CN109897853B - 一种长链非编码rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种长链非编码RNA及其应用，利用RNA‑seq分析SD大鼠坐骨神经损伤后不同时间点样本中差异的LncRNAs获得一种与细胞增殖和细胞周期调控有关的LncRNA LOC680254，可作为miRNA分子海绵特异性结合miR‑30d‑3p、miR‑671、miR‑3594‑3p或miR‑3473，从而拮抗miRNA的功能，促进Psrc1和Ska1基因的表达，从而促进细胞的增殖。

Description

一种长链非编码RNA及其应用

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，涉及一种长链非编码RNA及其应用。

技术背景

长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度大于200nt，不具有编码功能的RNA。LncRNA表达具有时空特异性，能在染色质重塑、转录调控以及转录后加工等多种水平调节基因的表达。LncRNA与多种疾病密切相关，目前大部分有关LncRNA的研究主要集中于与癌症的关系以及其作为肿瘤特异性标记物的作用，而LncRNA于其他生理活动或者疾病的研究非常有限。

在多细胞生物体内，各类细胞周期存在非常严密的调控系统，使各类细胞能够根据机体的需要进行增殖或处于静止状态。细胞周期除了受到细胞内某些物质的合成、降解或活化的影响，还受细胞内外各信号的种类、强度以及持续时间的控制。细胞周期的调控是细胞中对不同信号进行整合后依靠细胞内的级联翻译完成的，其中任一环节发生异常均可能导致细胞增殖过度或缺陷，并常常伴有细胞分化异常。细胞增殖过度或缺陷以及细胞凋亡过度与不足与多种疾病有关，例如神经退行性疾病、心血管疾病、免疫性疾病等等。因此研究发现与细胞周期调控有关的LncRNA具有很大的临床应用价值。

发明内容

本发明利用RNA-seq分析SD大鼠坐骨神经损伤后不同时间点样本中差异的LncRNAs获得一种与Schwann细胞的增殖和细胞周期调控有关的LncRNA LOC680254，有潜力成为周围神经损伤修复的新靶点。

本发明的具体技术方案如下：

一种长链非编码RNA LncRNA LOC680254，其cDNA序列如SEQ ID No：1所示。

本发明另一目的在于提供上述长链非编码RNA以及miR-30d-3p(SEQ ID No：2)、miR-671(SEQ ID No：3)、miR-3594-3p(SEQ ID No：4)和miR-3473(SEQ ID No：5)作为分子干预靶点在调控细胞增殖、凋亡和细胞周期中的应用。

本发明所述长链非编码RNA能够作为miRNA分子海绵特异性结合miR-30d-3p、miR-671、miR-3594-3p或miR-3473，从而拮抗miRNA的功能；miR-30d-3p、miR-671功能受到抑制后能够促进Psrc1基因的表达；miRNA-3594-3p、miRNA-3473功能受到抑制后能够促进Ska1基因的表达，从而对细胞增殖、凋亡及细胞周期进行调节。

本发明另一目的在于提供上述长链非编码RNA以及miR-30d-3p、miR-671、miR-3594-3p和miR-3473作为分子干预靶点在制备治疗与细胞增殖或凋亡有关疾病的药物中的应用。

上述疾病包括：与细胞增殖过度有关的疾病包括肿瘤、肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、前列腺肥大，原发性血小板增多症、家族性红细胞增多症、类风湿性关节炎、银屑病、肾小球间质性病变、动脉粥样硬化等。

与细胞增殖缺陷有关的疾病包括神经细胞再生、糖尿病肾病、神经退行性疾病(阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症)、再生障碍性贫血等。

与细胞凋亡不足有关的疾病包括肿瘤以及由于针对自身抗原的T淋巴细胞不能有效予以清除引起的自身免疫疾病等。

与细胞凋亡过度有关的疾病包括心血管疾病如心肌缺血-再灌注损伤、心力衰竭、神经退行性疾病(阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症等)、病毒感染(如艾滋病)。本发明一项具体的研究应用，长链非编码RNA可以作为分子干预靶点在制备调控神经胶质细胞(Schwann细胞)的增殖进而修复外周神经损伤修复药物中的应用。

