO、
HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO
构建好的慢病毒载体和辅助质粒，经过大量抽提后，A260/A280在1.7-1.8范围内以及浓度在1ug/ul以上进行病毒包装并转染，转染后6h换液。转染后分别于48h和72h收集病毒上清液(转染48h取上清后添加新培养基)，收集后以0.45μm滤器过滤至40ml离心管，4℃7200rpm离心120min。500μl新鲜培养基重悬病毒沉淀，至于-80℃保存。
(2)慢病毒感染目的细胞
用胰蛋白酶常规消化上皮细胞/成纤维细胞，调整细胞浓度为1-2×104个/孔细胞于24孔板中，铺20个孔，每隔1-2天换一次液，Polybrene浓度梯度设置为10个梯度，分别为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL，每个浓度梯度设置3个重复，连续观察，以24h内细胞无明显毒性反应为最佳。Puromycin设置为1-10μg/ml十个梯度，每个梯度三个生物学重复，分别添加到胎儿期上皮二代成纤维细胞和二代上皮细胞中，三天内杀死全部细胞的最小浓度为最佳浓度。感染复数(MOI)是指每个细胞感染的病毒颗粒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适的MOI也各有不同，根据操作说明书和相关文献，设置1-6六个梯度。
摸索好最佳的MOI值和polybrene和puromycin最佳浓度后，开始细胞转染试验。用胰蛋白酶常规消化上皮细胞/成纤维细胞，调整细胞浓度为1-2×104个/孔细胞于24孔板中，37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。当细胞汇合度约为50％-60％为宜，从冰箱中取出病毒并在冰上慢慢融化，弃去细胞旧培养基，加入1/2体积的培养液(此培养液为混匀含病毒原液的新鲜培养液)，37℃，5％CO2培养箱中感染4h，4h后补齐培养液至正常体积。感染后的第二天(约为24h)，弃掉含病毒的培养液，换上新鲜的培养液，继续37℃，5％CO2培养箱中培养。感染后48h，感染效率约为80％左右，荧光表达丰度较高时，荧光显微镜观察。感染72后，加入puromycin进行抗性筛选。
(3)总RNA的提取
HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532--ZsGreenPURO成纤维细胞/上皮细胞系总RNA的提取。将回合度达到百分之80以上的细胞培养基吸掉，pbs清洗三遍，加入Trizol。
(4)QPCR验证
使用Trizol试剂盒(Takara)从皮肤组织中分离总RNA，并使用Primer ScriptTM试剂盒(Takara)将总RNA反转录为cDNA，用于定量聚合酶链反应(QPCR)。根据制造商的说明，使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)在ABI 7300系统(美国)上进行QPCR。QPCR中使用的热循环条件是95℃30s，然后是95℃的45次循环10s、60℃的30s和72°的10s。
(5)总蛋白的提取
细胞转染72h后提取总蛋白，所有的操作均在冰上进行。将24孔板置于冰上，弃去旧培养液，用预冷的PBS清洗3遍。缓慢加入250μL的RIPA裂解液(中)，4℃静置5分钟，用细胞刮刀轻轻刮下细胞并转移至1.5mL的Eppendorf管中，4℃1200rpm离心10分钟。离心后吸取上清液于新的1.5mL的Eppendorf管中，吸出2-5μL用于蛋白定量。其余的封口，标号日期，冻存于-80℃冰箱。所有操作在冰上进行。
蛋白浓度的测定：对蛋白浓度的测定采用Pierce公司的BCA法，按照说明书于96孔板中进行。BCA工作液的配制：按照50：1的体积将试剂A与试剂B配制成适量的工作液，充分混匀，现用现配。配置标准液，将0μL、1μ、2L、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL标准液分别加到96孔板中，加PBS稀释液补足到20μL，即PBS稀释液分别为20μL、19μL、18μL、16μL、12μL、8μL、4μL、0μL。依次缓慢的像上述各孔中加入200μL的BCA工作液，37℃恒温箱孵育30min(恒温箱需提前1小时打开预热)。用分光光度计测定A562 nm处的吸光值，并记录读数。根据标准蛋白绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
(6)Western blot
首先将玻璃板用清洗剂清洗、再用酒精擦拭、自来水冲洗、蒸馏水冲洗、最后放入烘箱中烘干。然后将两块玻璃板对齐垂直卡在专用架子上，用蒸馏水检查是否有无漏液，并用吸水纸将内部的水全部吸干。
将灌制好的12％的分离胶混匀后迅速的将分离胶倒入两块玻璃板中间，一定要从玻璃板的一侧倒入，直到距离玻璃板外缘约2cm处，缓慢加入蒸馏水均匀划层，避免胶不平整，大约30分钟左右就可以在胶和水的中间看到一条清晰的折现，这时说明胶已经凝固，然后将水从一侧缓慢倒掉，用吸水纸小心吸干。将灌制好的浓缩胶混匀后迅速从一侧倒入，立即插入梳子，避免产生气泡。待胶完全凝固后(大约1小时左右)，把玻璃板拿出安装在电泳装置上，倒入Tris-甘氨酸电泳液。
从冰箱中取出蛋白样品并融化，加蛋白上样缓冲液充分混匀，干浴机上100℃、5分钟使蛋白变性，12000rpm离心3分钟，冷却后待用。
将梳子缓慢的拔出，按照顺序进行点样(大约为80μg)，最好要保证所有的上样质量保持一致，最后点上Marker，接通电源后设置电压80V，开始电泳，待溴酚蓝跑到分离胶与浓缩胶的交界处时将电压调到120V，继续跑电泳，待溴酚蓝距离分离胶底部上方约1cm左右时，停止电泳。
把待用的滤纸和NC膜剪成合适的大小(剪成比胶大一圈，并在左上角剪掉约1cm左右的边角，便于区分正反)，置于转膜缓冲液(4℃预冷)中浸泡20分钟，取出转膜夹子，按照阳极－三层浸润的滤纸－凝胶－膜－三层浸润的滤纸－阴极的顺序组装成“三明治”的结构。
将组装好的“三明治”夹紧，然后将白色板子对着红色板子，黑色板子对着黑色板子放入转膜架子中，一并放入转膜槽中，倒入1L的转膜液(转膜液用之前放入-80℃冰箱中预冷10分钟)，同时将转模槽冰浴，连接电源，电流设置为350mA，时间约为1h，开始转膜。
待转膜完成后，将NC膜轻轻取出用蒸馏水正反面冲洗3次，在WB专用自封袋中加入无蛋白封闭液，4℃摇床孵育过夜。将NC膜取出后放入孵育盒中，加入含WNT10A抗体的稀释液，室温条件下置于摇床上摇60分钟，4℃过夜。
从4℃冰箱中取出一抗封闭的膜，置于室温60分钟，用TBST冲洗5次，每次5分钟，洗去一抗封闭液。加入含有二抗的稀释液后室温封闭，摇床震动1小时。从4℃冰箱中取出二抗封闭的膜，置于室温60分钟，用TBST冲洗5次，每次5分钟，洗去二抗封闭液。用高敏ECL显色试剂盒显色(应避光操作)，将NC膜放入暗盒中，按A液与B液1：1配制好的显影液加在膜上，避光反应3-5分钟，然后将凝胶成像系统调整曝光时间，照相保存。
二、试验结果
(1)Polybrene和Puromycin的最佳浓度筛选
