CN114774512A - 一种地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法 - Google Patents

一种地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法，包括以下步骤：a、合成具有活性的DNA聚合酶θ；b、使用化合物对DNA聚合酶θ进行预先孵育；c、通过地高辛标记底物，标记好的底物在DNA聚合酶θ的作用下进行DNA聚合反应；d、通过免疫印迹的方法检测地高辛信号；e、利用软件进行数据分析。本方法在普通生化分子实验室就能够进行，实验室条件要求较低，不受实验条件的限制，容易普及，具有快速、微量、高效且经济的优点。

Description

一种地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法
【技术领域】
本发明涉及生物化学的技术领域，特别是以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法的技术领域。
【背景技术】
传统药物的筛选是对于某一个已知靶点，合成大量的化合物，进行相互作用，进而筛选出先导化合物，然后进行后续研发。
DNA聚合酶活性测定是一种基本的测定方法，广泛应用于各种分子生物学研究。在药物发现和疾病诊断中，DNA聚合酶是一个重要的癌症治疗潜在靶点。然而，常用的DNA聚合酶标准实验方法(Aposhian,H.V.and A.Kornberg.1962.Enzymatic synthesis ofdeoxyri-bonucleic acid.J.Biol.Chem.237:519-525.)，是基于放射性同位素标记的掺入来进行的。受国内放射性同位素使用和处置条例的实验室要求限制，不能够在常规生物实验室中进行，同时该标记方法也不适合于药物筛选所需的高通量实验，因此需要一种易于实现快速、微量、高效且经济的、能够对靶点进行筛选的实验方法。
【发明内容】
本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法，具有快速、微量、高效且经济的特点。
为实现上述目的，本发明提出了一种地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法，包括以下步骤：
a、合成具有活性的DNA聚合酶θ；
b、使用化合物对DNA聚合酶θ进行预先孵育；
c、通过地高辛标记底物，标记好的底物在DNA聚合酶θ的作用下进行DNA聚合反应；
d、通过免疫印迹的方法检测地高辛信号；
e、利用软件进行数据分析。
作为优选，包括以下步骤：
a、以原核表达的方法获得具有活性的DNA聚合酶θ；
b、使用不同浓度的化合物对步骤a中得到的DNA聚合酶θ在室温下进行预先孵育；
c、在反应缓冲液中添加DNA聚合酶θ和DNA模板孵育5分钟，在缓冲液中加入底物和地高辛，继续孵育5分钟，在反应体系中添加终浓度为2mM的氯化镁，37℃环境下进行DNA聚合反应，反应一定时间后，将反应体系在95℃环境下处理5分钟，终止反应；
d、对反应体系进行免疫印迹实验，并将信号进行数字化转化；
e、用软件对数据进行分析拟合，确定药物对靶点的作用。
作为优选，所述步骤b为：不同的化合物分别在50μM、10μM、5μM、1μM、0.5μM、0.1μM、0.05μM、0.01μM浓度下别对DNA聚合酶θ进行5-10分钟的预先孵育。
作为优选，反应缓冲液中添加10nM的步骤b得到的DNA聚合酶θ，将DNA聚合酶θ与10μM DNA序列在室温环境孵育5分钟，加入终浓度分别为10μM dATP/dCTP/dGTP/dTTP和终浓度为1μM的地高辛-dUTP，反应体系在室温环境下孵育5分钟；
在反应体系中添加终浓度为2mM的氯化镁，37℃环境下反应30分钟，反应结束后将反应体系在95℃环境下处理5分钟，终止反应。
本发明的有益效果：国外实验室中常以P32标记进行DNA聚合酶反应，放射性同位素标记的实验方法对实验室要求很高，在国内无法在常规生物实验室中进行。以地高辛-dUTP参与合成反应后依赖地高辛标记对反应生成的DNA进行定量分析，使得实验在常规生物实验室中就能够进行。
本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
【附图说明】
图1为反应体系与对照体系的尼龙膜显影信号图；
图2为反应体系经不同浓度的TM-2处理的尼龙膜显影信号图；
图3为不同化合物作用下对POLQ polymerase domain IC50的拟合确定。
【具体实施方式】
实验材料：
实验试剂：感受态细胞(购于TIANGEN)；蛋白胨、酵母粉；
Tween-20、BSA、Tris、氯化钠、氯化镁、TCEP；地高辛-dUTP及还原性谷胱甘肽(均购于Sigma公司)；
dNTP(购于KATARA公司)；
Digoxigenin(D8Q9J)Rabbit mAb抗体(购于Cell Signal Technology公司)；
SUPERSIGNAL WEST Atto超敏底物(购于Thermo公司)；
HYBOND-N+核酸用尼龙印迹膜(购于GE公司)。
实验仪器：
