CN115786339A - 一种tmej检测底物、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本申请一方面提供了一种TMEJ检测底物，包括dsDNA片段序列为主体的双链DNA，所述dsDNA片段序列包括依次连接的特异性EGFP基因、SV40转录终止子和CMV启动子，所述特异性EGFP基因的序列如SEQ ID N0.1所示。另一方面，本申请还提供了上述TMEJ检测底物的制备方法及应用的技术方案。本申请底物便于构建，成本相对较低，检测操作难度低、速度快，且能够实时检测TMEJ修复过程。

Description

一种TMEJ检测底物、其制备方法及应用

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种TMEJ检测底物、其制备方法及应用。

背景技术

在人类细胞中，DNA会由于外源性刺激和内源性代谢过程而遭受大量损伤，一旦细胞丧失了有效修复DNA损伤的能力，就会导致细胞基因组的改变，转录过程出现错误，进而通过翻译过程影响到信号转导和细胞功能必需的蛋白质，可能使细胞出现衰老，凋亡和癌变。

DNA双链断裂是一种严重的损伤，会导致基因组序列丢失和重排，主要有三种修复途径。第一种是非同源末端连接修复（NHEJ），第二种是同源重组修复（HR）。第三种是介导的末端连接修复（TMEJ），由PARP1发起，用于切除DNA末端，经磷酸化CtIP活化后，募集Mre11-Rad50-NBS1（MRN）复合物等酶，POLQ与DBS的5’-3’切除产生的长单链DNA（ssDNA）结合，并以2-6对微同源序列作为DNA合成的引物，然后用LIG3-XRCC 1或LIG 1连接稳定的DNA末端。

DNA聚合酶θ（POL θ）是人类基因组中16种DNA聚合酶之一，是TMEJ修复途径中的核心酶，也是唯一在其N端含有类似解旋酶结构域的DNA聚合酶。POL θ在正常组织中的几乎不表达，但在多种肿瘤类型（如乳腺癌、卵巢癌、HNSCC和肺癌）中高表达，因此，POL θ也是近年来发现的一种新的治疗HR缺陷性肿瘤的药物靶点。准确、快速的检测Pol θ的活性和TMEJ修复过程，对于抗肿瘤药物的研发有着重要的意义。

目前，有两种方法用于测试Pol θ的活性。第一种是EGFP荧光报告基因法，利用流式检测细胞中的EGFP信号值。如图1所示，此方法将I-Sec酶切位点及终止子融入EGFP基因，同时插入可诱导的I-Sec元件。当I-Sec经诱导表达后，会切割EGFP中的14-18bp的酶切位点，造成9-bp的微末端互补序列，此处经Pol θ修复后，可产生完整读码框的EGFP基因，并表达出EGFP蛋白，可经FACS检测修复的程度。第二种是NanoLuc报告基因法，利用瞬转的方式，评价Pol θ的活性。如图2所示，首先构建体外构建末端突出的DNA底物，选用NanoLuc报告基因。转染入细胞后，经Pol θ修复会产生完整NanoLuc读码框，可用NanoGlo试剂检测信号值，评价修复的程度。

然而，上述两种方法均存在缺陷。EGFP荧光报告基因法需要构建单拷贝基因插入克隆，方法操作难度高、周期长、筛选克隆和验证工作量很大，另外经FACS测试DNA修复的窗口较小，通量较小，不利于药物的筛选，相对成本较高。NanoLuc报告基因法读取信号值终点，无法多次、实时检测DNA的修复过程，且试剂成本较高。

发明内容

为了解决上述至少一种技术问题，开发出一种底物便于构建，成本相对较低，检测操作难度低、速度快，且能够实时检测TMEJ修复过程的检测底物和检测方法，本申请提供一种TMEJ检测底物、其制备方法及应用。

一方面，本申请提供的一种TMEJ检测底物，包括dsDNA片段序列为主体的双链DNA，所述dsDNA片段序列包括依次连接的特异性EGFP基因、SV40转录终止子和CMV启动子，所述特异性EGFP基因的序列如SEQ ID N0.1所示。

通过采用上述技术方案，本申请结合了EGFP实时检测的可操作性与NanoLuc瞬时转染的便捷性，制备出了能够便捷的通过电转染方式转染的TMEJ检测底物，能够大幅降低检测TMEJ修复过程的操作难度；同时，本申请设计的TMEJ检测底物，能够基于Pol θ参与下的修复的特异性，将TMEJ检测底物修复为EGFP蛋白，利用高内涵分析设备可以通过监测EGFP蛋白信号值的表达，实现对Pol θ活性和TMEJ修复过程的实时监测。

