DE10041766A1 - Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Markierung und zur Detektion von chemischen Substanzen beschrieben, die spezifisch an einen Rezeptor binden. Dabei dient die Sequenz eines DNA-, RNA- oder PNA-Oligomer-Einzelstrangs als eindeutige molekulare Markierung, die am jeweiligen Rezeptor angebracht wird. Nach Abtrennung der Komplexe aus chemischer Substanz und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit wird statt der chemischen Substanz der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil identifiziert und quantifiziert.

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Markierung und Detektion chemischer Substanzen.

Stand der Technik

Die quantitative Erfassung aller Proteine einer Zelle eines bestimmten Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt, oft als (zelluläre) Proteom-Forschung bzw. (cellular) Proteomics bezeichnet, ist der Schlüssel zu einem funktionellen Verständnis des physiologischen, im Spezialfall pathologischen Zustands der betreffenden Zelle. Die "proteomische" Information bereichert sowohl die Grundlagen- als auch die angewandte Forschung. Sie liefert die molekulare Basis für den Zustand einer Zelle und bietet die Möglichkeit, die Änderung des Expressions- und Modifikationsmusters der Proteine als Antwort auf eine spezifische Störung (z. B. eine Krankheit oder die Verabreichung eines bestimmten Medikaments) aufzuzeichnen. Damit besitzt die Proteom-Forschung eine fundamentale Bedeutung für die Target-Suche und -Auswahl in der biomedizinischen Forschung, also der Entwicklung neuer Medikamente. Das (zelluläre oder globale) Proteom kann daneben auch zur Diagnose von Krankheiten und zur Therapiekontrolle eingesetzt werden. Somit verfolgt die Proteom-Forschung im Prinzip die gleichen Ziele wie die Genom-Forschung, nämlich die Korrelation des Zustands eines Organismus oder einer Zeile (des Phänotyps) mit grundlegenden molekularen Bausteinen dieses Organismus durch die parallele Analyse möglichst vieler solcher Bausteine (z. B. der mRNA bzw. der Proteine).

Das Proteom besitzt im Vergleich zum Genom einen wesentlich größeren Informationsgehalt. Während das Genom das Vererbungsmuster und das unmittelbare Transkriptionsmuster der Gene in Form der cDNA und mRNA qualitativ und quantitativ erfasst, wächst die Komplexität der Transkriptionsprodukte, also der Proteine, durch posttranslatorische Modifikationen vieler Proteine (Phosphorylierung, Glycosilierung, proteolytische Prozessierung etc.) weiter. Dasselbe Genom führt also aufgrund dieser posttranslatorischen Variationen und durch Transportmechanismen, die transkribierte Genprodukte über den ganzen Organismus verteilen zu unterschiedlichen Proteomen und somit verschiedenen physiologischen (bzw. pathologischen) Zuständen.

Das Proteom besitzt zudem im Hinblick auf die Target-Suche und -Auswahl bzw. die Diagnose von Krankheiten gegenüber dem Genom zwei wesentliche Vorteile: Zum einen ist die Korrelation zwischen Proteom und Phänotyp enger, zum anderen kann das Proteom (zumindest teilweise) in den typisch klinischen Proben wie Serum, cerebrospinale Flüssigkeit oder Urin untersucht werden. Diese einfach zugänglichen Proben enthalten keine DNA, aber Proteine, so dass die Proben zwar auf potentielle proteomische Marker einer Krankheit untersucht werden können, nicht aber auf genomische Marker.

Im Vergleich zur Genomforschung ist die Analyse des Proteoms allerdings wesentlich schwieriger durchzuführen, da - im Gegensatz zum Hybridisierungsprinzip der DNA, cDNA bzw. mRNA beim Genom - für Proteine kein einfaches, universell einsetzbares und eindeutiges Detektionsprinzip existiert. Sowohl die Isolierung und Auftrennung als auch die eigentliche Detektion müssen individuell an die biochemischen Eigenschaften (z. B. Hydrophobizität, Hydrophilie, Acidophilie, Thermophilie) der jeweiligen Proteine bzw. Proteingruppen angepasst werden.

Die Analyse des Proteoms kann in folgende Schritte eingeteilt werden (vgl. F. Lottspeich, "Proteom Analysis: A Pathway to the Functional Analysis of Proteins", Angewandte Chemie, International Edition, 1999, Vol. 38, 2476-2492): Bestimmung der Startparameter, Probenvorbereitung, Protein-Separierung, Protein-Quantifizierung und Datenanalyse. Die Startparameter sollen garantieren, dass das Material, das einer Proteom-Analyse unterzogen wird, reproduzierbar hergestellt werden kann. Die Probenvorbereitung umfasst u. a. Zellkultivierung und Zellaufschluss unter denaturierenden oder nichtdenaturierenden Bedingungen. Da Proteine keine einheitlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften besitzen, erfordert die Probenvorbereitung ein exaktes Protokoll, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Die zur Zeit gängigste, hochauflösende Methode der Protein-Separierung stellt die 2D- Gelelektrophorese dar, bei der Proteine nach (i) Ladung (mittels isoelektrischer Fokussierung, IEF-Gel) und (ii) Größe (mittels SDS-PAGE Gel-Elektrophorese) aufgetrennt werden. Auch bei dieser Methode liegt das Problem in der Reproduzierbarkeit, in diesem Fall in der Reproduzierbarkeit der zweidimensionalen Muster auf dem Gel. Äußere Parameter wie der Protein-Transfer von der ersten, IEF- Gel-Dimension in die zweite, SDS-PAGE-Gel-Dimension, das Elektrophoresegerät, die Gelkomposition, die Elektrophoresedauer bei IEF-Gelen, Anfärbemethoden, Bedienungspersonal usw. können zu einer deutlichen Variation der Muster führen.

Die Protein-Identifizierung und -Quantifizierung erfolgt i. d. R. durch massenspektrometrische Verfahren, die einen Transfer der gel-separierten Proteine vom Gel in andere Umgebungen (z. B. organische Matrizes bei MALDI- Massenspektroskopie, MALDI-MS) voraussetzen. Auch dieser Transfer in eine andere Umgebung kann zu Modifikationen der Proteine und somit zu Fehlinformation oder Informationsverlust führen.

Die abschließend notwendige Datenanalyse wird durch entsprechende Methoden der Bioinformatik bewerkstelligt.

Neben der begrenzten Reproduzierbarkeit stellen vor allen Dingen die sehr personal- und apparateintensive Probenbereitung und -analyse (MALDI-MS-Quantifizierung) wesentliche Nachteile der geschilderten Vorgehensweise zur Proteom-Analyse dar. Zudem wird nur ein geringer Parallelisierungsgrad erreicht, da von den ca. 20.000 bis 30.000 expremierten Proteinen einer Zelle auch in den aufwendigen 2D-Gelen nur wenige hundert verschiedene Proteine separiert und dann auch detektiert werden können. Die 2D-Gel Technik ist außerdem nicht automatisierbar und daher personal- und kostenintensiv.

Aus dem Stand der Technik bekannte Alternativen im Bereich der Probenvorbereitung und Separation sind die Immunoprezipitation und die chromatographische Auftrennung. Neben irreversibel gebundenem und damit für die Analyse verlorenem Protein stellt vor allem die geringe Trennkraft der verbreiteten chromatographischen Methoden ein wesentliches Problem dieser Alternativen dar. Im ersten chromatographischen Schritt kann das Proteom in wenige hundert Fraktionen mit unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen getrennt werden, die anschließend in erneuten chromatographischen Schritten, also seriell, weiter separiert werden müssen.

Zur Erhöhung des Parallelisierungsgrades wurden verschiedene Strategien zur, zumindest partiellen, chip-basierten Proteomanalyse vorgeschlagen (vgl. Alan Dove: "Proteomics: translating genomics into products?", Nature Biotechnology, 1999, Vol. 17, 232-236). So könnten z. B. "Separations-Chips", die mit verschiedener Protein- spezifischer Oberflächenchemie oder spezifischen Protein-Bindungspartner strukturiert sind, zur zweidimensionalen Auftrennung des Proteoms verwendet werden. Die fraktionierten Proteine sollen dann massenspektroskopisch analysiert werden. In einer verwandten Strategie wird vorgeschlagen, die Proteine des isolierten Proteoms zuerst (einheitlich) mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren, dann auf einem Antikörper- Chip-(Antibody-Array) zweidimensional aufzutrennen und schließlich anhand der Fluoreszenzintensität (z. B. über CCD-Kameras) zu quantifizieren. Dazu erforderlich ist eine sehr spezifische Antikörper-Bibliothek, wobei die Spezfizität/Selektivität der Antikörper extrem hoch sein muss. Zudem weist die Antibody-Chip-Strategie die Nachteile einer unspezifischen Fluoreszenz und einer aufgrund des zweidimensionalen Ausleseverfahrens der Fluoreszenz durch z. B. CCD-Kameras in Kombination mit kofokaler Mikroskop-Optik extrem teuren Detektionsmethode auf. Daneben stellt die Vereinheitlichung der Reaktion zur Anbindung des Fluoreszenzfarbstoffs an die verschiedenen Proteine (qualitativ und quantitativ) ein ungelöstes Problem dar.

Die Proteom-Analyse besitzt somit das Potential, sich zu einer äußerst hilfreichen Technik in der biomedizinischen Forschung und medizinischen Diagnostik zu entwickeln. Allerdings müssen dazu die oben geschilderten Probleme überwunden werden, nämlich die ungenügende Reproduzierbarkeit, der geringe Grad an Parallelisierung und der enorme Aufwand an präparativer Arbeit, an hochqualifiziertem Personal und teurer technischer Ausstattung.

Darstellung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen bereitzustellen, welches die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen gemäß unabhängigen Patentanspruch 1, die Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen gemäß unabhängigen Patentansprüchen 21, 22, 35, 36, 71 und 79, die Verfahren zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen chemischen Substanzen gemäß unabhängigen Patentansprüchen 50 und 57, dem Verfahren zur Detektion von Hapten-Analoga gemäß unabhängigen Patentanspruch 59, sowie durch die Kits gemäß den unabhängigen Patentansprüchen 106 bis 115, 121 und 122 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:
Als Genom wird der komplette Satz genetischer Information bezeichnet, über den eine Zelle verfügt. Die funktionelle Genom-Forschung (functional genomics or phenomics) umfasst im allgemeinen die Expression und das Verhalten der Gen-Produkte. Innerhalb der "functional genomics" werden die Bereiche zelluläre Transkriptom- Forschung, zelluläre Proteom-Forschung, globale Proteom-Forschung und Metabolom- Forschung unterschieden. Als zelluläre Transkriptom-Forschung (cellular transcriptomics) wird die vergleichende Untersuchung der mRNA Expessionsprofile mit Hilfe von z. B. DNA-Chips bezeichnet. Die quantitative Isolierung und Identifikation aller Proteine einer Zelle ist als zelluläre Proteom-Forschung (cellular proteomics) bekannt. Bei der globalen Proteom-Forschung (global proteomics) werden alle encodierten Proteine des gesamten Genoms analysiert und zwar ohne Festlegung auf einen spezifischen Zelltypus oder spezifische Wachstumsbedingungen (physiologischer Zustand der Zelle). Das Proteom selbst stellt einen Baustein des Metaboloms bzw. der Metabolom-Forschung (metabolomics) dar, also des Verständnisses über den gesamten Metabolismus eines Organismus.

Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten, wobei die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten aus jeweils einem Nukleinsäureoligomer bekannter Sequenz und jeweils einer daran angebundenen Rezeptor-Einheit bestehen und die Rezeptor-Einheit eine chemische Substanz spezifisch binden kann, und Inkontaktbringen der bereitgestellten chemischen Substanzen mit den bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und zugehöriger chemischer Substanz erfolgt.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von chemischen Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der chemischen Substanzen mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, Bindung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz an ein geeignetes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, Spaltung einer oder mehrerer chemischer Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz derart, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, von dem Chromatographiematerial getrennt wird, Auswaschen der von dem Chromatographiematerial getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile durch ein geeignetes Verfahren.

Die vorliegende Erfindung umfasst daneben ein Verfahren zur Detektion von chemischen Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bereitstellen definierter Mengen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der chemischen Substanzen mit den definierten Mengen an Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, Bindung der gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz an ein geeignetes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, Auswaschen der im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch ein geeignetes Verfahren direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial, Bereitstellen ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten mit den an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz und eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten erfolgt, Spaltung einer oder mehrerer chemischer Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz derart, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, von dem Chromatographiematerial getrennt wird, Auswaschen der von dem Chromatographiematerial getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile durch ein geeignetes Verfahren.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial, Bereitstellen definierter Mengen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der definierten Mengen an Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten mit den an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, Auswaschen der im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch ein geeignetes Verfahren direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen chemischen Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer Arten unlöslicher chemischer Substanzen, Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der unlöslichen chemischen Substanzen mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz erfolgt, Abtrennen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz, Spalten einer oder mehrerer chemischer Bindungen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz derart, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers von der unlöslichen chemischen Substanz getrennt wird, Abtrennen der von der unlöslichen chemischen Substanz getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile und Detektion der Nukleinsäureoligomer- Bestandteile durch ein geeignetes Verfahren.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen chemischen Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer Arten unlöslicher chemischer Substanzen, Bereitstellen definierter Mengen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der unlöslichen chemischen Substanzen mit den definierten Mengen von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz erfolgt, Abtrennen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz, Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der von der unlöslichen chemischen Substanz getrennten, sich im Überstand befindenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch ein geeignetes Verfahren.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von Hapten- Analoga umfassend die Schritte: Bereitstellen eines oder mehrerer Hapten-Analoga, Bereitstellen eines Überschusses relativ zu den Hapten-Analoga von ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der Hapten- Analoga mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon erfolgt, Bereitstellen der Hapten-Analoga in modifizierter Form, wobei die Modifikation in der Anbindung eines Carrier-Moleküls an die Hapten-Analoga besteht, wobei an jede Art von Hapten-Analogon eine bestimmte Art von Carrier-Molekül gebunden wird, welches der Bedingung genügt, dass durch die Anbindung des Carrier-Moleküls keine signifikante Änderung der spezifischen Bindungsfähigkeit des Epitops der Hapten- Analoga erfolgt, Inkontaktbringen der modifizierten Hapten-Analoga im Überschuss mit dem gebildeten Gemisch aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten und gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und modifiziertem Hapten-Analogon erfolgt, Bindung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und modifiziertem Hapten-Analogon an ein geeignetes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten- Analogon erfolgt, Auswaschen der im Eluat verbleibenden Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und Hapten-Analogon durch ein geeignetes Verfahren direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst.

Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bereitstellen von ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten im Überschuss relativ zu den chemischen Substanzen, Inkontaktbringen der chemischen Substanzen mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz erfolgt, Bereitstellen der chemischen Substanzen in modifizierter Form, wobei die Modifikation in der Anbindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial besteht, Inkontaktbringen des Gemisches aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz mit den an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen, wodurch eine Bildung von Komplexen aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten und an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen erfolgt, Auswaschen der im Eluat verbleibenden Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz und Detektion der Nukleinsäureoligomer- Bestandteile der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz durch ein geeignetes Verfahren direkt als Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, Bereitstellen eines Überschusses relativ zu den ein oder mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten von ein oder mehreren chemischen Substanzen, Bindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial, Inkontaktbringen der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten mit den an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, Bereitstellen ein oder mehrerer Arten von zweiten chemischen Substanzen, wobei die zweiten chemischen Substanzen spezifisch an die chemischen Substanzen binden können, Inkontaktbringen der ein oder mehreren Arten von zweiten chemischen Substanzen mit den gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz, wobei durch die spezifische Bindung der zweiten chemischen Substanzen an die chemischen Substanzen zumindest ein Teil der gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz in die Bestandteile Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemische Substanz gespalten werden, wodurch die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in das Eluat freigesetzt werden, Auswaschen der freigesetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch ein geeignetes Verfahren direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem einen Kit zur Durchführung eines der oben genannten Verfahren, einen Kit zur zur Markierung chemischer Substanzen, einen Kit zur Detektion chemischer Substanzen, einen Kit zur Detektion von Proteinen oder Antigenen, einen Kit zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen chemischen Substanzen, einen Kit zur Detektion von Antikörpern, einen Kit zur Detektion von Haptenen oder Hapten-Analoga, einen Kit zur Detektion DNA- und/oder RNA-bindender Proteine, einen Kit zur Detektion der Antagonisten von Enzymen oder der Antagonisten von DNA- und/oder RNA-bindenden Proteinen, einen Kit zum Screenen von Hybridoma-Zellen und einen Kit zum Screenen von Hybridoma-Zellen und gleichzeitigem Epitop-Mapping. Jeder erfindungsgemäße Kit umfasst eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten.

In ihrer allgemeinsten Form betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wobei die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten aus jeweils einem Nukleinsäureoligomer bekannter Sequenz und jeweils einem daran angebundenen Rezeptor bestehen und der Rezeptor eine chemische Substanz spezifisch binden kann, und Inkontaktbringen der bereitgestellten chemischen Substanzen mit den bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und zugehöriger chemischer Substanz erfolgt. Die Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt nur, wenn der Rezeptor der Nukleinsäure-Rezeptor-Einheit die chemische Substanz spezifisch bindet. Diese(r) Komplex(e) aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und zugehöriger chemischer Substanz kann anschließend beliebigen Manipulationen ausgesetzt werden wie z. B. der Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und zugehöriger chemischer Substanz von nicht mit chemischen Substanzen komplexierten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten.

Nach Abschluss der für eine gewisse Aufgabenstellung notwendigen oder gewünschten Manipulationen kann - statt der spezifischen chemischen Substanz - der zugehörige Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der ursprünglich an diese chemische Substanz gebundenen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit als Nachweis für das Vorhandensein der chemischen Substanz verwendet werden. Der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit dient somit als universales Kodierungsmolekül für die zugehörige spezifische chemische Substanz, solange eine bestimmte Basensequenz einer bestimmten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und somit der bestimmten zugehörigen chemischen Substanz zugeordnet ist. Dies birgt u. a. die Vorteile,

• 1. dass es im allgemeinen einfacher ist ein Nukleinsäureoligomer nachzuweisen als eine beliebige chemische Substanz, vor allem wenn es sich um eine undefinierte Mischung der chemischen Substanzen mit unterschiedlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften handelt (Vereinheitlichung und Parallelisierung der Detektion),
• 2. dass es im allgemeinen einfacher ist ein Nukleinsäureoligomer nachzuweisen als eine beliebige chemische Substanz, vor allem wenn es sich um eine undefinierte Mischung der chemischen Substanzen mit sehr ähnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften handelt und diese daher nur sehr schwer chromatographisch aufgetrennt werden können,
• 3. dass in kleinen Volumen/hohen Konzentrationen der chemischen Substanzen gearbeitet werden kann,
• 4. dass sekundäre Immunkomplexe zur besseren Abtrennung verwendet werden können, ohne dass der damit übliche Informationsverlust (Akklommeration verschiedener Rezeptor-Target-Einheiten) hingenommen werden muss,
• 5. dass das kodierende Nukeinsäureoligomer durch geeignete Methoden amplifiziert werden kann und somit auch geringste Mengen einer chemischen Substanz einfach nachgewiesen werden können und
• 6. dass das Inkontaktbringen unter Nutzung der hochspezifischen Wechselwirkung zwischen Rezeptor und zugehöriger chemischer Substanz stattfinden kann, die anschließenden Manipulationen und die schlussendliche Detektion aber auch unter Bedingungen stattfinden können, die die ursprüngliche Erscheinungsform der chemischen Substanzen verändert oder zerstört, und die Stabilität zwischen Rezeptor und chemischer Substanz nicht berücksichtigt werden muß, solange die Sequenzintegrität des Nukleinsäureoligomerbestandteils gewahrt bleibt.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäureoligomere sind durch chemische Bindung eines Substanz-spezifischen Rezeptors modifiziert.

Als Nukleinsäureoligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA-Fragment, verwendet. In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff Nukleinsäureoligomer auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat-Strukturen, wie z. B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat- oder ein Phosphoramid-Rückgrat. Wesentliches Merkmal eines Nukleinsäureoligomers im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, dass sie analoge Nukleinsäureoligomere basensequenzspezifisch binden können. Alternativ zu dem Begriff "Nukleinsäureoligomer" werden die Begriffe "Oligonukleotid", "Nukleinsäure" oder "Oligomer" verwendet.

Unter einer "rezeptorspezifischen Substanz" (Target) wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Einheit jede Substanz, jede Verbindung, jedes Biomolekül oder Molekül oder Kombinationen daraus) verstanden, die spezifisch an eine konjugierte Rezeptor- Einheit (Substanz, Verbindung, Biomolekül oder Molekül oder Kombinationen daraus) binden kann.

"Photolabil" heißt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Spaltung einer Gruppe, also deren Eigenschaft unter bestimmten äußeren Umständen in zwei oder mehrere Bruchstücke zu zerfallen, erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge entfaltet wird.

Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer

Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer. Ein Rezeptor wird an ein Nukleinsäureoligomer direkt kovalent durch die Reaktion des Nukleinsäureoligomers mit dem Rezeptor gebunden oder indirekt nichtkovalent durch Ausbildung spezifischer Wechselwirkungen zwischen dem (modifizierten) Nukleinsäureoligomer und dem (modifizierten) Rezeptor. Diese Bindung kann auf vier verschiedene Arten (a-d) durchgeführt werden:

• a) Als reaktive Gruppe zur Bindungsbildung am Nukleinsäureoligomer wird eine freie Phosphorsäure-, Thiophosphorsäure-, Thiol-, Carbonyl-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe des Oligonukleotid-Rückgrats, insbesondere eine Gruppe an einem der beiden Enden des Oligonukleotid-Rückgrats, verwendet. Die freien, endständigen Phosphorsäure-, Thiophosphorsäure-, Thiol-, Carbonyl-, Zucker- C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen weisen eine erhöhte Reaktivität auf und gehen daher leicht typische Reaktionen wie z. B. eine Amidbildung mit (primären oder sekundären) Aminogruppen bzw. mit Säuregruppen, eine Esterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Alkoholen bzw. mit Säuregruppen, eine Thioesterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Thio-Alkoholen bzw. mit Säuregruppen, eine Disulfidbildung aus zwei Thiolgruppen oder die Kondensation von Amin und Aldehyd mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH₂-NH Bindung ein. Die zur kovalenten Anbindung der Rezeptor-Einheit nötige Kopplungsgruppe (Säure-, Amin-, Alkohol-, Thioalkohol- oder Aldehydfunktion) ist entweder natürlicherweise an dem Rezeptor vorhanden oder wird durch chemische Modifikation des Rezeptors erhalten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit verwendet, wobei die Kopplung der reaktiven Gruppen zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor eine nach Induktion spaltbare Gruppe enthält. Dies kann z. B. eine Disulfidgruppe, die reduktiv, als nach Induktion durch ein Reduktionsmittel wie DTT oder β-Mercaptoethanol, in die beiden Thiolbestandteile gespalten werden kann, eine -CHOH-CHOH-Gruppe, die durch Zugabe eines Oxidationsmittels wie z. B. NaIO₄ oder eine -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO- Gruppe, die durch Zugabe von H₂N-OH gespalten werden kann oder eine photolabile Gruppe wie z. B. die Azogruppe (-N=N-Gruppe), die nach Induktion durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge gespalten werden kann, sein.

• a) Das Nukleinsäureoligomer ist über einen kovalent angebundenen Molekülteil (Spacer) beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge (längste durchgehende Kette von aneinander gebundenen Atomen), insbesondere der Kettenlänge 1 bis 50, am Oligonukleotid-Rückgrat bzw. an einer Base mit einer reaktiven Gruppe modifiziert. Die Modifikation erfolgt bevorzugt an einem der Enden des Oligonukleotid-Rückgrats bzw. an einer terminalen Base. Als Spacer kann z. B. ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinylsubstituent verwendet werden. Mögliche einfache Reaktionen zur Ausbildung der kovalenten Bindung zwischen Rezeptor- Einheit und des so modifizierten Nukleinsäureoligomers sind wie unter a) beschrieben, die Amidbildung aus Säure- und Amino-Gruppe, die Esterbildung aus Säure- und Alkohol-Gruppe, die Thioesterbildung aus Säure- und Thio-Alkohol-Gruppe, die Disulfidbildung aus zwei Thiolgruppen oder die Kondensation von Aldehyd und Amin mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH₂-NH Bindung.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit verwendet, bei der der Linker/Spacer nach Kopplung der reaktiven Gruppen zwischen Linker/Spacer und Nukleinsäureoligomer sowie zwischen Linker/Spacer und Rezeptor eine nach Induktion spaltbare Gruppe aufweist. Geeignete nach Induktion spaltbare Gruppen sind z. B. eine Disulfidgruppe, die reduktiv, also nach Induktion durch ein Reduktionsmittel wie DTT oder β-Mercaptoethanol, in die beiden Thiolbestandteile gespalten werden kann, eine -CHOH-CHOH-Gruppe, die durch Zugabe eines Oxidationsmittels wie z. B. NaIO₄ oder eine -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO- Gruppe, die durch Zugabe von H₂N-OH gespalten werden kann oder eine photolabile Gruppe wie z. B. die Azogruppe (-N=N-Gruppe), die nach Induktion durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge gespalten werden kann.

• a) Bei der Synthese des Nukleinsäureoligomers wird eine terminale Base oder ein terminales Nukleotid bzw. terminales Nukleosid durch den Rezeptor, einen Linker/Spacer-modifizierten (vgl. b)) Rezeptor oder einen Linker/Spacer mit reaktiver Gruppe (vgl. b)) ersetzt. Die Anbindung des Rezeptors bzw. Linker/Spacer-modifizierten Rezeptors bzw. Linker/Spacers mit reaktiver Gruppe kann komplett oder in Teilen dieser Einheit mit anschließender Vervollständigung der Einheit erfolgen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit verwendet, bei der der Linker/Spacer nach Kopplung der reaktiven Gruppen zwischen Linker/Spacer und Nukleinsäureoligomer bzw. zwischen Linker/Spacer und Rezeptor eine nach Induktion spaltbare Gruppe aufweist. Neben den Kopplungsgruppen zur Anbindung an das Nukleinsäureoligomer bzw. an den Rezeptor befindet sich in der durchgehenden Kette zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor eine nach Induktion spaltbare Gruppe, z. B. eine Disulfidgruppe, die reduktiv, also nach Induktion durch ein Reduktionsmittel, wie DTT oder β-Mercaptoethanol, in die beiden Thiolbestandteile gespalten werden kann, eine -CHOH-CHOH-Gruppe, die durch Zugabe eines Oxidationsmittels wie z. B. NaIO₄ oder eine -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO- Gruppe, die durch Zugabe von H₂N-OH gespalten werden kann oder eine photolabile Gruppe wie z. B. die Azogruppe (-N=N-Gruppe), die nach Induktion durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge gespalten werden kann.

• a) Das Nukleinsäureoligomer ist indirekt nichtkovalent an den Rezeptor gebunden.