电热恒温培养箱购于上海博讯公司，恒温震荡培养箱购于上海旻泉公司，超净工作台购于苏州佳宝公司，大型落地离心机购于美国Beckman公司，超声破碎购于上海净信，旋转混样仪购于其林贝尔公司，AKTA购于美国GE公司，NanoDrop购于美国Thermo公司，分子杂交炉购于宁波新芝公司，恒温震荡孵育器购于杭州来泊生物公司，微孔过滤器购于美国Bio-Rad公司，震荡摇床购于其林贝尔公司，显影仪购于美国Bio-Rad公司。
实施例1：
步骤一：合成DNA聚合酶θ
将质粒pGEX-4T-1-POLQ polymerase domain(1819-2590aa)转化于感受态Rosetta(DE3)中，获取蛋白表达菌株。将质粒pGEX-4T-1-POLQ polymerase domain(1819-2590aa)转化于感受态Rosetta(DE3)中，获取蛋白表达菌株。
步骤二：使用不同浓度化合物在50μM、10μM、5μM、1μM、0.5μM、0.1μM、0.05μM、0.01μM浓度下分别对蛋白进行预先孵育5分钟的处理，以不添加酶作为反应的阴性对照，以不添加化合物作为阳性对照。
步骤三：进行DNA聚合反应
配置反应缓冲液，缓冲液成分为：25mM Tris-HCl(pH 8.0)；50mM NaCl；1mMMgCl2；0.01％Triton X-100；0.01％BSA；1mM DTT。
在反应缓冲液中添加10nM的蛋白质POLQ polymerase domain(DNA聚合酶θ)，将蛋白质与10μM DNA序列在室温环境孵育5分钟，加入终浓度分别为10μM dATP/dCTP/dGTP/dTTP和终浓度为1μM的地高辛-dUTP，室温环境下孵育5分钟。在反应体系中添加终浓度为2mM的氯化镁，37℃环境下孵育30分钟后，95℃处理5分钟终止反应。
步骤四：检测合成的DNA
将反应产物通过微孔过滤器添加在尼龙膜上，将尼龙膜放置在60℃环境下交联15分钟。配置1％BSA，室温环境下在震荡摇床上对膜进行封闭处理30分钟。使用1XTBST缓冲液对膜进行震荡清洗5分钟，更换新的1XTBST缓冲液重复清洗5分钟。将Digoxigenin(D8Q9J)Rabbit mAb抗体以1：5000的比例稀释在1％BSA中，室温条件在震荡摇床上进行抗体孵育1小时，使用1XTBST缓冲液对膜进行震荡清洗5分钟，更换新的1XTBST缓冲液重复清洗3次，每次5分钟。将HRP标记的山羊抗兔二抗1：5000比例稀释在1XTBST中，室温环境下震荡孵育40分钟。使用1XTBST缓冲液对膜进行震荡清洗5分钟，更换新的1XTBST缓冲液重复清洗3次，每次5分钟。配置显影液，避光环境下对膜孵育3分钟后，使用显影仪进行显影，信号强弱即衡量POLQ polymerase domain活性下合成DNA的量。
步骤五：数据分析
对显影后尼龙膜上呈现出的信号通过Image J软件进行数字化转化并进一步分析，每个药物浓度处理下相对抑制率(％)＝1-[(反应组-阴性对照组)/(阳性对照组-阴性对照组)]。以不同浓度Log10为横坐标，使用GraphPad Prism软件，采用非线性回归方法进行曲线拟合并计算相应的IC50。
方法的初步验证：
在DNA的聚合反应中，将能够抑制DNA聚合酶θ活性的化合物称为阳性化合物。
如图1所示，第1个样品为添加目标蛋白的反应组(即阳性反应组)，图中第2个样品为不含目标蛋白的反应组(即阴性反应组)，第3个样品为添加了目标蛋白和抑制化合物的反应组，第4个样品为添加了化合物溶剂的空白对照组。
图中，TM-2为已知的DNA聚合酶θ的小分子抑制剂，其结构式为：
Figure BDA0003598048740000051
如图2所示，将TM-2在3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、30nM、10nM、3μM、1nM浓度下分别别蛋白进行5分钟的预先孵育的处理，之后进行DNA聚合酶反应，对反应完成后的信号进行ImageJ的处理，每个药物浓度处理下相对抑制率(％)＝1-[(反应组-阴性对照组)/(阳性对照组-阴性对照组)]。以不同浓度Log10为横坐标，使用GraphPad Prism软件，采用非线性回归方法进行曲线拟合并计算相应的IC50，结果如图3A所示。
由图1和图2可知，本方法可以有效反映出TM-2对DNA的聚合反应的抑制作用，方法可靠。
方法的应用：
将待筛选的化合物分别在3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、30nM、10nM、3μM、1nM浓度下分别别蛋白进行预先孵育的处理，之后进行DNA聚合酶反应，对反应完成后的信号进行Image J的处理，每个药物浓度处理下相对抑制率(％)＝1-[(反应组-阴性对照组)/(阳性对照组-阴性对照组)]。以不同浓度Log10为横坐标，使用GraphPad Prism软件，采用非线性回归方法进行曲线拟合并计算相应的IC50。
通过一系列化合物的筛选，筛选出对DNA聚合酶θ效果明显的化合物，实验数据如图3和表1所示。
表1
Figure BDA0003598048740000061
Figure BDA0003598048740000071
由筛选结果可知，SY-1和SY-3都对DNA聚合酶θ具有抑制作用，且SY-3的抑制效果强于SY-1。
SY-1即市面上的ART558(即TM-2)，是经过临床验证的聚合酶θ的的小分子抑制剂。
