CN110530829A - 一种基于荧光的早期药物筛选方法 - Google Patents
一种基于荧光的早期药物筛选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110530829A CN110530829A CN201910770631.4A CN201910770631A CN110530829A CN 110530829 A CN110530829 A CN 110530829A CN 201910770631 A CN201910770631 A CN 201910770631A CN 110530829 A CN110530829 A CN 110530829A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fluorescence
- drug
- gaba
- target spot
- ion channel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 31
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 230000008484 agonism Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 claims description 46
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 30
- 102000027484 GABAA receptors Human genes 0.000 claims description 15
- 108091008681 GABAA receptors Proteins 0.000 claims description 15
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- 102000005915 GABA Receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 108010005551 GABA Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 4
- 241001614291 Anoplistes Species 0.000 claims 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 30
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 21
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- IYGYMKDQCDOMRE-QRWMCTBCSA-N Bicculine Chemical compound O([C@H]1C2C3=CC=4OCOC=4C=C3CCN2C)C(=O)C2=C1C=CC1=C2OCO1 IYGYMKDQCDOMRE-QRWMCTBCSA-N 0.000 description 5
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 5
- AACMFFIUYXGCOC-UHFFFAOYSA-N bicuculline Natural products CN1CCc2cc3OCOc3cc2C1C4OCc5c6OCOc6ccc45 AACMFFIUYXGCOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IYGYMKDQCDOMRE-UHFFFAOYSA-N d-Bicucullin Natural products CN1CCC2=CC=3OCOC=3C=C2C1C1OC(=O)C2=C1C=CC1=C2OCO1 IYGYMKDQCDOMRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 4
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 3
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- KPYSYYIEGFHWSV-UHFFFAOYSA-N Baclofen Chemical compound OC(=O)CC(CN)C1=CC=C(Cl)C=C1 KPYSYYIEGFHWSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LHNKBXRFNPMIBR-UHFFFAOYSA-N Picrotoxin Natural products CC(C)(O)C1(O)C2OC(=O)C1C3(O)C4OC4C5C(=O)OC2C35C LHNKBXRFNPMIBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 229960000794 baclofen Drugs 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003529 diazepam Drugs 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 description 2
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 2
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N monobenzene Natural products C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000012402 patch clamp technique Methods 0.000 description 2