Dabei wird zum einen z. B. Biotin direkt oder indirekt über einen Spacer/Linker (vgl. b)) an ein Nukleinsäureoligomer gebunden und zum anderen Avidin, insbesondere monovalentes Avidin und/oder Streptavidin, insbesondere monovalentes Streptavidin und/oder anti-Biotin-Antikörper (bzw. das F_ab-Fragment davon) an den Rezeptor (direkt oder indirekt über einen Spacer/Linker (vgl. b)) oder vice versa. Die Verknüpfung dieser modifizierten Nukleinsäureoligomer-Einheit mit dem entsprechend modifizierten Rezeptor-Einheit geschieht durch Kopplung der beiden Einheiten aufgrund der spezifischen Wechselwirkungen zwischen Biotin und Avidin (oder Biotin und Streptavidin oder Biotin und anti-Biotin-Antikörper oder zwischen Biotin und dem F_ab- Fragment von anti-Biotin-Antikörper). Weitere Beispiele für die Realisierung der indirekten nichtkovalenten Verbindung zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor ergeben sich allgemein durch direkte oder indirekte Anbindung (vgl. b)) einer (zweiten) chemischen Substanz an das Nukleinsäureoligomer, die einen spezifischen Bindungspartner für eine dritte chemische Substanz darstellt, wobei diese dritte chemische Substanz diejenige ist, mit der der Rezeptor modifiziert wurde. Beispiele für solche zweite chemische Substanzen zur Bindung an das Nukleinsäureoligomer sind ein Hapten-Analogon (FITC, DNP, Digoxigenin oder Rhodamin), ein Antigen, ein His- Tag, ein HA-TAG, ein FLAG-TAG, ein GST-Tag, eine Z-Domäne (monovalente funktionelle Domäne des Protein A), ein funktionelles Protein, ein chitinbindendes Protein, ein Avidin, monovalentes Avidin, ein Streptavidin oder monovalentes Streptavidin ist. Der dazu passende spezifische Bindungspartner, also die dritte chemische Substanz ist ein Antikörper (spezifischer Bindungspartner für das Hapten oder das Antigen) oder F_ab-Fragment (spezifischer Bindungspartner für das Hapten oder Antigen), insbesondere ein anti-FITC-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für FITC), ein anti-DNP-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für DNP), ein anti- Digoxigenin-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für Digoxigenin) oder ein anti- Rhodamin-Antikörper, oder ein anti-His-Tag-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für His-Tag), ein anti-HA-TAG-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für HA-TAG), ein anti-Flag-Tag-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für FLAG-TAG), ein anti- GST-Tag-Antikörper oder Glutathion (spezifische Bindungspartner für GST-Tag), Antikörper F_c-Fragment (spezifischer Bindungspartner für die Z-Domäne), Biotin (spezifischer Bindungspartner für Avidin, monovalentes Avidin, Streptavidin, monovalentes Streptavidin, anti-Biotin-Antikörper oder dem F_ab-Fragment von anti- Biotin-Antikörper) oder dem spezifischen Bindungspartner für das funktionelle Protein wie z. B. Chitin als spezifischen Bindungspartner für das chitinbindende Protein. Statt der zweiten chemischen Substanz kann auch der spezifische Bindungspartner der zweiten chemischen Substanz an das Nukleinsäureoligomer gebunden werden, wobei dann zur indirekten Bindungsbildung zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor ein Rezeptor verwendet wird, der mit der zweiten chemischen Substanz modifiziert wurde.

Diese Anbindungsform birgt den Vorteil, dass zum einen der an das jeweilige Nukleinsäureoligomer anzubindenden Rezeptor in einer einfachen, unabhängigen und separaten Reaktion stöchiometrisch eindeutig angebunden werden kann und zum anderen, dass die Bindung zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor bzw. zwischen mehreren Nukleinsäureoligomeren und Rezeptoren - sofern zur Nukleinsäureoligomer-Rezeptorverbindung das identische Paar konjugierter chemischer Substanzen verwendet wurde - bei Bedarf gespalten werden kann (z. B. nach der Abtrennung der Komplexe aus Target und Nukleinsäure-Rezeptor-Einheit), indem ein spezifischer Antagonist auf die konjugierten chemischen Substanzen einwirkt (bzw. mehrere solcher Antagonisten bei Verwendung verschiedener konjugierter chemischer Substanzen, nötigenfalls jeweils im deutlichen Überschuss eingesetzt).

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als Rezeptor ein Antigen, ein Antikörper, insbesondere ein m 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002010041766 00004 99880onoklonaler Antikörper, ein F_ab-Fragment eines Antikörpers ein Peptid oder Protein, ein Protein eines Multiproteinkomplexes, ein Allergen, ein Enzym, ein Enzym-Inhibitor, ein Hormon, ein Hormonrezeptorprotein, ds-DNA (ss-DNA, ss-RNA) mit spezifischer Sequenz zur Anbindung eines DNA- (RNA-)bindenden Proteins, ein DNA- oder RNA-bindendes Protein, ein Hapten-Analogon, ein Oligoglycosid oder ein Lectin verwendet.

Die Rezeptor-Einheit kann gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung an eine der Phosphorsäure-Einheiten, an eine der Thiophosphat-Einheiten, an eine der Thiol-Einheiten, an eine der Phosphorsäureamid- Einheiten, an eine der Zucker-Einheiten, insbesondere an eine Zucker-Hydroxy- Gruppe, an eine Carbonyl-, Carboxyl-, Amid- oder Amin-Gruppe, oder an eine der Basen des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils angebunden sein, insbesondere an eine endständige 3'- oder 5'-Einheit.

Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen die Rezeptor-Einheit über eine durch Induktion spaltbare Gruppe an den Nukleinsäureoligomer-Bestandteil angebunden ist, und darunter insbesondere die Ausführungsformen, in denen die Rezeptor-Einheit über eine -CHOH-CHOH-Gruppe, eine -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO- Gruppe, eine -S-S-Gruppe, eine -N=N-Gruppe, über Psoralen oder über zwei spezifisch bindende konjugierte chemische Substanzen (siehe Punkt (d) im Abschnitt Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer) angebunden ist. Die spaltbaren Gruppen zwischen Nukleinsäureoligomer-Bestandteil und Rezeptor-Einheit können auch Bestandteil eines Linkers zwischen dem Nukleinsäureoligomer-Bestandteil und der Rezeptor-Einheit sein.

Bevorzugt sind außerdem Ausführungsformen, gemäß denen der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit wenigstens eine beliebige Primer-Bindungsregion umfasst, insbesondere Ausführungsformen, gemäß denen der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit zwei beliebige Primer-Bindungsregionn umfasst. Bevorzugt sind hierbei Primerabschnitte, die 5' von der Codierungssequenz identische Sequenz aufweisen (bevorzugt 8-24 bp lang) und 3' von der Codierungsregion eine Sequenz aufweisen, die komplementär zu (einem) Primer(n) (bevorzugt 8-24 bp lang) ist. Besonders vorteilhafte Effekte ergeben sich, wenn die verschiedenen Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten einer Analyse identische Primer-Bindungsregionen umfassen. Diese Ausführungsform birgt den Vorteil, dass die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit, insbesondere solche in Form von DNA, RNA oder PNA, bei Bedarf (z. B. nach der Abtrennung der Komplexe aus Target und Nukleinsäure-Rezeptor- Einheit und nachfolgender Abtrennung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils) durch PCR oder andere Methoden (Synthese mit Hilfe anderer DNA- oder RNA-Polymerasen) amplifiziert werden können, um z. B. auch geringe Targetmengen zu detektieren und/oder die Nukleinsäureoligomerbestandteile mit einem Detektionsmarker zu versehen. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung befindet sich 3' neben der Codierungsregion oder 3' neben der 3'-Primer- Bindungsregion eine Bindungsstelle für die T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase, wodurch eine in vitro Transskription der Codierungssequenz möglich wird.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die verschiedenen Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten keine zueinander komplementären Nukleinsäureoligomere auf und insbesondere in den Kodierungsregionen keine Bereiche auf, die zu mehr als 75% komplimentär zu den Primer-Bindungsregionen sind.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit verwendet, die vor, während oder nach Anbindung des Rezeptors nach einer der Möglichkeiten a) bis d) zusätzlich mit einem Fluoreszenzfarbstoff und/oder mit einem Hapten und/oder mit Biotin (Avidin/Streptavidin)), einer einheitlichen Basensequenz zur Anbindung eines universellen Primers (bei Verwendung von cDNA oder RNA als Nukleinsäureoligomer) und/oder einer reaktiven Gruppe (direkt oder Linker-/Spacer-gebunden) modifiziert wird.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren findet eine spezifische Bindungsbildung zwischen einer chemischen Substanz und dem Rezeptor der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit statt. Die für den jeweiligen Rezeptor spezifische Substanz, das Target, wird in einem beliebigen Substanzgemisch mit der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit markiert, wobei die rezeptormodifizierten Nukleinsäureoligomere als Reinsubstanzen (ein modifiziertes Nukleinsäureoligomer) oder Gemische (mehrere verschiedene modifizierte Nukleinsäureoligomere) eingesetzt werden können.

Spezifische Bindungsbildung zwischen chemischer Substanz und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit

Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die spezifische Bindung einer chemischen Substanz an eine für diese Substanz spezifische Rezeptor-Einheit der rezeptormodifizierten Nukleinsäureoligomere. Als Beispiele eines substanzspezifischen Rezeptors mit zugehöriger spezifischer chemischer Substanz seien genannt:

Die Verwendung von Antigenen als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass damit natürliche und künstlich hergestellte Antikörper gegen dieses Antigen identifiziert werden können. Dabei können mit dieser Methode auch extrem geringe Mengen natürlich vorkommender Antikörper (z. B. im Blutseren) nachgewiesen werden. Daneben kann ein Gemisch mit anderen verwandten Antigenen ausgetestet werden und die positiven Ergebnisse (Antigen mit gebundenem Antikörper) können quantitativ und in hoher Konzentration aus der Mischung abgetrennt werden, da die Methode keine Auftrennung der positiven Ergebnisse in dieser kritischen Phase erfordert. Die Antikörper können deshalb auch in sekundären Immunkomplexen mit anti-Ig-Antikörpern gebunden werden, wodurch die quantitative Immobilisierung mit hoher Avididät für alle Antikörper deutlich verbessert wird. Letztendlich können die Bedingungen für die chromatographische Aufreinigung so optimiert werden, dass allein die Affinität der einzelnen Antigene zu den entsprechenden Antikörpern berücksichtigt werden muß. Die Eluation kann in Fraktionen mit steigender Stringenz bei den Waschbedingungen erfolgen.

Die Verwendung von Antikörpern als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass die Antikörper gegen die entsprechenden Antigene eine extrem hohe Spezifität bei hoher Affinität besitzen, das Spektrum der Antigene beliebig breit ist und verschiedene physiologische Formen des Antigens unterschieden werden können. Damit ist gewährleistet, dass man in einer komplexen Mischung die einzelnen Antigene quantitativ identifizieren kann, ohne diese chromatographisch ab- oder auftrennen zu müssen. Daneben können auch Substanzen, die Hapten-Analoga bilden, mit Hilfe der Antikörper-Rezeptoren detektiert werden, wobei auch hier die Spezifität bei hoher Affinität die Unterscheidung nahe verwandter (chemisch ähnlicher) Substanzen in einer komplexen Mischung mit anderen, chromatographisch schwierig abtrennbaren Substanzen erlaubt.

Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern oder affinitätsaufgereinigten polyklonalen Antikörpern, die nur gegen eine bestimmte Region oder ein Epitop des Antigens gerichtet sind, ist besonders bevorzugt, da diese eine erhöhte Spezifität aufweisen, damit z. B. aktive und inaktive Isoformen, alternativ gespleißte, oder proteolytisch prozessierte, oder modifizierte Formen der ansonsten gleichen Antigene unterschieden werden können. Die Verwendung von F_ab-Fragmenten der Antikörper bietet zudem den Vorteil, dass pro F_ab-Fragment nur ein Antigen oder Hapten bindet und dass die Abtrennung der positiven Ergebnisse (F_ab-Fragment mit zugehörigem Antigen oder Hapten) bei Verwendung von sekundären Immunkomplexen einfacher ist, da F_ab-Fragmente, im Gegensatz zu Antikörpern, nicht an die Affinitätschromatographie-Träger binden.

Die Verwendung von Enzymen als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass ein bekannter wirksamer Antagonist (oder Inhibitor bzw. einer Gruppe davon) dem bisher unbekannten Wirkort (aus einer Auswahl von beliebigen Nukleinsäureoligomer-kodierten Enzymen) zugeordnet werden kann. Daneben können die als Rezeptoren verwendeten Enzyme zum quantitativen Nachweis von Inhibitoren, Antagonisten und Cofaktoren verwendet werden, die nicht immunogen sind. Darüber hinaus können Enzyme indirekt über ihre Kofaktoren an die Nukleinsäureoligomere angebunden werden. Dies erlaubt z. B. eine Anbindung eines Kofaktors an das Nukleinsäureoligomer, die i. a. nicht unter physiologischen Bedingungen durchgeführt werden muss, da die Kofaktoren i. a. wesentlich stabiler sind als der Enzymkomplex. Der Kofaktor kann z. B. direkt während der Festphasensynthese an das Nukleinsäureoligomer gebunden werden und die Nukeinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit wird nachträglich, durch Rekonstitution (Inkubation mit Kofaktor-befreitem Enzym) vervollständigt.