在成纤维细胞转染24h后，6μg/ml为最大无明显毒性的浓度；在转染上皮细胞24h后，3μg/ml为最大无明显毒性的浓度。6μg/ml在三天内杀死里全部的成纤维细胞和上皮细胞。
(2)MOI值的测定
上皮细胞转染72h后，MOI＝5的组荧光值最大，转染效率最高(图23)；成纤维细胞转染72h后，MOI＝4的组荧光值最大，转染效率最高(图24)。
(3)构建HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO、
HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO稳转上皮细胞/成纤维细胞系
通过荧光显微镜观察抗性筛选良好，说明成功构建了HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO稳转上皮细胞(图25)/成纤维细胞系(图26)，可以进行后续实验。
(4)QPCR验证
在上皮细胞中，HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO组WNT10A的表达量是NC组的3.6206倍(p＜0.1)；HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO组WNT10A的表达量是NC组的1.6714倍(p＜0.05)；HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO组WNT10A的表达量是NC组的2.1504倍(p＜0.01)；HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO组WNT10A的表达量是NC组的0.232倍(p＜0.01)；HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO组WNT10A的表达量是NC组的0.5651倍(p＜0.01)倍；HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO组WNT10A的表达量是NC组的0.4583倍(p＜0.01)(图27)。
在成纤维细胞中，HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO组WNT10A的表达量是NC组的2.2245倍(p＜0.01)；HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO组WNT10A的表达量是NC组的1.1697倍(p＞0.05)；HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO组WNT10A的表达量是NC组的1.593倍(p＜0.01)；HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO组WNT10A的表达量是NC组的0.368倍(p＜0.01)；HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO组WNT10A的表达量是NC组的0.62301倍(p＜0.01)倍；HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO组WNT10A的表达量是NC组的0.50223倍(p＜0.01)(图28)。
(5)蛋白浓度的测定
根据绘制蛋白标准曲线(图29)和各样品的OD值计算出各样品的浓度(表5)。
表5样品蛋白浓度
Figure BDA0003112026570000111
(6)western blot
利用image-pro plus分析上皮细胞(图30)和成纤维细胞(图32)各处理组WNT10A与β-actin胶片的灰度值，并计算出上皮细胞中各试验组WNT10A蛋白的相对表达量(图31)和成纤维细胞中各试验组WNT10A蛋白的相对表达量(图33)。计算方法为各处理组内WNT10A的灰度值比β-actin的灰度值。
在上皮细胞中，空白组、阴性对照、HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-130b-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-301a-ZsGREEN-PURO组和HBLV-chi-532-ZsGREEN-PURO组的WNT10A/β-actin分别为：0.159、0.194、0.604、0.280、0.419、0.050、0.102和0.094。
在成纤维细胞中，空白组、阴性对照、HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-130b-ZsGREEN-PURO组、HBLV-chi-301a-ZsGREEN-PURO组和HBLV-chi-532-ZsGREEN-PURO组的WNT10A/β-actin分别为：0.285、0.295、0.666、0.332、0.465、0.109、0.179和0.158。
本发明成功构建了HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO稳转上皮细胞系和成纤维细胞系，通过QPCR和western blot试验发现，无论是在成纤维细胞还是在上皮细胞中，chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p在mRNA和蛋白水平上均可不同程度的调控WNT10A的表达。chi-miR-130b-3p是通过与WNT10A的靶向结合来实现的，而chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p可能通过其他途径实现这一作用。
实施例5 miRNA对内蒙古绒山羊胎儿期上皮细胞和成纤维细胞的影响
一、试验方法
(1)分别将生长良好的HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO稳转上皮细胞系/成纤维细胞系的增殖用0.25％胰蛋白酶溶液消化下来，以2×105个/孔细胞接种于96孔板中，每孔100uL培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔24h取3个孔的细胞，每孔加10uL的CCK8培养1-4h，置于酶标仪450nm测OD值，以培养时间为横坐标，细胞浓度为纵坐标绘细胞生长曲线。
(2)分别将生长良好的HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO、HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO稳转成纤维细胞系/上皮细胞系的增殖用0.25％胰蛋白酶(无EDTA)溶液消化下来，2000rpm离心7分钟。细胞收集好后去上清，加入适量PBS缓冲液，用移液枪轻轻吹打混匀，2000rpm离心7分钟。细胞洗涤完成后去上清，加入200μL 1×Binding Buffer，用移液枪轻轻吹打混匀。Annexin V-FITC荧光染色：各试验组加入5μL Annexin V-FITC，混匀后避光15分钟。PI荧光染色：上机前5分钟各试验组加入5μL PI，混匀后避光5分钟。上机前各试验组补加200μL 1×Binding Buffer，混匀后上机。