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- VJKUPQSHOVKBCO-AHMKVGDJSA-N picrotoxin Chemical compound O=C([C@@]12O[C@@H]1C[C@]1(O)[C@@]32C)O[C@@H]3[C@H]2[C@@H](C(=C)C)[C@@H]1C(=O)O2.O=C([C@@]12O[C@@H]1C[C@]1(O)[C@@]32C)O[C@@H]3[C@H]2[C@@H](C(C)(O)C)[C@@H]1C(=O)O2 VJKUPQSHOVKBCO-AHMKVGDJSA-N 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- DTGKSKDOIYIVQL-WEDXCCLWSA-N (+)-borneol Chemical compound C1C[C@@]2(C)[C@@H](O)C[C@@H]1C2(C)C DTGKSKDOIYIVQL-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- REPVLJRCJUVQFA-UHFFFAOYSA-N (-)-isopinocampheol Natural products C1C(O)C(C)C2C(C)(C)C1C2 REPVLJRCJUVQFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- MEXAGTSTSPYCEP-JEDNCBNOSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;hydrobromide Chemical compound Br.NCCCC[C@H](N)C(O)=O MEXAGTSTSPYCEP-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- 239000003140 4 aminobutyric acid A receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 102000034573 Channels Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940090502 GABA A receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- -1 HygromycinB Chemical compound 0.000 description 1
- 102000004086 Ligand-Gated Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000543 Ligand-Gated Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- FTALBRSUTCGOEG-UHFFFAOYSA-N Riluzole Chemical compound C1=C(OC(F)(F)F)C=C2SC(N)=NC2=C1 FTALBRSUTCGOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PPTYJKAXVCCBDU-UHFFFAOYSA-N Rohypnol Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C([N+]([O-])=O)C=C2C=1C1=CC=CC=C1F PPTYJKAXVCCBDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000049 anti-anxiety effect Effects 0.000 description 1
- 239000002249 anxiolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940116229 borneol Drugs 0.000 description 1
- CKDOCTFBFTVPSN-UHFFFAOYSA-N borneol Natural products C1CC2(C)C(C)CC1C2(C)C CKDOCTFBFTVPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N carbamazepine Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000623 carbamazepine Drugs 0.000 description 1
- 229960004424 carbon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 229910002090 carbon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000027288 circadian rhythm Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- DTGKSKDOIYIVQL-UHFFFAOYSA-N dl-isoborneol Natural products C1CC2(C)C(O)CC1C2(C)C DTGKSKDOIYIVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- NPUKDXXFDDZOKR-LLVKDONJSA-N etomidate Chemical compound CCOC(=O)C1=CN=CN1[C@H](C)C1=CC=CC=C1 