Die Verwendung von potentiellen Enzym-Inhibitoren und -Antagonisten als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass nach forschungsrelevanten oder therapeutisch relevanten Inhibitoren oder Antagonisten eines Enzyms (oder einer Gruppe von Enzymen) gesucht werden kann. Daneben können diese als Rezeptoren verwendeten Enzym-Inhibitoren und Antagonisten zum quantitativen Nachweis von Enzymen verwendet werden, wobei selektiv der Anteil der aktiven Form von Enzymen detektiert wird. Darüber hinaus können Enzym-Inhibitoren und Antagonisten, solange sie einfache chemische Verbindungen sind, leicht mit Nukleinsäureoligomeren modifiziert werden, da sie i. a. nicht unter physiologischen Bedingungen gehandhabt werden müssen und somit z. B. direkt während der Festphasensynthese an das Nukleinsäureoligomer gebunden werden können.

Die Verwendung von ds-DNA (ss-DNA, ss-RNA) mit spezifischer Sequenz zur Anbindung DNA-(RNA-)bindender Proteine als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit besitzt gegenüber den Antikörpern den besonderen Vorteil, dass damit der Anteil der aktiven Formen, also der bindenden Formen bekannter DNA- (RNA-)bindender Protein quantitativ oder qualitativ nachgewiesen werden kann.

Außerdem kann mit solchen Rezeptoren nach bisher nicht bekannten Sequenzen gesucht werden, die spezifisch an ein DNA-(RNA-)bindendes Protein (bzw. eine Gruppe DNA-(RNA-)bindender Proteine) binden, und aus diesen Informationen eine consensus-Sequenz der Bindungsstelle ermittelt werden. Daneben können diese Nukleinsäure-Rezeptor-Einheiten in Kombination mit den zugehörigen Targets benutzt werden, um festzustellen, für welche der Komplexe aus ds-DNA(ss-DNA, ss-RNA)- Sequenz und DNA-(RNA-)bindender Proteine eine potentieller Antagonist wirkt, wodurch man nicht nur eine consensus-Bindungsstelle ermittelt, sondern diese Bindungsstellen auch eine funktionelle Relevanz besitzt.

Darüber hinaus können die spezifischen Sequenzen direkt in der Festphasensynthese an das Kodierungs-Nukleinsäureoligomer angebunden werden. Auch müssen diese spezifischen Sequenzen zur Anbindung DNA-(RNA-)bindender Proteine nicht notwendigerweise zur Detektion abgetrennt werden (nach Ausbildung und Abtrennung der Rezeptor-Target-Komplexe und gegebenenfalls anschließender Dissoziation der Target-Einheit).

Die Verwendung DNA-(RNA-)bindender Proteine als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass damit bekannte ds-DNA (ss-DNA, ds-RNA, ss-RNA) mit spezifischer Sequenz zur Anbindung charakterisiert werden können in Bezug auf das Spektrum welche DNA-(RNA-)­ bindende Proteine an diese Sequenzen binden. Dies ist bei Promotorstudien, bei alternativem Spleißen und bei der Bestimmung von spezifischen m-RNA- Transportfaktoren ein wichtiges Hilfsmittel. DNA- und RNA-bindende Proteine können auch herangezogen werden, um die Verfügbarkeit von Bindungsstellen, die aufgrund eines Regulationsmechanismus blockiert sein können, qualitativ und quantitativ nachzuweisen

Die Verwendung von Proteinen eines Multiproteinkomplexes als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass damit Multiproteinkomplexe qualitativ und quantitativ detektiert werden können. Sie können auch als sogenannte potentielle Komponenten dazu herangezogen werden, um nach unbekannten Bindungspartnern für ein bestimmtes Protein oder Multiproteinkomplex zu suchen.

Die Verwendung von Multiproteinkomplexen als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass damit Proteine in physiologisch aktiver Form qualitativ und quantitativ detektiert werden können, die an einen bestimmten Multiproteinkomplex binden.

Die Verwendung von funktionellem Protein oder Peptid (z. B. ein Hormon- Rezeptorprotein) als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass ein bekannter wirksamer Bindungspartner (z. B ein Hormon), ein Antagonist zu diesem Bindungspartner (oder Inhibitor bzw. einer Gruppe davon) dem bisher unbekannten Wirkort (aus einer Auswahl von beliebigen Nukleinsäureoligomer-kodierten funktionellen Proteine oder Peptide) zugeordnet werden kann. Daneben können diese als Rezeptoren verwendeten Proteine oder Peptide zum quantitativen Nachweis von Bindungspartnern wie z. B. Hormonen, Antagonisten zu diesem Bindungspartner (oder Inhibitoren oder Cofaktoren) verwendet werden, wobei der Anteil der aktiven Form von Bindungspartnern detektiert wird.

Die Verwendung von potentiellen spezifischen Bindungspartners eines funktionellen Proteins oder eines funktionellen Peptids (z. B. eines Hormons) oder eines potentiellen Antagonisten als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass nach forschungsrelevanten oder therapeutisch relevanten Inhibitoren oder Antagonisten des Bindungspartners eines bestimmten funktionellen Proteins oder Peptids (oder einer Gruppe von funktionellen Proteinen oder Peptiden) gesucht werden kann. Daneben können diese Bindungspartner zum quantitativen Nachweis der zugehörigen Rezeptor-Proteine (z. B. der Hormon-Rezeptorprotein) herangezogen werden, wobei die aktive Form der Rezeptor-Proteine mit freier Bindungsstelle detektiert wird.

Die Verwendung von Lectinen als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass Glycosylierungsmuster und/oder pathologische Veränderungen des Glycosylierungsmusters qualitativ und quantitativ erfasst werden können. Darüber hinaus sind Lectine besonders stabil und können daher einfach (unter breiten Reaktionsbedingungen) mit den Nukleinsäureoligomeren verbunden werden.

Die Verwendung von Oligoglykosiden als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass sie als Bindungspartner für verschiedene Rezeptorproteine dienen und damit diese qualitativ und quantitativ erfasst werden können, wobei die aktiven Rezeptor-Proteine detektiert werden. Darüber hinaus können Oligoglykosiden daraufhin geprüft werden, ob sie als Bindungspartner für ein bestimmtes Rezeptorprotein dienen.

Die spezifische Bindungsbildung zwischen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und einer oder mehrerer Arten von spezifisch bindenden chemischen Substanzen (Targets) kann in beliebigen Aggregatszuständen der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und der Targets erfolgen, wobei die Targets in vitro oder in vivo vorliegen können. Bevorzugt sind die Bindungsbildung in löslicher Umgebung, wobei auch einer der beiden Bindungspartner, insbesondere das/die Target(s), nicht notwendigerweise in gelöster Form vorliegen muss. Er kann auch in Form eines Präzipitats, in permeable Vesikel (Zellen) eingeschlossen, an/in (Zell-)Membranen oder geeignete Trägermaterialien gebunden oder in Form von Mizellen in der Lösung enthalten sein. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung findet die spezifische Bindungsbildung zwischen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und einer oder mehrerer Arten von spezifisch bindenden chemischen Substanzen (Targets) durch Immobilisieren der Targets auf einem Träger und Inkubation der Träger-immobilisierten Targets mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten statt, wobei die Inkubation durch Zugabe der gelösten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten stattfindet.

Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten

Die nachfolgende Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz von den restlichen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten kann durch spezifische Präzipitation, Filtration, Zentrifugation, durch chromatographische Methoden (Säulenchromatographie, Affinitätschromatographie, Size-Exclusion (Gelfiltration), Membranchromatographie etc.) oder durch Gelelektrophorse erfolgen.

Als "Trägermaterial" oder "Chromatographiematerial" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedes stationäre zwei- oder dreidimensionale Material bezeichnet, das - nötigenfalls durch entsprechende Derivatisierung - geeignet ist, einen oder mehrere der Bausteine des Komplexes aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz zu binden. Das Chromatographiematerial kann auch an eine "Chromatographieoberfläche" gebunden sein, wobei als Chromatographieoberfläche jedes stationär an einer Fläche aufgebrachte Material oder jede Oberfläche verstanden wird, die es erlaubt, einen oder mehrere der Bausteine des Komplexes aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz in einer nach der Art der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz geordnetem Raster zu binden, also in einer definierten ortsaufgelösten Anordnung der verschiedenen Komplexes aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz.

In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Chromatographiematerial - nötigenfalls nach vorhergehender Derivatisierung - geeignet, die rezeptorspezifische Substanz, das Target, oder Modifikationen der rezeptorspezifischen Substanz (Targetkomplexe aus rezeptorspezifischer Substanz und einer oder mehreren weiteren chemischen Substanzen, die nicht die erfindungsgemäße Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit darstellen), als solche oder einen oder mehrere der Bausteine dieses Targetkomplexes, zu binden, während die nicht targetbesetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten nicht gebunden werden (oder vice versa).

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Immobilisierung der Targets zur Inkubation einer oder mehrerer Arten von Targets mit einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und/oder zur Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von den restlichen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Bindung an ein Chromatographiematerial. Diese Bindungsbildung zwischen Target und Chromatographiematerial kann folgendermaßen durchgeführt werden:

a) Bindung an Ionenaustauscher

Das Target oder der Komplex aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target wird an starke Ionenaustauscher gebunden, die so auf die Anbindung der Targets optimiert wurden, dass die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten alleine (ohne zugehöriges Target) nicht gebunden werden.

b) Bindung an speziell modifiziertes Chromatographiematerial über zwei spezifische Bindungspartner

Das Target alleine oder das Target im Komplex aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target wird mit einer weiteren (zweiten) chemischen Substanz modifiziert, die einen spezifischen Bindungspartner für eine dritte chemische Substanz darstellt, wobei diese dritte chemische Substanz diejenige ist, mit der das Chromatographiematerial modifiziert wurde. Solche weiteren (zweiten) chemischen Substanzen sind z. B. ein Hapten-Analogon (Biotin, FITC, DNP, Digoxigenin oder Rhodamin), ein Antigen, ein His-Tag, ein HA-Tag, ein Flag-Tag, ein GST-Tag, eine Z-Domäne (monovalente funktionelle Domäne des Protein A), ein funktionelles Protein, ein chitinbindendes Protein, ein Avidin, monovalentes Avidin, ein Streptavidin oder monovalentes Streptavidin. Der dazu passende spezifischen Bindungspartner, also die dritte chemische Substanz, ist ein Antikörper (spezifischer Bindungspartner für das Hapten-Analogon oder das Antigen) oder F_ab-Fragment (spezifischer Bindungspartner für das Hapten-Analogon oder Antigen) ist, insbesondere ein anti-FITC-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für FITC), ein anti-DNP- Antikörper (spezifischer Bindungspartner für DNP) ein anti-Digoxigenin-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für Digoxigenin), oder ein anti-Rhodamin-Antikörper, oder ein anti-His-Tag-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für His-Tag), ein anti- HA-Tag-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für HA-Tag), ein anti-Flag-Tag- Antikörper (spezifischer Bindungspartner für Flag-Tag), ein anti-GST-Tag-Antikörper oder Glutathion (spezifische Bindungspartner für GST-Tag), Antikörper F_c-Fragment (spezifischer Bindungspartner für die Z-Domäne), Biotin (spezifischer Bindungspartner für Avidin, monovalentes Avidin, Streptavidin, monovalentes Streptavidin, anti-Biotin- Antikörper oder dem F_ab-Fragment von anti-Biotin-Antikörper) oder der spezifische Bindungspartner für das funktionelle Protein wie z. B. Chitin als spezifischer Bindungspartner für das chitinbindende Protein. Statt der zweiten chemischen Substanz kann auch der spezifische Bindungspartner der zweiten chemischen Substanz an das Target alleine oder das Target im Komplex aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und Target gebunden werden, wobei als Chromatographiematerial ein mit der zweiten chemischen Substanz modifiziertes Chromatographiematerial verwendet wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die zweite und dritte chemische Substanz zur Anbindung des Targets an das Chromatographiematerial verschieden von der zweiten und dritten chemischen Substanz zur indirekten Verknüpfung von Nukleinsäureoligomer und Rezeptor (siehe Abschnitt "Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer").

c) Bindung an Chromatographiematerial über Photocrosslinking

Das Target wird vor Bildung des Komplexes aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target mit einem Photocrosslinker modifiziert. Die Anbindung an das Chromatographiematerial wird durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge induziert. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Photocrosslinker verwendet, der über eine nach Induktion spaltbare Gruppe verfügt, wie z. B. über eine Disulfidgruppe, die reduktiv, also nach Induktion durch ein Reduktionsmittel (z. B. DTT oder β-Mercaptoethanol), in die beiden Thiolbestandteile gespalten werden kann, über eine -CHOH-CHOH-Gruppe, die durch Zugabe eines Oxidationsmittels wie z. B. NaIO₄ oder über eine -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO-Gruppe, die durch Zugabe von H₂N-OH gespalten werden kann. Die spaltbare Gruppe kann auch eine photolabile Gruppe wie z. B. die Azogruppe (-N=N-Gruppe) sein, die nach Induktion durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge gespalten werden kann, wobei eine photolabile Gruppe besonders bevorzugt ist, die zur Spaltung Licht anderer Wellenlänge braucht als der Photocrosslinker zur Aktivierung. Alternativ kann auch das Chromatographiematerial mit einem Photocrosslinker modifiziert sein und das unmodifizierte Target wird vor Bildung des Komplexes aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target an das Chromatographiematerial durch Inkubation des Targets mit dem Chromatographiematerial und Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge angebunden.