二、实验结果
(1)CCK8法检测chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p对上皮细胞和成纤维细胞增殖的影响
通过HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO上皮细胞系与阴性对照组相比(图34A)我们发现，干扰掉chi-miR-130b-3p后的上皮细胞的细胞生长曲线与阴性对照组在1-6天内无显著差异(p＞0.05)且曲线变化趋势相近，但是通过HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO上皮细胞系与阴性对照组相比(图34D)我们发现，将上皮细胞的chi-miR-130b-3p过表达后，上皮细胞系增长缓慢，且HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO上皮细胞系在第三天开始与阴性对照组开始出现极显著差异(p＜0.01)，表明chi-miR-130b-3p能够抑制上皮细胞的增殖。
通过HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO上皮细胞系与阴性对照组相比(图34B)我们发现，干扰掉chi-miR-130b-3p后的上皮细胞的细胞生长曲线与阴性对照组在1-6天内无显著差异(p＞0.05)，但是通过HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO上皮细胞系与阴性对照组相比(图34E)我们发现，将上皮细胞的chi-miR-130b-3p过表达后，HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO上皮细胞系增长缓慢，且HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO上皮细胞系在第三天开始与阴性对照组开始出现极显著差异(p＜0.01)，表明chi-miR-301a-3p能够抑制上皮细胞的增殖。
通过HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO上皮细胞系与阴性对照组相比(图34C)我们发现，干扰掉chi-miR-532-3p后的上皮细胞的细胞生长曲线与阴性对照组在1-6天内无显著差异(p＞0.05)，但是通过HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO上皮细胞系与阴性对照组相比(图34F)我们发现，将上皮细胞的chi-miR-130b-3p过表达后，上皮细胞系增长缓慢，且HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO上皮细胞系在第三天开始与阴性对照组开始出现显著差异(p＜0.05)，并在第四天开始转变为极显著差异(p＜0.01)，表明chi-miR-532-3p能够抑制上皮细胞的增殖。
通过HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO成纤维细胞系与阴性对照组相比(图35A)我们发现，干扰掉chi-miR-130b-3p后的成纤维细胞的细胞生长曲线与阴性对照组在1-6天内无显著差异(p＞0.05)且曲线变化趋势相近，但是通过HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO成纤维细胞系与阴性对照组相比(图35D)我们发现，将成纤维细胞的chi-miR-130b-3p过表达后，成纤维细胞系增长缓慢，且HBLV-chi-130b-ZsGreen-PURO成纤维细胞系在第二天开始与阴性对照组开始出现显著差异(p＜0.05)，到了第四天差异变为极显著(p＜0.01)，表明chi-miR-130b-3p能够抑制成纤维细胞的增殖。
通过HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO成纤维细胞系与阴性对照组相比(图35B)我们发现，干扰掉chi-miR-301a-3p后的成纤维细胞的细胞生长曲线与阴性对照组在1-6天曲线变化趋势相近，但在第三天有显著差异(p＜0.05).通过HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO成纤维细胞系与阴性对照组相比(图35E)我们发现，将成纤维细胞的chi-miR-301a-3p过表达后，成纤维细胞系增长缓慢，且HBLV-chi-301a-ZsGreen-PURO成纤维细胞系在第三天开始与阴性对照组开始出现极显著差异(p＜0.01)，表明chi-miR-301a-3p能够抑制成纤维细胞的增殖。
通过HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO成纤维细胞系与阴性对照组相比(图35C)我们发现，干扰掉chi-miR-532-3p后的成纤维细胞的细胞生长曲线与阴性对照组细胞生长曲线变化趋势相近且无显著差异(p＞0.05)。将成纤维细胞中的chi-miR-532-3p过表达后(图35F)，HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO成纤维细胞系在第三天开始与阴性对照组开始出现极显著差异(p＜0.01)，表明chi-miR-532-3p能够抑制成纤维细胞的增殖。
(2)Annexin V-FITC/PI双染色法检测chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p对上皮细胞和成纤维细胞凋亡的影响
Annexin V-FITC/PI双染色法染色判定细胞凋亡的依据为：象限Q2-3(PI-/Annexin V-FITV-)为细胞膜膜完整的活细胞，象限Q2-1(PI+/Annexin V-FITC-)为细胞膜损伤的细胞，象限Q2-2(PI+/Annexin V-FITC+)为凋亡晚期细胞，象限Q2-4(PI-/AnnexinV-FITC+)为凋亡早期细胞。
在上皮细胞凋亡柱状图(图36H)我们可以发现，HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO上皮细胞系的细胞凋亡测定(图36B)与阴性对照(图36A)相比无显著差异(p＞0.05)；HBLV-chi-130b--ZsGreen-PURO成上皮细胞系的细胞凋亡测定(图36E)与阴性对照(图36A)相比差异极显著增加(p＜0.01)，表明chi-miR-130b-3p可以增加上皮细胞的凋亡。
HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO上皮细胞系的细胞凋亡测定(图36C)与阴性对照(图36A)相比无显著差异(p＞0.05)；HBLV-chi-301a--ZsGreen-PURO成上皮细胞系的细胞凋亡测定(图36F)与阴性对照(图36A)相比差异极显著增加(p＜0.01)，表明chi-miR-301a-3p可以增加上皮细胞的凋亡。
HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO上皮细胞系的细胞凋亡测定(图36D)与阴性对照(图36A)相比无显著差异(p＞0.05)；HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO成上皮细胞系的细胞凋亡测定(图36G)与阴性对照(图36A)相比差异极显著增加(p＜0.01)，表明chi-miR-532-3p可以增加上皮细胞的凋亡。
在成纤维细胞凋亡柱状图(图37H)我们可以发现，HBLV-chi-130b-3p-sponge-ZsGreen-PURO成纤维细胞系的细胞凋亡测定(图37B)与阴性对照(图37A)相比无显著差异(p＞0.05)；HBLV-chi-130b--ZsGreen-PURO成上皮细胞系的细胞凋亡测定(图37E)与阴性对照(图37A)相比无显著差异(p＞0.05)，表明chi-miR-130b-3p不会增加成纤维细胞的凋亡。
HBLV-chi-301a-3p-sponge-ZsGreen-PURO成纤维细胞系的细胞凋亡测定(图37C)与阴性对照(图37A)相比极显著降低(p小于0.01)；HBLV-chi-301a--ZsGreen-PURO成上皮细胞系的细胞凋亡测定(图37F)与阴性对照(图37A)相比无显著差异(p＞0.05)，表明chi-miR-301a-3p与成纤维细胞的凋亡有关，降低chi-miR-301a-3p的表达量可以抑制成纤维细胞的凋亡。
HBLV-chi-532-3p-sponge-ZsGreen-PURO成上皮细胞系的细胞凋亡测定(图37D)与阴性对照(图37A)相比无显著差异(p＞0.05)；HBLV-chi-532-ZsGreen-PURO成上皮细胞系的细胞凋亡测定(图37G)与阴性对照(图37A)相比无显著差异(p＞0.05)，表明chi-miR-532-3p不会增加成纤维细胞的凋亡。
CCK8法和Annexin V-FITC/PI双染色法结果显示chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p对上皮细胞和成纤维细胞增殖的影响，结果表明chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p均不同程度的抑制上皮细胞和成纤维细胞的增殖。chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p对上皮细胞和成纤维细胞凋亡的影响，结果表明在上皮细胞中，chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p均可不同程度促进细胞凋亡；在成纤维细胞中，chi-miR-130b-3p和chi-miR-532-3p对细胞凋亡无影响，chi-miR-301a-3p低表达会抑制细胞凋亡。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 内蒙古农业大学
<120> 一种与羊的皮肤毛囊成熟相关的miRNA及应用
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(“”)
<400> 1
cagtgcaatg ttaaaagggc a 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(“”)
<400> 2
cagtgcaata gtattgtcaa agc 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(“”)
<400> 3
cctcccacac ccaaggcttg c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(“”)
<400> 4
tgagatgaag cactgtagct cg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(“”)
<400> 5
cagtgcaatg atgaaagggc at 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(“”)
<400> 6
cagtgcaatg atattgtcaa agc 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(“”)
<400> 7
tgtgcaaatc tatgcaaaac tga 23
<210> 8
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<212> DNA
<213> 未知(“”)
<400> 8
tagtgcaata ttgcttatag ggt 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(“”)
<400> 9
tgtgcaaatc catgcaaaac tga 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 10
cgcttcggca gcacatatac 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 11
aaatatggaa cgcttcacga 20
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 12
cgcctcccac acccaag 17
<210> 13
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<400> 13
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 14
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgcaagc 50
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 15
gcgcgtagtg caatattgct ta 22
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 16
agtgcagggt ccgaggtatt 20
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<212> DNA
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<400> 17
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacccta 50
<210> 18
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<212> DNA
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<400> 18