NPUKDXXFDDZOKR-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- 229960001690 etomidate Drugs 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002102 hyperpolarization Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229960004181 riluzole Drugs 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000004799 sedative–hypnotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于荧光的早期药物筛选方法。该方法包括以下步骤：步骤1）提供稳定表达离子通道靶点的目标细胞；步骤2）将电压敏感染料和具有不同浓度的所述药物与所述目标细胞一起孵育；步骤3）利用荧光测量装置测量孵育后的细胞的荧光基线值和随时间变化的数值；和步骤4）对所得的数值进行数据拟合，确定所述药物对所述离子通道靶点是具有激动作用或抑制作用。利用该方法，能够利用成本低廉的酶标仪来以中等通量对数十个离子通道靶点进行药物筛选，尤其适用于早期的药物筛选。
Description
技术领域
本发明涉及药物筛选方法，特别涉及基于荧光的早期药物筛选方法。
背景技术
离子通道是中枢神经系统活动的基础，与中枢神经系统的各种活动等密切相关，也是重要的药物筛选靶点。药物非特异性地作用于中枢神经系统离子通道，是药物中枢神经系统不良反应的主要原因。因此，药物对中枢神经系统的非特异性效应早期筛选，是中枢神经系统次级药理学筛选和安全药理学的重要内容，是新药研发过程中早期发现药物中枢神经系统毒性的重要工具。
传统的中枢神经系统离子通道靶点筛选技术在毒性靶点筛选中，存在一定的缺陷，如膜片钳技术，虽然数据准确性较高，但是通量低，成本高，需要较强的技术背景，难以对数十个离子通道靶点同时进行筛选。荧光技术广泛应用于高通量筛选，成本低，但是经常需要昂贵的数据采集仪器(如FLIPR等)。而且一般针对一个靶点筛选大量的化合物，对于一个或几个化合物，筛选数十个性质不同的离子通道的作用靶点，仍然力不从心。
另外，一些靶点(例如门控离子通道受体)存在多个亚型，且每个亚型还可能存在多个亚单元，这导致形成了大量的不同亚基组合的异构体，其分布、功能和药理学性质具有非常广泛的差异。因此，同时检测化合物对各个亚型的作用，也存在较大的困难。
因此，本领域仍然需要一种快速、微量、高效且经济的、能够以中等通量同时对数十个离子通道靶点同时进行筛选的药物筛选方法，尤其在早期对药物进行有效筛选的方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的一个目的在于提供一种基于荧光的早期药物筛选方法。
本发明的另一目的在于提供一种基于荧光的γ-氨基丁酸受体的早期药物筛选方法。
上述目的通过以下方案来实现：
在一方面，本发明提供一种基于荧光的药物筛选方法，所述方法包括以下步骤：步骤1)提供稳定表达离子通道靶点的目标细胞；步骤2)将电压敏感染料和具有不同浓度的所述药物与所述目标细胞一起孵育；步骤3)利用荧光测量装置测量孵育后的细胞的荧光基线值和随时间变化的数值；和步骤4)对所得的数值进行数据拟合，确定所述药物对所述离子通道靶点是具有激动作用或抑制作用。
通过所述技术方案，能够以利用荧光测量来实现离子通道靶点的药物筛选。与传统检测检测方法手段如膜片钳等相比，根据该技术方案的方法进行的检测过程受外界影响因素较小，灵敏度较高。
根据第一方面所述的药物筛选方法，优选地，所述离子通道靶点具有性能不同的多个亚型。进一步优选地，所述离子通道靶点为GABAA受体，其具有GABAα1～6六个亚型：α1β2γ2、α2β3γ2、α3β3γ2、α4β3γ2、α5β3γ2、α6β2γ2。
通过所述技术方案，能够以中等通量同时对数十个离子通道靶点进行高效率筛选。
根据第一方面所述的药物筛选方法，优选地，所述目标细胞为稳定表达GABAα1～6的HEK293细胞系。
根据第一方面所述的药物筛选方法，优选地，所述电压敏感染料为细胞膜电位敏感染料。
通过所述技术方案，在筛选过程中，能够用荧光检测细胞膜电位的变化，从而对药物进行筛选。
根据第一方面所述的药物筛选方法，优选地，所述荧光测量装置为酶标仪。
酶标仪具有检测灵敏度高、实用性强的特点。利用酶标仪，能够避免对昂贵的检测仪器如FLIPR荧光检测系统的需求，从而使本发明方法具有经济、高效等优点。
根据第一方面所述的药物筛选方法，优选地，随着所述药物的浓度升高，所测量的荧光数值降低，则判断所述药物对所述离子通达靶点具有抑制作用。进一步优选地，随着所述药物的浓度升高，所测量的荧光数值升高，则判断所述药物对所述离子通达靶点具有激动作用。
通过所述技术方案，根据所测量的荧光数值变化就能直观、快速地了解药物对所筛选的离子通道靶点是具有抑制或激动作用，并且检测的灵敏度高。
在第二方面，本发明提供了一种基于荧光的γ-氨基丁酸受体的早期药物筛选方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1)提供稳定表达GABAα1～6的HEK293细胞系；
步骤2)将电压敏感染料和具有不同浓度的所述药物与所述HEK293细胞系一起孵育；
步骤3)利用荧光测量装置测量孵育后的HEK293细胞系的荧光基线值和随时间变化的数值；和
步骤4)对所得的数值进行数据拟合，确定所述药物对所述GABAα1～6具有激动作用或抑制作用。
根据第二方面所述的药物筛选方法，所述电压敏感染料为得自美国AAT公司的RedFluorescence膜电位检测试剂盒中包含的电压敏感染料。
该细胞膜电压敏感染料能够进行一步检测，且具有廉价、免洗和快速灵敏的优点。
通过上述技术方案，本发明获得了如下有益效果：