d) Bindung an das Chromatographiematerial über chemische Bindung

Das Target alleine wird vor Bildung des Komplexes aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target mit einem Linker mit reaktiver Gruppe, insbesondere einem aktivierten Linker modifiziert wie z. B. mit einem über die 4-Azido-Gruppe durch Photocrosslinking an das Target gekoppeltes 4-Azidobenzoesäure-N-sulfosuccinimidylester Natriumsalz. Die Anbindung an das Chromatographiematerial erfolgt durch Inkontaktbringen des modifizierten Targets mit geeignetem Chromatographiematerial, also solchem mit der nötige Gegengruppe zur Ausbildung einer kovalenten chemischen Bindung mit der reaktiven Gruppe des Linkers. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Linker verwendet der über eine nach Induktion spaltbare Gruppe verfügt, wie z. B. über eine Disulfidgruppe, die reduktiv, also nach Induktion durch ein Reduktionsmittel (z. B. DTT oder β-Mercaptoethanol), in die beiden Thiolbestandteile gespalten werden kann, über eine -CHOH-CHOH-Gruppe, die durch Zugabe eines Oxidationsmittels wie z. B. NaIO₄ oder über eine -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO-Gruppe, die durch Zugabe von H₂N-OH gespalten werden kann oder über eine photolabile Gruppe wie z. B. die Azogruppe (-N=N-Gruppe), die nach Induktion durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge gespalten werden kann. Alternativ kann auch das Chromatographiematerial mit einem chemischen Crosslinker modifiziert sein und das unmodifizierte Target wird vor Bildung des Komplexes aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und Target an das Chromatographiematerial durch Inkubation des Targets mit dem Chromatographiematerial angebunden.

e) Bindung an ein mit Antikörpern oder mit Rezeptor-Proteinen modifiziertes Chromatographiematerial

Existieren für die Targets bzw. das Target im Komplex aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target neben dem Rezeptor spezifische Antikörper, wie z. B. anti-IgA-Antikörper, anti-IgG-Antikörper, anti-IgM-Antikörper, anti- IgE-Antikörper und anti-IgD-Antikörper, spezifische F_ab-Fragmente, oder spezifische monoklonale oder polyklonale Antikörper (z. B. im Falle von Antigenen oder Haptenen als Targets) kann das Chromatographiematerial mit diesen Antikörpern und/oder F_ab- Fragmenten und/oder monoklonale und/oder polyklonale Antikörpern modifiziert werden, um die Targets oder Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target an den Träger zu binden. Existieren gegen Target-besetzte Rezeptoren im Komplex aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target andere Bindungspartner wie z. B. Rezeptor-Proteine wie F_c-γ-Rezeptoren oder Kompliment- C1q, die selektiv gegen Gruppen von Target-besetzte Rezeptoren wirken, können auch diese zur Modifikation des Säulenmaterials verwendet werden.

f) Bindung an ein mit Protein A-, Protein G- oder gegen die F_c-Domäne gerichtete anti- Ig-Antikörper-modifiziertes Chromatographiematerial

Existieren für die Targets bzw. das Target im Komplex aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target neben dem Rezeptor spezifische Antikörper, oder spezifische monoklonale oder polyklonale Antikörper (z. B. im Falle von Antigenen oder Haptenen als Targets) können die Targets nach Ausbildung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target aber vor Anbindung dieser Komplexe an das Chromatographiematerial mit den Antikörpern inkubiert werden, wodurch sich aus den Komplexen sogenannte primäre und nach Zugabe von anti-Ig-Antikörpern sekundäre Immunkomplexe bilden. Diese (primären oder) sekundären Immunkomplexe können über Chromatographiematerial, das mit Protein A, Protein G oder mit gegen die F_c-Domäne gerichtete anti-Ig-Antikörper modifiziert ist, von den verbleibenden nicht Target- besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten abgetrennt werden. In einer besonderen Ausführungsform, bei der der Rezeptor und die eingesetzten Antikörper verschiedene Regionen oder Epitope erkennen, kann die Inkontaktbringung der Antikörper mit den Targets auch gleichzeitig mit dem Inkontaktbringung der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten mit den Targets erfolgen.

g) Bindung an mit Target modifiziertem Chromatographiematerial

Das Chromatographiematerial wird mit der oder den Arten von Targets abgesättigt, z. B. analog zu den Methoden a) bis d) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten"). Nach Inkontaktbringen der Nukleinsäure- Rezeptor-Einheiten und Targets und Bindungsbildung zwischen Nukleinsäure- Rezeptor-Einheiten und Targets wird die Mischung mit so modifiziertem Chromatographiematerial in Kontakt gebracht, wobei die nicht Target-besetzten Nukleinsäure-Rezeptor-Einheiten immobilisiert werden und die Target-besetzten Nukleinsäure-Rezeptor-Einheiten im Eluat verbleiben.

In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von den restlichen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten nicht durch Bindung an ein Chromatographiematerial. Bei in wässrigen Medien unlöslichen Targets, z. B. unlöslichen Proteinen als Targets, kann die Komplexbildung zwischen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target durch Inkubation einer Suspension der Targets mit den gelösten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter dem Ausdruck "wässriges Medium" alle Lösungen mit dem Hauptbestandteil Wasser verstanden. Nach erfolgter Komplexbildung werden die löslichen nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt (Pelletierung der komplexe, gemeinsam mit verbleibendem unlöslichem Material). Auch bei Targets mit hohem Molekulargewicht im Vergleich zum Molekulargewicht der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten können nach erfolgter Komplexbildung die löslichen nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Zentrifugation abgetrennt werden. Bei im Vergleich zu den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten großen Targets können die nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Size-Exclusion (Gelfiltration) oder Filtration abgetrennt werden. Weiterhin können die Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten als sekundären Immunkomplexe (vgl. Methode f) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten") durch Filtration oder Zentrifugation (Immunpräzipitation) von den restlichen Bestandteilen der Untersuchungslösung abgetrennt werden.

Verfahrensalternative IA

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von chemischen Substanzen, umfassend die Schritte (i) Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, (ii) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, (iii) Inkontaktbringen der chemischen Substanzen mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, (iv) Bindung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz an ein geeignetes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den ins Eluat übergehenden nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, (v) Spaltung einer oder mehrere chemische Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz derart, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, von dem Chromatographiematerial getrennt wird, und schließlich (vi) Auswaschen der von dem Chromatographiematerial getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile und deren (vii) Detektion durch ein geeignetes Verfahren.

Alternativ zu den Schritten (iv) und (vi) können bei Targets mit hohem Molekulargewicht im Vergleich zum Molekulargewicht der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten nach erfolgter Komplexbildung die löslichen nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten durch Zentrifugation abgetrennt werden oder bei im Vergleich zu den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten großen Targets die nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Size-Exclusion (Gelfiltration) abgetrennt werden.

Verfahrensalternative IB

Alternativ können die chemischen Substanzen durch ein Verfahren mit den nachfolgend genannten Schritten detektiert werden: (i) Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, (ii) Bereitstellen definierter Mengen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, (iii) Inkontaktbringen der chemischen Substanzen mit den definierten Mengen von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, (iv) Bindung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz an ein geeignetes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den ins Eluat übergehenden nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, und schließlich (v) Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der im Eluat befindlichen, nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren.

Alternativ zum Schritt (v) können bei Targets mit hohem Molekulargewicht im Vergleich zu den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten nach erfolgter Komplexbildung die löslichen nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Zentrifugation abgetrennt werden oder bei im Vergleich zum Molekulargewicht der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten großen Targets die nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Size-Exclusion (Gelfiltration) abgetrennt werden.

Verfahrensalternative IIA

Alternativ können die chemischen Substanzen durch ein Verfahren mit den nachfolgend genannten Schritten detektiert werden: (i) Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, (ii) Bindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial, (iii) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, (iv) Inkontaktbringen der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten mit den an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz stattfindet und somit eine Trennung von den ins Eluat übergehenden nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, (v) Spaltung einer oder mehrerer chemischer Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz derart, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, von dem Chromatographiematerial getrennt wird, und schließlich (vi) Auswaschen der von dem Chromatographiematerial getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile und deren Detektion durch ein geeignetes Verfahren.

Verfahrensalternative IIB

Alternativ können die chemischen Substanzen durch ein Verfahren mit den nachfolgend genannten Schritten detektiert werden: (i) Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, (ii) Bindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial, (iii) Bereitstellen definierter Mengen ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, (iv) Inkontaktbringen der definierten Mengen an Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten mit den an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen, wodurch eine Bitdung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz stattfindet und somit eine Trennung von den ins Eluat übergehenden nicht Target- besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, und schließlich (v) Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der im Eluat befindlichen, nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren.

Verfahrensalternative III

Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen Substanzen, insbesondere unlöslicher Proteine umfassend die Schritte (i) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten unlöslicher Substanzen, insbesondere unlöslicher Proteine, (ii) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der unlöslichen Proteine mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und unlöslichem Protein erfolgt, (iii) Abtrennen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslichem Protein von nicht-Target- besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, (iv) Spaltung einer oder mehrerer chemischer Bindungen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslichem Protein derart, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers von dem unlöslichen Protein getrennt wird, (v) Abtrennen der von dem unlöslichen Protein getrennten gelösten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile und schließlich (vi) Detektion der von dem unlöslichen Protein getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile durch ein geeignetes Verfahren.

In einer besonderen Ausführungsform der Verfahrensalternative III werden die Schritte (iii) Abtrennen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslichem Protein von nicht-Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten und (v) Abtrennen der von dem unlöslichen Protein getrennten gelösten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile durch Zentrifugation durchgeführt. Alternativ dazu können im Schritt (iii) die nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und /oder im Schritt (v) die von dem unlöslichen Protein getrennten gelösten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile durch Size-Exclusion (Gelfiltration) abgetrennt werden.

Verfahrensalternative IV

Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Detektion von Hapten-Analoga umfassend die Schritte: (i) Bereitstellen einer oder mehrerer Hapten-Analoga, (ii) Bereitstellen eines Überschusses von ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten (relativ zu den in Schritt (i) bereitgestellten Hapten-Analoga), (iii) Inkontaktbringen der bereitgestellten Hapten- Analoga mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon erfolgt, (iv) Bereitstellen eines Überschusses der im Schritt (i) bereitgestellten Hapten-Analoga in Form von mit Carrier-modifizierten Hapten-Analoga, (v) Inkontaktbringen der im Schritt (iv) bereitgestellten modifizierten Hapten-Analoga mit den in Schritt (iii) gebildeten Gemisch aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten- Analogon, wodurch Komplexe aus verbliebenen nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und modifizierter Hapten-Analogon erfolgt, (vi) Anbinden der in Schritt (v) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und modifizierter Hapten-Analogon an ein geeignetes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den ins Eluat übergehenden Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon erfolgt und schließlich (vii) Detektion der ins Eluat übergegangenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon direkt als Komplex aus chemischer Substanz und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens IV besteht die Modifikation der in Schritt (iv) bereitgestellten modifizierten Hapten-Analoga in der Anbindung eines Carrier-Moleküls an die Hapten-Analoga bei der an jede Art von Hapten-Analogon eine spezifische Art von Carrier-Molekül gebunden wird, welches der Bedingung genügt, dass durch die Anbindung des Carrier-Moleküls keine signifikante Änderung der spezifischen Bindungsfähigkeit des Epitiops der Hapten-Analoga zur Anbindung des Rezeptor-Bestandteils der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit erfolgt.

Alternativ zum Schritt (vi) können bei Carriern mit hohem Molekulargewicht im Vergleich zu dem Molekulargewicht der mit Hapten-Analogon besetzten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten nach erfolgter Komplexbildung die Komplexe aus mit Carrier modifiziertem Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit durch Zentrifugation von den Komplexen mit Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit abgetrennt werden oder bei im Vergleich zu den mit Hapten-Analogon besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten großen Carriern die Komplexe aus mit Carrier-modifiziertem Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit durch Size-Exclusion (Gelfiltration) von den Komplexen aus Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten abgetrennt werden.

Verfahrensalternative V

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von chemischen Substanzen, umfassend die Schritte: (i) Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, (ii) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, (iii) Inkontaktbringen der chemischen Substanzen mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, (iv) Bindung der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten an ein mit den Targets modifiziertes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den ins Eluat übergehenden Target-besetzten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten erfolgt, und schließlich (v) Detektion der Nukleinsäureoligomer- Bestandteile der im Eluat befindlichen, Target-besetzten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren.

Verfahrensalternative VI

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von Antagonisten für Bindungspartner von Rezeptorproteinen oder Enzymen umfassend die Schritte (i) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Bindungspartnern von Rezeptorproteinen oder Enzymen, (ii) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wobei der Rezeptor einen potentiellen Antagonisten der Bindungspartner von Rezeptorproteinen oder Enzymen darstellt, (iii) Bereitstellen eines Überschusses an mit den Targets Rezeptorproteinen oder Enzymen modifizierten Chromatographiematerial (im Vergleich zu den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten), (iv) Inkontaktbringen der in Schritt (ii) bereitgestellten einen oder mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten mit dem in Schritt (iii) bereitgestellten Target-modifizierten Chromatographiematerial, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target-modifizierten Chromatographiematerial erfolgt, (v) fraktionierte Eluation der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten mit einer allmählich steigenden Konzentration der in Schritt (i) bereitgestellten Bindungspartner der Rezeptorproteine oder Enzyme, wodurch eine Trennung von den ins Eluat übergehenden nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, und schließlich (v) separate Detektion der in den einzelnen Fraktionen vorhandenen Nukleinsäureoligomer- Bestandteile der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren.

In einer besonderen Ausführungsform der Verfahrensvariante VI wird zusätzlich nach der fraktionierten Eluation mit den Bindungspartnern ein Eluationsschritt mit einem bekannten Antagonisten durchgeführt und die so erhaltenen Nukleinsäureoligomer- Bestandteile werden durch ein geeignetes Verfahren separat detektiert.