另一方面，本申请还提供了上述TMEJ检测底物的制备方法，包括以下步骤：

S1、dsDNA片段序列的制备：通过酶切、连接至pcDNA3.1载体的方式，制备得dsDNA片段序列；

S2、制备部分双链的DNA：将步骤S1制得的dsDNA片段序列的特异性EGFP基因一端连接E端长链引物和E端断链引物，CMV启动子一端连接C端长链引物和C端断链引物，制得部分双链的DNA；

S3、制备TMEJ检测底物：将步骤S2制得的部分双链的DNA经连接酶连接，制得双链DNA的TMEJ检测底物；

所述E端长链引物和E端断链引物的序列如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示，所述C端长链引物和C端断链引物序列如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示。

可选的，所述步骤S2中，所述dsDNA片段序列连接引物后，需经过退火处理。

可选的，所述步骤S3中，所述连接酶采用T4 DNA连接酶。

通过采用上述技术方案，采用特殊设计的引物序列，配合检测底物的设计，能够便捷的通过三片段连接获得底物基因片段，并且通过连接酶制备出双链DNA的TMEJ检测底物，不但制备过程简单，而且回收率较高。

第三方面，本申请还提供了上述TMEJ检测底物在药物研发领域和/或细胞修复研究领域的应用。

可选的，所述应用需使用细胞TMEJ修复过程的监测方法，包括以下步骤：

a、细胞培养：将选取的实验细胞放置在含有牛血清和抗生素的DMEM培养基中培养；

b、转染：取步骤a培养的细胞，通过电转染的方式转染TMEJ检测底物，得到转染后的实验细胞；

c、接种培养：将步骤b得到的转染后的实验细胞放置在不含抗生素的DMEM培养基中，轻摇混合，然后转移至细胞培养多孔板中，放入CO₂培养箱中培养；

d、监测：利用高内涵分析设备对步骤c细胞培养多孔板中的实验细胞进行EGFP信号值的监测，获取监测数据。

通过采用上述技术方案，可以利于本申请的检测底物监测细胞TMEJ修复过程，从而为不同类型的药物筛选及研发，比如共价小分子、蛋白降解诱导剂、RNA药物等类型的药物，提供支持；本申请的检测底物配合监测方法，可实时、定量的检测Pol θ蛋白的活性，更清晰反映靶蛋白的动力学活性，为深入探索此类TMEJ修复通路相关靶点提供支持，可结合文库的筛选方法，探索该通路中协同作用、补偿作用的新靶点，为联合用药及耐药性补偿提供支持。

可选的，所述步骤a中，所述牛血清选用胎牛血清，浓度控制在10%，所述抗生素选用青霉素-链霉素，浓度控制在1%。

可选的，所述步骤a中，实验细胞的培养，需培养至细胞增长到80~90%汇合度，然后用胰蛋白酶处理，最后用培养基中和，离心后计数。

可选的，所述步骤b中，所述电转染具体采用以下步骤：

b1、配液：以不小于100ul的R缓冲液中加入10ug的TMEJ检测底物的配比，用R缓冲液配置DNA缓冲液；

b2、重悬：取步骤a培养的细胞，用DNA缓冲液重悬；

b3、转染：用电转枪头吸取步骤b2重悬的细胞电转染；

b4、清洗：将步骤b3电转染后的细胞用DPBS溶液清洗，而后离心处理，弃去上清后，得到转染后的实验细胞。

通过采用上述技术方案，采用电转方式配合EGFP信号值的检测方式，能够极大的简化操作，提高筛选通量，能够较为直观的反映出蛋白活性的动力学过程。

可选的，所述步骤c中，所述CO₂培养箱的培养条件采用37℃加湿条件。

综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

1. 本申请结合了EGFP实时检测的可操作性与NanoLuc瞬时转染的便捷性，制备出了能够便捷的通过电转染方式转染的TMEJ检测底物，能够大幅降低检测TMEJ修复过程的操作难度。

2. 本申请设计的TMEJ检测底物，能够基于Pol θ参与下的修复的特异性，将TMEJ检测底物修复为EGFP蛋白，利用高内涵分析设备可以通过监测EGFP蛋白信号值的表达，实现对Pol θ活性和TMEJ修复过程的实时监测。