1)与传统检测检测方法手段，如膜片钳等相比，根据本发明的方法的检测过程受外界影响因素较小；当细胞膜电位受外界刺激发生变化，即离子通道发生开合时，离子流进出导致的膜电位改变等，电压敏感染料也可以由激发光和发射光照射检测出这种变化值；
2)根据本发明的筛选方法步骤少、简单、快速、可靠，需要的设备成本低廉，非常经济，并且能够以中等通量同时对数十个离子通道靶点同时进行筛选，效率高；
3)根据实验所得的数据稳定，重复性好，适合推行到大规模高通量筛选技术；
4)根据本发明的方法，在同一筛选系统中，通过基于荧光的中枢神经系统早期筛选技术，对所有可能靶点进行检测，进而筛选出先导化合物的次级靶标，避免后续研发过程中的一些不良反应及脱靶效应，这对于药物的筛选具有非常重大的意义。
附图说明
以下将结合附图来具体描述本发明的一些优选实施方式。本领域的普通技术人员将会理解，这些附图仅用于举例说明的目的，而无意于以任何方式来限制本发明的范围。
图1显示在酶标仪上测量的GABA剂量依赖关系。该剂量依赖关系是利用膜电位检测试剂盒(ATT)在不同GABA浓度下测量的；
图2显示酶标仪上检测的使用GABA的GABAA受体细胞系的EC50值：A:GABAα1β2γ 2-HEK293，EC50＝14.85±4.33μM；B:GABAα2β3-HEK293，EC50＝7.40±0.92μM；C:GABA α3β3-HEK293，EC50＝1.53±0.47μM；D:GABAα4β3γ2-HEK293，EC50＝2.51±0.06μM； E:GABAα5β3-HEK293，EC50＝0.54±0.05μM；F:GABAα6β2γ2-HEK293，EC50＝0.50±0.23 μM；
图3显示在酶标仪上检测的使用Bicuculline的GABAA受体细胞系的EC50值：A:GABAα1β2γ2-HEK293，IC50＝14.29μM；B:GABAα2β3-HEK293，IC50＝24.99μM；C:GABAα3β 3-HEK293，IC50＝5.92μM；D:GABAα4β3γ2-HEK293，IC50＝20.48μM；E:GABAα5β 3-HEK293，IC50＝8.25μM；F:GABAα6β2γ2-HEK293，IC50＝8.52μM；
图4A-H显示一系列化合物对GABAA2靶点有效性的筛选示意图。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例来描述本发明的一些具体实施方式。本领域的普通技术人员会理解，提供这些实施例的目的仅仅是为了举例说明如何能够实施本发明的方案，而非以任何方式限制本发明的范围。
传统药物的筛选是对于某一个已知靶点，合成大量的化合物，进行相互作用，进而筛选出先导化合物，然后进行后续研发。对于某些多效性、量效关系复杂性、作用相对不稳定性的化合物，这种方法很难发现其对人体其他靶点的不良反应，尤其是在临床前期很难发现的中枢神经系统的不良反应，导致后期研发失败。
本发明对此进行了研究。在实践中，本发明人发现，利用电压敏感染料 (Voltage-sensitivedyes,VSD)孵育待检测的细胞,用激发光照射,当细胞膜电位受刺激而发生变化时(△Vm),作为分子探针的染料同步出现荧光变化，并通过多功能酶标仪读取相应的荧光变化值，从而能够测定待测化合物对GABAA通道的激动或抑制作用。本发明人在此发现的基础上做出了本发明。
基于所述发现，本发明提出了一种基于荧光的化合物筛选方法。所述方法主要包括以下：步骤1)提供稳定表达离子通道靶点的目标细胞；步骤2)将电压敏感染料和具有不同浓度的所述化合物与所述目标细胞一起孵育；步骤3)利用荧光测量装置测量孵育后的细胞的荧光基线值和随时间变化的数值；和步骤4)对所得的数值进行数据拟合，确定所述化合物对所述离子通道靶点是具有激动作用或抑制作用。
以下将以离子通道靶点γ-氨基丁酸A型受体为例对本发明进行举例说明。然而，本领域的普通技术人员会理解，这些实施例仅仅用于举例说明的目的，而无意于以任何方式限制本发明的范围。
γ-氨基丁酸A型受体简称GABAA受体(GABAAR)，是配体门控离子通道超家族成员之一，是中枢神经系统最主要的抑制性神经递质受体，介导前脑大多数快速突触抑制。由GABAA受体介导的行为效应,除了安定类诱导的抗焦虑、肌肉松弛和镇静催眠作用外,GABAA受体配体能影响生理节律、生育、食欲、食物吸收、运动神经功能、防御、识别和记忆等。因此药物作用于GABAA受体，会产生一些列中枢神经系统的毒副反应。另外，GABAA 受体是一种氯离子介导的离子通道，GABAA通道开放时，细胞膜内测负电位会更加超极化。
GABAA受体亚基系列,依据氨基酸顺序相似程度，将亚基系列分为7个亚基族,分别命名为α1～6,β1～4,γ1～4,δ1,ε1,π1和ρ1～3。这些亚基及其不同的组合方式组成了众多五边形异构体亚型，一般的组合方式是2个α亚单位，2个β亚单位和1个γ(或δ，ε等)亚单位。其中，根据α亚单位的不同，将GABAA受体分成GABAA1-GABAA66个亚型，随着α亚单位与β和γ亚单位的不同组合，GABAA受体形成了大量的不同亚基组合的异构体，其分布、功能和药理学性质具有非常广泛的差异。因此，要想同时检测化合物对GABAA 受体的各个亚型的作用，也存在较大的困难。
本发明旨在基于荧光筛选技术，利用一般实验室现有的低成本的多功能酶标仪以及市售膜电位检测试剂盒(例如，购于美国AAT公司的ScreenQuestMembranePotentialAssay Kit*RedFluorescence*膜电位检测试剂盒或购于美国MolecularDevices(MD)公司的试剂盒 FLIPRMembranePotentialRed，Explorer)，对不同性质的离子通道靶点进行分类，建立一套离子通道多靶点筛选技术，在一个96孔板上筛选一个化合物对多个甚至十几个离子通道的作用，从而建立起一个中等通量，较低成本的多离子通道中枢神经系统次级药理学药物靶点筛选平台。
实施例