本发明利用RNA-seq分析SD大鼠坐骨神经损伤后不同时间点样本中差异的LncRNAs得到30个差异表达的LncRNAs，其中本发明所述LncRNA LOC680254在神经损伤后持续表达上调。qRT-PCR证明LncRNA LOC680254表达变化与RNA-seq结果一致。RACE反应得到LncRNA LOC680254的全长序列，位于13q22。亚细胞定位分析LncRNA LOC680254主要表达于Schwann细胞的细胞质中。

本发明研究表明体外干扰LncRNA LOC680254的表达，显著抑制Schwann细胞增殖、促进Schwann细胞的凋亡，并且阻滞了Schwann细胞周期的发展。基因芯片分析与ceRNA预测结合Luciferase检测提示LncRNA LOC680254与4个miRNAs相结合，调节与细胞增殖、凋亡、细胞周期相关的靶基因Psrc1和Ska1的表达，其中miR-30d-3p、miR-671靶向Psrc1基因；miRNA-3594-3p、miRNA-3473靶向Ska1基因。本发明研究提示LncRNA LOC680254有可能通过调节与细胞周期有关的基因表达影响Schwann细胞的增殖和细胞周期，有潜力成为周围神经损伤修复的新靶点。

附图说明

图1为本发明所述的LncRNA LOC680254的表达趋势及分布。(图1a.qRT-PCR检测坐骨神经损伤后坐骨神经组织中LOC680254的表达变化(以GAPDH内参)。相比于0d，损伤后坐骨神经中的LncRNA LOC680254持续表达上调(**p<0.01)。图1b.qRT-PCR检测LncRNALOC680254在Schwann细胞细胞质与细胞核中的相对表达水平。U6作为细胞核里内参，β-actin作为细胞质内参。LncRNA LOC680254在细胞质或是细胞核中的分布用其占总RNA的百分比呈现)。

图2为本发明所述的干扰LncRNA LOC680254对Schwann细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。(图2a.Edu细胞增殖实验检测干扰LncRNA LOC680254对Schwann细胞增殖的影响。右下侧柱状图为siRNA干扰LncRNA LOC680254后Schwann细胞的增殖率，LOC680254敲除后显著抑制Schwann细胞的增殖。图2b.Annexin V-TITC/PI染色，流式细胞技术检测干扰LncRNA LOC680254对Schwann细胞凋亡的影响。右下侧柱状图为流式检测不同实验组Schwann细胞凋亡率统计图。图2c.转染siRNA及对照48h后，Tunel检测Schwann细胞的凋亡情况。右下侧柱状图为Tunel检测不同实验组Schwann细胞凋亡率统计图。图2d.通过流式检测干扰LncRNA LOC680254对Schwann细胞周期的影响。图中所示为细胞周期各时期细胞平均百分比(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001))。

图3为本发明所述的LncRNA LOC680254通过调节miR-30d-3p、miR-671及miRNA-3594-3p、miRNA-3473影响基因Psrc1和Ska1的表达。(图3a.qRT-PCR检测Schwann细胞中干扰LncRNA LOC680254后基因Psrc1和Ska1的表达。图3b.Luciferase reporter assays检测LncRNA LOC680254与miR-30d-3p、miR-671及miRNA-3594-3p、miRNA-3473的结合情况。

图3c.Luciferase reporter assays检测miR-30d-3p、miR-671及miRNA-3594-3p、miRNA-3473分别Psrc1和Ska1的3’UTR的结合情况。图3d.qRT-PCR检测Schwann细胞中转染miR-30d-3p、miR-671后Psrc1的表达情况。图3e.qRT-PCR检测Schwann细胞中转染miRNA-3594-3p、miRNA-3473后Ska1的表达情况(**p<0.01，***p<0.001))。

