DE3850468T2

DE3850468T2 - System zum Detektierung von ONS.

Info

Publication number: DE3850468T2
Application number: DE3850468T
Authority: DE
Inventors: Viola T Kung; Peter A Nagainis; Iii Edward L Sheldon
Original assignee: Molecular Devices LLC
Current assignee: Molecular Devices LLC
Priority date: 1987-09-04
Filing date: 1988-09-02
Publication date: 1995-01-19
Anticipated expiration: 2008-09-03
Also published as: CA1323292C; EP0310251B1; EP0310251A2; EP0310251A3; JPH0217000A; DE3850468D1; ATE107965T1; US4978608A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins von DNA. Das Verfahren sieht die Verwendung von bindenden Proteinen mit hoher Affinität für einstrangige DNA vor.
Die DNA-Menge in einer Probe wurde traditionell entweder durch spektrophotometrische Mittel oder fluorometrisch unter Verwendung von Äthidiumbromid gemessen. Wenn die Probe rein ist, (enthält keine signifikante Mengen an Verunreinigungen wie z. B. andere Nukleinsäuren, Protein, Phenol oder Agarose) ist die spektrophotometrische Messung der Menge absorbierter ultravioletter (UV) Strahlung einfach und genau. Wenn jedoch eine Verunreinigung durch Protein oder Verbindungen gegeben ist, die stark im UV absorbieren, wie z. B. Phenol, ist eine genaue Quantifizierung der DNA-Menge nicht möglich. Weiters eignet sich diese Technik nur für Proben, die DNA im ug/ml-Bereich enthalten.
Wenn die DNA-Menge in der Probe klein ist oder die Probe bedeutsame Mengen an Verunreinigungen enthält, kann die DNA-Menge anhand der Intensität UV-induzierter Fluoreszenz geschätzt werden, die durch das in der DNA eingelagerte Äthidiumbromid emittiert wird. Die Fluoreszenzmenge ist zur Gesamtmenge an DNA proportional. Die DNA-Menge in der Probe kann daher durch Vergleichen der Ausbeute an Fluoreszenz der Probe mit jener einer Reihe von Standards geschätzt werden. Durch dieses Verfahren lassen sich selbst so geringe Mengen wie 1 bis 5 ug/ml DNA nachweisen. Unter Verwendung eines Minifluorometers (wie z. B. hergestellt durch Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, Kalifornien) und des Fluorochrom Hoechst 33258 kann die Empfindlichkeit auf 10 ng/ml erhöht werden.
Mit dem Aufkommen der rekombinanten DNA-Technologie wurde es unumgänglich, bedeutend kleinere DNA-Konzentrationen in einer Probe feststellen zu können, z. B. jegliche verunreinigende DNA, die in einem rekombinanten Produkt vorhanden sein kann. Die verunreinigende DNA kann nicht-spezifisch sein und eine unbekannte Sequenz aufweisen. Daher ist die Enzymamplifikation der Proben-DNA (z. B. unter Verwendung des DNA-Polymerasekettenreaktions-Verfahrens) aufgrund des Mangels an universellen Primern für die DNA-Synthese schwierig. Aus diesem Grund besteht beträchtliches Interesse, das Vorhandensein äußerst kleiner DNA-Mengen rasch und genau nachweisen zu können.

Einschlägige Literatur

Krauss et al., Biochemistry (1981) 22 : 5346-5352 offenbaren das Binden von einzelstrangigen bindenden Proteinen aus E.coli an Oligonukleotide. Vogelstein und Gillespie, Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1979) 76 : 615-619 offenbaren das Binden von DNA an Glas. Kung et al. offenbaren die Reinigung von Topoisomerase I aus Micrococcus luteus durch Hochsalz-Eluierung aus einer DNA-Sepharosesäule; J.Biol.Chem. (1977) 252 : 5398-5402. Es folgen Übersichtsartikel, die sich auf DNA-bindende Proteine beziehen. Gellert, The Enzymes, Band XIV (1981) 345-366; Wang, The Enzymes, Band XIV (1981) 332-343; Chase, Ann.Rev.Biochem. (1986) 55 : 103-136; Kowalczykowski et al., The Enzymes, Band XIV (1981) 375-444.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wird ein neuartiges Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von DNA in einer Probe bereitgestellt, das die Verwendung eines DNA-Nachweissystems vorsieht, bei dem eine der Komponenten ein DNA-bindendes Protein ist, das eine hohe Affinität für Einzelstrang-DNA (ssDNA) hat. Zum Nachweisen des Vorhandenseins von DNA wird eine Probe, die wahlweise vorbehandelt ist, wenn sie Protein enthält, denaturiert, um ssDNA zu ergeben. Danach wird die Probe mit einem einstrangigen DNA-bindenden Protein (BP) mit hoher Affinität in Kontakt gebracht, um ssDNA-BP-Komplexe zu bilden, die anschließend mittels einer entweder an die ssDNA oder das BP gebundenen Markierung nachgewiesen werden können. Das BP und die ssDNA können zum Zeitpunkt des In-Kontakt-Bringens beide in Lösung sein, oder es kann entweder die ssDNA oder das BP vor dem Zeitpunkt des In-Kontakt-Bringens nicht-diffusiv an einen festen Träger gebunden sein. Wenn die ssDNA oder das BP an einen festen Träger gebunden sind, können sie direkt an den festen Träger gebunden oder mittels eines Linkermoleküls gebunden werden. Man kann dieses Verfahren zum Nachweisen von DNA z. B. in rekombinanten Proteinprodukten oder zum Nachweisen von verunreinigenden Organismen in einer Probe anwenden.

BESCHREIBUNG SPEZIELLER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweisen des Vorhandenseins von DNA in einer Probe, insbesondere in einem in Kultur erzeugten Proteinprodukt, z. B. Fermentation, bereitgestellt. Das Vorhandensein von DNA läßt sich durch Verwendung von Hochaffinitäts/Einzelstrang-DNA-bindenden Proteinen nachweisen.
Das einstrangige DNA-bindende Protein (BP) mit hoher Affinität kann aus einer beliebigen Quelle (entweder einer eukaryotischen oder prokaryotischen) stammen und kann einstrangige-DNA bindende Proteine, Topoisomerasen und DNA-abwickelnde Proteine enthalten. Von besonderem Interesse sind das einstrangige DNA-bindende Protein aus E.coli (SSB), T4-Gen 32-Protein und Topoisomerase I aus Micrococcus luteus und E.coli. Isolationsverfahren umfassen die durch Lohman et al., Biochemistry (1986) 25 : 21-25 beschriebene Affinitätschromatographie. BP ist auch im Handel erhältlich, z. B. bei dem United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio.
Das DNA-bindende Protein ist dadurch gekennzeichnet, daß es eine hohe Affinität für einstrangige-DNA (ss-DNA) aufweist, zumindest 10&sup5; M&supmin;¹, üblicherweise im Bereich von etwa 10&sup8;-10¹&sup0; M&supmin;¹, wenn die ssDNA zumindest 100 Nukleotide lang ist. Alternativ dazu kann das Protein als einstrangige-DNA-bindendes Protein gekennzeichnet sein, das zur Eluierung aus ssDNA-Zellulose oder ssDNA-Sepharose eine Konzentration von mehr als etwa 0,4 M Natriumchlorid (oder ein anderes einwertiges Salz,- das eine vergleichbare Ionenstärke bietet) benötigt. Im allgemeinen ist die Konzentration zur Eluierung größer als etwa 0,6 M Natriumchlorid, und vorzugsweise größer als etwa 1,0 M Natriumchlorid. Beim Bestimmen der Affinität sollte man einen wässerigen Puffer, pH-Wert 6 bis 9, bei 25ºC verwenden. Kein Detergens, Denaturierungsmittel (z. B. Harnstoff, Guanidinchlorid), chaotropisches Mittel oder organisches Lösungsmittel sollte im Puffer vorhanden sein.
Das BP kann ungebunden an jegliche andere Komponente verwendet werden, oder es kann entweder direkt, durch ein Linkermolekül oder kovalent an eine Markierung nicht-diffusiv kovalent oder adsorptiv an einen festen Träger gebunden werden. Bei Verwendung eines Linkermoleküls wird das BP an eine Hälfte eines speziellen Bindungspaares gebunden, wobei die andere Hälfte das Linkermolekül ist. Beispiele spezieller Bindungspaare sind Biotin und Antibiotin; Avidin und Streptavidin.
Es eignen sich verschiedene feste Trägermaterialien. Somit kann der feste Träger Filtermembranen, vorzugsweise ImmobilonTM oder Nitrozellulose enthalten. Für Nitrozellulosemembranen ist die Porengröße der Membran weniger als 5 um, vorzugsweise weniger als 1 um; sie ist üblicherweise größer als 0,05 um, vorzugsweise größer als 0,1 um. Zur nicht-diffusiven Bindung des BP an den festen Träger werden herkömmliche geeignete Verfahren angewendet. Die Verfahren umfassen das kovalente Binden an Carbonylimidazolgruppen oder andere aktive, auf der Membran vorhandene Gruppen oder das nicht-kovalente Binden an die Membran durch Adsorption.
Das feste Trägermaterial kann auch Chromatographiebett-Materialien, monodisperse Latexteilchen, einschließlich jener auf Styrolbasis, chemisch modifiziertes Styrol, Propylen, Methacrylat, Butadien, Acrylnitril oder andere Monomere; Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen (z. B. hergestellt durch Polysciences, Inc.), Nylonperlen, chemisch modifizierte Nylonperlen, Oxiranacrylperlen, wie z. B. Eupergit® (Rohm Pharma, Darmstadt, Deutschland); Copolymere von Acrylester und Acrylamid enthalten. Verfahren zum Binden von BP an diese Materialien umfassen folgende: BP kann durch herkömmliche Mittel kovalent an ein aktiviertes Chromatographieharz mit reaktionsfähigen Gruppen gebunden werden, die kovalente Bindungen mit Proteinen bilden können, wie z. B. CNBr-aktivierte Sepharose-4B, CNBr-aktivierte 4% Agarose oder CNBr-aktivierte Sepharose-6MB (Pharmacia P-L Biochemicals; Pisca-taway, New Jersey) oder ein anderes Harz, wie z. B. Zellulose. BP kann durch nicht-spezifische Adsorption an Polystyrolperlen gebunden werden. BP kann auch durch herkömmliche Mittel kovalent an Polystyrolperlen gebunden werden, die carboxyl- oder aminofunktionale Gruppen enthalten (Polysciences, Inc.; Warrington, Pennsylvania).
Die im allgemeinen zu einstrangiger DNA (ssDNA) denaturierte DNA kann nicht-diffusiv entweder absorptiv oder kovalent, sowie entweder direkt oder durch ein Linkermolekül an einen festen Träger gebunden werden. Der feste Träger kann eine Membran, wie z. B. Nitrozellulose, sein. Die die ssDNA enthaltende Probe wird vorzugsweise auf die Membran gefiltert. Um das Binden an die Membran zu erleichtern, ist die Salzkonzentration der Probe im allgemeinen größer als 50 mM Natriumchlorid, vorzugsweise größer als 100 mM Natriumchlorid oder eines anderen Salzes, das ähnliche Ionenstärke bietet. Die ssDNA wird dann z. B. durch Backen der Membran bei einer Temperatur zwischen 75ºC und 100ºC, vorzugsweise bei 80ºC über einen Zeitraum von zumindest 30 Minuten, üblicherweise von zumindest 1 Stunde und vorzugsweise von nicht mehr als 6 Stunden auf der Membran fixiert. Andere Verfahren des Fixierens der ssDNA auf der Membran umfassen das Waschen der Membran mit Äthanol.
Wird die DNA durch ein Linkermolekül an den festen Träger gebunden, kann das Linkermolekül jedes beliebige Molekül sein, das für DNA eine hohe Affinität aufweist, wie z. B. ein Antikörper zu DNA, ein BP u.ä. In einem bevorzugten Verfahren umfaßt das Linkermolekül ein Konjugat von Biotin und anti-DNA oder Biotin und BP, das nicht-diffusiv an den festen Träger gebunden ist.
Der feste Träger kann auch positiv geladenes Nylon, z. B. Perlen oder Membranen sein (beispielsweise Nytran® (Schleicher und Schüll.; Keene, NH), Gene-Screen PlusTM (duPont Company, Boston, Massachusetts), Zeta-Probe® (BioRad Laboratories; Pinole, Kalifornien), Bio-TraceTM (Gelman Sciences, Inc.; Ann Harbor, MI), Bio-dyne B® (Pall Biosupport; Glen Cove, New York) und GenatranTM (Plasco, Inc., Woburn, Massachusetts)). Die ssDNA kann durch Inkubieren des Nylons in einem Puffer bei einem pH-Wert von zwischen 6 und 9 umfassend eine geeignete Salzlösung und/oder nicht-ionischens Detergens selektiv nicht-diffusiv an das positiv geladene Nylon gebunden werden. Die geeignete Salzlösung ist vorzugsweise weniger als 1 M Natriumchlorid (oder eines anderen Salzes, das ähnliche Ionenstärke bietet) und vorzugsweise weniger als 0,6 M Natriumchlorid. Beispiele geeigneter nicht-ionischer Detergentien sind Tween-2® oder Triton X-100® bei einer Konzentration von 0,1-5,0 % v/v.
Die Probe kann jede beliebige Probe sein, in der es erwünscht ist, DNA nachzuweisen, wenn sie in einer niedrigen Konzentration vorhanden ist. Die Probe kann ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein, z. B. eine proteinartige, lyophilisierte Zusammensetzung oder ein wässeriges Medium. Proben können Proteine enthalten, die durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden, z. B. Gewebeplasminogenaktivator, Insulin, Wachstumshormon, Interleukin 2 und Interferone; für therapeutische Zwecke hergestellte monoklonale Antikörper; Wasser zur Verwendung in Verfahrensweisen, bei denen absolute Reinheit erforderlich ist. Die DNA kann in Form nackter DNA entweder als doppelstrangige oder einstrangige DNA oder in Form einer ganzen Zelle (entweder prokaryotisch oder eukaryotisch) vorliegen.
Das Verfahren zur Durchführung der vorliegenden Erfindung ist im allgemeinen wie folgt, doch Variationen liegen auch im Schutzbereich der Erfindung.
Wenn die DNA in ganzen Zellen, wie z. B. in Bakterien- oder Hefezellen, vorhanden ist, können die Zellen lysiert werden, indem sie lytischen Bedingungen ausgesetzt werden, wie z. B. Behandlung mit Natriumhydroxid, chaotropen Mitteln wie Kaliumthiocyanat u.ä. Wenn die Probe proteinhältig ist, wird das Protein wahlweise entfernt. Die DNA wird dann zu ssDNA denaturiert und die ssDNA nicht-diffusiv an einen festen Träger gebunden. Wenn der feste Träger kein nicht-diffusiv gebundenes BP enthält, kann die ssDNA z. B. durch Backen, Behandeln mit Äthanol oder durch andere geeignete Verfahren an den festen Träger fixiert werden. Danach wird zum festen Träger BP hinzugefügt, das sich spezifisch an die ssDNA bindet. Wenn der feste Träger BP umfaßt, bindet sich die ssDNA spezifisch an das BP auf dem festen Träger, und der Fixierungsschritt entfällt. Ob DNA in der Probe vorhanden ist, wird durch Nachweisen von ssDNA-BP-Komplexen auf dem festen Träger mittels einer Markierung bestimmt, die sich entweder auf dem BP oder der ssDNA befindet. Alternativ dazu kann das BP direkt zur denaturierten Probe hinzugefügt werden, wo es sich an ssDNA bindet, um BP-ssDNA-Komplexe zu bilden. Die Probe wird dann gefiltert.
Wenn es erwünscht ist, die Konzentration vorhandener DNA zu bestimmen, werden zumindest eine, keine DNA enthaltende Hintergrundlösung und zumindest eine, eine bekannte DNA-Menge enthaltende Bezugslösung identisch mit der Probe behandelt, die eine unbekannte Konzentration an DNA enthält. Die Menge an Markierung, die in der Hintergrundlösung nachweisbar ist, wird von der Menge der in der Bezugslösung und der unbekannten Probe nachweisbaren Markierung abgezogen. Die eingestellten Werte für die Bezugslösung und die unbekannte Probe werden dann in Beziehung gesetzt, um die Menge der in der Probe vorhandenen DNA zu bestimmen.
Im folgenden werden allgemeine Verfahren zur Durchführung der obigen Schritte beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Nachweis von DNA entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von Protein verwendet werden. Bei Vorhandensein von Protein ist ein zusätzlicher Schritt des Entproteinisierens der Probe erwünscht. Es eignet sich jedes herkömmliche Mittel zum Entproteinisieren (z. B. Phenolextraktion), das die Integrität der DNA nicht nachteilig beeinflußt. Weist das Protein bekannte Eigenschaften auf, kann die Probe durch Ionenaustauschsäulenchromatographie (z. B. DEAE-Zellulose, Phosphozellulose, Sulfongel), Hydroxyapatit (die einstrangige oder doppelstrangige DNA kann durch Eluierung mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen vom Protein getrennt werden), Gelfiltration und Affinitätschromatographie entproteinisiert werden.
Die Affinitätschromatographie kann zum direkten Entfernen des Proteins aus der Probe verwendet werden (z. B. unter Verwendung des immobilisierten Mäuseimmunoglobulins, das gegen das zu entfernende Protein gebildet ist), oder die Probe kann unter Verwendung von immobilisiertem BP entproteinisiert werden, um die DNA in der Probe zu binden. Die DNA kann anschließend unter Verwendung einer Hochsalzkonzentration, üblicherweise größer als 1 M, vorzugsweise größer als 2 M, aus dem BP eluiert und der Eluant direkt im Nachweisassay nach dem Einstellen der Salzkonzentration verwendet werden. Die endgültige Salzkonzentration hängt von der jeweils verwendeten Vorschrift ab. Wo der feste Träger z. B. eine positiv geladene Nylonmembran oder eine ein Linkermolekül umfassende Membran ist, wird die Salzkonzentration auf isotonisch eingestellt. Zum Nachweis von DNA in einer monoklonalen Antikörperprobe kann der monoklonale Antikörper unter Verwendung von an einen festen Träger gebundenem Protein A entfernt werden.
Andere Verfahren des Entproteinisierens der Probe umfassen das Mischen der Probe mit einer Suspension aus Glasteilchen in Gegenwart einer hohen Natriumjodid-Konzentration. Jegliche, in der Probe vorhandene DNA wird durch die Glasteilchen nicht-diffusiv gebunden. Die Glasteilchen werden isoliert und die DNA durch Behandlung mit Wasser oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewonnen. Die Glasteilchen können fein gemahlene Glasperlen oder vorzugsweise eine Zusammensetzung enthalten, die GlassmilkTM ein Produkt von BIO 101, Inc., La Jolla, Kalifornien, umfaßt.
Ein weiteres Verfahren zum Entproteinisieren der Probe ist das Mischen der proteinhältigen Probe mit einer proteolytischen Enzymzusammensetzung, die z. B. zumindest eines der Enzyme Pronase oder Proteinase K enthält. Nach der Enzymbehandlung wird das hydrolysierte Produkt im allgemeinen entfernt, z. B. durch Zentrifugieren durch eine Membran mit einem Niedermolekulargewichts-Cutoff (etwa 10.000 oder 30.000, geliefert durch Centriprep-10, Centriprep-30; Amicon, Danvers, Massachusetts), Verwendung eines Millipore Kleinvolumenultrafiltrations-Geräts mit einem Niedermolekulargewichts-Cutoff (etwa 10.000 oder 30.000) oder Gelfiltration. Nach Digerieren, Entfernen oder Digerieren plus Entfernen jeglichen vorhandenen Proteins wird die DNA zu ssDNA denaturiert. Verfahren zum Denaturieren der DNA umfassen das Erhitzen auf etwa 90-100ºC oder die Behandlung mit Natriumhydroxid (pH-Wert 13,0). Nachdem raschen Abkühlen (zur Vermeidung des erneuten Annelierens der DNA) oder Neutralisieren (unter Verwendung von z. B. Ammoniumacetat oder Trispuffer) wird die ssDNA mit einem festen Träger in Kontakt gebracht.
Wenn der feste Träger eine Membran wie z. B. Nitrozellulose oder positiv geladenes Nylon ist, wird die Probe im allgemeinen unter Verwendung eines Mehrfach-Filtrationsgeräts gefiltert. Wenn der feste Träger jedoch z. B. positiv geladene Nylonperlen sind, können die Perlen direkt in der Probe inkubiert werden. Wenn der feste Träger auf seiner Oberfläche immobilisiertes BP aufweist, bindet sich die ssDNA an das BP, um BP-ssDNA-Komplexe zu bilden. Wenn der feste Träger keine BP enthält, wird die DNA durch Backen oder Behandlung mit Äthanol am festen Träger fixiert. Dieser Schritt kann entfallen, wenn man eine positiv geladene Nylonmembran verwendet.
Nichtspezifische bindende Stellen auf Nitrozellulose oder positiv geladenem Nylon können durch Inkubation der Membran oder Perlen mit einer Proteinlösung hoher Konzentration, wie z. B. 1 bis 10% Rinder-Serumalbumin (BSA), nichtfetter Trockenmilchlösung u.ä. blockiert werden. Für das positiv geladene Nylon kann die nichtspezifische bindende Stelle zusätzlich durch Waschen mit einer nichtionischen Detergenslösung, wie z. B. Tween-20® oder Triton X-100® (üblicherweise 0,1-5,0%) blockiert werden.
Der nicht-diffusiv gebundene ssDNA umfassende feste Träger wird dann mit markiertem BP inkubiert, um 3P-ssDNA-Komplexe zu bilden. Wenn der feste Träger eine Nitrozellulose oder positiv geladene Nylonmembran ist, wird ein Puffer (pH-Wert 6-9), der BP enthält (üblicherweise etwa 0,3 ug/ml) zur Membran hinzugefügt. Der Puffer ist im allgemeinen bei Raumtemperatur und enthält, vorzugsweise 0,01-0,3 M, Natriumchlorid und für das positiv geladene Nylon zusätzlich ein nichtionisches Detergens wie z. B. Tween-20® oder Triton X-100® (vorzugsweise 0,1-5,0% v/v).
Mittels der entweder am BP oder ssDNA befestigten- Markierung können jegliche BP-ssDNA-Komplexe nachgewiesen werden, wobei die Markierung vorzugsweise am BP befestigt ist. Eine Ausnahme besteht dann, wenn BP-am festen Träger vorbefestigt wird, wenn die DNA vorzugsweise markiert wird. Das BP kann auf verschiedene Weise kovalent markiert werden. Die Markierung kann ein Enzym, z. B. alkalische Phosphatase, β-D-Galactosidase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glucoseoxidase, Meerrettichperoxidase, β-Lactamase, Urease; ein Radionuklid wie z. B. ¹²&sup5;J; eine chemilumineszierende oder fluoreszierende Verbindung wie z. B. Fluoresceinisocyanat; ein Hapten wie z. B. Biotin u.ä.; oder jede andere Markierung sein, die ein nachweisbares Signal liefert. Wenn die Markierung ein Enzym wie z. B. Urease ist, das zumindest einen freien, zugänglichen, nicht-essentiellen Cysteinrest enthält, kann BP an das Enzym gekoppelt werden, wie dies z. B. durch Blakely et al., J.Mol.Catalysis (1984) 23 : 263-292 beschrieben ist. Andere Enzyme, die auf diese Weise gekoppelt werden können, sind z. B. -D-Gal actosidase.
Alternativ dazu kann eine Enzymmarkierung thioliert und dann an das BP konjugiert werden. Verfahren zum Befestigen von Markierungen an Proteinen sind ausführlich in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Siehe beispielsweise Healey et al., Clinica Chimica Acta (1983) 134 : 51-58; Ishikawa et al., J.Immunoassay (1983) 4 : 209-327; und T&ijlig;ssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (1985) 259-263, Elsevier Science Publishers (Amsterdam).
Wenn die Markierung auf SSB ein Enzym ist, beträgt die Anzahl an pro SSB-Molekül gebundenen Enzymmolekülen üblicherweise etwa 1 bis 3 Maleimidmoleküle/SSB, vorzugsweise 1,8 Maleimide/Molekül. Im allgemeinen führt dies zu einem SSB-Enzymkonjugat umfassend 1 Enzymmolekül pro SSB-Molekül. Wenn die Markierung ein Hapten wie z. B. Biotin ist, beträgt die Anzahl an pro SSB-Molekül gebundenen Haptenmolekülen üblicherweise 1 bis 5, vorzugsweise 3 bis 4.
Die nachzuweisende DNA und nicht das BP kann markiert werden. Die Markierung kann ein Radionuklid, Fluorophor oder ein Hapten wie z. B. Digoxin oder Biotin u.ä. enthalten. Die Markierung kann durch jede beliebige herkömmliche Enzymreaktion wie z. B. Nick-Translation oder durch terminales Markieren mit ³H, I4C ³²P oder biotinmarkierten Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTP) in die DNA eingeführt werden. Die markierte DNA wird dann durch Alkali oder Wärme zu ssDNA denaturiert.
Alternativ dazu kann die DNA mit einem Reagens wie Isopsoralen markiert werden, das sich an doppelstrangige DNA bindet. ³H-Isopsoralen oder Biotinisopsoralen ist bei HRI Research, Inc., Berkeley, Kalifornien zu beziehen. Das Isopsoralenreagens wird durch Vermischen mit einer Probe und anschließender Photobestrahlung bei 340-380 nm an DNA gebunden. Wenn die verwendete Markierung Isopsoralen ist, ist es nicht erforderlich, die markierte DNA zu denaturieren, da Isopsoralen-markierte DNA ohne jeglichen Denaturierungsschritt durch BP erkannt wird.
Verfahren zum Nachweisen von BP-ssDNA-Komplexen hängen von der Art der Markierung sowie der erforderlichen Empfindlichkeit ab. Wenn die Markierung ein Enzym ist, kann das Verschwinden von Substrat oder das Auftreten eines Reaktionsprodukts nach der Zugabe von Substrat spektrophotometrisch gemessen werden. Wenn das Enzym z. B. Urease ist, kann ein Indikatorfarbstoff wie z. B. Cresolrot verwendet werden, um die Veränderung des pH-Werts in der Probe nach der Zugabe von Enzymsubstrat zu überwachen. Die Veränderung der optischen Dichte oder der visuellen Intensität der Farbveränderung wird dann mit dem DNA-Gehalt der Probe durch Vergleich mit zumindest einer identisch behandelten Bezugslösung korreliert, die eine bekannte DNA-Konzentration enthält. Alternativ dazu kann man jegliche vorhandene DNA durch Messen des Betrags der pH-Veränderung mit einem photoreaktiver Gerät nachweisen, wie es in der US PS 4.591.550 beschrieben ist. Zu anderen Verfahren zum Nachweisen von BP-ssDNA-Komplexen in der Probe gehören das Quantifizieren der Menge an Radioaktivität, wenn die Markierung ein Radionuklid ist. Wenn die Markierung ein Hapten wie z. B. Biotin ist, kann die Markierung z. B. durch Verwendung von enzymmarkiertem Avidin, Streptavidin oder Antibiotin nachgewiesen werden.
Aus praktischen Gründen werden die Reagentien oft in Sätzen bereitgestellt, wo sie in Verbindung mit Puffer, Stabilisatoren, Exzipienten u.ä. vorhanden sein können. Der Satz kann auch jegliche zusätzliche Reagentien enthalten, die zur Herstellung von markiertem BP oder von ssDNA und zum Nachweis der markierten BP-ssDNA-Komplexe bei der Durchführung des Assay erforderlich sind. Wenn die Reagentien BP enthalten, kann das markiert oder unmarkiert bereitgestellt sein. Falls es unmarkiert ist, kann es auch nicht-diffusiv an einen festen Träger gebunden bereitgestellt sein.
Die folgenden Beispiele dienen als Veranschaulichung und sind keineswegs einschränkend.

VERSUCHSTEIL

Beispiel 1

Herstellung von BP-Enzymkonjugaten

A. Herstellung von SSB-Ureasekonjugat unter Verwendung von m-Maleimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS)

Einstrangige-DNA-bindendes Protein aus E.coli (SSB) stammte von United States Biochemical Corp. Cleveland, Ohio. Es wurde wie folgt an das Vernetzungsmittel MBS verbunden. 100 ul 0,25% MBS in Dimethylformamid (DMF) wurde zu 2,0 ml hinzugefügt, in denen 2 mg SSB in 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 5,8 enthalten war. Die Mischung wurde 30 min lang bei Raumtemperatur vorsichtig gerührt und dann auf Sephadex G-25 getrennt. Der Eluierungspuffer war 0,1 M Phospliat, pH-Wert 6,8. Fraktionen wurden durch UV-Absorption bei 280 im überwacht. Die Peakfraktionen (3 ml) wurden mit 4 ml Urease (20 mg) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,3 kombiniert. Die Mischung wurde 20 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 1,75 ml 500 mM Natriumsulfit in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,8, unterbrochen, der 10 mM Dithiothreitol (DTT) enthielt. Das gebildete Konjugat wurde durch Gelfiltrationschromatographie vom unkonjugierten Enzym getrennt. Das gereinigte Enzymkonjugat wurde dann 1 : 1 (v/v) mit Glycerin verdünnt. BSA wurde zu D,25% (g/v) hinzugefügt. Das Konjugat wurde bei 2-8ºC gelagert.

B. Herstellung von SSB-Meerrettichperoxidase (HRP) Konjugat unter Verwendung von m-Maleimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS)

HRP (Boeringer-Mannheim, La Jolla, Kalifornien) wurde mit N-Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithio)propionat (SPDP) (Pierce, Rockville, Illinois) durch Kombinieren von 16 mg HRP in 0,1 M Kaliumphosphatpulver, 0,2 M Natriumchlorid, pH-Wert 7,5 mit 435 ug SPDP in 25 ul Dimethylformamid (DMF) und durch 30-minütiges Koppeln bei Raumtemperatur thioliert. Nicht umgesetztes SPDP wurde durch Chromatographie auf Sephadex G-25 entfernt, mit einem 0,2 M Natriumchlorid enthaltendem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0 eluiert.
Dithiopyridingruppen auf HRP wurden durch Zugabe von 25 mM DTT innerhalb von 30 Min. entblockt und anschließend das DTT und das gebildete 2- Thiopyridin durch Trennen auf G-25 in PBS entfernt.
Maleimid-SSB wurde durch Zugabe von 25 ml einer 0,25%igen Lösung von MBS in DMF zu 0,55 mg SSB in 0,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer und 30-minütiges Rühren bei Raumtemperatur gebildet. Maleimid-SSB wurde auf Sephadex G-25 gereinigt und dann mit 15 mg thioliertem HRP durch Kombinieren der beiden Lösungen sowie 20-minütiges Umsetzen bei Raumtemperatur kondensiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 12,5 ul 100 mM 2-Mercaptoäthanol unterbrochen. Die SSB-HRP-Konjugatlösung wurde in Glycerin zu 10% gemacht (v/v) und bei 4ºC gelagert.

C. Herstellung von SSB-Biotinkonjugat

1 mg SSB in PBSE (150 mM, NaCl 50 mM, Natriumphosphat, pH-Wert 7,0 und 1 mM EDTA) wurde mit 50 ug Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester in 20 ul DMF 2 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Rühren vermischt. Nicht umgesetztes Biotinreagens wurde durch Schicken über eine Sephadex®G-25-Säule entfernt.

D. Herstellung von Anti-DNA-Urease-Konjugat

1 mg gereinigter Anti-DNA-monoklonaler Antikörper, Klon 4H2 (erhalten von Dr.Richard Weisbart, Sepulveda Veterans Administration Hospital, Los Angeles) in 1 ml PBSE wurde mit 125 ug 4-(N-MaieimIdmetnyi)cycionexan-1-Karuonsäure N-hydroxysuccinimidester (SMCC) in 50 ul DMF umgesetzt. Nicht umgesetzter SMCC wurde durch Schicken über eine Sephadex® G-25-Säule mit PBSE eluiert. Die Zahl der Maleimidgruppen pro Antikörper betrug 4. Urease (20 mg) wurde anschließend zum Maleimidantikörper hinzugefügt und 4 Stunden lang bei 4ºC inkubiert. Nicht umgesetzte Maleimidgruppen wurden dann durch Zugabe von 2-Mercaptoäthanol bis auf eine Konzentration von 2 mM blockiert.
Konjugat wurde durch Gelfiltrationschromatographie auf einer 1,5 cm · 70 cm Säule von Sephacryl® S-400 HR (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) in einem Puffer aus 50 mM Natriumsulfit, 20 mM Natriumdihydrogenphosphat, 200 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA, 2 mM Dithiothreitol und 0,1% Tween®-20 gereinigt. Der gesamte Proteinpeak, der vor dem freien Ureasepeak eluierte, wurde kombiniert. 0,05% BSA wurde hinzugefügt und die Konjugatlösung bei 4ºC in dicht verschlossenen Behältern unter Argongas gelagert.

E. Herstellung von Biotin-Anti-DNA-Konjugat

1 mg gereinigter Anti-DNA Antikörper von R.Weisbart in PBSE wurde zu 50 ug Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester in 20 ul DMF hinzugefügt und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nicht umgesetztes Biotinreagens wurde durch Schicken über eine Sephadex® G-25-Säule entfernt. Gereinigtes Anti-DNA-Biotin wurde bei 4ºC gelagert.

Beispiel 2

Binden von SSP an feste Träger

A. Immobilisierung von SSB auf einer ImmobilonTM-Membran

Die ImmobilonTM-Membran enthält Carbonylimidazolgruppen, die sich an Epsilonaminogruppen auf Lysin oder Arginin binden. SSB wurde auf einer 0,65 um ImmobilonTM-Membran (Millipore; Bedford, Massachusetts) durch Tränken der Membran in phosphatgepufferter, 0,2 mg/ml SSB enthaltender Salzlösung bei Raumtemperatur 1 Stunde lang immobilisiert (10 ml Proteinlösung/ 100 cm²-Membran). Die SSB-Lösung wurde durch Dekantieren entfernt. Jegliche verbleibenden aktiven Carbonylimidazolgruppen auf der Membran wurden mit 0,1 M Äthanolamin (pH-Wert 9,5) bei Raumtemperatur über Nacht gequencht. Die Membran wurde anschließend nacheinander in phosphatgepufferter Salzlösung, destilliertem Wasser und Polyvinylalkohol gewaschen (15 pro Waschung) und danach bei 65ºC 5 Min. lang getrocknet. Die getrocknete Membran war dann zur Verwendung im Nachweissystem bereit. 400 ul einer Probe, die einstrangige ³²P-markierte DNA (von 10-1000 pg) in einer 10 mg/ml BSA-wässerigen Lösung enthielt, wurde durch die SSB-ImmobilonTM-Membran gefiltert (Filtrationszeit 10 min). 70% der ³²P-Zählungen wurden auf der Membran eingefangen, wenn die SSB-Konzentration 0,2 mg/ml betrug. Eine Steigerung der im Immobilisierungsverfahren verwendeten SSB-Konzentration auf 1 mg/ml steigerte den DNA-Einfang auf 80%.

B. Immobilisierung von SSB auf Nitrozellulosemembranen

SSB wurde zu einer Nitrozellulosemembran (0,45 u Porengröße, Schleicher und Schüll) durch Tränken der Membran in 50 ug/ml SSB enthaltende PBS bei 4ºC über Nacht adsorbiert. Nichtspezifische bindende Stellen auf der Membran wurden mit 10 mg/ml BSA bei Raumtemperatur 1 Stunde lang blockiert. Wenn 400 ul 10 mg/ml BSA enthaltender Proben und ³²P-markierte einstrangige DNA durch die Membran gefiltert wurden, wurden 36% der ³²P-Zählungen auf der Nitrozellulosemembran eingefangen.

Beispiel 3

Nachweis von reiner DNA in einer Probe

A. Visuelle Bestimmung

Proben, die reine Kalbsthymus-DNA (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0) aus 0-100 pg/Probe (in 10 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,0, 0,15 M Natriumchlorid, 1 mM EDTA) enthielten, wurden durch zehnminütiges Erhitzen auf 100ºC und anschließendes rasches Abkühlen zu einstrangiger
DNA denaturiert. Die denaturierten Proben wurden unter Verwendung eines Mehrfach-Filtrierungsgeräts durch eine 0,45 u Nitrozellulosemembran (Schleicher und Schüll; Keene, NH) gefiltert. Die Membranen wurden dann 1 Stunde lang gebacken, um die DNA zu fixieren. SSB-Ureasekonjugat, das wie in Beispiel 1A hergestellt und ohne weitere Reinigung verwendet wurde, wurde in 2% Rinder-Serumalbumin (BSA), 2% Ficoll, 2% Polyvinylpyrrolidon, 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumchlorid zu 0,3 ug/ml verdünnt, 2 mM EDTA, pH-Wert 7,5, wurde zur Membran hinzugefügt. Die Membran wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit dem SSB-Ureasekonjugat in einer Petrischale in einem ausreichenden Konjugatvolumen inkubiert, um die Membran abzudecken. Die Membran wurde dann dreimal mit 0,15 M Natriumchlorid, 1 mM EDTA (pH-Wert 6) gewaschen, um jegliches nicht-spezifisch gebundenes Konjugat zu entfernen. Jegliche vorhandene DNA wurde durch die Zugabe von Enzymsubstrat (100 mM Harnstoff, 0,15 M Natriumchlorid, 1 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6, 0,5 mM Cresolrot) nachgewiesen. Die Veränderung des pH-Werts aufgrund der Urease-Reaktion führte zu einer Farbänderung des Cresolrots von orange zu purpurrot. Die visuelle Intensität des purpurroten Flecks wurde anschließend durch Bestimmen der relativen Größe der Farbflecke auf der Membrar. und der Farbintensität mit dem DNA-Gehalt korreliert.

Tabelle 1

KOLORIMETRISCHER NACHWEIS VON DNA

Reine DNA Farbintensität nach (pg/Probe) 3 Min.
0 10 +
20 ++
50
100

B. Biosensor pH-Bestimmung

Jegliche DNA, die auf den wie oben beschrieben vorbereiteten Membranen vorhanden war, kann auch durch Messen des Betrags der Veränderung des pH-Werts im Anschluß an die Zugabe von Enzymsubstrat unter Verwendung eines photoreaktiven Geräts (siehe z. B. US PS 4.591.550) nachgewiesen werden. Eine Enzymsubstratmischung, die 1 mM Natriumphosphat, 0,05% Tween-20, 100 mM Harnstoff, pH-Wert 6, enthielt, wurde zu den Membranen hinzugefügt. Die Veränderung des pH-Werts aufgrund der Urease-Reaktion führt zu einer Veränderung des Signals des photoreaktiven Geräts. Die Veränderung des Signals (in uVolt/sek) wurde dann mit dem DNA-Gehalt der Probe korreliert.

Tabelle 2

NACHWEIS VON DNA DURCH BIOSENSOR pH-BESTIMMUNG

DNA (pg/Probe) uVolt/sek
0 64
12 107
25 153
50 268
100 341

Beispiel 4

Herstellung von Festen Trägern für das Spezifische Einfangen von DNA

A. Herstellung von Antibiotin-Membran

1. Nitrozellulose

Antibiotin (Sigma) wurde bei einer Konzentration von 0,25 mg/ml in PBS aufgelöst. Ein Nitrozellulose-Blatt (0,8 u) (Schleicher und Schüll) wurde mit DNA-freiem Wasser angefeuchtet und dann 15 Min. lang bei Raumtemperatur und anschließend bei 4ºC über Nacht in der Antibiotin-Mischung (0,2 ml/cm² Membran) unter leichtem Schütteln der Membran inkubiert. Die Antibiotin-Mischung wurde dann weggegossen und die Nitrozellulose kurz mit PBS (0,2 ml/cm²) ausgespült. Die Nitrozellulose wurde anschließend mit 0,1% (g/v) Glutaraldehyd in PBS 15 Min. lang inkubiert. Die Nitrozellulose wurde dann hintereinander mit PBS und DNA-freiem Wasser (beide bei 0,2 ml/cm²) gewaschen. Danach wurde die Nitrozellulose mit 0,2% (g/v) Polyvinylalkohol 10 Min. lang bei 0,2 ml/cm² angefeuchtet und 10 min lang bei 60ºC gebacken.

2. Zelluloseacetat

Eine Antibiotin-Membran wurde wie in Abschnitt 3A.1 hergestellt, wobei diesmal eine Zelluloseacetat-Membran (Schleicher und Schüll, 1,2 u Porengröße) verwendet wurde, außer daß das Waschen mit PBS vor der Glutaräldehyd/PBS-Inkubation nicht stattfand.

Beispiel 5

Nachweis von DNA in proteinhältigen Proben durch Adsorption der DNA auf eine Nitrozellulose-Membran

A. Proteinentfernung durch Glasperlen

400 ul Natriumjodid (6 M) wurden 200 ul der Proben hinzugefügt, wobei jede 2 mg BSA und 100, 50, 25 oder 0 pg Kalbsthymus-DNA enthielt. 2 ul GlassmilkTM wurden hinzugefügt und die Mischung 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der GlassmilkTM/DNA-Komplex wurde durch Zentrifugieren für 10 Sek. in einer Mikrozentrifuge pelletiert. Das Pellet wurde mit 150 ul 20 mM Trispuffer gewaschen, der 200 mM Natriumchlorid und 2 mM EDTA in 55% Methanol enthielt. Der Waschvorgang wurde einmal wiederholt. Nach Eluieren der DNA mit 400 ul phosphatgepufferter Salzlösung wurde jede Probe 10 Min. lang auf 100ºC erhitzt, um die dann rasch abgekühlte DNA zu denaturieren. Die Probe wurde auf Nitrozellulose-Membranen gefiltert. Man wies DNA durch das in Beispiel 3A beschriebene visuelle Bestimmungsverfahren nach.

Tabelle 4

NACHWEIS VON PROTEINHALTIGEN PROBEN

DNA DNA (pg/Probe) Farbintensität nach 3 Min.
0 gering positiv
25 ++
50 +++
100 ++++

B. Proteinasedigestion von Protein

Proteinase K und Dithiothreitol (Endkonzentration jeweils 100 ug/ml bzw. 50 mM) wurden zu 100 ul der Proben hinzugefügt, von denen jede 1 mg BSA und 100, 50, 25, 12 oder 0 pg DNA in phosphatgepufferter Salzlösung enthielt. Die Mischung wurde 2 Stunden lang inkubiert, um das Protein zu digerieren. Nach der Digestion wurden alle Proben 5 Min. lang auf 100ºC erhitzt, um Proteinase K zu inaktivieren und DNA zu einstrangiger DNA zu denaturieren. Kontrollproben, die eine übereinstimmende DNA-Menge, aber kein Protein enthielten, wurden zur gleichen Zeit denaturiert. Jede Probe wurde nach raschem Abkühlen zur Verhinderung des erneuten Annelierens der DNA durch eine Nitrozellulose-Membran gefiltert. Visuelle Bestimmungsverfahren erfolgten wie in Beispiel 3A beschrieben, um das Vorhandensein von DNA nachzuweisen. Tabelle 5 NACHWEIS VON PROTEINASE-DIGERIERTEN, PROTEINHÄLTIGEN PROBEN DNA (pg/Probe) Intensität mit Protein ohne Protein

Beispiel 6

Nachweis von DNA in proteinhältiger Probe durch Adsorption der DNA auf positiv geladenem Nylon

A. Visueller Nachweis von DNA in Insulinproben unter Verwendung von SSB-HRP-Konjugat

7,5 ul Proteinase K (2 ng/ml) wurden dann zu 150 ul Lösung aus Schweineinsulin (Cal Biochem, La Jolla, Kalifornien) 10 mg/ml in 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA, pH-Wert 8,7 hinzugefügt, die 0, 5, 10, 20 oder 40 pg an doppelstrangiger Kalbsthymus-DNA enthielt. Die Proben wurden über Nacht bei 55ºC inkubiert, bei 100ºC 5 Min. lang gekocht und danach auf Eis abgekühlt. Die digerierten Proben wurden dann mit einer Rate von etwa 100 ul/min durch eine positiv geladene Nylonmembran gefiltert (GenatranTM, 6 cm · 8 cm, ein Produkt von Plasco, Inc., Woburn, MA). DNA wurde durch 40-minütiges Inkubieren der Membran bei Raumtemperatur in einer Petrischale mit 0,2-0,5 ml/cm² SSB-HRP-Konjugat (150 ng/ml in 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,4; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA, 0,1 mg/ml; 0,1 mg/ml BSA; 5% Triton-X 100®) nachgewiesen. Die Membran wurde dann dreimal durch Inkubieren der Membran in PBS, die 1 M Harnstoff und 1% Dextransulfat enthielt, in jeweils 3minütigen Waschungen gewaschen, um jegliches nicht-spezifisch gebundenes SSB-HRP zu entfernen. Die Membran wurde anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen, 10 Min. in 10 mM Natriumcitratpuffer (enthielt 10 mM EDTA, 0,1 mg/ml Tetramethylbenzidin und 0,001% Wasserstoffperoxid), pH-Wert 5, inkubiert. Die visuelle Intensität der blauen Flecken, die auf der Membran entstanden, wurde subjektiv bestimmt und dann mit dem DNA-Gehalt der ursprünglichen Probe korreliert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgelistet.

Tabelle 6

VISUELLER NACHWEIS VON DNA UNTER VERWENDUNG VON SSB-HRP

pg von DNA in Insulinprobe Farbintensität
40 ++++
20 ++
10 +
5 gering positiv
0 -

Beispiel 7

Nachweis von DNA durch spezifisches Einfangen von Proben-DNA auf einer Antibiotin-Membran

A. Reinigung von SSB-Ureasekonjugat

In diesem Beispiel wurde SSB-Ureasekonjugat weiter gereinigt, um unkonjugierte Urease durch Gelfiltrationschromatographie der SSB-Urease auf einer Säule von 1 cm · 30 cm Superose 6HR (Pharmacia, Piscataway, NJ) in einem Puffer zu entfernen, der 50 mM Natriumsulfit, 20 mM Natriumdihydrogenphosphat, 200 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA, 2 mM Dithiothreitol und D,1% Tween-20, pH-Wert 7,0, enthielt. Der vor dem unkonjugierten Ureasepeak eluierende Proteinpeak wurde gesammelt, mit Glycerin 1 : 1 (v/v) verdünnt und bei -20ºC gelagert.

B. Biosensor-Nachweis von DNA in Puffer mit SSB-Ureasekonjugat (Aufeinanderfolgende Zugabe von Reagentien)

Antibiotin-beschichtete, wie in Beispiel 4A hergestellte Nitrozellulose-Membranen wurden durch Filtern von 200 ul Biotin-Anti-DNA (300 ng/ml in 10 mM Tris-HCl enthaltend 1% BSA, 1 mM EDTA), die wie in obigem Beispiel 1E beschrieben wurde, durch die Antibiotin-Membran über einen Zeitraum von etwa 4 Min. mit Biotin-Anti-DNA beschichtet. Die Membranen wurden dann mit 300 ml PBS gewaschen. 200 ul der DNA-hältigen Proben (0, 12, 25, 50 pg/200 ul DNA in PBS) wurden in einem Zeitraum von etwa 4 Min. gefiltert. Der Filter wurde wieder mit 300 ul PBS gewaschen. Während etwa 4 Min. wurden 200 ul SSB-Ureasekonjugat, das wie in Beispiel 7A beschrieben gereinigt wurde (100 ng/ml verdünnt in 2% BSA, 2% Ficoll®, 2% Polyvinylpyrrolidon, 10 mM Natriumphosphat, 40 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH-Wert 7,5) durch die Membran gefiltert. Die Membran wurde anschließend dreimal mit 1 ml 1 mM Natriumacetat, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween-20, pH-Wert 5, gewaschen. Die Membran wurde zur Substratlösung (100 mM Harnstoff enthaltender Acetatwaschpuffer) hinzugefügt und die Rote der Produktbildung wie in obigem Beispiel 3B beschrieben gemessen. Die Rate der Produktbildung war eine Funktion der Konzentration von DNA in der Probe, wie dies in Tabelle 7 ersichtlich ist.

Tabelle 7

BIOSENSOR-NACHWEIS VON DNA UNTER VERWENDUNG VON B-UREASEKONJUGAT

DNA-Menge (pg) Rate (uV/sek)
50 546
25 300
12 183
0 120

C. Titrierung von Biotin-Anti-DNA für einen Simultanen Inkubationsassay

Die Auswirkung des gleichzeitigen Hinzufügens von Biotin-Anti-DNA und SSB-Ureasekonjugat (gereinigt wie in Beispiel 7A beschrieben) zur Nitrozellulose-Membran wurde wie folgt bewirkt:
200 ul der Probe (1% BSA in TE mit oder ohne 100 pg ssDNA) wurde mit 200 ul Biotin-anti-DNA (40, 81, 162, 325 ng/ml in 1% BSA, TE) und 200 ul SSB-Ureasekonjugat (15 ng/ml in 2% BSA, 2% Ficol®, 2% Polyvinylpyrrolidon, 10 mM Natriumphosphat, 40 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH-Wert 7,5) bei Raumtemperatur 50 Min. lang inkubiert. Die Mischung wurde anschließend über einen Zeitraum von etwa 10 Min. langsam durch eine Nitrozellulose-Membran gefiltert. Die Membran wurde dann dreimal mit 1 ml Acetatwaschpuffer gewaschen (1 mM Natriumacetat, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween-20, pH-Wert 5). Substratlösung (100 mM Harnstoff enthaltender Acetatwaschpuffer) wurde hinzugefügt und die Menge an auf der Membran vorhandener DNA mittels des in Beispiel 3B beschriebenen Biosensor-Verfahrens ermittelt. Die in Tabelle 8 ersichtlichen Ergebnisse zeigen, daß in einem simultanen Assay das Verhältnis von Biotin-Anti-DNA und SSB-Ureasekonjugat vermutlich aufgrund der Konkurrenz sowohl von Anti-DNA als auch SSB um DNA entscheidend ist. Tabelle 8 TITRIERUNG VON BIOTIN-ANTI-DNA DURCH SIMULTANEN INKUBATIONSASSAY Konzentration von Biotin-Anti-DNA Rate Keine DNA

Beispiel 8

Biosensor-Nachweis von DNA in Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierungsfaktor (GMCSF)-Proben mit SSB-HRP-Konjugat (Aufeinanderfolgende Zugabe)

300 ul rekombinanter menschlicher GMSCF, 3,4 mg/ml PBS wurde mit 0, 5, 10, 50 oder 100 pg doppelstrangiger Kalbsthymus-DNA gespiked. Die Proben wurden 5 Min. lang auf 100ºC erhitzt, um die DNA zu denaturieren und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. ImmobilonTM-Membranen (Millipore, Bedford, MA) wurden mit Ziegen-Antibiotin-IgG beschichtet (Sigma, St.Louis, MO), wie dies oben bezüglich des SSB-Beschichtens auf ImmobilonTM in Beispiel 2A beschrieben ist. 200 ul Biotin-markierte Anti-DNA (Klon 4H2) wurde durch die Membran gefiltert. 300 ul der GMSCF enthaltenden Proben wurden durch die Membranen gefiltert und die Membranen wieder mit 200 ul PBS gewaschen. 200 ul SSB-HRP-Konjugat (650 ng/ml, verdünnt in PBS enthaltend 0,1 mg/ml BSA, 2 mM EDTA, 5% Triton-X 100) wurde durch die Membran gefiltert. Membranen wurden dann einmal mit PBS gewaschen, die 5% Triton-X 100, 1 M Harnstoff enthielt, und mit 0,1 M Natriumacetat gewaschen, das 5% Äthanol und 1 mM EDTA, pH-Wert 5,5 enthielt. Die DNA-Menge werde dann durch das in obiger US PS 4.591.550 beschriebene Biosensor-verfahren ermittelt, welche Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist. Die Substratlösung umfaßte Natriumacetatwaschpuffer, der 250 um Tetramethylbenzidin, 50 uM Ruthenium, 500 uM Wasserstoffperoxid, pH-Wert 5,5 enthielt. Die Veränderung des Potentials aufgrund der HRP-Redoxreaktion führte zu einer Veränderung des Signals des photoreaktiven Geräts. Die Ergebnisse sind aus nachstehender Tabelle 9 ersichtlich.

Tabelle 9

BIOSENSOR-NACHWEIS VON DNA IN GMCSF-PROBEN UNTER VERWENDUNG VON SSB-HRP-KONJUGAT

pg von DNA in 1 mg Rate (uV/sek) GMCSF (1 mg/ml ??)
0 -137
5 -201
10 -268
50 -629
100 -1550

Beispiel 9

Nachweis von Bakterien in einer Wasserprobe

Kulturen von grammnegativen und grammpositiven Bakterien werden in 100 ul Wasser von HPLC-Qualität auf 80, 400, 2.000, 10.000/100 ul verdünnt. Bei einem Probensatz werden die Bakterien durch Behandlung mit 10 ul 3N NaOH lysiert und denaturiert und anschließend mit 50 ul 1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,3 neutralisiert. Ein zweiter identischer Verdünnungssatz wurde nicht auf diese Weise behandelt und diente als Kontrolle für die nicht-spezifische Wechselwirkung zwischen der Probe und dem SSB-HRP-Konjugat.
Beide Verdünnungssätze werden auf eine positiv geladene Nylonmembran (GenatranTM) unter Verwendung einer Dot-Blot-Vorrichtung (Schleicher und Schüll) geladen. Jeder Napf der Vorrichtung wird mit 165 ul Probe gefüllt. Es werden auch Standardlösungen hergestellt, die aus in Wasser in HPLC-Qualität verdünnter, denaturierter Kalbsthymus-DNA bestehen, und auf die positiv geladenen Nylonmembranen aufgebracht. Die Standardlösungen enthalten 0, 5, 10 oder 50 pg ssDNA. DNA wird mittels eines visuellen Assays (in obigem Beispiel 3A beschrieben) unter Verwendung eines SSB-HRP-Konjugats nachgewiesen.
Die vorliegenden Verfahren und Zusammensetzungen stellen ein rasches und einfaches Mittel zum Nachweisen von Pikogramm-Mengen an DNA in einer Probe durch Verwendung von einstrangigen DNA-bindenden Proteinen mit hoher Affinität dar. Der Assay eignet sich nicht nur für reine DNA-Proben sondern auch für Proben, die eine beträchtliche Proteinmenge enthalten oder zum Nachweisen der Verunreinigung einer Probe durch einen Mikroorganismus.
Alle in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen legen Zeugnis über die Kompetenz der Fachleute auf dem Gebiet ab.

Claims

1. Verfahren zum Nachweisen von DNA in einer Probe unter Verwendung eines einstrangigen DNA-bindenden Proteins (BP) mit hoher Affinität, worin das BP oder die DNA eine nachweisbare Markierung enthält, wobei das genannte

Verfahren umfaßt:

das In-Kontakt-Bringen jeglicher einstrangiger DNA in der Probe mit dem BP, um DNA-BP-Komplexe zu bilden;

das Befreien der Komplexe von ungebundener(em) Probe und BP; und

das Nachweisen der Komplexe durch die Markierung als Indikator für das Vorhandensein von DNA in der Probe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe vor dem In-Kontakt-Bringen DNA-denaturierenden Bedingungen unterworfen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der DNA-BP-Komplex auf einem festen Träger vorliegt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die nachweisbare Markierung an eine photoreaktive Verbindung gebunden ist und das Verfahren umfaßt:

das Mischen der Probe mit der photoreaktiven Verbindung;

das Bestrahlen der Mischung mit aktivierendem Licht, um die aktivierte Verbindung mit jeglicher in der Probe vorhandener DNA umzusetzen;

das In-Kontakt-Bringen der bestrahlten Mischung mit dem festen Träger; und

das Nachweisen jeglicher auf dem festen Träger vorhandener photoreaktiver Verbindung durch die Markierung als Indikator für' das Vorhandensein von DNA in der Probe.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die photoreaktive Verbindung Isopsoralen ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die nachweisbare Markierung Biotin ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Biotin unter Verwendung eines Konjugats nachgewiesen wird, das mit einem Enzym, Radioisotop oder Fluorophor verbundenes Avidin, Streptavidin oder Antibiotin umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 3, worin der feste Träger eine mit Antibiotin beschichtete Membran ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe vor dem genannten In-Kontakt- Bringen (a) DNA-denaturierenden Bedingungen ausgesetzt wird; und (b) die denaturierte DNA nicht-diffusiv an einen festen Träger gebunden wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, welches die darauffolgende Durchführung des Schritts des In-Kontakt-Bringens durch

In-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit BP, um DNA-BP-Komplexe zu bilden; und

Durchführen des Befreiungsschrittes durch Befreien des festen Trägers von jeglicher/-em ungebundener/-en Probe und BP umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der feste Träger eine positiv geladene Nylonmembran oder eine Nitrozellulosemembran ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, worin das BP nicht-diffusiv an einen festen Träger gebunden wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1, worin das BP einstrangiges E.coli-DNA- bindendes Protein (SSB), T4 Gen 32-Protein oder Topoisomerase I ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Markierung ein mit dem BP verbundenes Enzym ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Enzym Urease oder Meerrettichperoxidase ist.

16. Verfahren nach Anspruch 1, das weiters umfaßt:

die zusätzliche Behandlung zumindest einer Hintergrundlösung, die keine DNA enthält, und zumindest einer Bezugslösung, die eine bekannte Menge an DNA enthält, nach dem Verfahren nach Anspruch 1;

das Subtrahieren der in der Hintergrundlösung festgestellten Markierung von der in der Probe festgestellten Markierung und von der in der genannten Bezugslösung festgestellten Markierung; und

das In-Beziehung-Setzen der in der Probe und in der Bezugslösung festgestellten berichtigten Markierung, um die in der Probe vorhandene DNA-Menge zu bestimmen.

17. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe weiters Protein enthält.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin die proteinhältige Probe vor dem In-Kontakt-Bringen entproteinisiert wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die proteinhältige Probe nach einem Verfahren entproteinisiert wird, das umfaßt:

das Mischen der proteinhältigen Probe mit (a) einer Glasteilchen enthaltenden Suspension und (b) ausreichend Jodid, um zu bewirken, daß die DNA sich an die Glasteilchen bindet;

das Isolieren der Glasteilchen; und

das Eluieren jeglicher DNA aus den Teilchen.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin das Eluieren mit Wasser oder phosphatgepufferter Salzlösung erfolgt.

21. Verfahren nach Anspruch 17, worin die proteinhältige Probe nach einem Verfahren entproteinisiert wird, das umfaßt:

das Mischen der proteinhältigen Probe mit einer proteolytischen Enzymzusammensetzung unter Bedingungen, bei denen vorhandenes Protein hydrolysiert wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, das weiters umfaßt:

nach dem Mischen das Abtrennen jeglichen Produkts des hydrolysierten Proteins von jeglicher DNA.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin das Abtrennen umfaßt:

nach dem Mischen das Zentrifugieren der Probe durch eine Membran mit Niedrigmolekulargewichts-Cutoff; oder das Hindurchschicken der Probe durch eine Ultrafiltrationsvorrichtung oder eine Gelpermeationschromatographiematrix mit Niedrigmolekulargewichts-Cutoff;

und

das Wiedergewinnen jeglicher vorhandener DNA.

24. Verfahren nach Anspruch 21, worin die proteolytische Enzymzusammensetzung Pronase und/oder Proteinase K enthält.

25. Konjugat, das ein einstrangiges DNA-bindendes Protein (BP) mit hoher Affinität umfaßt, das kovalent an ein Enzym gebunden ist.

26. Konjugat nach Anspruch 25, worin das BP einstrangiges E.coli-DNA-bindendes Protein (SSB), T4 Gen 32-Protein oder Topoisomerase I ist.

27. Konjugat - nach Anspruch 26, worin das Enzym Urease oder Meerrettichperoxidase ist.

28. Verfahren zum Nachweisen eines Organismus in einer Probe unter Verwendung eines DNA-Nachweissystems, das als eine erste Komponente ein einstrangiges DNA-bindendes Protein (BP) mit hoher Affinität aufweist; worin zumindest eine Komponente des Systems eine Markierung enthält; und worin aus dem Organismus hergestellte einstrangige DNA (ssDNA) oder zumindest eine Komponente des Systems nichtdiffusiv an einen festen Träger gebunden wird, wobei das Verfahren umfaßt:

das In-Kontakt-Bringen der ssDNA mit der ersten Komponente, um ssDNA-BP-Komplexe zu bilden;

das Befreien der Komplexe von ungebundener ssDNA und Komponenten des Systems; und

das Nachweisen der Komplexe durch die Markierung als Indikator für das Vorhandensein eines Organismus in der Probe.

29. Verfahren nach Anspruch 28, worin die Markierung an die erste Komponente konjugiert ist.

30. Verfahren nach Anspruch 28, worin der Organismus ein Bakterium, eine Hefezelle oder ein Virus ist.

31. Verfahren nach Anspruch 30, worin das Bakterium ein gramnegatives Bakterium ist.

32. Verfahren nach Anspruch 30, worin das gramnegative Bakterium E.coli ist.

33. Verfahren nach Anspruch 30, das weiters umfaßt:

vor dem In-Kontakt-Bringen das Aussetzen der Zelle an eine zellaufbrechende Zusammensetzung in einer Menge und für einen Zeitraum, die ausreichen, um die DNA aus der Zelle freizusetzen; und das Denaturieren der DNA zu einstrangiger DNA (ssDNA).