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞和试剂GABAα1～6-HEK293稳转细胞系根据以下实验方法中的步骤进行构建；ScreenQuestMembranePotentialAssayKit*RedFluorescence*膜电位检测试剂盒购于美国 AAT公司；FLIPRMembranePotentialRed，Explorer，购于美国MolecularDevices(MD)公司； HBSS，FBS，0.25％Trypsin-EDTA购于gibco公司；DMEM购于Corning公司；GABA，DMSO，Poly-L-lysinehydrobromide购于sigma公司；Bicuculline购于美国SantaCruz公司；转染试剂：X-tremeGENEHPDNATransf.Reag.，购自Roche公司；抗生素G418，HygromycinB，Zeocin表1：稳定的细胞系和保藏编号
1.1.2主要仪器Synergy4多功能酶标仪购于美国BioTek公司；TD25M低速离心机购于长沙易达仪器公司；BDS200倒置显微镜购于重庆奥特光学仪器有限责任公司；CCl-170B-8二氧化碳细胞培养箱购于新加坡ESCO公司；DL-CJ-1ND-Ⅱ超净工作台购于北京东联哈尔仪器制造有限公司；GH3643412道多道移液器购于美国ThermoFisher公司；3603玻璃底透黑色96孔细胞培养板购于美国Corning公司。
1.2实验方法
1.2.1细胞构建和培养
将表达GABA通道蛋白的质粒和转染试剂混匀，滴加至HEK-293细胞中，加入含抗生素G418 (800μg/ml)、HygromycinB(200μg/ml)、Zeocin(100μg/ml)的培养基筛选，将筛选出的细胞做单克隆，扩大培养，检测单克隆细胞的蛋白表达和电流情况，挑选出有合适电流的细胞株，得到所需离子通道HEK-293细胞系；然后，将GABAα1～6-HEK293稳转细胞系用DMEM+10％FBS+0.5μg/mlPuromycin培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。细胞传代：除去旧培养基并用PBS洗一次，然后加入1mlTrypsin，37℃孵育0.5分钟。当细胞从皿底脱离，加入5ml37℃预热的完全培养基。将细胞悬液用吸管轻轻吹打使聚集的细胞分离。将细胞悬液转移至无菌的离心管中，1000rmp离心5分钟收集细胞，以每孔5*104 个细胞接种于96孔板中(Corning，3603)，96孔板提前加PLLcoating过夜，铺板后18小时左右进行膜电位检测实验。
1.2.2膜电位检测方法
GABAα1～6-HEK293稳转系，过夜培养后，孔板中细胞融合度达80％左右时进行实验，将含有待测细胞的96孔板从孵箱中取出，置于室温；去除原孔培养基，每孔加入100μlHHBSbuffer，每孔加入100μlMPdye-loadingsolution，放入37度培养箱孵育30min，然后放室温30min；设置酶标仪激发光620/10nM；发射光665/8nM；先读10s基线值，间隔300ms；然后每孔加50μL化合物(GABA，5X)，酶标仪读240s加化合物后荧光值，间隔300ms。
1.3结果分析
取加药前基数平均值，加药后最大值，％对照(最大值)＝(最大值-基线平均值)/对照×100，使用GraphPadPrism5软件，采用非线性回归方法进行曲线拟合及EC50和IC50计算。
1.4实验稳定性分析
选择国际公认的统计学参数Z'因子以确认实验结果是否符合高通量筛选的要求，采用Z'因子分析法来进行评估，其计算公式为:
其中μC+:阳性对照组的平均值，μC－:阴性对照组的平均值；σC+:阳性对照组的标准偏差，σC－:阴性对照组的标准偏差。
2.结果：
2.1由酶标仪检测的GABAA受体与GABA的剂量依赖图
细胞孵育完荧光染料后，酶标仪检测10s荧光值，间隔300ms，此为基线值，加注阳性药GABA，酶标仪检测240s荧光值，间隔300ms，得到不同剂量GABA所对应的荧光数值，如图1所示，由荧光值为纵坐标，时间为横坐标，即可得到GABAA受体与GABA的剂量依赖图。
2.2GABA对于稳定表达GABAα1～6的HEK293细胞系的激动作用
GABAα1～6-HEKK293细胞系计数铺板，第二天检测；细胞与膜电位染料共孵育，1h后酶标仪检测，先读取10s基线值，加注器加注不同浓度GABA，酶标仪检测荧光变化值，间隔300ms，检测4分钟；由％对照(最大值)＝(最大值-平均值)/对照×100作为纵坐标，不同浓度GABA的Log值为横坐标，使用GraphPadPrism5软件，采用非线性回归方法进行曲线拟合计算EC50，各组数值如图2所示。
3.3Bicuculline对于稳定表达GABAα1～6的HEK293细胞系的抑制作用
GABAα1～6-HEKK293细胞系计数铺板，第二天检测；细胞与膜电位染料及各浓度bicuculline 共孵育，1h后酶标仪检测。先读取10s基线值，加注器加注相同浓度GABA，酶标仪检测荧光变化值，间隔300ms，检测4分钟；由％对照(最大值)＝(最大值-平均值)/对照×100 作为纵坐标，不同浓度bicuculline的Log值为横坐标，使用GraphPadPrism5软件，采用非线性回归方法进行曲线拟合计算IC50，各组数值如图3所示。
3.4一系列化合物对GABAA2靶点筛选验证
选取Picrotoxin，Riluzole，Carbamazepine，Baclofen，Diazepam，Pentobarbiba，Borneol， Etomidate等一系列化合物，应用上述方法对GABAA2靶点进行验证，其中Picrotoxin是一种非竞争性的GABAAreceptor拮抗剂，具有强烈的生理学效应，应用此方法可以快速检测出IC50为1.759μM；Diazepam与中枢苯二氯卓受体结合而促进γ-氨基丁酸(GABA)的释放或突触传递功能，本实验也验证出其对GABA受体的明显激动作用；Baclofen是GABA衍生物，可松弛骨骼肌肉，是选择性GABAB受体激动剂，对GABAA受体无明显作用[17]，这些药物的作用都与实验结果相符；通过这一系列化合物的筛选，可以筛选出对此靶点效果明显的化合物，数据结果如图4。
