CN110819630B - 环状RNA circ-01477及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环状RNA circ‑01477及其在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用。研究结果表明通过下调或者抑制机体circ‑01477的表达，抑制星形胶质细胞的增殖和迁移，进而有利于中枢神经损伤修复。

Description

环状RNA circ-01477及其应用

技术领域

本发明属于神经再生和修复技术领域，具体涉及一种环状RNA circ-01477在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用。

背景技术

脊髓损伤是神经损伤中比较严重的一类，会导致永久的运动和感觉失常，影响人们生活质量。脊髓损伤后机体会发生一系列细胞和分子水平上的变化，涉及多种细胞，包括星形胶质细胞、少突细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞等，影响轴突损伤后的再生微环境。其中星形胶质细胞在脊髓损伤后增生，进而在损伤处形成胶质疤痕，阻碍轴突再生和神经环路重塑。此外，胶质疤痕也可以限制炎症反应扩散到周围组织，修复受损的血脑屏障，维持局部微环境。因此星形胶质细胞在脊髓损伤后发挥着重要的作用。

环状RNA circular RNAs(circRNAs)是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的RNA.，可以调节基因表达，参与多种生物学过程。目前关于circRNAs的研究主要集中在癌症方面。在神经系统发育中circRNAs也发挥着重要的作用，可以影响神经元的迁移和轴突生长。但到目前为止circRNAs在中枢神经系统损伤修复中的作用鲜有报道，尤其是对星形胶质细胞的表型调节。

发明内容

本发明目的在于提供一种新的大鼠源的环状RNA circ-01477及其用途，可用于制备促进神经再生和修复神经损伤药物。

本发明具体技术方案如下：

一种环状RNA circ-01477，所述circRNA的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，首尾连接成环状结构。

本发明另一目的在于提供上述环状RNA circ-01477在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用，所述神经损伤为中枢神经系统脊髓损伤。

可根据circ-01477核苷酸序列设计干预circ-01477表达的物质，选自化合物、蛋白、多肽、多糖、糖蛋白、糖肽、核酸中的一种或几种。

优选的，所述干预circRNA表达的物质，选自与circ-01477环化位点处的序列互补的siRNA。

本发明另一目的在于提供一种干预上述circ-01477表达的siRNA，核苷酸序列如下：

circ-01477 siRNA正义链:5’-cgaggggcuacacuugcca dTdT-3’(SEQ ID NO:4)。

circ-01477 siRNA反义链:5’-uggcaaguguagccccucg dTdT-3’(SEQ ID NO:5)。

本发明研究结果表明，所述siRNA能够干扰circ-01477的表达，抑制星形胶质细胞增殖和迁移。

本发明另一目的在于提供上述干预circ-01477表达的siRNA在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用。

本发明构建大鼠脊髓损伤半切模型，取损伤不同时间点的脊髓组织，通过RNA-seq及生物信息学分析，挑选损伤后表达变化明显的circRNAs。针对筛选到的circRNAs设计特异性的背向引物，再通过PCR验证以及测序鉴定，获得一种新的环状RNA circ-01477。在原代星形胶质细胞中，设计siRNA干扰circ-01477的表达，可以抑制星形胶质细胞增殖和迁移。

附图说明

图1为实施例1所述circ-01477在大鼠脊髓损伤后脊髓组织中不同时间点的表达变化(以GAPDH为内参)。

图2为实施例2所述circ-01477的siRNA对原代星形胶质细胞中circ-01477表达的影响(以GAPDH为内参)。

图3为实施例2所述circ-01477的siRNA干扰circ-01477对星形胶质细胞增殖(A)和迁移(B)的影响。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1：circ-01477的表达与鉴定

对SD(Sprague Dawley)大鼠脊髓半切损伤后不同时间点(0d、1d、3d、7d、14d、21d和28d)的脊髓组织进行RNA-seq。根据测序结果挑选全部由外显子组成且环>500nt的表达差异明显的circRNAs。测序结果分析筛选出来的circRNA，进一步通过PCR验证circRNA的存在。根据circRNAs引物设计原则对这些circRNAs设计背向引物，每个circRNA使用NCBI设计引物。根据引物信息选择不同的退火温度进行PCR扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳选出条带大小与预期相符的circRNAs，送公司测序，并将测序结果与原始序列比对验证其是否跨越环化位点。最终得到与预期条带大小一致且测序鉴定过环化位点的circRNAs，并挑选其中的circ-01477进行进一步研究，circ-01477的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

一、脊髓组织RNA提取

取鼠脊髓T 9半切损伤后不同时间点(0d、1d、3d、7d、14d、21d和28d)的损伤处近端5mm脊髓组织按

Reagent(Invitrogen)说明书提取组织RNA。大鼠脊髓损伤后不同时间点的损伤组织放入1.5ml RNase-free EP管，加入1ml

Reagent(Invitrogen)；将EP管置于冰中并使用电动匀浆器将组织匀浆，冰上静置5min-10min裂解。加入三氯甲烷200μl，涡旋剧烈振荡20s，室温静置10min；13000rpm，4℃离心15min。小心仔细吸取上清，加入异丙醇800μl，上下颠倒轻柔混匀，-20℃静置1h，13000rpm，4℃离心15min，弃除上清。加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃离心13000rpm，5min；去除上清，吹干。加入适量RNase-free H₂O，65℃促溶10min；检测RNA的OD值及浓度，-80℃保存备用。

二、RNA逆转录合成cDNA

使用逆转录试剂盒(Takara RR037A)，将500 ng的RNA逆转录为cDNA。

(1)circRNA的逆转

冰上操作，每个反应体系10μl，如下：

(2)mRNA的逆转

冰上操作，每个反应体系10μl，如下：

反应程序为：37℃45min，85℃5min，4℃∞。

三、qRT-PCR

根据circRNAs引物设计原则设计circRNAs qRT-PCR引物序列。

circ-01477qRT-PCR引物

circ-01477-F 5’-gaatgtcacaagcagatgagaga-3’(SEQ ID NO:2)

circ-01477-R 5’-ctttgcatcaagacttgtggg-3’(SEQ ID NO:3)

将逆转录反应得到的cDNA，按照1∶10稀释，进行如下qRT-PCR反应。

(1)按下列组份配制qRT-PCR反应液：

(2)反应液混匀，Real-time PCR仪反应程序如下：

(3)反应设置3个复孔，内参为GAPDH，程序结束后，查看溶解曲线与扩增曲线，舍去误差较大的实验数据，根据具体实验要求，对数据进行统计分析。

(4)考察上述circRNA在大鼠脊髓损伤后受损脊髓组织中不同时间点的表达变化，结果如图1所示，表明circ-01477在脊髓损伤后表达持续下降。

实施例2：circRNA的功能验证

一、原代星形胶质细胞的培养

将出生后1天的红皮鼠脊髓分离，移入一盛有分离缓冲液(DMEM)的培养皿中。体视镜下剥离脊膜分离出脊髓，移入另一盛有分离缓冲液(DMEM)的培养皿中。使用分离缓冲液(DMEM/F12)清洗组织，用手术剪将组织剪碎。加入消化液0.25％胰酶2ml，37℃消化15min，每5min中晃动几次。使用消化终止液(DMEM/F12+10％FBS)终止消化,1000rpm离心5min，弃去上清。加入完全培养基(DMEM/F12+10％FBS+1％p.s+1％L-glu)重悬细胞。镜检观察神经细胞结团情况，过细胞筛网，收集细胞悬液。计数后种在100mm培养皿中，每2-3天换液一次。

二、星形胶质细胞转染

将培养至P1代的星形胶质细胞用0.25％胰酶进行消化，加入完全培养基(DMEM/F12+10％FBS+1％p.s+1％L-glu)终止消化，计数。将一定量的细胞与siRNA混合，充分混匀，使其最终浓度达到每管100μl混合液中含有2×10⁶星胶细胞+200nM的siRNA,其中细胞体积为90μl，siRNA体积为10μl。然后参照NEPA21(NEPAGENE公司)原代神经细胞电转染操作步骤进行电转。

circ-01477 siRNA如下所示：

circ-01477 siRNA正义链:5’-cgaggggcuacacuugcca dTdT-3’(SEQ ID NO:4)。

circ-01477 siRNA反义链:5’-uggcaaguguagccccucg dTdT-3’(SEQ ID NO:5)。

三、星形胶质细胞RNA提取、逆转录及qRT-PCR

原代星形胶质细胞分别转染特异性针对circ-01477 siRNA及其对照siRNANegative Control(NC)，24h或48h后，收细胞，按

Reagent(Invitrogen)说明书提取星形胶质细胞RNA，逆转录，进行qRT-PCR，方法同实施例1中所述。结果如图2所示，siRNA处理24h或48h后，circ-01477 siRNA可以显著干扰circ-01477在星形胶质细胞中的表达，**P<0.01。

四、Edu细胞增殖实验

原代星形胶质细胞分别转染特异性针对circ-01477的siRNA(circ-01477 siRNA)及其对照(NC)，24h后，根据Cell-Light^TM EdU

In Vitro Kit(广州市锐博生物科技有限公司，C10310-1)进行Edu细胞增殖实验。按1000：1的比例用完全培养基稀释EdUA溶液；加入96孔板，37℃孵育24h，弃去培养基；PBS轻柔清洗细胞1-2次。每孔加入4％多聚甲醛约100μl，室温孵育30min，弃去4％多聚甲醛；每孔加入2mg/ml甘氨酸50μl，孵育5min后，弃甘氨酸溶液；每孔加入PBS 100μl，5min后弃去PBS；每孔加入100μl渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)，10min后弃去液体；PBS清洗1次，5min。每孔加入

染色反应液约100μl，室温、避光、孵育30min后，弃除反应液；加入渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)100μl清洗2-3次，每次10min，弃除渗透剂；按100：1的比例用ddH₂O稀释试剂F，制备1×Hoechst 33342反应液，避光保存；每孔加入1×Hoechst 33342反应液50μl，室温避光孵育30min后，弃反应液；每次每孔加入PBS 100μl清洗2-3次；每孔加入PBS 100μl荧光显微镜拍照。用circ-01477 siRNA与siRNA Negative Control(NC)转染原代培养的星形胶质细胞，在转染siRNA24h后，按上述方法进行EdU标记，Edu实验结果如图3A所示，柱状图为siRNA干扰circ-01477后星形胶质细胞的增殖率，*P<0.05。结果表明：与对照组相比，siRNA干扰circ-01477，显著抑制星形胶质细胞的增殖。

五、Transwell迁移实验

在超净台中，将需要检测的细胞板中的星形胶质细胞消化下来，用DMEM重悬，计数并调整为3×10⁵/mL。每个Transwell中加入100μl不同组别的重悬细胞，之后将Transwell轻轻放到含有500μl完全培养基的24孔板的孔中，培养箱培养。培养24h后，取出Transwell，4％多聚甲醛/PBS固定0.5h，用0.1％结晶紫染色0.5h，水洗三遍，轻轻用棉签将没有穿过膜的细胞擦掉，晾干。倒置显微镜下观察，随机选取5个以上视野，拍照。实验重复3次以上，进行统计分析。结果如图3B所示，Transwell结果表明，与NC相比，circ-01477 siRNA干扰circ-01477，明显抑制星形胶质细胞迁移，右侧柱状图为siRNA干扰circ-01477后星形胶质细胞的迁移率，*P<0.05。

序列表

<110> 南通大学

<120> 环状RNA circ-01477及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2233

<212> DNA

<213> 大鼠(Rat)

<400> 1

tggctgccag ctccccacca gcaattccca aagtcagaat caaaacaatt aagacatcat 60

caggggaaat caaacggact gttacaaggg tcctgccaga ccctgatgac ccaagtgagt 120

cacctgcagg gggcacaagt gctgaggttc caagtgaggt gccaggggat gaaggttcag 180

ccatgcctgt ggaagagcac ttttctgagg caggcataga ttcagggagc ccccagggtg 240

acagaaaagg gggtgagaat atgatcaaca agaccagtga ctctttgtct ccctgccgca 300

cctctgggcc ccgggtccca aaaggatctg ccctgaactc acaggcaagc aagaagcaac 360

agagcacagc acttcaggca tcaactccgg cccctgccag tctcttgccg aaagctgtgc 420

acttggccaa cttgaacctg gtcccccaca gtgttgctgc ttctgtgact gccaagtctt 480

cagcacagag acggagccag cctcaggtca cgcaaatgac agtgcccctg gtccaccagg 540

tgaaaaaggc cgcccctcta attgtggagg tcttcaacaa ggtccttcac agctctaacc 600

ctgtgcccct ctatgcgcca aatctcagcc cacccgcaga cagcagaatc catgtgccgg 660

ccagtgggta ctgctgcctg gagtgtggag acgcgtttgc cttagagaag agcctgagcc 720

agcactacag ccggcggagt gtccacatcg aggtgctgtg cacactgtgc tctaagacac 780

tgctcttctt caacaagtgc agcctgcttc ggcatgcccg tgaccacaag agcaagggac 840

tcgtcatgca gtgttctcag ctgcttgtga agcccatctc tgcggaccag atgtttgtgg 900

cggctcctgt gaactccact gcaccagcaa ccccagctgc ttcttcctcc cccaaaccca 960

gccccacttt ggacaatgcc agccctgtaa ttccagcctt gccactttac ccagacccag 1020

tgaggctcat ccggtatgga accaaatgtc ctgaatgtca caagcagatg agagattata 1080

tggtcctggc tacacatttc cagaggacaa cagaggaaac cgaggggcta cacttgccag 1140

catccagcca tgggggatat gaaaacccca gattttgatg atcttctggc ggcctttgac 1200

atcccagatc ccacaagtct tgatgcaaag gaggccatcc agactcctag tgaggagaat 1260

gagagtcccc tgaagtcctc aggcatgtgc atggatgaga atgtgtcctt gtctcactca 1320

ggatcagtcc cagatgtgcc ggctgtgagt gtcattgtca agaacaccag ccgccaagag 1380

tcatttgaag cagagaaaga ccacattact cccagtctcc tacataatgg attccggggt 1440

tcagacctgc ccccagactc ccaccattgt ggaaagtttg attctacttt tataaatgga 1500

gacagtgcta ggagtttcac gagtaagcta gagccttcca agtcggagcc attacccacc 1560

ttcaaccagt tcagcccaat ctctagccca gaacctgagg atcctgtcaa agataatggg 1620

tttgggataa agtccaagca ctctgacagt tatttcccac ctcctcctgg gactgtggga 1680

ggcccagtcc tggaagctct ggcaaagttc ccagtcccag agctacacat gtttgatcac 1740

ttttgtaaga aagaacccaa accagaaccc ttgcctttag agagccagca ggagcatgaa 1800

cagggtgggc agaaggtggt ggagcctcac aaagatctgg attccagtcg gttctttggg 1860

gaagctttag agttcaatag tcaccctagc aacagtattg gagagcccaa gaagcttgtt 1920

ccagagctta gtgcttgctc ctctgtcccc cctaggcagc gtctgaaacc agctcattcc 1980

aagctatcct cttgtgttgc agccttggtg gccttacagg ccaaaagggt ggccaatgtc 2040

accaaggagg atcagcctgg tcacataaag gattcctcag ggcccactaa agagggttct 2100

aaaggcagcc ccaaaatgcc caagtcacca aagagtcccc ggagccctct agaggccact 2160

agaaaaaata tcaagccatc agatagccct cggagcatct gcagtgacag cagcagcaaa 2220

gggtcccctt ctg 2233

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaatgtcaca agcagatgag aga 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctttgcatca agacttgtgg g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgaggggcua cacuugccat t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uggcaagugu agccccucgt t 21

Claims (2)

1.干预环状RNA circ-01477表达的 siRNA在制备修复脊髓损伤药物中的应用，其特征在于所述circ-01477的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述干预环状RNA circ-01477表达的siRNA正义链核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

Images