SY-3为本实验筛选出的对聚合酶θ具有抑制作用的新药。
实验稳定性分析：
选择国际公认的统计学参数Z’因子以确认实验结果是否符合高通量筛选的要求，采用Z’因子分析方法进行评估，计算公式为：A＝1-[3X(σC++σC-)]/IμC+-μC-I。
上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、合成DNA聚合酶θ；
b、使用化合物对DNA聚合酶θ进行处理；
c、底物在DNA聚合酶θ的作用下进行DNA聚合反应；
d、对合成的DNA进行检测；
e、根据检测结果进行数据分析。
2.如权利要求1所述的地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、合成具有活性的DNA聚合酶θ；
b、使用化合物对DNA聚合酶θ进行预先孵育；
c、通过地高辛标记底物，标记好的底物在DNA聚合酶θ的作用下进行DNA聚合反应；
d、通过免疫印迹的方法检测地高辛信号；
e、利用软件进行数据分析。
3.如权利要求1所述的地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、以原核表达的方法获得具有活性的DNA聚合酶θ；
b、使用不同浓度的化合物对步骤a中得到的DNA聚合酶θ在室温下进行预先孵育；
c、在反应缓冲液中添加DNA聚合酶θ和DNA模板孵育5分钟，在缓冲液中加入底物和地高辛，继续孵育5分钟，在反应体系中添加终浓度为2mM的氯化镁，37℃环境下进行DNA聚合反应，反应一定时间后，将反应体系在95℃环境下处理5分钟，终止反应；
d、对反应体系进行免疫印迹实验，并将信号进行数字化转化；
e、用软件对数据进行分析拟合，确定药物对靶点的作用。
4.如权利要求1所述的地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法，其特征在于，所述步骤a为：
将质粒pGEX-4T-1-POLQ polymerase domain(1819-2590aa)转化于感受态Rosetta(DE3)中，获取蛋白表达菌株；
将目标菌株进行扩大培养，在OD为0.7时添加0.2mM IPTG在16℃温度下培养15小时，4000rpm、4℃条件下收集菌体后用重悬缓冲液混匀菌体；4℃温度下使菌体充分破碎，10000rpm、4℃环境下离心20分钟获得上清液；将菌体上清液与适量GST磁珠在4℃环境下低速旋转孵育2小时后，4000rpm、4℃环境下收集磁珠并用缓冲液进行除杂清洗；
使用含有还原性谷胱甘肽的洗脱缓冲液将磁珠上结合的目的蛋白洗脱；使用AKTA将样品通过脱盐柱进行处理获得所需的目标蛋白；对样品进行SDS-PAGE检测，验证获得纯度较高的目标蛋白。
5.如权利要求1所述的地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法，其特征在于，所述步骤b为：
不同的化合物分别在50μM、10μM、5μM、1μM、0.5μM、0.1μM、0.05μM、0.01μM浓度下别对DNA聚合酶θ进行5-10分钟的预先孵育。
6.如权利要求1所述的地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法，其特征在于，所述步骤c为：
反应缓冲液中添加10nM的步骤b得到的DNA聚合酶θ，将DNA聚合酶θ与10μM DNA序列在室温环境孵育5分钟，加入终浓度分别为10μM dATP/dCTP/dGTP/dTTP和终浓度为1μM的地高辛-dUTP，反应体系在室温环境下孵育5分钟；
在反应体系中添加终浓度为2mM的氯化镁，37℃环境下反应30分钟，反应结束后将反应体系在95℃环境下处理5分钟，终止反应。
7.如权利要求1所述的地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法，其特征在于，所述步骤d为：
将反应产物通过微孔过滤器添加在尼龙膜上，将尼龙膜放置在60℃环境下交联15分钟；配置1％BSA，室温环境下在震荡摇床上对膜进行封闭处理30分钟；使用1XTBST缓冲液对膜进行震荡清洗5分钟，更换新的1XTBST缓冲液重复清洗5分钟；
将Digoxigenin(D8Q9J)Rabbit mAb抗体以1：5000的比例稀释在1％BSA中，室温条件在震荡摇床上进行抗体孵育1小时，使用1XTBST缓冲液对膜进行震荡清洗5分钟，更换新的1XTBST缓冲液重复清洗3次，每次5分钟；
将HRP标记的山羊抗兔二抗1：5000比例稀释在1XTBST中，室温环境下震荡孵育40分钟；使用1XTBST缓冲液对膜进行震荡清洗5分钟，更换新的1XTBST缓冲液重复清洗3次，每次5分钟；
配置显影液，避光环境下对膜孵育3分钟后，使用显影仪进行显影，信号强弱即衡量DNA聚合酶θ活性下合成DNA的量。
8.如权利要求1所述的地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法，其特征在于，所述步骤e为：
对显影后尼龙膜上呈现出的信号通过Image J软件进行数字化转化并进一步分析。
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