3.5Z'因子
从大量化合物库中快速准确的筛选出有活性的化合物已经成为现代药物筛选技术的最终目标。在实验中这种筛选方法是否合适，得到数据是否稳定，以及是否适合推行到大规模高通量筛选技术中，可以由一个简单的参数进行评估，即Z'因子。由上述公式可以计算出本研究得到数据的Z'因子值，均大于0.5，证明实验稳定性较好。
表2 GABAA受体细胞系EC50检测试验中的Z'因子
表3 GABAA受体细胞系IC50检测试验中的Z'因子
表4 GABAA受体细胞系EC50[μm]值检测试验
表5 GABAA受体细胞系IC50[μm]值检测试验
表6 GABAA受体EC50值的荧光检测和电生理检测比较
4.讨论
本实验通过膜电位染料(AAT)检测了GABAα1～6的HEK293稳转细胞系对于GABA及Bicuculline的敏感性及各组实验的EC50及IC50值[表4，5]，与文献报道(MartinMortensen,BijalPatel,TrevorG.Smart.GABApotencyatGABAAreceptorsfoundinsynapticand extrasynapticzones.CELLULARNEUROSCIENCE,2012Jan(6),1-10)的用电生理方法检测的数值比较[表6]，其各亚型对GABA亲和力比较一致，从而为以GABA通道为靶点的化合物筛选提供了一个新的技术方法。另外，与传统检测手段相比，根据本发明的检测过程受外界影响因素较小，而相比其他荧光筛选手段(如FLIPR等)，成本大幅降低，普及性广。并且，由于仪器及检测方法的特点，此种筛选技术更加适用于普通实验室微孔板多靶点，中等通量的化合物筛选。
另外，如前所述，通过计算Z'因子，确定根据本发明的实验方法具有较好的稳定性。因此，其证实了根据本发明的方法能够被有效用于同时对多个(例如，数十个)离子通道靶点进行药物筛选。此实验方法快速、微量、高效、经济，与传统的膜片钳技术具有明显的优势。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种基于荧光的早期药物筛选方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1）提供稳定表达离子通道靶点的目标细胞；
步骤2）将电压敏感染料和具有不同浓度的所述药物与所述目标细胞一起孵育；
步骤3）利用荧光测量装置测量孵育后的细胞的荧光基线值和随时间变化的数值；和
步骤4）对所得的数值进行数据拟合，确定所述药物对所述离子通道靶点是具有激动作用或抑制作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子通道靶点具有性能不同的多个亚型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离子通道靶点为GABAA受体，其具有GABAα1~6六个亚型：α1β2γ2、α2β3γ2、α3β3γ2、α4β3γ2、α5β3γ2、α6β2γ2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标细胞为稳定表达GABA α1~6的HEK293细胞系。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电压敏感染料为细胞膜电位敏感染料。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光测量装置为酶标仪。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，随着所述药物的浓度升高，所测量的荧光数值降低，则判断所述药物对所述离子通达靶点具有抑制作用。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，随着所述药物的浓度升高，所测量的荧光数值升高，则判断所述药物对所述离子通达靶点具有激动作用。
9.一种基于荧光的γ-氨基丁酸受体的早期药物筛选方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1）提供稳定表达GABA α1~6的HEK293细胞系；
步骤2）将电压敏感染料和具有不同浓度的所述药物与所述HEK293细胞系一起孵育；
步骤3）利用荧光测量装置测量孵育后的HEK293细胞系的荧光基线值和随时间变化的数值；和
步骤4）对所得的数值进行数据拟合，确定所述药物对所述GABA α1~6具有激动作用或抑制作用。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述电压敏感染料为得自美国AAT公司的RedFluorescence膜电位检测试剂盒中包含的电压敏感染料。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910770631.4A CN110530829A (zh) | 2019-08-20 | 2019-08-20 | 一种基于荧光的早期药物筛选方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910770631.4A CN110530829A (zh) | 2019-08-20 | 2019-08-20 | 一种基于荧光的早期药物筛选方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110530829A true CN110530829A (zh) | 2019-12-03 |
Family
ID=68663942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910770631.4A Pending CN110530829A (zh) | 2019-08-20 | 2019-08-20 | 一种基于荧光的早期药物筛选方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110530829A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113607707A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-11-05 | 国家食品安全风险评估中心 | 一种基于钠离子通道Nav1.1的海洋神经毒素荧光快速筛查方法 |