3. 本申请制备出双链DNA的TMEJ检测底物，不但制备过程简单，而且回收率较高。

4. 本申请能够为不同类型的药物筛选及研发，比如共价小分子、蛋白降解诱导剂、RNA药物等类型的药物，提供支持。

5. 本申请的检测底物配合监测方法，可实时、定量的检测Pol θ蛋白的活性，更清晰反映靶蛋白的动力学活性，为深入探索此类TMEJ修复通路相关靶点提供支持。

附图说明

图1是本申请的实施例1的DNA的修复程度检测数据图；

图2是本申请实施例1的EGFP荧光值的对比检测照片；

图3是本申请实施例2的EGFP的信号值的监测数据图；

图4是本申请实施例3添加抑制剂后EGFP信号随抑制剂浓度变化的实时监测图；

图5是本申请实施例4每孔接种2万个细胞时不同时间抑制剂对修复信号抑制情况的检测图；

图6是本申请实施例4每孔接种4万个细胞时不同时间抑制剂对修复信号抑制情况的检测图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本申请作进一步详细说明。

本申请设计了一种TMEJ检测底物，包括dsDNA片段序列为主体的双链DNA，所述dsDNA片段序列包括依次连接的特异性EGFP基因、SV40转录终止子和CMV启动子，所述特异性EGFP基因的序列如SEQ ID N0.1所示。

本申请的上述TMEJ检测底物采用以下方法制备，包括以下步骤：

S1、dsDNA片段序列的制备：通过酶切、连接至pcDNA3.1载体的方式，制备得dsDNA片段序列；

S2、制备部分双链的DNA：将步骤S1制得的dsDNA片段序列的特异性EGFP基因一端连接E端长链引物和E端断链引物，CMV启动子一端连接C端长链引物和C端断链引物，制得部分双链的DNA；

S3、制备TMEJ检测底物：将步骤S2制得的部分双链的DNA经连接酶连接，制得双链DNA的TMEJ检测底物；

所述E端长链引物和E端断链引物的序列如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示，所述C端长链引物和C端断链引物序列如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示。

可选的，所述步骤S2中，所述dsDNA片段序列连接引物后，需经过退火处理。

可选的，所述步骤S3中，所述连接酶采用T4 DNA连接酶。

本申请的设计结合了现有的EGFP实时检测的可操作性与NanoLuc瞬时转染的便捷性。本申请设计了特异性的EGFP基因，并采用三片段连接的方式设计并制备出了以EGFP基因-SV40转录终止子-CMV启动子的dsDNA片段序列作为主体序列。

发明人通过设计出这种错误排序的序列，利用Pol θ参与下的细胞TMEJ修复，能够将上述错误排序的序列修复的特性，底物在细胞中被修复后，会形成完整的蛋白编码盒，含有CMV、EGFP的读码框及转录终止子SV40，在细胞核中可顺利转录mRNA并在细胞质中编码EGFP蛋白。而后，可以通过高内涵分析设备检测EGFP蛋白发出的荧光，通过荧光强度的检测，实现定量检测Pol θ蛋白的活性的目的。

本申请设计时，考虑到现有的EGFP实时检测的操作复杂性，通过设计特定引物序列，采用特定的方法，先制备出部分双链的DNA，然后通过连接酶连接的方式制备出双链的DNA。这样的设计，可以使检测底物能够便于采用电转染的方式转染进入细胞中，不但转染成功率极高，而且操作十分便捷。

本申请的上述TMEJ检测底物，可以应用在药物研发领域和/或细胞修复研究领域。

具体的，在上述应用时，本申请的TMEJ检测底物主要通过转染细胞后监测细胞TMEJ修复过程，实时、定量的检测Pol θ的活性，以此为上述研究提供数据基础。

而本申请的TMEJ检测底物，监测细胞TMEJ修复过程，采用以下的方法，具体包括以下步骤：

a、细胞培养：将选取的实验细胞放置在含有牛血清和抗生素的DMEM培养基中培养；

b、转染：取步骤a培养的细胞，通过电转染的方式转染TMEJ检测底物，得到转染后的实验细胞；

c、接种培养：将步骤b得到的转染后的实验细胞放置在不含抗生素的DMEM培养基中，轻摇混合，然后转移至细胞培养多孔板中，放入CO₂培养箱中培养；

d、监测：利用高内涵分析设备对步骤c细胞培养多孔板中的实验细胞进行EGFP信号值的监测，获取监测数据。

以下是本申请具体应用采用的实验方法，包括以下步骤：

a、细胞培养：将选取的实验细胞放置在含有10%的胎牛血清和1%的抗生素的DMEM培养基中培养；待细胞增长到80~90%汇合度时，将细胞经胰蛋白酶处理后用培养基中和，离心，计数。