图4为本发明所述的LncRNA LOC680254通过Psrc1和Ska1调节Schwann细胞增殖。(图4a.Edu细胞增殖实验检测Schwann细胞中过表达LncRNA LOC680254对Schwann细胞增殖的影响。图4b.Edu细胞增殖实验检测Schwann细胞中干扰Psrc1和Ska1对过表达LncRNALOC680254调节Schwann细胞增殖的影响(*p<0.05，**p<0.01))。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1考察LncRNA LOC680254的表达及分布特性

1、坐骨神经组织RNA提取及qRT-PCR

取大鼠0d、1d、4d、7d、14d坐骨神经夹伤近端的组织按

Reagent(Invitrogen)说明书提取组织RNA，逆转录后，采用

PrimeScript RT-PCR Kit(Takara)进行qRT-PCR，操作按试剂盒说明书进行(以GAPDH作为内参),PCR仪反应程序：Stage 1：95℃2min，Stage2(Cycle：40)：95℃15s，60℃30s；Stage 3：95℃15s，60℃1min，95℃15s。LncRNA LOC680254引物序列如SEQ ID No：6-7所示。qRT-PCR结果如图1a所示，结果显示与0d相比，损伤的坐骨神经组织中的LncRNA LOC680254表达持续上调。

2、快速扩增cDNA末端(RACE)

根据SMARTer^TM RACE(Clotech)说明书要求，Tm>70℃，碱基数在28nt左右，针对LOC680254设计5’-GSP的引物。取SD大鼠坐骨神经组织，使用RNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen)提取高品质RNA，严格按照SMARTer^TM RACE(Clotech)试剂盒的说明书体系，分别进行用5’-CDS primer完成First-strand cDNA的合成，得到相应的5’-cDNA。根据说明书要求，针对LncRNA LOC680254设计5’-GSP的引物LOC680254-5-GSP序列如SEQ ID No：8所示，随后使用降落PCR进行5’-RACE，获取LOC680254的5’末端。测序完成后，将结果和原来已知序列进行拼接，获取LOC680254的cDNA全长序列并与UCSC(http://genome.ucsc.edu/)数据库的大鼠序列进行比对分析，表明LncRNA LOC680254位于13q22。

3、qRT-PCR检测LncRNA的亚细胞定位

按照PARIS^TMKit(Ambion公司)，分别从Schwann细胞中提取等份的细胞质与细胞核中的RNA。将上述获取的100μl RNA溶液，按照RNeasy Mini Kit中RNA cleanup(Qigen)操作，纯化RNA，两份RNA用相同体积的RNase-free水洗脱(30μl)，分别命名为细胞质-RNA、细胞核-RNA，测浓度。按照逆转录试剂盒(Takara RR047A)，将等体积细胞质-RNA和细胞核-RNA溶液逆转录为cDNA，采用

PrimeScript RT-PCR Kit(Takara)进行qRT-PCR。PCR仪反应程序：Stage 1：95℃2min，Stage 2(Cycle：40)：95℃15s，60℃30s；Stage 3：95℃15s，60℃1min，95℃15s。qRT-PCR检测LncRNA LOC680254、U6、β-actin的表达，与主要在细胞核中表达的U6，主要在细胞质中表达的β-actin的相比，结果如图1b所示，结果表明LncRNA LOC680254主要在细胞质中表达

实施例2考察干扰LncRNA LOC680254表达对Schwann细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