In einer besonderen Ausführungsform der Verfahrensvariante VI wird zusätzlich nach der fraktionierten Eluation der Schritt Spaltung einer oder mehrerer chemischer Bindungen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und modifiziertem Chromatographiematerial derart durchgeführt, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers vom Target-modifizierten Chromatographiematerial getrennt wird, eingefügt und die so erhaltenen Nukleinsäureoligomer-Bestandteile werden durch ein geeignetes Verfahren separat detektiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird in den Verfahren IA, IB, IIA, IIB, IV, V und VI bei Verwendung von Chromatographiematerial zur Immobilisierung der Targets im Zuge der Inkubation einer oder mehrerer Arten von Targets mit einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptoreinheiten und/oder im Zuge der Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von den restlichen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten ein Ionenaustauscher-Material, eine RP-Material oder ein Membran-Material als Chromatographiematerial verwendet, das so auf die Anbindung der Targets optimiert wurde, dass die Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten alleine (ohne zugehöriges Target) nicht gebunden werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird in den Verfahren IA, IB, IIA, und IIB bei Verwendung von Chromatographiematerial zur Immobilisierung der Targets im Zuge der Inkubation einer oder mehrerer Arten von Targets mit einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und/oder im Zuge der Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von den restlichen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten gemäß einer der unter b) bis f) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten" beschriebenen Methoden durchgeführt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird im Verfahren IV bei Verwendung von Chromatographiematerial zur Immobilisierung der Carrier im Zuge der Inkubation einer oder mehrerer Arten von Komplexen aus mit Carrier-modifizierter Hapten-Analogon mit einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten und/oder im Zuge der Abtrennung der Komplexe aus mit Carrier modifizierter Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit von den restlichen Komplexen aus Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten gemäß einer der unter b) bis f) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten" beschriebenen Methoden durchgeführt, wobei sich - ausschließlich in diesem Fall - in den beschriebenen Methoden der Begriff "Target" oder grammatische Äquivalente durch den Begriff "Carrier-modifiziertes Target" oder grammatische Äquivalente zu ersetzen ist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird im Verfahren V und VI das Target gemäß einer der unter b) bis f) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten" beschriebenen Methoden an das Chromatographiematerial gebunden.

Abtrennung und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile

Die Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von den restlichen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten kann, wie oben erwähnt, durch spezifische Präzipitation, Filtration, Zentrifugation, durch chromatographische Methoden oder durch Gelfiltration erfolgen. Die anschließende Identifizierung und Quantifizierung der an die jeweiligen Rezeptoren der rezeptormodifizierten Nukleinsäureoligomere gebundenen rezeptorspezifischen Substanzen erfolgt durch ein indirektes Verfahren, bei dem die rezeptorspezifischen Substanzen (Targets) anhand des Oligonukleotid-Tags am Rezeptor bestimmt werden, das eindeutig für einen bestimmten Rezeptor und damit die entsprechende rezeptorspezifische Substanz kodiert.

Bei den oben genannten Verfahrensalternativen IA, IB, IIA, IIB und III bis VI werden Target-besetzte Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten (Verfahrensalternativen IA, IB, IIA, IIB, und III) bzw. von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, die mit einem Carrier- modifizierten Target-besetzt sind (Verfahrensalternativen IV) bzw. Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten, die an Chromatographiematerial gebundenen Targets gebunden sind (Verfahrensalternativen V) abgetrennt.

Anschließend werden in den Verfahrensalternativen IA, IB, IIA, IIB, III und VI entweder die gelösten abgetrennten nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten anhand ihrer Nukleinsäureoligomer-Bestandteile detektiert (siehe unten), wobei diese gelösten abgetrennten nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten direkt oder nach Abtrennung des Nukleinsäureoligomer- Bestandteils aus der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit eingesetzt werden können oder es werden die abgetrennten immobilisierten Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten nach Abtrennung des Nukleinsäureoligomer- Bestandteils aus den immobilisierten Komplexen eingesetzt. Im Verfahren IV und V werden entweder die gelösten abgetrennten Target-besetzten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten anhand ihrer Nukleinsäureoligomer-Bestandteile detektiert (siehe unten), wobei diese gelösten abgetrennten Target-besetzten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten direkt oder nach Abtrennung des Nukleinsäureoligomer- Bestandteils aus der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit eingesetzt werden können.

Die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der abgetrennten gelösten nicht Target- besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten (Verfahren IA, IB, IIA, IIB und III) bzw. die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der immobilisierten und danach Komplexe aus Carrier-modifizierten Targets bzw. Target und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit (Verfahren IV, V) stehen anhand der Differenz zwischen ursprünglich eingesetzten und schließlich abgetrennten, Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten quantitativ und qualitativ stellvertretend für die spezifische chemische Substanz (das target), welche ursprünglich in der Probenlösung enthalten war. Die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der abgetrennten immobilisierten Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten (Verfahren IA, IB, IIA, IIB und III) bzw. die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der abgetrennten gelösten Komplexe aus Target und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit (Verfahren IV) bzw. die die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der abgetrennten gelösten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten (Verfahren VI) stehen quantitativ und qualitativ stellvertretend für die spezifische chemische Substanz (das Target), welche ursprünglich in der Probenlösung enthalten war.

Diese in den Verfahren erforderliche oder als Alternative mögliche Abtrennung der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile kann auf folgende Weise durchgeführt werden:

A) Harnstoff-Behandlung

Bei Inkubation der Target-besetzten, nicht Target-besetzten oder mit Carrier-modifiziertem Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten mit Guadiniumhydrochlorid werden Bestandteile dieser Komplexe, insbesondere die Protein- oder Peptidbestandteile denaturiert, so dass diese Komplexe dissoziieren und der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil als solcher oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomer-Bestandteils, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, abgetrennt werden.

B) Spaltung der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit

Bei Verwendung von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, die gemäß einer der bevorzugten Ausführungsformen der Bindungsarten a) bis c) im Abschnitt "Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer" gebildet wurden kann die Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit durch Inkubation mit dem nötigen Induktionsmittel in einen Nukleinsäureoligomer und einen Rezeptor-Bestandteil gespalten werden. Bei Verwendung von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, die gemäß einer der Ausführungsformen der Bindungsart d) im Abschnitt "Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer" gebildet wurden, kann die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit durch Inkubation mit einem Antagonisten einer der beiden konjugierten chemischen Substanzen, die für die indirekte, nichtkovalente Bindung zwischen Rezeptor und Nukleinsäureoligomer verwendet wurden, gespalten werden. Nötigenfalls wird die Inkubation mit einem deutlichen Überschuss des Antagonisten durchgeführt.

C) Spaltung der Bindung zwischen Target und Träger

Werden die Target- besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in den Verfahren IA oder IIA bzw. die Komplexe aus Carrier-modifizierten Target und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit gemäß einer der Methoden c) oder d) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten" an Chromatographiematerial gebunden, kann der angebundene Komplex durch Inkubation mit dem nötigen Induktionsmittel vom Chromatographiematerial abgetrennt werden. Werden die Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in den Verfahren IA oder IIA bzw. die Komplexe aus Carrier-modifizierten Target und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit gemäß einer der Methoden b) oder e) oder f) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten" an Chromatographiematerial gebunden, kann der angebundene Komplex durch Inkubation mit einem Antagonisten einer der beiden konjugierten chemischen Substanzen, die für die indirekte, nichtkovalente Anbindung an das Chromatographiematerial verwendet wurden, vom Chromatographiematerial abgetrennt werden. Nötigenfalls wird die Inkubation mit einem deutlichen Überschuss des Antagonisten durchgeführt.

In besonders vorteilhafter Weise können die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Markierung oder zur Detektion von einer oder mehrerer Arten von Antigenen und Proteinen angewandt werden. Insbesondere bevorzugt wird die Anwendung zur Markierung oder zur Detektion wenigstens einer Art von nativen, denaturiertem oder partiell denaturiertem Protein oder Antigen. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren zur Markierung oder zur Detektion von Antikörpern, Antigenen oder Hapten-Analoga angewandt.

In sämtlichen erfindungsgemäßen Verfahren werden die Ausführungsformen besonders bevorzugt, gemäß denen eine oder mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten bereitgestellt werden, die durch Anbindung einer oder mehrerer gleicher oder unterschiedlicher funktioneller chemischer Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Farbstoff, insbesondere Fluoreszenzfarbstoff, redoxaktive Substanz, insbesondere Chinone und Übergangsmetallkomplexe, Biotin, Hapten, Avidin, insbesondere monovalentes Avidin und Streptavidin, insbesondere monovalentes Streptavidin modifiziert sind und/oder zusätzlich durch ein Radiolabel, insbesondere durch ³⁵P, ³²S, ¹⁴C oder ³H modifiziert sind. Alternativ können diese Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten nicht in modifizierter Form bereitgestellt werden, sondern es kann die Modifikation erst während eines erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen. Die Modifikation kann dabei vor einem beliebigen Schritt, der nach dem Schritt "Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten" durchgeführt wird, erfolgen.

Ganz besonders bevorzugt werden die Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren, in denen der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit eine DNA- oder RNA-Sequenz darstellt und wenigstens eine beliebige Primer-Bindungsregion umfasst. In diesem Fall wird vor der Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile eine Amplifizierung der Nukleinsäureoligomer- Bestandteile, insbesondere durch RNA-Polymerasen oder durch DNA-Polymerasen wie z. B. bei der Polymerase-Chain-Reaction (PCR), durchgeführt. Ganz besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, gemäß denen vor der gemeinsamen Amplifizierung der einen oder mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer-Bestandteilen eine definierte Menge eines Nukleinsäureoligomers zugegeben wird, wobei das zugegebene Nukleinsäureoligomer den selben oder die selben Primer-Abschnitte wie die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile umfasst. Besonders bevorzugt wird ein Primer verwendet, der einen Detektions-Marker trägt.

Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Identifizierung und Quantifizierung der rezeptorspezifischen Substanzen (Targets). Die Detektion der chemischen Substanzen wird indirekt über die Detektion des abgetrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteils (siehe oben) durchgeführt, wobei die Detektion des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils über die Hybridisierung an ein komplementäres Nukleinsäureoligomer bevorzugt ist.

Besonders bevorzugt werden die Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren, in denen die Detektion der Hybridisierungsereignisse elektrochemisch, insbesondere amperometrisch, cyclovoltametrisch, impedanzspektroskopisch, potentiometrisch, durch optische Spektroskopie, insbesondere Absorptions oder Fluoreszenzmessung, durch Schwingungsspektroskopie, insbesondere IR-, Raman-, FTIR- oder FT-Raman-spektroskopisch, durch Totalreflexionsmethoden, insbesondere Attenuated total reflection, durch Quarz-Crystal-Micro-Balance, durch Surface Plasmon Resonanz, durch Chemilumineszenzmessung oder durch Radioaktivitätsmessung erfolgt.

Besonders bevorzugt wird die gleichzeitige Detektion verschiedener Nukleinsäureoligomer-Bestandteile durch eine einheitliche der im vorigen Absatz beschriebenen Hybridisierungs-Detektionsart, insbesondere die Detektion auf sogenannten DNA-Chips oder sogenannten Dot-Plot-Membranen.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem einen Kit zur Markierung chemischer Substanzen, einen Kit zur Detektion chemischer Substanzen, einen Kit zur Detektion von Proteinen, einen Kit zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen Proteinen, einen Kit zur Detektion von Antikörpern, einen Kit zur Detektion von Antigenen, einen Kit zur Detektion von Hapten-Analoga, einen Kit zur Detektion DNA- und/oder RNA- bindender Proteine und einen Kit zur Detektion der Antagonisten von DNA- und/oder RNA-bindenden Proteinen, einen Kit zum Screenen nach Antagonisten für Bindungspartner von Enzymen und Rezeptorproteinen und einen Kit zum Screenen von Hybridomazellen unter gleichzeitigem Epitopmapping.

Jeder erfindungsgemäße Kit umfasst eine effektive Menge einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie sie in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Bevorzugt wird ein Kit, der zusätzlich Primer umfasst, insbesondere mit Rhodamin oder Fluorescin modifizierte Primer. Besonders bevorzugt wird außerdem jeder Kit, der zusätzlich die Nukleotid-Bausteine dCTP, dGTP, dATP und dTTP umfasst, wobei ein Satz von Nukleotiden, bei dem wenigstens eine Art von Fluoreszenzfarbstoff- modifizierten Nukleotiden beinhaltet ist, besonders bevorzugt ist.

Besonders bevorzugt wird auch ein Kit der zusätzlich eine Chromatographiekartusche zur Abtrennung der Target-besetzten Nukleinsäureoligomere umfasst. Bevorzugt umfassen die Kits zusätzlich eine mit Biotin belegte Chromatographiesäule.

Besonders bevorzugt wird auch ein Kit der zusätzlich eine Gelfiltrationskartusche umfasst.

Ganz besonders bevorzugt wird ein Kit, wobei als Rezeptor-Einheit der einen oder der mehreren der von dem Kit umfassten Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten ein anti-Biotin-F_ab-Fragment, ein monovalentes Avidin oder ein monovalentes Streptavidin enthalten ist.

Kits, die eine effektive Menge einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten, wie sie in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen, sind ganz besonders bevorzugt. Besonders bevorzugt werden Kits, die zusätzlich biotinylierte Peptide, Polypeptide oder Proteine umfassen.

Insbesondere bevorzugt wird ein Kit, der als Rezeptor der einen oder der mehreren der von dem Kit umfassten Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten ein anti- Biotin-F_ab-Fragment, ein monovalentes Avidin oder ein monovalentes Streptavidin enthält. Insbesondere bevorzugt wird ein Kit, der daneben eine oder mehrere Arten von biotinylierten Rezeptoren enthält.