b、配液：以不小于100ul的R缓冲液中加入10ug的TMEJ检测底物的配比，用R缓冲液配置DNA缓冲液；将上述缓冲液平衡至室温，并预热不含抗生素的DMEM培养基。

c、转染：设置氖管系统，将氖管插入氖管移液器，加入E2缓冲液；取一定量的经培养的细胞，用DNA缓冲液重悬细胞；用电转枪头吸取经DNA缓冲液重悬的细胞，根据设备推荐的转染条件，将TMEJ检测底物通过电转染的方式转入细胞中。

d、接种培养：将转染后的细胞放置在不含抗生素的DMEM培养基中，轻摇混合；然后以不低于10000个细胞/孔/40ul培养基的接种量，将细胞接种到384孔板中；最后放入CO₂培养箱中37℃加湿培养。

e、监测：利用高内涵筛选仪Operetta捕捉EGFP的表达情况，获取实时监测数据。

以下为本申请的应用实施例。为了通过对比，检验本申请的技术效果，选用ArtiosPharma生产的ART558，作为POL θ活性的抑制剂。

实施例1

本实施例中选用市购的HEK293T细胞作为实验细胞。

首先，采用本申请的方法制备出TMEJ检测底物。制备时，dsDNA片段序列连接引物后，经退火处理；而连接酶采用T4 DNA连接酶。经检测，回收率可以达到80%以上。

然后，采用本申请具体应用采用的实验方法进行转染和检测。实验中，培养的细胞分为对照组和实验组，对照组细胞中加入DMSO，实验组的细胞中加入ART558。实验中，转染选取的细胞数为2×10⁶，接种采用40000个细胞/孔/40ul培养基的接种量。

通过监测，选择EGFP荧光信号最强时的检测数据作为检测结果，并对该时间点的细胞的EGFP荧光值情况拍照。具体结果见图1和图2所示，图2中左侧图为未添加ART558的照片，右侧图为添加ART558的照片。

通过图1和图2的数据可以看出，本实施例的实验组在添加ART558后，荧光信号明显大幅减弱，符合ART558的抑制效果，进而可以充分佐证本申请的TMEJ检测底物和监测方法具有较高的准确性。

实施例2

本实施例主要用以检验本申请的TMEJ检测底物和监测方法，是否能够便捷的实时监测细胞内部的修复过程。

本实施例采用的细胞和TMEJ检测底物与实施例1相同，采用的监测方法也与实施例1相同。

本实施例的区别在于，监测时，采用实时监测的方式，监测24小时内EGFP荧光信号的变化状况，用以反映细胞内部的修复过程。

本实施例的监测结果如图3所示。由图3可以看出，在转染后6小时内，EGFP的信号值较低，对照组和实验组难以区分；但6小时后，可以看到修复后EGFP产生的信号值逐渐升高。

由图3还可以看出，本申请便于研究人员观测蛋白表达的速率及动力学，可以从反应速率上评价化合物的抑制作用。

实施例3

本实施例主要用以检验本申请的TMEJ检测底物和监测方法，是否能够对药物筛选提供研发数据支持。

本实施例采用的细胞和TMEJ检测底物与实施例1相同，采用的监测方法也与实施例1相同。

本实施例的区别在于，监测时，采用实时监测的方式，监测抑制剂与细胞混合孵育24后，EGFP荧光信号的变化状况，用以确定本申请的TMEJ检测底物是否能够筛选和评价候选化合物。本实施例的另一区别是，监测采用的设备可以是细胞实时监控仪IncuCyte或高内涵筛选仪Operetta。

本实施例的监测结果如图4所示。由图4可以看出，应用本实施例的方案进行监测，在化合物与细胞孵育后，可见EGFP信号随着抑制剂浓度的增加而降低，并且该过程可以通过细胞实时监控仪IncuCyte或高内涵筛选仪Operetta捕捉EGFP的表达情况，达到实时检测的效果。

由图4还可以看出，在抑制剂与细胞共孵育24小时后，可测得ART558的IC50值是120nM，能够进行定量检测，并且具有较高的检测精度，可用于筛选和评价候选化合物。

实施例4

本实施例主要用以检验本申请的TMEJ检测底物和监测方法，是否能够对不同时间点下的抑制剂的作用进行比较。

本实施例采用的细胞和TMEJ检测底物与实施例1相同，采用的监测方法也与实施例1相同。

本实施例的区别在于，监测时，采用实时监测的方式，检测不同时间抑制剂对修复信号的抑制，以判断是否存在剂量依赖性。本实施例的另一区别是，接种培养时，采用每孔接种2万和4万个细胞，然后分别检测。

本实施例的监测结果如图5和图6所示。由图5和图6可以看出，每孔接种2万和4万个细胞，检测不同时间抑制剂对修复信号的抑制，可以看到存在剂量依赖性的抑制。

此外，本实施例采用的检测模式，对于稳定性较差的抑制剂而言，可以利用较短的孵育时间评价抑制剂的活性；也可以观察抑制剂的抑制性随着孵育时间的不同而发生的变化。

以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种TMEJ检测底物，其特征在于，包括dsDNA片段序列为主体的双链DNA，所述dsDNA片段序列包括依次连接的特异性EGFP基因、SV40转录终止子和CMV启动子，所述特异性EGFP基因的序列如SEQ ID N0.1所示。

2.如权利要求1所述的TMEJ检测底物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、dsDNA片段序列的制备：通过酶切、连接至pcDNA3.1载体的方式，制备得dsDNA片段序列；

S2、制备部分双链的DNA：将步骤S1制得的dsDNA片段序列的特异性EGFP基因一端连接E端长链引物和E端断链引物，CMV启动子一端连接C端长链引物和C端断链引物，制得部分双链的DNA；

S3、制备TMEJ检测底物：将步骤S2制得的部分双链的DNA经连接酶连接，制得双链DNA的TMEJ检测底物；

所述E端长链引物和E端断链引物的序列如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示，所述C端长链引物和C端断链引物序列如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示。

3.根据权利要求1所述的TMEJ检测底物的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述dsDNA片段序列连接引物后，需经过退火处理。

4.根据权利要求1所述的TMEJ检测底物的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述连接酶采用T4 DNA连接酶。

5.如权利要求1所述的TMEJ检测底物在药物研发领域和/或细胞修复研究领域的应用。

6.根据权利要求5所述的TMEJ检测底物的应用，其特征在于，所述应用需使用细胞TMEJ修复过程的监测方法，包括以下步骤：

a、细胞培养：将选取的实验细胞放置在含有牛血清和抗生素的DMEM培养基中培养；

b、转染：取步骤a培养的细胞，通过电转染的方式转染TMEJ检测底物，得到转染后的实验细胞；

c、接种培养：将步骤b得到的转染后的实验细胞放置在不含抗生素的DMEM培养基中，轻摇混合，然后转移至细胞培养多孔板中，放入CO₂培养箱中培养；

d、监测：利用高内涵分析设备对步骤c细胞培养多孔板中的实验细胞进行EGFP信号值的监测，获取监测数据。

7.根据权利要求6所述的TMEJ检测底物的应用，其特征在于，所述步骤a中，所述牛血清选用胎牛血清，浓度控制在10%，所述抗生素选用青霉素-链霉素，浓度控制在1%。

8.根据权利要求6所述的TMEJ检测底物的应用，其特征在于，所述步骤a中，实验细胞的培养，需培养至细胞增长到80~90%汇合度，然后用胰蛋白酶处理，最后用培养基中和，离心后计数。

9.根据权利要求6所述的TMEJ检测底物的应用，其特征在于，所述步骤b中，所述电转染具体采用以下步骤：

b1、配液：以不小于100ul的R缓冲液中加入10ug的TMEJ检测底物的配比，用R缓冲液配置DNA缓冲液；

b2、重悬：取步骤a培养的细胞，用DNA缓冲液重悬；

b3、转染：用电转枪头吸取步骤b2重悬的细胞电转染；

b4、清洗：将步骤b3电转染后的细胞用DPBS溶液清洗，而后离心处理，弃去上清后，得到转染后的实验细胞。

10.根据权利要求6所述的TMEJ检测底物的应用，其特征在于，所述步骤c中，所述CO₂培养箱的培养条件采用37℃加湿条件。

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