| CN114774512A (zh) * | 2022-04-15 | 2022-07-22 | 杭州圣域生物医药科技有限公司 | 一种地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法 |
| CN115786339A (zh) * | 2022-10-24 | 2023-03-14 | 北京爱思益普生物科技股份有限公司 | 一种tmej检测底物、其制备方法及应用 |
| CN115927526A (zh) * | 2023-01-05 | 2023-04-07 | 北京爱思益普生物科技股份有限公司 | 一种hERG通道的高通量检测方法及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1842709A (zh) * | 2003-07-10 | 2006-10-04 | 塞诺米克斯公司 | 使用表达人的ENaC的卵母细胞的改进的电生理测定法和用于在使用膜电位报告染料的测定中提高ENaC增强子功效的PHENAMIL的用途 |
| CN101300489A (zh) * | 2005-11-03 | 2008-11-05 | 红点生物公司 | Trpm5离子通道的高通量筛选实验 |
| CN101848717A (zh) * | 2007-10-26 | 2010-09-29 | 塞诺菲-安万特股份有限公司 | 诺孕酯作为trpc3、trpc6和trpc7离子通道选择性抑制剂的用途 |
| CN101868539A (zh) * | 2007-10-18 | 2010-10-20 | Seoul大学校产学协力团 | 鉴定调变钙活化型氯通道活性的药剂的方法 |
| CN104449670A (zh) * | 2014-11-11 | 2015-03-25 | 山东大学 | 一种苯基呋喃类hERG钾离子通道的小分子荧光探针及其应用 |
-
2019
- 2019-08-20 CN CN201910770631.4A patent/CN110530829A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1842709A (zh) * | 2003-07-10 | 2006-10-04 | 塞诺米克斯公司 | 使用表达人的ENaC的卵母细胞的改进的电生理测定法和用于在使用膜电位报告染料的测定中提高ENaC增强子功效的PHENAMIL的用途 |
| CN101300489A (zh) * | 2005-11-03 | 2008-11-05 | 红点生物公司 | Trpm5离子通道的高通量筛选实验 |
| CN101868539A (zh) * | 2007-10-18 | 2010-10-20 | Seoul大学校产学协力团 | 鉴定调变钙活化型氯通道活性的药剂的方法 |
| CN101848717A (zh) * | 2007-10-26 | 2010-09-29 | 塞诺菲-安万特股份有限公司 | 诺孕酯作为trpc3、trpc6和trpc7离子通道选择性抑制剂的用途 |
| CN104449670A (zh) * | 2014-11-11 | 2015-03-25 | 山东大学 | 一种苯基呋喃类hERG钾离子通道的小分子荧光探针及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 余蓉: "《生物化学》", 31 July 2015 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113607707A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-11-05 | 国家食品安全风险评估中心 | 一种基于钠离子通道Nav1.1的海洋神经毒素荧光快速筛查方法 |
| CN113607707B (zh) * | 2021-08-05 | 2024-03-12 | 国家食品安全风险评估中心 | 一种基于钠离子通道Nav1.1的海洋神经毒素荧光快速筛查方法 |
| CN114774512A (zh) * | 2022-04-15 | 2022-07-22 | 杭州圣域生物医药科技有限公司 | 一种地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法 |
| CN114774512B (zh) * | 2022-04-15 | 2023-02-03 | 杭州圣域生物医药科技有限公司 | 一种地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法 |
| CN115786339A (zh) * | 2022-10-24 | 2023-03-14 | 北京爱思益普生物科技股份有限公司 | 一种tmej检测底物、其制备方法及应用 |
| CN115927526A (zh) * | 2023-01-05 | 2023-04-07 | 北京爱思益普生物科技股份有限公司 | 一种hERG通道的高通量检测方法及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110530829A (zh) | 一种基于荧光的早期药物筛选方法 | |
| Zheng et al. | High throughput assay technologies for ion channel drug discovery | |
| Fang et al. | Interleukin-17 alteration in first-episode psychosis: a meta-analysis | |