1、原代Schwann细胞的培养

取新生1d的SD大鼠的坐骨神经若干只、加入1ml 3mg/ml的胶原酶，剪碎组织、37℃消化30min；室温离心1200rpm，5min，弃除胶原酶，加入1ml胰酶，37℃消化10min；加入3ml完全培养基终止消化，过滤筛网，离心去上清(1200rpm，5min)，再加入3ml完全培养基洗2遍；将细胞种在PLL包被好的培养皿中培养(5％CO₂，37℃)；第二天，换成含有Arac(10μM)的完全培养基，抑制成纤维细胞的快速增殖；第四天，换成含有HRG(50ng/ml)和Forskolin(2μM)的完全培养基刺激Schwann细胞快速生长。待细胞融合后，对细胞进行纯化。先将细胞胰酶消化并转移到5ml离心管中、离心(1200rpm,5min)去除上清；用含有anti-thy1.1(1∶1000)的完全培养基悬浮细胞，冰上孵育2h；1200rpm 5min离心去上清，加入补体(250μl Rabbitcomplement+750μl DMEM)，37℃，孵育0.5h；3ml DMEM洗三遍；种到PLL包被好的培养皿中；8-12h换液培养(含有HRG和Forskolin)，待细胞融合，纯度达95％以上，用于后续实验。

2、Schwann细胞转染

小分子RNA转染：本实验中，使用Lipofectamine^TMRNAiMAX将siRNA(终浓度：100nM)、miRNA minic(购自于广州市锐博生物科技有限公司，终浓度：20nM)转入Schwann细胞，第二天换成完全培养基，根据需要进行后续实验。针对LncRNA LOC680254的siRNA 254-si-1和254-si-2序列如SEQ ID No：9 5’CCAGCUGUCCAAGAUCAGA dTdT 3’和SEQ ID No：105’UGUGGUUCCUUCAUGACAA dTdT 3’所示。

质粒DNA转染：先按要求接种细胞，待Schwann细胞密度达到85％以上时，使用Lipofectamine^TM3000，按照lip3000：质粒＝2μl：1μg的浓度比，均匀滴加到细胞培养液中，轻轻混匀，4～6h后换成新的完全培养基，第二天再次换成新的完全培养基，根据需要进行后续实验。

3、Edu细胞增殖实验

EdU标记：用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，配制适量的50μMEdU培养基；96孔板每孔加入100μl 50μM EdU培养基37℃培养箱，孵育24小时，弃培养基；PBS清洗细胞1～2次，每次5分钟。细胞固定化：每孔加入100μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液；每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；每孔加入100μl PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；(加强)每孔加入100μl渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。Apollo染色：每孔加入100μl的1X

染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；加入100μl渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟，弃渗透剂；(加强)每孔每次加入100μl甲醇清洗1～2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。DNA染色：用ddH₂O按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1X Hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入100μl 1X Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；每孔每次加入100μl PBS清洗1～3次；每孔加入100μl PBS荧光显微镜拍照。用LncRNALOC680254的2个特异性的siRNA(254-si-1、254-si-2)与siRNA Negative Control(NC)转染原代培养的Schwann细胞，在转染siRNA 48h后，按上述方法进行EdU标记，Edu实验结果如图2a所示。结果表明：与对照组相比，LncRNA LOC680254的敲除，显著抑制了Schwann细胞的增殖。

4、Annexin V-FITC细胞凋亡检测

用胰酶将Schwann细胞消化下来，转移至5ml离心中。1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用适量PBS重悬细胞并计数。取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。加入10μl PI(碘化丙啶)染色液，轻轻混匀。室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光。通过LncRNA LOC680254特异性的siRNA(254-si-1、254-si-2)干扰Schwann细胞中LncRNA LOC680254的表达，在转染siRNA后48h，按上述方法进行流式细胞技术检测Schwann细胞的凋亡情况，流式结果如图2b所示，结果表明与阴性对照组siRNA Negative Control(NC)相比，干扰LncRNALOC680254显著促进Schwann细胞的凋亡。

5、TUNEL染色(TMR Red)

在15-25℃下用新鲜的固定液固定风干的Schwann细胞1h；PBS清洗30min；渗透液冰浴(2-8℃)2min；Tunel反应混合物的准备：取两个管(管1：酶浓缩溶液，管2：标记溶液)为10个样本和2个阴性对照组进行染色，每个样本使用50μl Tunel混合液，每个对照组使用50μl标记溶液。取100μl标记溶液(管2)于对照组。将酶浓缩溶液(管1)的总量(50μl)添加到管2中剩余的450μl标记溶液中，以配成500μlTunel混合液，混匀，以使各成分充分混合。标记：用PBS清洗玻片3次，每次3min，小心吸干样品周围的液体；添加50μlTunel混合液到样本中；湿盒中37℃避光孵育60分钟；用PBS清洗3次；Hoechst染核30min；抗荧光淬灭封片液封片，荧光倒置显微镜或是激光共聚焦显微镜检测。通过LncRNA LOC680254特异性的siRNA(254-si-1、254-si-2)干扰Schwann细胞中LncRNA LOC680254的表达，在转染siRNA后48h，按上述方法进行TUNEL染色检测Schwann细胞的凋亡情况如图2c所示，结果表明，与阴性对照组siRNA Negative Control(NC)相比，干扰LncRNA LOC680254显著促进Schwann细胞的凋亡。

6、流式检测细胞周期

细胞样品的准备：用胰酶消化Schwann细胞，并将细胞转移至5ml离心管中。1000g左右离心5分钟，沉淀细胞。弃上清，加入1ml预冷的PBS，重悬细胞并转移到1.5ml离心管内。1000g离心5min，沉淀细胞，小心弃除上清。可以残留少量PBS，避免吸走细胞。轻弹离心管底，分散细胞，避免细胞聚集成团。细胞固定：向离心管中加入1ml预冷的70％乙醇，用枪头轻轻吹打混匀，4℃固定24小时。1000g离心5分钟，沉淀细胞。弃上清，加入1ml预冷的PBS，重悬细胞。1000g离心5min，沉淀细胞，弃上清，可以残留少量PBS，并轻弹管底以分散细胞，避免细胞成团。PI染色液的配制：根据待检测样品的数量配制适量的PI染色液。染色：每管细胞样品中加入0.5ml PI染色液，用枪头轻轻吹打，充分重悬细胞，37℃避光温浴30分钟。4℃或冰浴避光存放。24小时内完成流式检测。流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。在Schwann细胞中转染LncRNA LOC680254特异性siRNA(254-si-1、254-si-2)以及阴性对照siRNA Negative Control(NC)，48h后按上述方法进行流式检测细胞周期。结果如图2d所示，结果表明，与对照组相比，干扰LncRNA LOC680254，S期的细胞数显著减少。

实施例3考察LncRNA LOC680254通过调节miR-30d-3p、miR-671及miRNA-3594-3p、miRNA-3473影响基因Psrc1和Ska1的表达

1、靶基因筛选

对原代培养的Schwann细胞转染LncRNA LOC680254特异性siRNA与Negativecontrol(NC)，提取总RNA，用Agilent表达谱芯片进行表达谱分析，筛选下调2倍以上的548个基因。依据LncRNA LOC680254的全长序列，用Tay Y等(Tay Y,Kats L,Salmena L,etal.Coding-independent regulation of the tumor suppressor PTEN by competingendogenous mRNAs[J].Cell,2011,147(2):344-357.)建立的生物信息学预测ceRNA的方法，挑选出191个LncRNA LOC680254可能以ceRNA方式调节的靶基因及miRNA。这191个靶基因中下调3倍以上的基因有54个，miRNAs结合位点数不小于2个的基因有82个。两者取交集得到20个基因，其中与细胞增殖和凋亡相关的有12个基因。进一步通过qRT-PCR和双荧光素酶报告检测确认Psrc1和Ska1这两个靶基因。

2、qRT-PCR检测Schwann细胞中干扰LncRNA LOC680254后基因Psrc1和Ska1的表达

用LncRNA LOC680254的特异性siRNA 254-si-2转染原代培养的Schwann细胞，在转染siRNA 48h后，收细胞，提RNA，逆转录，进行qRT-PCR检测基因Psrc1和Ska1的表达，基因Psrc1的引物序列如SEQ ID No：11和12所示，基因Ska1的引物序列如SEQ ID No：13和14所示。结果如图3a所示，结果表明干扰Schwann细胞中LncRNA LOC680254表达时，Psrc1、Ska1的表达也降低。说明LncRNA Loc680254可以调控Psrc1、Ska1的表达。

3、双荧光素酶报告检测

使用Dual-

Reporter Assay System(Promega)试剂盒进行检测。293FT细胞转染后继续培养24h，观察细胞状态，用预冷的PBS洗一次；加入100μl 1×PLB，将培养板摇床室温剧烈摇晃15min；每个孔吹打5次，将裂解液转移EP管中；4℃离心，13000rpm，5min；在96孔板中加入20μl LABII，再加入20μl细胞裂解液，每孔吹打5次，操作均一，放入酶标仪上使用软件Gene5检测Firefly luciferase(Firefly)的荧光强度；再加入20μlStop&Glo，酶标仪检测Renilla luciferase(Renilla)荧光强度；将两荧光相比(relativeluciferase)。实验每次做3个复孔，进行3次以上实验重复，统计分析结果。将LncRNALOC680254的全长构建到pmirGLO载体上，在293FT细胞中共转染pmirGLO-LOC680254-full与4个miRNAs(miR-30d-3p、miR-671、miRNA-3594-3p、miRNA-3473)及miRNA mimic(MC)，细胞培养24h后，按上述方法，利用双荧光素酶报告基因系统，检测Firefly与Renilla的荧光值，并计算Relative luciferase(Firefly/Renilla)，结果如图3b所示。结果表明：与MC相比，转染了miRNAs的实验组，标准化的荧光素酶活性显著降低，说明LncRNA LOC680254可能与这4个miRNAs都有一定程度的结合。接着又通过luciferase实验，检测上述4个miRNAs与对其应靶基因Psrc1和Ska1的3’-UTR的结合情况，结果如图3c所示。结果表明，与MC相比，转染miRNAs后，荧光素酶活性都出现显著性下调，miR-30d-3p、miR-671可以与Psrc1结合；miR-3594-5p、miR-3473可以与Ska1结合。

4、qRT-PCR检测miRNAs对靶基因表达的影响

在原代培养的Schwann细胞中，分别转染miRNAs(miR-30d-3p、miR-671、miRNA-3594-3p、miRNA-3473)及miRNA mimic(MC)。转染miRNA后48h，收细胞，提RNA，逆转录，同上述方法进行qRT-PCR检测基因Psrc1和Ska1的表达。qRT-PCR检测结果如图3d和3e所示，结果表明，转染了miR-30d-3p，miR-671后Psrc1在mRNA水平显著下调；转染了miR-3473，miR-3594-3p后Ska1在mRNA水平也显著下调。这说明miR-30d-3p、miR-671、miRNA-3594-3p、miRNA-3473可以通过与Psrc1和Ska1的3’-UTR结合，抑制Psrc1和Ska1的表达，LncRNA LOC680254可以竞争性结合miR-30d-3p、miR-671、miRNA-3594-3p、miRNA-3473，从而拮抗miR-30d-3p、miR-671、miRNA-3594-3p、miRNA-3473对Psrc1和Ska1表达的抑制。

实施例4LncRNA LOC 680254通过Psrc1和Ska1调节Schwann细胞增殖

对原代培养的Schwann细胞感染包装有LncRNA LOC 680254全长的慢病毒(LV-254，对照病毒：LV-con)(用Enhanced infection solution(Eni.S)稀释病毒，按照MOI＝20感染)，在Schwann细胞中过表达LncRNA LOC 680254，12h后换回常规培养基，继续培养。再过表达LncRNA LOC 680254的Schwann细胞中转染Psrc1和Ska1特异性siRNA序列(SEQ IDNo:15 5’ggaggagauc cuugaugaa dTdT 3’和SEQ ID No:16 5’gcaucuauga gcucugugadTdT 3’)与Negative control(NC)，48h后按上述方法进行Edu细胞增殖实验。结果如图4a和4b所示。结果表明Schwann细胞中过表达LncRNA LOC 680254后，Schwann细胞增殖明显增加(图4a)，而干扰Psrc1或Ska1的表达，能拮抗LncRNA LOC 680254对Schwann细胞增殖的影响，表明LncRNA LOC 680254通过Psrc1和Ska1调节Schwann细胞增殖(图4b)。

序列表

<110> 南通大学

<120> 一种长链非编码RNA及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 785

<212> DNA

<213> 大鼠(Rat)

<400> 1

cttcgagctg ctggtggaag ctgagacggt gtggggaggc ggagagaaaa gggggtgcgg 60

gaaatttaaa aagatgggaa aggcgcttcc ctttcttctt agccccttcc ctgttgattt 120

ctggaccaat gcttctttct tgaacgaaga gcatgaagac gctgctttat ctaacagtca 180

ccttggagga aacgccatcg ttcttccaga agggagatct ggcccccggt cttggattct 240

gagatcagtg cgagatcccg gctctgcgcc ctgtccgccc tggaactgga tttatcatca 300

gtttagaata gcatggctac gatgtgtggt gtggatggat ggacgagccc cgcaagtgca 360

aacaggacag tccaggttac ctgacaaagc agccaccggt gcaccagctg tccaagatca 420

gacctaggtc aatcactgac atggctaaaa gcaccaagaa ggtctggatc attgtgctgc 480

ctcactccaa aaaatggtga caaaaattaa aatcaaccag cacgccagga tcctctgtgg 540

caagaccaag ataatgtggg ccactgtcat ctggcactgt ggttccttca tgacaacaat 600

ggctggtggg tcctgggttt actacaccac ttctgctgtc agtcaaactg gccatcagga 660

gactgaagga aatgaaagac catagaagtg ctactgtctg agcagccctg gcctccagta 720

aatgagtcat tcctatgaca aaattataat aaaaagtgtt ggttgagtaa aaaaaaaaaa 780

aaaaa 785

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cuuucaguca gauguuugcu gc 22

<210> 3

<211> 81

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggaagagg aggaagcccu ggaggggcug gaggugaugg auguuuuccu ccgguucuca 60

gggcuccacc ucuuucgagc c 81

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacaccgccu cugcccgcua gu 22

<210> 5

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aucacagucc uauuucugcc cucaaagaca aaaaugaugu cuagggcugg agagauggcu 60

aaguggg 67

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtgtggatg gatggacgag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttggagtga ggcagcacaa 20

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggagtgaggc agcacaatga tccagac 27

<210> 9

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccagcugucc aagaucagatt 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ugugguuccu ucaugacaatt 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gacagtagca agcccaccaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggatggctga gggaaatggt 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgacccagag ctcgactcat a 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgggatttca tgtacgcagg 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggaggagauc cuugaugaatt 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcaucuauga gcucugugatt 19

Claims (5)

1.一种干扰长链非编码 RNA的siRNA在制备治疗神经损伤疾病的药物中的应用，其特征在于所述siRNA以长链非编码 RNA作为分子干预靶点，所述长链非编码 RNA cDNA 序列如 SEQ ID No：1 所示。

2.如权利要求 1 所述的应用，其特征在于所述长链非编码 RNA 作为 miRNA 分子海绵特异性结合 miR-30d-3p、miR-671、miR-3594-3p 或 miR-3473，从而抑制 miRNA 的功能。

3.如权利要求 2所述的应用，其特征在于所述 miR-30d-3p、miR-671 功能受到抑制后能够促进 Psrc1 基因的表达；miRNA-3594-3p、miRNA-3473 功能受到抑制后能够促进Ska1 基因的表达，从而对细胞增殖、凋亡及细胞周期进行调节。

4.如权利要求 1所述的应用，其特征在于所述药物为调控神经胶质细胞的增殖进而修复外周神经损伤修复的药物。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述siRNA核苷酸序列如 SEQ ID No：9或10所示。

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