cgcgtgagat gaagcactgt 20
<210> 19
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<212> DNA
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agtgcagggt ccgaggtatt 20
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<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 21
cgcgcagtgc aatgatattg t 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 22
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 23
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgctttg 50
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 24
cgcgcagtgc aatagtattg t 21
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 25
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 26
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<212> DNA
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<400> 26
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgctttg 50
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 27
gcgtgtgcaa atctatgcaa 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
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<400> 28
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 29
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcagtt 50
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 30
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<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 31
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 32
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcagtt 50
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 33
cgcgcagtgc aatgttaaa 19
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 34
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<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 35
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactgccct 50
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 36
gcgcagtgca atgatgaaa 19
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 37
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 38
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacatgccc 50

Claims (10)

1.一种与羊的皮肤毛囊成熟相关的miRNA，其特征在于，所述miRNA靶向羊的WNT10A基因，所述WNT10A基因的NCBI序列号为XM_018059319.1。
2.根据权利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA选自chi-miR-130a-3p、chi-miR-301a-3p、chi-miR-532-3p、chi-miR-143-3p、chi-miR-130b-3p、chi-miR-301b-3p、chi-miR-19a、chi-miR-454-3p、chi-miR-19b-3p，其对应的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.1-9所示。
3.根据权利要求2所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA选自chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p。
4.根据权利要求2所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA为chi-miR-130b-3p。
5.根据权利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述羊为内蒙古绒山羊，优选羊处于胎儿期。
6.根据权利要求5所述的miRNA，其特征在于，所述羊胎儿期七个时期包括45天、55天、65天、75天、95天、115天和135天。
7.权利要求1-6任一项所述的miRNA在研究羊的皮肤毛囊成熟中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括miRNA抑制上皮细胞和成纤维细胞增殖。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用miRNA促进上皮细胞凋亡。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述miRNA包括chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p和chi-miR-532-3p。
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