| CN109142710B (zh) | 一种快速灵敏检测河豚毒素ttx的方法 | |
| Watson et al. | Extraction, identification, and functional characterization of a bioactive substance from automated compound-handling plastic tips | |
| US20140199704A1 (en) | Multiplex cell signalling assays | |
| Kufareva et al. | A novel approach to quantify G-protein-coupled receptor dimerization equilibrium using bioluminescence resonance energy transfer | |
| Giudice et al. | Optimization and standardization of fluorescent cell barcoding for multiplexed flow cytometric phenotyping | |
| Yeyeodu et al. | A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth | |
| CN110006866B (zh) | 一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒 | |
| CN108387743B (zh) | 一种检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片及其检测方法 | |
| US20060008849A1 (en) | Methods for measuring chloride channel conductivity | |
| CN107121553A (zh) | 一种气‑液界面暴露系统联合高内涵技术定量检测1,3‑丁二烯致细胞dna损伤的方法 | |
| L Chang et al. | Quantification of intracellular proteins and monitoring therapy using flow cytometry | |
| US20140335545A1 (en) | Method for detecting compound-binding protein | |
| EP1778860B1 (en) | Methods for determining the potency, specificity, and toxicity of hematopoietic prostaglandin d2 synthase | |
| CN108801996A (zh) | 一种检测外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比的方法 | |
| Proudfoot et al. | Glossary of terms used in biomolecular screening (IUPAC Recommendations 2011) | |
| Manandhar et al. | Evaluating opioid-mediated adenylyl cyclase inhibition in live cells using a BRET-based assay | |
| CN107064086A (zh) | 一种基于高内涵技术定量分析苯并[a]芘致细胞DNA损伤的方法 | |
| KR20080004994A (ko) | 형광 이미징법을 이용한 ５－ｈｔ６ 수용체 리간드 고효율검색법 | |
| Chen et al. | Application of large-scale transient transfection to cell-based functional assays for ion channels and GPCRs | |
| Perez de Arce et al. | Co-culture Synaptogenic Assay: A New Look at Fluorescence Reporters and Technological Devices | |
| Fang | Cellular assays | |
| CN112280741A (zh) | FRT细胞株在制备筛选Piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240319 Address after: Room 101, 1st Floor, Building 16, No. 18 Science and Technology Innovation 13th Street, Daxing District, Beijing, 100176 Applicant after: ICE BIOSCIENCE Inc. Country or region after: Zhong Guo Address before: Building 4, 3rd Floor, No. 35 Jinghai Third Road, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing, 100176 Applicant before: ICE BIOSCIENCE Inc. Country or region before: Zhong Guo Applicant before: Xuzhou aisiyipu Biotechnology Co.,Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |