DE69215169T2

DE69215169T2 - Nachweis von komplementären Nukleotid-Sequenzen

Info

Publication number: DE69215169T2
Application number: DE69215169T
Authority: DE
Inventors: Scott J Eisenbeis
Original assignee: Microgenics Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1991-08-15
Filing date: 1992-08-13
Publication date: 1997-04-17
Anticipated expiration: 2012-08-14
Also published as: US5795718A; EP0530998A1; DE69215169D1; ES2096041T3; AU2105592A; JPH06178700A; EP0530998B1; ATE145250T1; CA2075858C; AU653244B2; JP2761159B2; CA2075858A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis spezifischer komplementärer Sequenzen in Nukleinsäuren und neue Sets zur Verwendung bei solchen Verfahren.
Die Nukleinsäurehybridisierung stellt ein äußerst wirkungsvolles Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von genetischem Material dar. Die Hybridisierung ist die Bildung einer doppelstrangigen Nukleinsäure aus einstrangigen Molekülen, wenn die Basensequenzen in den Strängen komplementär sind. Wasserstoffbindungen halten die komplementären Stränge zusammen und machen den doppelstrangigen Komplex sehr stabil.
Die Hybridisierung zwischen zwei einstrangigen Nukleinsäuren hängt jedoch von der Komplementarität der zwei Sequenzen ab. Dies ist das Prinzip, auf dem die extreme Spezifität beruht, die bei der Anwendung der Nukleinsäurehybridisierung als analytisches Instrument möglich ist. Radioaktiv- oder Enzymmarkierung einer Nukleinsäure ermöglichte es, die Bildung sequenzspezifischer Hybridisierungsereignisse zu überwachen und daher das Vorhandensein der Nukleinsäuresequenz von medizinischem Interesse nachzuweisen.
"Ziel"nukleinsäuren aus den Genomen von Protozoen, Bakterien, Schimmelpilzen, Pilzen, Viroiden und Viren oder jeder anderen Pflanzen- oder Tierlebensform können mittels markierter einstrangiger Nukleinsäure"sonden" nachgewiesen und identifiziert werden. Neben Infektionserregern können DNA-Sondenverfahren dazu dienen, die menschliche DNA zu analysieren, um zu bestimmen, ob Abnormalitäten in der DNA- Sequenz vorhanden sind, die mit dem Auftreten einer genetischen Erkrankung in Zusammenhang stehen. Diese Assays müssen nicht nur die Gegenwart einer spezifischen DNA-Sequenz, sondern auch subtile Änderungen in der Sequenz aufgrund von Punkt-, Insertions- oder Deletionsmutationen nachweisen. Das Interesse an spezifischen Sequenzen kann die Bestimmung des Vorhandenseins von Allelen, des Vorhandenseins von Läsionen in einem Wirtsgenom, den Nachweis einer bestimmten mRNA oder die Überwachung einer Modifizierung eines zellulären Wirts umfassen.
Zystische Fibrose, Thalassämie, Sichelzellenanämie und Huntington-Chorea sind einige Beispiele von genetischen Krankheiten, die mittels Sondenhybridisierung nachweisbar sind. Die derzeit zum Nachweis von Infektionserregern oder Abnormalitäten in einer menschlichen DNA-Probe angewendeten Verfahren sind jedoch kompliziert und zeitaufwendig.
Das am häufigsten angewendete Verfahren ist als Southern Blot-Filterhybridisierung bekannt (Southern, EJ., Mol. Biol. 98: 503 (1975). Dieses Verfahren dient allgemein zum Nachweis von Infektionserregern und genetischen Erkrankungen. Die DNA aus einer geeigneten Probe wird mit Restriktions-Endonukleasen gespalten und die resultierenden Fragmente mittels Elektrophorese auf einem Acrylamid- oder Agarosegel getrennt. Die Fragmente werden dann auf ein Nitrozelluloseblatt übertragen, was die gespaltene Ziel-DNA immobilisiert. Das Blatt wird dann mit denaturierter, markierter Sonde inkubiert. Während dieser Inkubation findet sequenzspezifische Hybridisierung statt. Banden, die die Gegenwart eines Infektionserregers oder einer genetischen Krankheit anzeigen, können durch Autoradiographie des Nitrozelluloseblatts sichtbar gemacht werden, nachdem überschüssige, markierte Sonde abgewaschen wurde. Obwohl dieses Verfahren beim Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen sehr empfindlich und genau ist, erfordert es für seine Durchführung ein beträchtliches technisches Fachwissen. Außerdem ist es sehr zeitaufwendig, erfordert Spezialgeräte und setzt Radioaktivität als Marker ein.
US-Patent Nr.4.358.535 offenbart ein Verfahren zum Nachweis eines Infektionserregers durch Hybridisierung seiner Nukleinsäure an eine radioaktiv markierte Sonde. Das Verfahren umfaßt die Extraktion von genetischem Material aus einer klinischen Probe, das in einstrangiger Form an einem festen Träger fixiert wird. Die immobilisierte Nukleinsäure wird dann mit radioaktiv markierter einstrangiger Nukleinsäure, die zur Nukleinsäure des Pathogens von Interesse komplementär ist, inkubiert. Wenn die Zielnukleinsäure in der Probe vorhanden ist, kann die radioaktiv markierte Sonde auf der festen Phase nachgewiesen werden, nachdem die unhybridisierte Sonde abgewaschen wurde. Dieses Verfahren weist ebenfalls den Nachteil auf, daß die Arbeit mit Radioaktivität unerwünscht ist. Außerdem ist es bei der Arbeit mit vielen Proben unpraktisch, die Nukleinsäure aus jeder Probe auf der festen Phase zu immobilisieren.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0117.440 offenbart eine ähnliche Methodik, wobei aber eine nicht-radioaktive, chemisch markierte Sonde verwendet wird. Die europäische Patentanmeldung Nr. 0070.685 beschreibt ein homogenes Hybridisierungssystem, bei dem ein nicht-radioaktives Energieübertragungssystem zum Nachweis verwendet wird. Dieses System erfordert zwei Sondenstränge, die nebeneinander bzw. aneinander angrenzend auf der Ziel-DNA hybridisieren. Die erste Sonde trägt einen Chemilumineszenzkatalysator, während die zweite eine Absorberemittergruppe aufweist. Wenn die zwei Sonden in unmittelbare Nähe gebracht werden, wird das ausgestrahlte Licht durch ein geeignetes Instrument gemessen und zeigt das Vorhandensein von Zielnukleinsäure an. Andere relevante Offenbarungen umfassen die US-PS Nr.4.486.539, ein "Sandwich"-Sondenassay; Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78: 6633, die Verwendung von Avidin-Biotin für Nukleinsäure-Affinitätssonden; und US-Patent Nr. 4.868104 die Verwendung sondenbeschichteter Perlen in Verbindung mit einer Sekundärsonde, was bei Vorhandensein eines Ziels zu einem erhöhten Perlendurchmesser führt.
Wie aus der obigen Besprechung ersichtlich, ist die derzeitige Fähigkeit, eine spezifische Nukleinsäure oder eine subtile Änderung in einer Nukleinsäure nachzuweisen, durch einen oder mehrere der folgenden Faktoren eingeschränkt: Kosten, Zeit, Fertigkeiten, Instrumente, Sicherheit, Empfindlichkeit und Hintergrundsignal.
Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleotidsequenzen mittels eines festen Trägers, zumindest einer Markierung und der Hybridisierung, umfassend eine Probe und eine markierte Sonde, worin das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Duplexbildung zur Fähigkeit führt, die räumliche Beziehung zwischen dem Träger und der oder den Markierung(en) zu modifizieren, sind in US-Patent Nr.4.775.619 geoffenbart.
US-Patent Nr.4.868.105 beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis bestimmter Nukleinsäuresequenzen mit zwei Reagentien, wobei das erste Reagens zur Markierung der Analytensequenz führt und das zweite Reagens die Mittel bietet, an den Analyten gebundene Markierung von nicht gebundener Markierung im Assaymedium zu trennen. Herkömmliche Verfahren dienen zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit der Markierung.
Die obigen Patentveröffentlichungen, die verschiedene Hybridisierungsverfahren beschreiben, die die Bindung einer Polynukleotidsequenz an einen Träger erfordern und eine markierte Sonde einsetzen, sind hierin durch Verweis aufgenommen.
Ein ideales Nachweissystem wäre billig, homogen, kolorimetrisch, einfach und auf pathogene oder nicht-pathogene Erreger sowie auf genetische Ziele anwendbar. Es würde den Einsatz gefährlicher Radioaktivität verhindern sowie ein empfindliches und genaues System zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen bereitstellen.
Die Erfindung wird durch die folgende ausführliche Beschreibung und die beigelegten Abbildungen erläutert, worin:
Fig.1 der Zeitverlauf der Abspaltung von T&sub2;&sub0; aus einem ED&sub4;-T&sub2;&sub0;-Konjugat durch die Nuklease-P1 grafisch darstellt. Dieses Modellsystem zeigt, daß die Komplementierungsaktivität eines ED-Nukleinsäurekonjugats zunimmt, wenn die Nukleinsäure enzymatisch entfernt wird.
Fig.2 eine einstrangige DNA-Sequenz einer Sonde, BP-1, für M13mp18 darstellt. Die Sonde enthält Restriktions-Endonuklease-Stellen für BamHl, Smal, Knpl und Sacl. Ein primärer Aminlinker am 5'-Ende der Sequenz erleichtert seine Konjugation an das ED- Peptid. Diese Sequenz besitzt die SEQ ID Nr.1.
Fig.3 die Zielnukleinsäure M13mp18 darstellt. Die Sequenz des viralen Genoms, die komplementär zur Sonde BP-1 ist, ist ebenfalls dargestellt. Diese Sequenz besitzt die SEQ ID Nr.2.
Fig.4 eine schematische Darstellung der Schritte ist, die während einer der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung stattfinden. Bereich A zeigt das ED/Sonden-Reagens, das eine an einem ED konjugierte einstrangige Nukleinsäure ist. Eine Stelle für eine spezifische Restriktions-Endonuklease befindet sich neben dem Konjugationspunkt. Bereich B zeigt die Hybridisierung zwischen der einstrangigen Sonde und der Zielnukleinsäure, die entweder von Natur aus einstrangig ist oder vor diesem Schritt einstrangig gemacht wird. Bereich C zeigt die Spaltung des doppelstrangigen Nukleinsäurehybrids durch die doppelstrang-spezifische Restriktions-Endonuklease. Die in den Bereichen B und C beobachtete Komplementierungsaktivität ist niedriger bzw. höher als die im Bereich A beobachtete Aktivität.
Fig.5 graphisch die Komplementierungsaktivität des ED&sub4;-BP-1-Konjugats in den drei in Fig. 4 beschriebenen Stufen darstellt; (a) das ED&sub4;-BP-1-Konjugat alleine, (b) das an die Zielnukleinsäure hybridisierte Konjugat, und (c) das ED-Sonden-Konjugat und Zielhybrid nach der Spaltung durch die Restriktionsendonuklease BamHl.
Die Erfindung bietet Verfahren und Zusammensetzungen für den Nachweis spezifischer Zielnukleinsäuresequenzen.
Die Erfindung ermöglicht es, das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Nukleinsäure einer spezifischen Sequenz sowie subtile Unterschiede der Nukleinsäuresequenzen nachzuweisen. Diese Fähigkeiten eignen sich unmittelbar zum Nachweis und der Identifizierung pathogener und nicht-pathogener Zustände und genetischer Merkmale, einschließlich der Gegenwart oder Abwesenheit eines Gens in Pflanzen- oder Tierzellen, (a) ohne daß das Wachstum der Zeilen bis zu einer Stufe erforderlich wäre, bei der der Phenotyp exprimiert wird und/oder (b) wenn das Gen rezessiv ist.
In spezifischen Ausführungsformen setzt die Erfindung eine Sonde ein, die ein Konjugat eines einstrangigen DNA-Oligonukleotids und eines Polypeptidfragments (ED) ist, das einen Abschnitt der Sequenz von β-Galactosidase darstellt. Dieses ED-Polypeptid kann sich mit spezifischen inaktiven β-Galactosidase-Deletionsmutantenproteinen reassozueren (dieser Vorgang ist als Enzymkomplementierung bekannt), um eine aktive β- Galactosidase zu bilden. Die Reassoziationsrate der zwei inaktiven β-Galactosidase- Fragmente wird durch Hybridisierung von Zielnukleinsäure an das Sonden/ED-Konjugat moduliert.
Zusätzliche Verfahren sind bereitgestellt, die eine Restriktions-Endonuklease verwenden, um die Bildung eines sequenzspezifischen Hybrids zwischen dem Ziel und dem Sonden/ED-Konjugat zu verifizieren. Es werden auch Verfahren beschrieben, die die obigen Verfahren und Zusammensetzungen einsetzen, um zwischen subtilen Unterschieden der Nukleinsäure zu unterscheiden.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer spezifischen Nukleinsäuresequenz (eines Ziels) in einer Probe, umfassend
das Bilden eines Reaktionsgemisches durch Kombinieren
(1) einer Probe;
(2) eines Nukleinsäuresonde/Enzymdonorpolypeptid-Konjugats, umfassend
(a) eine Enzymdonorpolypeptidsequenz, umfassend ein β-Galactosidase- Fragment; und
(b) ein mit (a) vernetztes einstrangiges Oligonukleotid;
(3) eines Enzymakzeptorpolypeptids, worin das Enzymakzeptorpolypeptid bei Komplementierung mit dem Enzymdonorpolypeptidfragment ein aktives β- Galactosidase-Enzym bilden kann; und
(4) eines Substrats für β-Galactosidase; und
das Bestimmen der Menge des Substrats, das mit aktiver β-Galactosidase reagiert.
Die Fähigkeit des hybridisierten Sonden/Enzymdonorkonjugats, sich mit dem Enzymakzeptor zu verbinden, wird durch den zusätzlichen sterischen und Coulomb'schen Beitrag der hybridisierten Nukleinsäure aus der Probe beeinflußt. Die Hybridisierung des Sonden/Enzymdonorkonjugats an die Probennukleinsäure zur Bildung einer doppelstrangspezifischen Sequenz kann durch die Bestimmung der Menge der Enzymaktivität am Substrat im Reaktionsgemisch nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung kann für einen Sondenassay gemäß Fig.4, Bereiche A und B, oder ohne Nuklease, siehe Bereich C in Fig.4, verwendet werden. Dies gilt für alle Kombinationen von Sondenassays, wobei sowohl Ziel oder Sonde RNA oder DNA sein könnte. Wenn die Sonde RNA und das Ziel DNA ist, kann RNase H anstelle einer Restriktions-Endonuklease in Bereich C von Fig.4 verwendet werden. RNase H baut den RNA-Strang eines RNA-DNA-Hybrids spezifisch ab. Dies hätte zur Folge, daß die Sonde nur dann vom ED entfernt wird, wenn das Nukleinsäureziel vorhanden ist.
Die Erfindung beruht auf der Komplementierung des Enzyms β-Galactosidase. Einige Patentanmeldungen und Patente über Komplementierungsassays und visuell nachweisbare Verfahren zur Verwendung darin sind das Produkt der Labortätigkeit der Anmelder. Jene Patente und Patentanmeldungen, die sich mit β-Galactosidase- Enzymdonoren und -akzeptoren befassen, sind: US-PS-4.708.929; WO-A-86/02666; WO-90/13569; EP-A-419.081; und WO-90/13569.
Wie in den obigen Veröffentlichungen beschrieben, ermöglichte es das β-Galactosidase- Komplementierungssystem, daß empfindliche Immunassays und Rezeptorassays für Analyten in einem weiten Bereich von Molekulargewichten entwickelt wurden. Die Assays beruhen auf einer Komplementierung von β-Galactosidase. "Komplementierung" ist die spontane Neuanordnung zweier individueller, inaktiver Fragmente von β- Galactosidase-Protein, die sich kombinieren, um ein vollständig aktives β-Galactosidase- Enzym zu bilden. Das kleinere der zwei inaktiven Polypeptide in einer Komplementierung wird als ein "Donor" bezeichnet (nachstehend als "Enzymdonor" oder "ED" bezeichnet), das größere als ein "Akzeptor" (nachstehend als "Enzymakzeptor" oder "EA" bezeichnet). Das Enzymdonor besteht ungefähr aus dem N- terminalen 1/10-1/20 der β-Galactosidase-Aminosäuresequenz. Der Enzymakzeptor stellt etwa den Rest der Sequenz der β-Galadosidase dar.
Diese Polypeptidkomponenten von β-Galactosidase können dazu verwendet werden, einen homogenen, kolorimetrischen Nukleinsaure-"Sonden"assay zum Nachweis von Nukleinsäure mit spezifischer Sequenz zu konstruieren. Dies wird durch chemisches Befestigen einer einstrangigen Nukleinsäuresequenz am Enzymdonor-Polypeptidfragment erreicht. Diese einstrangige Nukleinsäuresequenz (hierin auch als die "Sonde" bezeichnet) ist zur Sequenz der Nukleinsäure, deren Nachweis in einer Probe erwünscht ist (hierin auch als das "Ziel" bezeichnet), komplementär oder im wesentlichen komplementär.
Verfahren zur Hybridisierung von DNA sind in vielen Veröffentlichungen beschrieben, z.B. Walker und Gaastra (Hg.) Techniques in Molecular Biology (1983) Macmillan Publishing Company, New York, S.113-135 und 273-283; Maniatis et al. (Hg.) Molecular Cloning (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, S.309; E.Southern, J. Mol. Biol. (1975) 98: 503; Botchan et al., Cell (1976) 9: 269; Jeffreys et al., Cell (1977) 12: 429.
Die einstrangige Nukleinsäure kann durch bekannte Verfahren zur Bildung und Isolierung von Sonden-Oligonukleotidsequenzen hergestellt werden, einschließlich durch automatisierte Internukleotidsynthese. Beispielsweise beschreiben "Biochemical Organic Compounds for Research and Diagnostic Reagents" von Sigma Chemical Company (1990) und Science, 251: 251 (3/8/91) kommerziell erhältliche Sonden und Reagentien zur Verwendung bei der (automatisierten) Oligonukleotidsynthese.
Solche Sondensequenzen tragen funktionelle chemische Verbindungsgruppen am 5'- Ende, die die Kupplung mit verschiedenen anderen Reagentien ermöglichen. Die Einführung solcher Verbindungsgruppen erfolgt durch verschiedene Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, z.B. aus EP-A-461.828. Wenn die funktionelle Verbindungsgruppe ein Polymermaterial ist, sind auf dem Gebiet verschiedene Verfahren zur Aktivierung von Polymeroberflächen und zur Befestigung von Immunglobulinen, Glycoproteinen, saccharidhältigen organischen Molekülen und Polynukleotiden bekannt. Siehe US-Patente Nr. 4.419.444; 4.775.619; 3.956.219 und 3.860.386 sowie die europäische Patentanmeldung Nr. 145.386 und Scouten, W.H. (Hg.) Solid Phase Biochemistry, Analytical and Synthetic Aspects (1983), Wiley & Sons, New York, S.779.
Die Länge der Sondensequenz hängt von der Art des Ziels ab und kann durch Fachleute auf dem Gebiet problemlos bestimmt werden. Die Sondensequenz umfaßt, als nicht einschränkendes Beispiel, von etwa 15 bis etwa 100 Nukleotide, vorzugsweise von etwa 20 bis etwa 45 Nukleotide.
Die Gruppe, die die funktionelle Verbindungsgruppe der Nukleinsäure-Sondensequenz und die funktionelle Verbindungsgruppe des ED verbindet, kann lediglich eine Bindung sein, wobei z.B. eine Säuregruppe aktiviert werden kann, um mit der Aminogruppe von ED zu reagieren, oder kann jedes bifunktionelles Material mit einem oder mehreren Atomen sein, üblicherweise von etwa 1 bis 24 Atomen, vor allem von etwa 1 bis 12 Atomen, und insbesondere von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, und 0 bis 6, vorzugsweise bis 4 Heteroatomen. Neben Kohlenstoffatomen können Heteroatome in der Kette Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff o.dgl. umfassen, worin Sauerstoff als Oxy oder Oxo vorhanden ist, Stickstoff als Amino oder Amido vorhanden ist und Schwefel als Thio oder Thiono vorhanden ist. Beispiele für solche Gruppen, die in der Proteinchemie allgemein bekannt sind, umfassen Dialdehyde wie z.B. Glutaraldehyd und Diamine wie 1,6-Diaminohexan. Andere geeignete Verbindungsmaterialien umfassen organische Polymere, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, wie z.B. Polysaccharide, Styrolpolymere, Polyacrylate, z.B. Polyacrylamid, Hydroxyethylpolymethacrylate, Glas, Keramik, Kohlenstoff, Polyvinylchlorid, Protein u.dgl. Styrolpolymeren umfassen Polystyrol, Polymere mit aromatischen Gruppen und höhere aromatische Verbindungen wie Naphthalin, Anthracen usw. Die kovalente Bindung ist vorzuziehen. Jedes der bekannten spezifischen Bindungspaare kann auch dazu dienen, die Nukleinsäure-Sondensequenz an den ED zu konjugieren. Beispielsweise kann das Biotin-Avidin-Bindungspaar verwendet werden, wobei ein Bestandteil an der Sonde und einer am ED befestigt wird. Antigen-Antikörper-Wechselwirkung könnte auch als Verbindungssystem dienen, z.B. das kleine Molekül Dinitrophenol (DNP) und anti- DNP-Antikörper.
Eine große Anzahl an funktionellen Verbindungsgruppen auf der Nukleinsäure Sondensequenz und dem ED kann beim Konjugieren oder Verbinden einer Vielzahl spezifischer einstrangiger Nukleinsäuresequenzen mit ED verwendet werden. Meistens ist die im ED zum Verbinden vorhandene funktionelle Gruppe eine Mercaptan- oder Aminogruppe. Zum Verbinden von Mercaptangruppen des ED sind eine Vielzahl an leicht verfügbaren Reagentien wie z.B. aktiviertes Halogen, aktiviertes Olefin oder Mercapto von besonderem Interesse, wobei die ersten beiden Thioether bilden und das zweite ein Disulfid bildet. Spezifische Verbindungsmittel umfassen N-Maleimidobenzoesäure, α-Bromacetamidcyclohexancarbonsäure, N-Maleimidbernsteinsäure, Methyldithioessigsäure u.dgl. Zum Verbinden von Aminogruppen der Sonde oder des ED kann eine Vielzahl aktiver Halogene oder Carbonsäuregruppen eingesetzt werden, insbesondere aktivierte Carbonsäuregruppen, wobei die Carbonsäuregruppen mit Carbodiimid, aktiven Estern wie z.B. N-Hydroxysuccinimid, o-Nitrophenol, p- Nitrophenol u.dgl. aktiviert werden können. Zum Verbinden der funktionellen Phosphorsäuregruppe der Sonde eignen sich aktivierende Gruppen wie z.B. Imidazolid. Die Konjugationsverfahren sind in der Literatur allgemein bekannt und durch die US- Patente Nr. 3.817.837; 4.262.089; 4.233.401; 4.220.722 und 4.374.925 ausführlich beschrieben. Ein bevorzugtes Verbindungsmittel ist Succinimidyl-1-4-(N- Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC).
Die zur Verwendung in der Erfindung geeigneten ED- und EA-Fragmente sind auf dem Gebiet allgemein bekannt und umfassen jene, die in den US-Patenten 4.708.929 und 4.956.274 des Zessionars beschrieben sind, deren Offenbarungen hierin durch Verweis aufgenommen sind. Da die ED- und EA-Fragmente allgemein bekannt sind, ist nur eine kurze Beschreibung der ED- und EA-Fragmente erforderlich. Diese Technik eignet sich für alle im US-Patent 4.708.929 beschriebenen ED- und EA-Varianten.
Die ED-Sequenz macht üblicherweise von etwa 1/10 bis 1/20 der gesamten Aminosäuresequenz von β-Galactosidase aus, üblicherweise von etwa 60 bis etwa 100 Aminosäuren. Die ED-Sequenz ist im allgemeinen modifiziert oder mutiert, sodaß eine Cystein- oder eine Lysineinheit vorhanden ist, was eine funktionelle Mercapto- oder Aminogruppe zur Verwendung bei der Herstellung eines ED-Konjugats der Erfindung einführt.
Die Verfahren zur Herstellung eines EA sind allgemein bekannt und können die Isolierung aus einer natürlich vorkommenden Mutantenquelle umfassen bzw. der EA kann mittels bekannter rekombinanter Verfahren synthetisiert werden.
Wenn das Sonden/Donor-Konjugat mit einstrangigem Nukleinsäureziel inkubiert wird, hybridisieren (annellieren) die Sonde und das Ziel, um ein doppelstrangiges Nukleinsäuresegment zu bilden, wobei die Sonden- und Zielsequenzen komplementär sind. Die Fähigkeit des hybridisierten Sonden/Donor-Konjugats, mit dem Akzeptor zu reassoziieren, wird durch den zusätzlichen sterischen und Coulomb'schen Beitrag des gebundenen Ziels negativ beeinflußt. Die Auswirkung auf die Komplementierung kann durch das Überwachen der Komplementierungsaktivität des Sonden/Donor-Konjugats mit und ohne gebundenes Ziel leicht festgestellt werden. Die Verringerung der Komplementierungsaktivität spiegelt sich als Abnahme der β-Galactosidase-Aktivität wider.
Ein zusätzlicher Schritt kann nach der Hybridisierung von Ziel und Sonde durchgeführt werden. Dieser Schritt umfaßt die Zugabe einer doppelstrangspezifischen, sequenzspezifischen Restriktions-Endonuklease (nachstehend hierin auch als "Restriktions-Endonuklease" bezeichnet). Der Einsatz dieses Schritts umfaßt die Auswahl einer Sondensequenz mit zumindest einer Restriktions-Endonuklease-Stelle neben dem Verbindungspunkt mit dem Polypeptidenzymdonor.
Der hierin verwendete Ausdruck "doppelstrangspezifische, sequenzspezifische Restriktions-Endonuklease" bezieht sich auf eine stellenspezifische Endodesoxyribonuklease und deren Isoschizomere. Allgemein wurde die chemische Struktur dieser Materialien nicht aufgeklärt, doch etwa 100 dieser Materialien wurden identifiziert und ihre Verwendung und Reaktionen empirisch untersucht.
In der vorliegenden Erfindung ist jede hybridisierte Sonde nun in Form einer doppelstrangigen Nukleinsäure vorhanden und wird als solches mit der doppelstrangspezifischen, sequenzspezifischen Restriktions-Endonuklease in Kontakt gebracht (inkubiert), um die hybridisierte Sonde freizusetzen.
Da das Sonden/Donor-Konjugat eine einstrangige Nukleinsäuresequenz trägt, wird die unhybridisierte Sonde durch Restriktions-Endonuklease nicht gespalten. Wenn jedoch die Sonde und das Ziel hybridisieren, bilden sie eine doppelstrangige Erkennungsstelle, die durch die Restriktions-Endonuklease gespalten wird. Dies hat zur Folge, daß das Ziel und die Sonde vom Donorpeptid freigesetzt werden. Das Ergebnis dieser Freisetzung ist eine Zunahme der Enzymkomplementierungsrate. Die Rate ist höher als die Komplementierungsrate des Ziel-Sonde/Donor-Komplexes und ist auch höher als die Komplementierungsrate von Sonde/Donor selbst. Der Grund liegt darin, daß nicht nur das Ziel durch Restriktions-Endonuklease-Spaltung, sondern auch die konjugierte Sonde freigesetzt wird. Die Aufhebung der sterischen und Coulomb'schen Effekte der hybridisierten Sonde ermöglicht es dem Enzymdonor, den Enzymakzeptor effizienter zu komplementieren.
Die Restriktions-Endonuklease-Spaltung dient dazu, die Bildung eines doppelstrangigen Hybrids zu verifizieren Zusätzlich bietet diese zweite Schritt aufgrund der Sequenzspezifität von Restriktions-Endonukleasen eine wirkungsvolle "Korrekturlese"- Funktion. Die Restriktions-Endonuklease schneidet nur, wenn das Substrat doppelstrangig ist und nur wenn die korrekte Sequenz in der Erkennungsstelle vorhanden ist. Wenn eine einzige Basis nicht mit der Erkennungsstelle übereinstimmt, schneidet das Enzym nicht. Diese Eigenschaft ermöglicht es der vorliegenden Erfindung, zwischen zwei Zielsequenzen zu unterscheiden, in denen der einzige Unterschied eine Änderung einer einzigen Base ist.
Die Bedeutung dieser Fähigkeit zeigt sich deutlich, wenn die vorliegende Erfindung zum Nachweis genetischer Erkrankungen herangezogen wird. Die Sichelzellenanämie wird z.B. durch eine einzige Basenänderung verursacht, die bei der sechsten Aminosäure in β-Giobin stattfindet (GAGTGTG). Diese Mutation zerstört auch eine Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuklease MstII. Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, zwischen normalen und Sicheizellen-β-Globin-DNA- Sequenzen zu unterscheiden, indem eine Sondensequenz entwickelt wird, die zur normalen β-Globin-Sequenz exakt komplementär ist, und die hybridisierte Probe anschließend mit Mstil oder einem ihrer Isoschizomere geschnitten wird. Wenn die Sonde an ein normales Sequenzziel hybridisiert wird, wird sie durch Mstll gespalten, doch wenn sie an das Sichelzellen-Sequenzziel hybridisiert wird, wird sie nicht gespalten.
Obwohl eine einzelne Basen-Fehlübereinstimmung nicht ausreicht, um die Hybridisierung an die Sonde zu verhindern (außer unter sehr sorgfältig gesteuerten Bedingungen), kann daher die Änderung einer einzigen Base dennoch mittels der Sequenzspezifität von Restriktions-Endonukleasen nachgewiesen werden. Die vorliegende Erfindung würde sich auch dazu eignen, zwischen eng verwandten Infektionserregern zu unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung besitzt auch die einzigartige Fähigkeit, die Möglichkeiten einiger Nukleinsäure-Amplifikationssysteme (siehe US-Patente 4.683.202 und 4.683.195, die europäischen Patente 272.098 und 224.126 und die PCT- Patentanmeldung 87/3.451), neue, allelspezifische Restriktions-Endonuklease-Stellen in das amplifizierte Ziel einzubauen (Friedmann et al., Clin. Chem. 36: 695; Haliassos et al., Nucleic Acids Res. 17: 3606) auszunützen. Andere relevante Amplifikationssysteme umfassen das NASBA-Amplifikationssystem (Nature, 350: 91), das TAS-Amplifikationssystem (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 1173) und das 3SR-Amplifikationssystem (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:1873).
Diese Amplifikationssysteme ermöglichen es, zwischen normalen und Mutantensequenzen durch das Spalten des amplifizierten Ziels mit der geeigneten Restriktions-Endonuklease und die Trennung der Fragmente mittels Elektrophorese zu differenzieren. Die vorliegende Erfindung kann allerdings dazu dienen, zwischen normalen und amplifizierten Mutantenprodukten in einem homogenen, kolorimetrischen Format zu unterscheiden, wie dies oben beschrieben ist.
Das Assayverfahren erfolgt üblicherweise in einem Assaymedium, das die Reagentien in einem geeigneten Puffer umfaßt. Die Pufferformulierung ist nicht entscheidend. Im allgemein kann man jeden physiologisch annehmbaren Puffer, einschließlich phosphatgepufferter Salzlösung, Tris-Puffer u.dgl. verwenden. In einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt der Puffer von etwa 100 mM bis etwa 300 mM Natriumphosphat oder etwa 300 mM bis etwa 500 mM Natriumchlorid, etwa 5 mM bis etwa 15 mM EGTA oder EDTA und etwa 5 mM bis etwa 20 mM Natriumazid mit einem pH-Wert von etwa 6 bis etwa 8.
Ein Chelatbildner kann beliebigen Polypeptidfragmenten zugegeben werden, die Cysteinreste enthalten, um diese vor metallkatalysierter Oxidation zu schützen. Die Zugabe einer stabilisierenden Menge eines Chelatbildners für Metallionen, wie z.B. EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) oder EGTA (Ethylenglykoltetraessigsäure) ist wünschenswert.
Ein Bakterizid wie z.B. Natriumazid kann vorhanden sein, um bakterielles Wachstum - insbesondere während der Lagerung - zu verhindern.
Andere Materialien können vorhanden sein; dazu zählen unter anderem Magnesiumionen oder andere Ionen für die enzymatische Aktivität, Reagentien zum Verhindern des Abbaus von Cysteinresten wie z.B. Dithiothreitol (DTT), Solubilisierungsmittel wie z.B. Ethylenglykol und nichtionische Tenside wie z.B. Fettsäure-Kondensationsprodukte von Sorbit und Ethylenoxid (z.B. Tween 20) u.dgl. Methionin und Rinderserum-Albumin (BSA) können auch vorhanden sein.
Das lagerstabile Assaymedium ist typischerweise wäßrig. Das ED-Fragment ist üblicherweise in einer Konzentration von etwa 2 pM bis etwa 5 nM vorhanden, wobei EA in verschiedenen Überschußmengen vorhanden ist.
Die Probe kann aus jeder Quelle von Interesse stammen, wie z.B. aus Mikroorganismen, Bakterien, Viren, Viroiden und Pflanzen- und Tierlebensformen, einschließlich aus Körperflüssigkeiten wie z.B. aus Blut, Serum, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit, Glaskörperflüssigkeit u.dgl. Wenn die Probe eine doppelstrangige Nukleinsäure ist, ist es erforderlich, die Probe zu behandeln, um die doppelstrangigen Moleküle vor dem Vermischen mit dem ED-Sondenkonjugat zu denaturieren Die Denaturierung kann am leichtesten durchgeführt werden, indem die Probe hoher Temperatur ausgesetzt wird. Es können auch andere Denaturierungsmittel eingesetzt werden, wie z.B. das Behandeln der Probe mit Alkalilösungen oder konzentrierten Lösungen von Formamid oder durch Anwendung anderer auf dem Gebiet bekannter Verfahren. Die Probe kann einer Vorbehandlung unterzogen werden, einschließlich Probenpräparationen, die in dem US-Patent 4.556.643 beschrieben sind, oder, wie erhalten, verwendet werden.
Die Probenmenge, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, hängt unter anderem von der Konzentration des Analyten, der Beschaffenheit der Probe und der Empfindlichkeit des Assays ab.
Nach dem Kombinieren der verschiedenen Reagentien des Assaymediums und der Probe zur Bildung eines Reaktionsgemisches wird das Assaymedium üblicherweise zumindest etwa 0,2 min lang und üblicherweise nicht mehr als etwa 15 min lang, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 10 min lang inkubiert. Die Inkubationstemperatur liegt üblicherweise im Temperaturbereich, der für Nukleinsäure-Hybridisierungsreaktionen geeignet ist, z.B. bei etwa 40º bis etwa 100ºC. Das Gemisch wird dann nach rückgängig gemachter Temperaturerhöhung mit oder ohne sequenzspezifischer Restriktions-Endonuklease inkubiert. Die Inkubationsbedingungen werden durch das einzelne Enzym bestimmt. Die bevorzugte Inkubationsdauer liegt unter 15 Minuten. EA und Substrat werden dann zugegeben und die Komplementierungsaktivität gemessen. Das Assayverfahren der Erfindung erfolgt im allgemeinen und vorzugsweise bei atmosphärischem Druck. Die zur Hybridisierung oder Konjugation erforderliche Zeit hängt von der Konzentration und Sequenzkomplexität der Nukleinsäuresonde sowie von der Assaytemperatur, dem Lösungsmittel, Reagenskonzentrationen u.dgl. ab.
Es wird im Verfahren der Erfindung ein Enzymsubstrat verwendet, das beim Spalten durch β-Galactosidase zu einer nachweisbaren Änderung in der Menge der Lichtabsorption (der optischen Dichte) oder -emission führt. D.h. die Spaltung des Substrat resultiert im Auftreten oder Verschwinden eines färbigen, chemilumineszierenden oder fluoreszierenden Produkts, das sich für spektrophotometrische, chemische oder fluorometrische Analysen eignet. Substrate zur Verwendung mit β-Galactosidase umfassen unter anderem p-Aminophenyl-β-D- galactopyranosid, 2'-N-(Hexadecanol)-N-(amino-4'-nitrophenyl)-β-D-galactopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranosid, Naphthyl-A-S-B1-β-D-galactopyranosid, 1- Naphthyl-β-galactopyranosid, 2-Naphthyl-β-D-galactopyranosidmonohydrat, o- Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid, m-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid, p-Nitrophenyl- β-D-galactopyranosid, Phenyl-β-D-galactopyranosid, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D- galactopyranosid, Resorufin-β-D-galactopyranosid, 7-Hydroxy-4-trifluormethylcumarin, ω-Nitrostyryl-β-D-galactopyranosid, Fluorescein-β-D-galactopyranosid, Chlorphenolrotgalactosid u.dgl. Bevorzugte Substrate sind Chlorphenolrotgalactosid (CGRP) und o- Nitrophenyl-β-D-galactosid (ONPG). Die Inkubation mit dem Enzymsubstrat führt zur Spaltung des Substrats, um ein Produkt zu bilden, das, vorzugsweise durch Farbe, nachweisbar ist.
In einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung ein Set zur Erleichterung des Assayverfahrens. Das Set umfaßt:
(1) ein Sonden/Enzymdonorpolypeptid-Konjugat zum Nachweis einer spezifischen Nukleinsäuresequenz, umfassend ein Konjugat
(a) einer Enzymdonorpolypeptid-Sequenz, umfassend ein β-Galactosidase- Fragment;
(b) eines einstrangigen Oligonukleotids; und
(c) einer Verbindungsgruppe, die den Enzymdonor mit dem einstrangigen Oligonukleotid verbindet; und
(2) ein Enzymakzeptorpolypeptid, das bei Komplementierung mit dem Enzymdonorfragment in zumindest einem Behälter ein aktives Enzym bilden kann.
Das Set kann weiters Substrat und zumindest eine Restriktions-Endonuklease in getrennten Behältern umfassen. Die Details und bevorzugten Werte, die oben hinsichtlich der neuartigen Sonde und des Verfahrens ausgedrückt wurden, gelten auch für das Set.
Soferne nicht anders angegeben, können die relativen Mengen der in der Erfindung verwendeten Reagentien stark variieren, um für Konzentrationen der Reagentien zu sorgen, die die Empfindlichkeit des Assayverfahrens erheblich verbessern können. Die Reagentien können als Trockenpulver, üblicherweise lyophilisiert, mit beliebigen Exzipienten vorliegen, die bei Auflösung eine Reagenslösung mit der geeigneten Konzentration zur Durchführung des Assayverfahrens der Erfindung liefern.
In den nachstehenden Beispielen verwendete Materialien und Definitionen umfassen:
SMCC: Succinimidyl-1,4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexancarboxylat, ein heterobifunktionelles Verbindungsmittel
ONPG: o-Nitrophenyl-β-galactosid (Substrat)
ED4: Die Kodierung von ED4 ist in Abschnitt 5.1.6 der US-PS-4.708.929 angegeben.
BP-1: SEQ ID Nr.1, wie in Fig.2 dargelegt
M13 mp18: SEQ ID Nr.2, wie in Fig.3 dargelegt
T&sub2;&sub0;: ein Homooligonukleotid mit 20 Thyminresten
CPRG: Chlorphenolrotgalactosid (Substrat)
EGTA: Ethylenglykoltetraessigsäure
Tween 20: Markenname für Polyoxyethylensorbitan, ein Kondensationsprodukt eines Ethers von Polyoxyethylen und Sorbit mit Dodecansäure und anderen Fettsäuren, einschließlich Laurinsäure, etwa 50%, und als Rest Myristin-, Palmitin- und Stearinsäuren
EA22: Enzymakzeptor (komplementär zu ED4) ist in Abschnitt 5.2. der US-PS- 4.708.929 angegeben.
TEAA: Triethylammoniumacetat
Puffer zur Spaltung von T&sub2;&sub0; durch Nuklease P&sub1;:
20 mM Natriumacetat
4 mM Magnesiumacetat
pH-Wert 5,3
Puffer für EA, ED und Substrat
150 mM Natriumphosphat
400 mM Natriumchlorid
10 mM EGTA
0,05º/o Tween 20
10 mM Methionin
5 mg/ml Rinderserum-Albumin
pH-Wert = 7,0
3 mM MgCl&sub2;

Beispiel 1

Herstellung von ED-Nukleinsäurekonjugaten

Oligonukleotide wurden mittels des Phosphoramidit-Verfahrens auf einem Applied Biosystems 380B DNA-Synthetisierer chemisch synthetisiert. Während des Endzyklus jeder Synthese wurde eine Linkergruppe mit entweder 3 oder 6 Kohlenstoffen, die mit einem primären Amin endete, an das 5'-Ende der vollständigen Nukleotidsequenz eingebracht. Die Produkte wurden von ihrer Schutzgruppe befreit, ethanolgefällt und ohne weitere Reinigung verwendet. Zwei Oligonukleotide wurden auf diese Weise synthetisiert. Das erste war ein Homooligonukleotid mit 20 Thyminresten (T&sub2;&sub0;), das zweite ein Oligonukleotid, das 24 Basen lang war (BP-1, SEQ ID Nr.1) und Stellen für die Restriktions-Endonukleasen BamHl, Smal, Kpnl und Sacl enthielt. Zur Erleichterung der Konjugation der Nukleinsäure an das ED-Peptid wurden beide Oligonukleotide am primären Amin der Linkergruppe derivatisiert. Das heterobifunktionelle Verbindungsmittel, Succinimidyl-1,4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), wurde in zehnfachem molaren Überschuss zugegeben und 40 Minuten lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Da nur Oligonukleotidketten mit voller Länge den Aminlinker tragen, reagieren Ausschussequenzen mit kurzer Länge nicht mit SMCC und werden leicht durch HPLC abgetrennt. Die Produkte der SMCC-Derivatisierung wurden von den Ausgangsmaterialien durch HPLC auf einer C-4-RPh-Säule mittels eines Acetonitrilgradienten (10-30%, T&sub2;&sub0;; 9-14%, BP-1, dessen Sequenz in SEQ ID Nr.1 dargelegt ist) in Triethylammoniumacetat (TEAA), pH-Wert 7,0, gereinigt. Die gepoolten Produkte wurden durch Lyophilisierung konzentriert und später in Natriumphosphatpuffer mit 100 mM, pH 7,0 wieder gelöst. Ein zweifacher Überschuß von ED-4 mit einem einzelnen Cysteinsulfhydryl wurde jedem derivatisierten Oligonukleotid zugegeben. Die Reaktion erfolgte 20 min lang bei Raumtemperatur. Die Endkonjugationsprodukte wurden durch RP-HPLC mittels eines Acetonitrilgradienten (20-35%, ED4-T&sub2;&sub0;; 24-31%, ED4-BP-1) in TEAA-Puffer, pH 7,0, gereinigt. Die Konzentration der ED-Nukleinsäurekonjugate wurde unter Verwendung berechneter Extinktionskoeffizienten von ED4-T&sub2;&sub0; und ED4-BP-1 zugeordnet.

Komplementierungsaktivität von ED4-T&sub2;&sub0;

Um die relative Komplementierungsaktivität von ED4-T&sub2;&sub0; im Vergleich zu einem Standard-ED-Analyten-Konjugat, ED-4-Digoxigenin, zu bestimmen, wurden ED4- Digoxigenin und ED4-T&sub2;&sub0; mit EA22 (nachstehend "EA") komplementiert und die resultierende Enzymaktivität gemessen. ED4-Digoxigenin wurde titriert (4,25 x 10&supmin;¹&sup0; - 4,25 x 10&supmin;&sup9; Mol) und die Komplementierungsaktivität nach EA- und ONPG- Substratzugabe als mAU/min bei 420 nm gemessen. Die Komplementierungsrate einer fixen Menge an ED4-T&sub2;&sub0; (4,25x&supmin;&sup9; Mol) wurde in ähnlicher Weise gemessen. Die Rate der Produktbildung wurde mit der Standardkurve aus der ED4-Digoxigenintitration verglichen. Die Ergebnisse zeigten, daß ED4-T&sub2;&sub0; unter den Versuchsbedingungen mit 24% der Effizienz von ED4-Digoxigenin komplementiert.

Wiedererlangung der Komplementierungsaktivität durch Nukleasebehandlung von ED4-T&sub2;&sub0;

Um aufzuzeigen, daß durch Entfernung des T&sub2;&sub0;-Oligonukleotids die volle Komplementierungsaktivität von ED4 wiedererlangt werden kann, wurde ein automatisierter Assay auf einem klinischen COBAS BIO-Analysator entwickelt, um die Komplementierungsaktivität nach Spaltung mit verschiedenen Mengen an Nuklease zu überwachen. ED4-T&sub2;&sub0; wurde 16,5 Minuten lang bei 37ºC mit verschiedenen Mengen an Nuklease P1 (Bethesda Research Laboratories), in 20 mM Na-Acetat, pH-Wert 5,3, 4 mM Mg-Acetat inkubiert. Am Ende der Inkubationsdauer wurden EA und das Substrat CPRG in 150 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 400 mM NaCl, 10 mM EGTA, 0,05% Tween 20 und 10 mM Methionin zugegeben. Die Rate der Produktbildung wurde bei 574 nm in mAU/min gemessen. Die Ergebnisse (Fig.1) zeigten, daß die Komplementierungsaktivität von ED4-T&sub2;&sub0; durch Spaltung des Konjugats mit Nuklease gesteigert werden kann. Eine fast fünffache Zunahme der Aktivität läßt sich zwischen der Verwendung keiner Nuklease und mit der Bedingung mit der höchsten Konzentration an Restriktions-Endonuklease feststellen.

Beispiel 2

Wiedererlangung der Komplementierungsaktivität durch Nukleasebehandlung von ED4- BP-1

ED4-BP-1 wurde einer Nuklease-P1-Behandlung ausgesetzt, wie dies für ED4-T&sub2;&sub0; beschrieben ist. Jedoch nur die höchste Menge an Nuklease diente zum Spalten von ED4-BP-1, um eine vollständige Entfernung des Nukleinsäurestrangs sicherzustellen. Die Komplementierungsraten des gespaltenen und nicht gespaltenen ED4-BP-1 waren 467,93 bzw. 183,54 mAU/min. Daher wird eine etwa 2,5-fache Zunahme durch die Entfernung der Nukleinsäure beobachtet.

Beispiel3

Komplementierungsaktivität von ED4-T&sub2;&sub0; nach Hybridisierung mit A&sub3;&sub0;&sub0;

ED4-T&sub2;&sub0; wurde mit einer Polyadenylatkette mit einer durchschnittlichen Länge von 300 Resten (A&sub3;&sub0;&sub0;, Sigma) hybridisiert. Die Komplementierungsaktivität des resultierenden ED4-T&sub2;&sub0;:A&sub3;&sub0;&sub0;-Komplexes wurde mit jener des nicht hybridisierten ED4-T&sub2;&sub0; verglichen. ED4-T&sub2;&sub0; (4,25 x 10&supmin;&sup9; Mol) wurde mit oder ohne A&sub3;&sub0;&sub0; (5 x 10&supmin;&sup8; Mol) in 60 mM K- Phosphat, pH 7,0, NaCl 400 mM, EGTA 10 mM, 0,05% Tween 20, 3 mM MgCl&sub2; und 10 mM Na-Azid (Bakterizid) 5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. EA und ONPG wurden dann zugegeben und die Änderungsrate der Absorption bei 420 nm nach dreiminütiger Inkubation bei 30ºC oder 37ºC gemessen.
Die Ergebnisse zeigen, daß A&sub3;&sub0;&sub0; die Komplementierung hemmte, wenn es an ED4-T&sub2;&sub0; hybridisiert war. Das Ausmaß der Hemmung ist von der Temperatur abhängig, da der Tm des hybridisierten Komplexes etwa 40ºC ist. Die Komplementierung wurde bei 37ºC im Vergleich zu nicht hybridisertem ED4-T&sub2;&sub0; zu 43% gehemmt, und bei 30ºC zu 60% gehemmt. Das Vorhandensein von A&sub3;&sub0;&sub0; beeinflußt die Komplementierung von ED4, der nicht mit T&sub2;&sub0; konjugiert ist, nicht.

Beispiel 4

Komplementierungsaktivität von ED4-BP-1 vor und nach Hybridisierung an die Zielnukleinsäure

Um zu bestimmen, ob sich ein ED-Nukleinsäurekonjugat als Sonde für den Komplementierungsaktivitätsnachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen eignen würde, wurde ein Konjugat von ED4 und BP-1 gebildet. BP-1 ist ein einstrangiges DNA- Oligonukleotid mit einer Länge von 24 Basen (SEQ ID Nr.1, Fig.2). Die BP-1-Sequenz ist komplementär zur Mehrfach-Klonierstellenregion der einstrangigen DNA aus dem Bakteriophage M13 mp18 (SEQ ID Nr.2, Fig.3). Die virale DNA, die eine Länge von etwa 7250 Basen aufweist, wurde als Modell-Zielnukleinsäure verwendet. 2,4 x 10&supmin;¹&sup0; Mol ED4-BP-1-Konjugat wurde mit und ohne 2,4 x 10&supmin;&sup9; Mol M13 mp18-DNA bei 55ºC 10 Minuten lang inkubiert. EA (20 U/Test) und CPRG (2,0 mg/ml Endkonzentration) wurden dann zugegeben und das Gemisch 4 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Zunahmerate von A574 wurde pro Minute zwischen 4 und 6 Minuten gemessen. Die Komplementierungsraten betrugen 80,73 bzw. 47,16 mAU/min ohne und mit Ziel-M13- mp18-DNA. Daher wurde die Komplementierung durch Hybridisierung mit der Zielnukleinsäure auf etwa 42% verringert (Fig.4).

Beispiel 5

Effekt der Zugabe sequenzspezifischer Restriktions-Endonuklease zu einem an das Ziel gebundenen ED4-BP-1-Konjugat

Wenn die einstrangige Ziel-M13- (SEQ ID Nr.2) und die Sonden-BP-1- (SEQ ID Nr.1) Sequenzen hybridisieren, bilden sie eine doppelstrangige Strecke von 24 Basen. In der doppelstrangigen Sequenz waren die Erkennungssequenzen für die Restriktions- Endonukleasen BamHl, Smal, Kpnl und Sacl enthalten.
ED4-BP-1 wurde 10 min lang bei 55ºC an M13 mp18 hybridisiert. Der hybridisierte Komplex wurde dann bei 37ºC 40 min lang sowohl mit als auch ohne BamHl inkubiert. Die Spaltung des ED4-BP-1/M13 mp18-Komplexes mit BamHl setzte die Ziel-DNA vollständig und die Sonden-DNA bis auf 2 Basen frei. Es wurde die Komplementierungseffizienz des ED4-BP-1/M13 mp18-Komplexes vor und nach Spaltung mit BamHl gemessen. Die Steigerungsrate bei A574 wurde wie oben pro Minute gemessen. Die Raten betrugen 47,16 und 114,07 für Proben ohne bzw. mit zugegebenem BamHl. Die Spaltung des Sonden/Ziei-Hybrids in diesem Modellsystem erhöhte daher die Komplementierungsrate etwa um das 2,4-fache (Fig.5).

Beispiel 6

Spezifität des Effekts der M13-Zielbindung und BamHl-Spaltung

Um die Spezifität der Sonden/Ziel-Wechselwirkung und der BamHl-Spaltung zu untersuchen, erfolgten mehrere Vergleichsversuche. ED4-BP-1 und ED4-T&sub2;&sub0; wurden mit und ohne BamHl inkubiert. Man beobachtete keinen Unterschied der Enzymkomplementierungsrate - gleichgültig, ob BamHl zugegeben wurde oder nicht. Daher war BamHl spezifisch für die Spaltung des Sonden/Ziel-Komplexes und spaltet unter Versuchsbedingungen keine einstrangige Sonden-DNA.
ED4-T&sub2;&sub0; wurde 15 Minuten lang bei 37ºC mit und ohne M13 mp18-Ziel-DNA inkubiert und dann untersucht, wie dies oben für die Enzymkomplementierungsaktivität beschrieben ist. In den Proben mit oder ohne M13-DNA wurde kein Unterschied festgestellt. Dies zeigte, daß die Spezifität der Hybridisierung zwischen Sonde und Ziel zur Hemmung der Komplementierung notwendig ist.
Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin solcherart durch Verweis aufgenommen, so als ob jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell durch Verweis aufgenommen wäre.
Nach dieser ausführlichen Beschreibung der Erfindung ist es für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig, daß sie zahlreichen Änderungen und Modifizierungen unterzogen werden kann. SEQUENZAUFLISTUNG:

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäuresequenz in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte:

(A) das entweder hintereinander oder gleichzeitig erfolgende Kombinieren:

(1) einer Probe, die vermutlich eine Nukleinsäure von Interesse enthält;

(2) eines Sonden/Enzymdonor-Konjugats, umfassend:

(a) einen Enzymdonor, der ein β-Galactosidas-Fragment mit 1/10-1/20 der Länge der N-terminalen β-Galactosidase- Aminosäuresequenz umfaßt und bei Komplementierung mit einem Enzymakzeptor-Polypeptid aktive β-Galactosidase bildet; und

(b) eine einzelstrangige Oligonukleotidsequenz, die mittels einer Konjugationsgruppe an (a) angebracht ist und die mit der Nukleinsäure hybridisieren kann;

(3) eines Enzymakzeptor-Polypeptids, das im wesentlichen aus einem Fragment von β-Galactosidase besteht, worin das Enzymakzeptor- Polypeptid bei Komplementierung mit dem Sonden/Enzymdonor- Konjugat das aktive β-Galactosidase-Enzym bildet; und

(4) eines Substrats für β-Galactosidase; und

(B) das Nachweisen des Hybridisierens zwischen der Nukleinsäure und der Oligonukleotidsequenz zur Bildung einer hybridisierten Sequenz, indem die Menge oder Rate der Enzymaktivität bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Oligonukleotidsequenz zumindest eine Restriktionsendonukleasen-Erkennungsstelle umfaßt und worin der Nachweisschritt vor dem Bestimmen der Menge oder Rate der Enzymaktivität das In-Kontakt-Bringen einer für die Restriktionsendonukleasen-Erkennungsstelle spezifischen doppelstrangspezifischen Restriktionsendonuklease mit der hybrid isierten Sequenz umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Restriktionsendonukleasen- Erkennungsstelle neben dem Befestigungspunkt der einzelstrangigen Oligonukleotidsequenz am Enzymdonor liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Menge an Enzymaktivität mit dem Substrat durch Ermittlung des Ausmaßes an Lichtabsorption oder -emission bestimmt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Nachweis jener eines visuell nachweisbaren Signals ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Nachweis jener eines fluoreszierenden oder chemolumineszierenden Signals ist.

7. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Menge an Nukleinsäure in der Probe vor dem Kombinieren amplifiziert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Nukleinsäure in der Probe mittels Polymerase-Ketten reaktion oder β-Replicase amplifiziert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nukleinsäure in der Probe RNA ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nukleinsäure in der Probe DNA ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Oligonukleotidsequenz zumindest eine Restriktionsendonukleasen-Erkennungsstelle umfaßt und worin der Nachweisschritt das In-Kontakt-Bringen einer für die Restriktionsendonukleasen-Erkennungssteile spezifischen doppelstrangspezifischen Restriktionsendonuklease mit der hybridisierten Sequenz umfaßt, nachdem anfänglich die Menge oder Rate der Enzymaktivität in Abwesenheit der Restriktionsendonuklease bestimmt wurde.

12. Set, umfassend:

(1) ein Sonden/Enzymdonor-Polypeptid-Konjugat zum Nachweis einer spezifischen Nukleinsäuresequenz, umfassend ein Konjugat

(a) eines Enzymdonors, umfassend ein N-terminales β-Galactosidase- Fragment von 1/10-1/20 der Länge von β-Galactosidase, der bei Komplementierung mit einem Enzymakzeptor-Polypeptid eine aktive β-Galactosidase bildet; und

(b) einer einzelstrangigen Oligonukleotidsequenz, die an (a) angebracht ist und mit der Nukleinsäure hybridisieren kann, worin die Oligononukleotidsequenz zumindest eine Restriktionsendonukleasen-Erkennungsstelle umfaßt;

(2) ein Enzymakzeptor-Polypeptid, das bei Komplementierung mit (a) ein aktives β-Galactosidase-Enzym bilden kann;

(3) zumindest eine doppelstrangspezifische Restriktionsendonuklease in einem getrennten Behälter.

13. Set nach Anspruch 12, worin das Set in einem getrennten Behälter zusätzlich Enzymsubstratlösung enthält, die gegebenenfalls das Enzymakzeptor-Polypeptid enthält.

14. Set nach Anspruch 12, worin mehr als eine Restriktionsendonuklease vorhanden ist.