Insbesondere bevorzugt wird ein Kit, der als Rezeptor der einen oder der mehreren der von dem Kit umfassten Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten ein anti- Digoxigenin-F_ab-Fragment enthält. Insbesondere bevorzugt wird ein Kit, der daneben eine oder mehrere Arten von Digoxigenin-markierten Rezeptoren enthält.

Insbesondere bevorzugt wird ein Kit, der als Rezeptor der einen oder der mehreren der von dem Kit umfassten Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten ein anti- FITC-F_ab-Fragment enthält. Insbesondere bevorzugt wird ein Kit, der daneben eine oder mehrere Arten von FITC-markierten Rezeptoren enthält.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegen die eine oder die mehrere der von den erfindungsgemäßen Kits umfassten Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in einem Lösungsmittel gelöst vor. Besonders bevorzugt ist als Lösungsmittel ein Phosphat-Puffer enthalten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen

Fig. 1: Schematischer Aufbau verschiedener Realisierungsmöglichkeiten einer Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit, DM = Detektionsmarkierung, L = Linker, P1 = Primer-Bindungsregion, K = Kodierungssequenz, P'2 = Primer-Bindungsregion, R = Rezeptor-Einheit, U, V, X, Y, Z sind funktionelle Gruppen wie z. B. eine Amid-Gruppe, eine Ester-Gruppe, eine Thioester-Gruppe, eine CH₂-NH-Gruppe, eine CHOH-CHOH- Gruppe, eine -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO-Gruppe, eine -S-S-Gruppe, eine -N=N- oder repräsentieren eine indirekte nichtkovalente Bindung wie unter d) im Abschnitt "Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer" dargestellt;

Fig. 2(a): Schematischer Aufbau einer Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit mit angebundener rezeptorspezifischer chemischer Substanz, (b) schematischer Aufbau einer Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit mit angebundener rezeptorspezifischer chemischer Substanz, die zusätzlich mit einem Antikörper (Ak) modifiziert ist; (c) schematischer Aufbau einer Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit mit angebundener rezeptorspezifischer chemischer Substanz, die zusätzlich mit einem Tag (z. B. His-Tag) modifiziert ist. Die Abkürzungen DM, L, P1, K, P'2, R, U, V, X, Y, Z entsprechen denen in Fig. 1.

Fig. 3: Ablaufschema einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens (die Abkürzung X entspricht der in Fig. 1): Target 1 bis 3 werden in einem ersten Schritt "A" mit identischen Tags modifiziert, dann in einem zweiten Schritt "B" mit verschiedenen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten (Rezeptor-Einheit 2 bis 4 mit rezeptorspezifischer Affinität zu Target 2 bis 4) zur Bindungsbildung inkubiert, anschließend wird diese Mischung auf eine mit zum Tag spezifischen Bindungspartner (z. B. dem anti-Tag-Antikörper) modifizierte Chromatigraphiesäule gegeben, wobei die nicht Target-besetzte Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit Rezeptor-Einheit 4 ins Eluat übergeht und so von den Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit Rezeptor-Einheit 2 und 3 getrennt wird; schließlich können entweder die im Eluat verbliebene Rezeptor-Einheit 4 oder - nach Schritt D, Spaltung der funktionellen Gruppe X (z. B. S-S-Gruppe) und Eluation der Nukleinsäureoligomer- Bestandteile der Rezeptor-Einheiten 2 und 3 - die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Rezeptor-Einheiten 2 und 3 anhand ihrer Kodierungssequenz detektiert werden, in beiden Detektionsvarianten ergibt sich, dass in der Untersuchungslösung von den durch die DNA-Rezeptoren 2 bis 4 gesuchten Targets die Targets 2 und 3, nicht aber Target 4, enthalten war.

Wege zur Ausführung der Erfindung Beispiel 1 Konstruktion des Nukleinsäureoligomers für die Festphasensynthese, verwendbar zur Markierung einer Rezeptor-Einheit

Eine Ausführungsform des Nukleinsäureoligomers besteht 5'-terminal aus der universellen Sequenz P1 (Primer-Bindungsregion 1, z. B. 12 Basen lang), die die identische Sequenz wie ein universal einsetzbarer Primer 1 besitzt, einer Sequenz K, die ein nach Anbindung an eine bestimmte Rezeptor-Einheit das für diese Rezeptor- Einheit spezifische Label (die Kodierungsequenz) darstellt, und 3'-terminal aus einer weiteren universellen Sequenz P'2 (Primer-Bindungsregion 2, z. B. 12 Basen lang), die zur Sequenz eines universal einsetzbaren Primer 2 komplementär ist. Daneben kann sich zwischen einer der Primer-Bindungsregionen und der Kodierungsregion eine weitere Region befinden, die spezifisch DNA- bzw. RNA-bindende Proteine bindet, insbesondere 3'terminale Regionen, die als Promotoren für die Anbindung von T3, T7 oder SP6-RNA-Polymerasen dienen. Die Regionen P1 und P'2 dienen der späteren Amplifizierung der Basensequenz des Nukleinsäureoligomers durch PCR. Wenn eine vollständige Target-Analyse auf ein und demselben Chip durchgeführt werden soll, und die Targets in extrem unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen, ist es auch möglich, für verschiedene Gruppen unterschiedliche Primer-Paare einzusetzen, wobei die jeweiligen Primer-Bindungsregionen P1 und P'2 durch entsprechende Sequenzen, z. B. Primer-Bindungsregion 2-1 und 2-'2 auf Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten für Targets mit geringer Repräsentanz, und Primer-Bindungsregion 3-1 und 3-'2 auf Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten für Targets mit sehr geringer Repräsentanz, ersetzt werden, so dass diese Gruppen von Nukleinsäureoligomeren selektiv amplifiziert werden können. Auswahlkriterien für die Konstruktion unterschiedlicher Primer ist, dass sie alle gleichen GC-Gehalt und gleiche Länge aufweisen, sich aber untereinander oder zu den Komplementärsequenzen in mindestens 60% der Basen unterscheiden.

Die Länge der spezifischen Region K (einschließlich benachbarter Basen der Primer- Bindungsregionen), die für die Detektion durch Hybridisierung mit Sonden- Nukleinsäureoligomeren benutzt wird (vgl. Beispiel 19), kann je nach GC-Gehalt der Sequenz variieren, wobei die Länge günstigerweise so gewählt wird, dass der jeweilige Schmelzpunkt T_m der hybridisierten Nukleinsäureoligomere (berechnet nach Bolton and McCarthy, 1962) für alle Nukleinsäureoligomere einer Analyse um nicht mehr als 0.5°C voneinander abweichen. Daneben ist die Sequenz der Kodierungsregion K günstigerweise so gewählt, dass jede spezifische Kodierungsregion K sich um mindestens 4 bp von jeder anderen spezifischen Kodierungsregion unterscheidet, wobei die Basenfehlpaarungen in einer besonders günstigen Ausführungsform über das ganze Molekül verteilt sind, keine der Kodierungssequenzen zu einer anderen oder zu den Primer-Bindungsregionen komplementär ist und die Sequenzen nicht über mehr als 75% der Kodierungssequenz palindromisch aufgebaut sind.

Das Nukleinsäureoligomer ist weiterhin direkt oder über einen Spacer mit einer reaktiven Gruppe, wie z. B. einer kovalent angebundenen C6-NH₂-Einheit (Hexyl-NH₂) versehen, die der direkten oder über einen zusätzlichen Linker verbrückten Anbindung einer bestimmten Rezeptor-Einheit (bzw. bestimmten Gruppe von Rezeptor-Einheiten) dient. Weiterhin ist das Nukleinsäureoligomer mit einem Detektions-Marker wie z. B. Rhodamin modifiziert, der der späteren Detektion des Nukleinsäureoligomers dient (wobei die Wahl des Detektionsmarkers an die Art der Nukleinsäureoligomer- Detektionsmethode angepasst wird).

Somit ist folgendes Nukleinsäureoligomer ein typischer Vertreter eines Nukleinsäureoligomers zur Anbindung an eine Rezeptor-Einheit:
Rhodamin-5'-GAGGACGAGACCGACCTCTGGTAGCTCGCACCAGAGCAG-3'-Hexyl-NH₂
mit dem Detektions-Marker Rhodamin, der Primersequenz P1 (= GAGGACGAGACC), der für die Rezeptor-Einheit (bzw. bestimmte Gruppe von Rezeptor-Einheiten) spezifischen Kodierungssequenz K (= GACCTCTGGTAGCTC) und der dem Primer P2 komplementären Basensequenz P'2 (= GCACCAGAGCAG) sowie einer Einheit (Hexyl- NH₂) zur direkten oder linkerverbrückten Anbindung der bestimmten Rezeptor-Einheit (bzw. Gruppen von bestimmten Rezeptor-Einheiten).

Beispiel 2 Anknüpfung eines durch Reduktion spaltbaren Linkers an ein synthetisches Nukleinsäureoligomer

Als synthetisches Nukleinsäureoligomer wird das kommerziell erhältliche Oligonukleotid aus Beispiel 1 verwendet, das am 3'-Ende einen C6-Linker mit funktioneller NH₂- Gruppe und am 5'-Ende ein Rhodamin trägt (Oligo1). 50 µg des Nukleinsäureoligomers und 50 µg Dithio-bis-(sulfosuccinimidyl-)propionat werden in 100 µl Kaliumphosphat- Puffer (50 mM, pH 8) gelöst und 2-4 Stunden bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert. Zur Isolierung und Aufreinigung des mit dem spaltbaren Linker Dithio-bis- propionat modifizierten Nukleinsäureoligomers (Oligo2_mod) wird die Inkubationslösung auf eine Biogel PD6-Säule gegeben, die vorher mit MES-Puffer (10 mM pH 6.0) equilibriert wurde. Die Säule wird mit MES-Puffer (10 mM pH 6.0) eluiert. Die erste fluoreszierende Fraktion enthält das Oligo2_mod. Das Oligo2_mod wird durch Zugabe von 5 M NaCl (¼ des Eluationsvolumens der Oligo2_mod-Fraktion, auf 0°C gekühlt) und Ethanol (3½faches Eluationsvolumen der Oligo2_mod-Fraktion, auf -20°C gekühlt) und anschließender Zentrifugation bei 4°C (30 min bei 15000 × g) gefällt. Das Prezipitat wird mit -20°C kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet.

Beispiel 3 Anknüpfung eines durch Licht spaltbaren Linkers an ein synthetisches Nukleinsäureoligomer

Als synthetisches Nukleinsäureoligomer wird das kommerziell erhältliche synthetische Oligonukleotid aus Beispiel 1 verwendet, das am 3'-Ende einen C6-Linker mit funktioneller NH₂-Gruppe und am 5'-Ende ein Rhodamin trägt. Als Linker wird eine Azo- Verbindung verwendet, die durch Einstrahlen von Licht im Wellenlängenbereich um 350 nm gespalten werden kann. Deshalb muss bei der Anknüpfung dieses Linkers an das Nukleinsäureoligomer unter Dämmerlicht oder Rotlicht gearbeitet werden. 4 nMol (ca. 50 µg) des Nukleinsäureoligomers und 50 µg 4,4'-Dihydroxyazobenzol-3,3'dicarbonsäure werden in je 50 µl MES-Puffer (100 mM, pH 6.0) gelöst und vereinigt. Nach Zusatz von 50 µg EDC and 70 µg NHS wird die Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur und anschließend 12 Stunden bei 4°C inkubiert. Zur Isolierung und Aufreinigung des mit 4,4'-Dihydroxyazobenzol-3,3'dicarbonsäure modifizierten Nukleinsäureoligomers (Oligo3_mod) wird die Inkubationslösung auf eine Biogel PD6-Säule gegeben, die vorher mit MES-Puffer (10 mM pH 6.0) equilibriert wurde. Die Säule wird mit MES-Puffer (10 mM pH 6.0) eluiert. Die erste fluoresziernde Fraktion enthält das Oligo3_mod. Das Oligo3_mod wird durch Zugabe von 5 M NaCl (¼ des Eluationsvolumens der Oligo3_mod- Fraktion, auf 0°C gekühlt), und Ethanol (3½faches Eluationsvolumen der Oligo3_mod- Fraktion, auf -20°C gekühlt) und anschließender Zentrifugation bei 4°C (30 min bei 15000 × g) gefällt. Das Prezipitat wird mit -20°C kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet.

Beispiel 4 Anknüpfung eines Linkers mit photoreaktiver Endgruppe an ein synthetisches Nukleinsäureoligomer

Als synthetisches Nukleinsäureoligomer wird das kommerziell erhältliche synthetische Oligonukleotid aus Beispiel 1 verwendet, das am 3'-Ende einen C6-Linker mit funktioneller NH₂-Gruppe am 5'-Ende ein Rhodamin trägt (Oligo1). Als Linker wird ein aktiver Ester (zur Anbindung an die Oligo1-NH₂-Gruppe) verwendet, der zusätzlich eine terminale Azido-Gruppe besitzt, die durch Einstrahlen von Licht im Wellenlängenbereich um 350 nm an eine beliebige andere Substanz gebunden werden kann. Deshalb muss bei der Anknüpfung des Esters an die Oligo1-NH₂-Gruppe unter Dämmerlicht oder Rotlicht gearbeitet werden. 50 nMol des Nukleinsäureoligomers werden in 0.7 ml sterilem Wasser aufgenommen und mit 100 µl Carbonat-Puffer (1 M NaHCO₃/Na₂CO₃, pH 9) versetzt. Der Linker 4-Azidobenzoesäure-N- sulfosuccinimidylester Natriumsalz (5 µMol) wird in 200 µl Carbonat-Puffer (0.1 M NaHCO₃/Na₂CO₃, pH 9) gelöst und zur Oligo1-Lösung gegeben. Man lässt über Nacht reagieren. Zur Isolierung und Aufreinigung des mit 4-Azidobenzoesäure gekoppeltem Nukleinsäureoligomers (Oligo4_mod) wird die Inkubationslösung auf eine Biogel PD6- Säule gegeben, die vorher mit MES-Puffer (10 mM pH 6.0) equilibriert wurde. Die Säule wird mit MES-Puffer (10 mM pH 6.0) eluiert. Die erste fluoreszierende Fraktion enthält das Oligo4_mod. Das Oligo4_mod wird durch Zugabe von 5 M NaCl (¼ des Eluationsvolumens der Oligo4_mod-Fraktion, auf 0°C gekühlt) und Ethanol (3½faches Eluationsvolumen der Oligo4_mod-Fraktion, auf -20°C gekühlt) und anschließender Zentrifugation bei 4°C (30 min bei 15000 × g) gefällt. Das Prezipitat wird mit -20°C kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet.

Beispiel 5 Verknüpfung eines Nukleinsäureoligomers mit einem Antikörper als Rezeptor-Einheit und Bestimmung der Zahl der angebundenen Nukleinsäureoligomere pro Antikörper

Enthält das Nukleinsäureoligomer eine Fluoreszenzmarkierung oder eine photolabile Gruppe im Linker, muss unter Dämmerlicht oder Rotlicht gearbeitet werden.

(i) Verknüpfung über Kopplung eines aktivierten Ester am Nukleinsäureoligomer an eine freie Aminogruppe des Antikörpers

Als Nukleinsäureoligomer wird Oligo2_mod aus Beispiel 2 oder Oligo3_mod aus Beispiel 3 verwendet. Beide enthalten am Nukleinsäureoligomer eine (über Linker angebundene) COOH-Gruppe. Das COOH- terminierte Nukleinsäureoligomer Oligo2_mod bzw. Oligo3_mod (4 nMol/ca. 50 µg) wird in 50 µl MES-Puffer (100 mM, pH 5.0) gelöst, 50 µg EDC and 70 µg NHS zugeben und für 15-30 min bei Raumtemperatur inkubiert, um aus der COOH-Gruppe einen NHS- aktivierten Ester zu erzeugen. Das nun mit aktiviertem Ester terminierte Nukleinsäureoligomer wird, wie in Beispiel 2 bzw. 3 beschrieben, isoliert und gereinigt. Zur Verknüpfung mit dem Antikörper wird das Nukleinsäureoligomer in 50 µl Kaliumphosphat-Puffer (50 mM, pH 7.2, 150 mM NaCl) gelöst und mit einer Lösung aus 150 µg des F_ab-Fragments eines monoklonalen Antikörpers in 20 µl PBS vereinigt. Diese Lösung lässt man für 4 h bei Raumtemperatur und für weitere 14 Stunden bei 4°C reagieren. Anschließend wird die Reaktionslösung auf eine Sephacryl S200-Säule aufgetragen, die vorher mit PBS equilibriert wurde. Es wird mit PBS eluiert. Die erste fluoreszierende Fraktion enthält die Nukleinsäureoligomer-F_ab-Fragment-Komplexe (ca. 60 kDa), die zweite fluoreszierende Fraktion die nicht mit F_ab-Fragment verknüpften Nukleinsäureoligomere (ca. 13 kDa). Die Anzahl der DNA-Einheiten pro F_ab-Fragment wird über das Verhältnis der Konzentration des Nukleinsäureoligomers, ermittelt über die Rhodamin-Fluoreszenz bei 575 nm, zur Konzentration an F_ab-Fragmenten, idealerweise ermittelt über Immunpräzipitation mit einem radioaktiv markierten Antigen oder mit einem Enzym-markierten Antigen (RIA, bzw. EIA) oder eine alternative Methode wie in (iii) beschrieben, erhalten.

(ii) Verknüpfung über Photocrosslinking einer terminalen photoreaktiven Gruppe am Nukleinsäureoligomer an eine freie Aminogruppe des Antikörpers

Als Nukleinsäureoligomer wird Oligo4_mod aus Beispiel 4 verwendet. Oligo4_mod (0.5 mg) wird in 100 µl Kaliumphosphat-Puffer (50 mM, pH 7.2, 150 mM NaCl) gelöst und mit einer Lösung aus 150 µg des F_ab-Fragments eines monoklonalen Antikörpers in 30 µl PBS vereinigt. Diese Lösung wird für 30 min mit dem Licht einer Xenon-Lampe mit aufgesetztem 330 bis 350 nm Interferenzfilter bestrahlt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf eine Sephacryl S200-Säule aufgetragen, die vorher mit PBS equilibriert wurde. Es wird mit PBS eluiert. Die erste fluoreszierende Fraktion enthält die Nukleinsäureoligomer-F_ab-Fragment-Komplexe (ca 60 kDa), die zweite fluoreszierende Fraktion die nicht mit F_ab-Fragment verknüpften Nukleinsäureoligomere (ca. 13 kDa). Die Effizienz der Markierung wird wie unter (i) bestimmt.

(iii) Möglichkeiten zur Bestimmung der Zahl der angeknüpften Nukleinsäureoligomere pro F_ab-Fragment

Die Menge angebundener Nukleinsäureoligomere kann nach einer der bekannten Methoden wie Fluoreszenz, Radioaktivität, etc. bestimmt werden, abhängig von dem Detektions-Marker des Nukleinsäureoligomers (Fluorophor, ³⁵P/³²S, Hapten etc.). Besitzt das Nukleinsäureoligomer keinen Detektionsmarker, ist eine Quantifizierung über Hybridisierung mit einem gelabelten Nukleinsäureoligomer mit komplemetärer Sequenz, das einen Detektionsmarker trägt, oder über eine detailliertere Analyse des Absorptionsspektrums zwischen 240 nm und 300 nm möglich. Die Menge der F_ab-Fragmente (Rezeptor-Einheit) wird idealerweise über Immunpräzipitation mit einem radioaktiv markierten Antigen, alternativ mit einem Enzym-markierten Antigen, durchgeführt: Hierzu gibt man unterschiedliche definierte Mengen des markierten Antigens zu einer definierten Mege der Rezeptor-Einheit und bestimmt die maximal präzipitierte Menge an Antigen (radioaktive Detektion oder über Enzym-abhängige Chemolumineszenz). Diese Methode hat den Vorteil, dass gleichzeitig der Nachweis erbracht wird, dass die isolierten F_ab-Fragmente intakt sind. Alternativ kann ein ELISA-System mit anti-F_ab-Antikörpern aufgebaut werden, falls das Antigen nicht zur Verfügung steht.

Beispiel 6 Isolierung nativer Proteine aus HeLa-Zellen (i) Isolierung von Proteinen aus HeLa-Zellen unter nichtdenaturierenden Bedingungen

HeLa-Zellen werden in PBS (in 9fachem Volumen des Zellpellet) mit den Additiven PMSF (1 mM) und EDTA (1 mM), optional mit weiteren Protease-Inhibitoren, versetzt und schonend mit einem Potter aufgeschlossen. Anschließend wird die Kernfraktion gemeinsam mit der unlöslichen Protein-Fraktion (ECM/Cytoskelett) bei 800 × g während 15 min abzentrifugiert (pelletiert). Danach werden aus dem Überstand die Membranfraktionen abgetrennt (zentrifugieren bei 25.000 × g für 60 min und bei 240.000 × g für 30 min). Alle Manipulationen werden bei 4°C ausgeführt. Der Überstand enthält die löslichen cytoplasmatischen Proteine und kann bei -20°C bis -80°C aufbewahrt werden. (Optional können einzelne Membranfraktionen mit spezifischer Zusammensetzung über Saccharose-Dichtenzentrifugation isoliert werden). Das Pellet der Membranfraktionen bei 4°C kann in PBS mit PMSF (1 mM) resuspendiert und mit Ultraschall weiter aufgeschlossen werden. Die Membranen werden bei 240.000 × g 30 min lang abzentrifugiert. Der Überstand enthält lösliche Proteine von Zellorganellen und kann bei -20°C bis -80°C aufbewahrt werden. Das Pellet enthält die Membranproteine und einige große Proteinkomplexe, wie z. B. Ribosomen, und kann bei -20°C bis -80°C aufbewahrt werden. Das Pellet aus Kernfraktion und unlöslicher Proteinfraktion (siehe oben) wird bei 4°C in PBS mit PMSF (1 mM) und EDTA (1 mM) kurz (2 min.) im Ultraschall resuspendiert und weiter aufgeschlossen. Aus der Suspension wird die unlösliche Proteinfraktion bei 800 × g während 15 min abzentrifugiert. Sie enthält überwiegend Cytoskellet-Proteine und Teile der Kernmembran. Aus dem Überstand wird die Haupt-Kernmembranfraktion bei 240.000 × g für 30 min. abzentrifugiert. Der Überstand enthält lösliche Proteine des Zellkerns.

(ii) Isolierung von Proteinen aus HeLa-Zellen unter partiell denaturierenden Bedingungen

Bei Verwendung von RIPA-Puffer (150 mM NaCl 1% NP-40, 0.5% Desoxycholat, 0.1% SDS, 50 mM Tris, pH 8.0) statt PBS mit den Additiven PMSF und EDTA können die Proteine anhand der Vorschrift in Beispiel 6i) (bei ansonsten gleicher Vorgehensweise) unter partiell denaturierenden Bedingungen isoliert werden. Die unter diesen partiell denaturierenden Bedingungen erhaltenen Proteinisolate besitzen den Vorteil, dass die in der löslichen Fraktion abgetrennten Proteine neben den cytoplasmatischen Proteinen auch einen (großen) Teil der Membranproteine und der Kernproteine enthält. Der Puffer ist geeignet, die Antigen-Antikörper-Kopplung trotz des Detergensantelis im gleichen Puffersystem durchzuführen, so dass keine zusätzlichen Manipulationen wegen eines Pufferwechsels notwendig sind.

Beispiel 7 Isolierung von Proteinen aus HeLa-Zellen unter denaturierenden Bedingungen

Zellen werden in PBS mit 6 M Harnstoff, 1% SDS und 1 mM PMSF aufgenommen, kurz auf 100°C erhitzt (2 min) und 3 min mit Ultraschall behandelt. Anschließend werden die unlöslichen Bestandteile bei 240.000 × g für 30 min abzentrifugiert. Der Überstand enthält die löslichen aber denaturierten Proteine. Die pelletierten unlösliche Bestandteile werden mit Ultraschall in PBST resuspendiert und zum Entfernen von Harnstoff und SDS erneut abzentrifugiert (240.000 × g, 30 min). Das Pellet enthält die unlösliche Proteinfraktion. Vorteil der Methode ist, dass durch diese Methode fast alle Proteine solubilisiert werden, die Pufferbedingungen erfordern jedoch einen Pufferwechsel vor Zugabe von Antikörpern (oder F_ab-Fragmenten). Dazu wird die gesamte Fraktion der löslichen Proteine auf eine Biogel PD6-Säule aufgetragen, die mit RIPA-Puffer equilibriert wurde, mit RIPA-Puffer eluiert und die Proteinfraktionen gesammelt. Alternativ dazu kann die Fraktion an Nitrozellulose gebunden werden: Zu 10 µl der Fraktion der löslichen Proteine gibt man 90 µl RIPA-Puffer und 40 µl Methanol und bindet jeweils ein Aliquot von 50 µl an Nitrocellulose- und an eine PVDF-Membran. Die Membranen werden anschließend jeweils mit PBS, danach mit PBST (PBS mit 0.1% Tween20) gewaschen. Schließlich werden die verbleibenden freien Bindungsstellen mit 1 mg rekombinanter β-Galactosidase in PBST blockiert und nochmals mit PBST gewaschen.

Beispiel 8 Immobilisierung der löslichen nativen cytoplasmatischen Proteine aus Beispiel 6 an Chromatographiematerial

Je 5 µl der löslichen nativen cytoplasmatischen Protein-Fraktionen in PBS von Beispiel 6 (aus dem erstem Aufschluss - cytoplasmatische Proteine, lösliche Fraktion aus Kern und Membranfraktionen) werden auf RP18 oder PVDF-Material bzw. auf Nitrocellulose-Material immobilisiert (Auftragen der Überstände). Die Säulen werden anschließend jeweils mit PBS, danach mit PBST (PBS mit 0.1% Tween20) gewaschen. Schließlich werden die verbleibenden freien Bindungsstellen mit 1 mg rekombinanter β- Galactosidase in PBST blockiert und nochmals mit PBST gewaschen.

Beispiel 9 Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante mit auf Chromatographiematerial immobilisierten Antigenen

Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Auf die mit PBS oder PBST gewaschenen Säulen oder Membranen (Beispiel 8) werden je 0.1 µg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente, die gemäß Beispiel 5 hergestellt wurden, in PBS in einem möglichst geringen Volumen (bzw. in einem Säulenvolumen verdünnt) auf die Säule oder die Membran gegeben. Man lässt die Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die auf dem Chromatographiematerial immobilisierten Proteine binden, und wäscht mit PBST und Phosphat-Waschpuffer (50 mM Kaliumphosphat pH 7.5, 500 mM NaCl). Durch die Waschschritte werden die verbleibenden nicht gebundenen Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente entfernt, und auf dem Säulenmaterial oder der Membran bleiben nur die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten zurück, die an das Target gebunden wurden. Die Nukleinsäuroligomer-Einheit kann nach einer der in den untenstehenden Beispielen (17-19) beschriebenen Methoden isoliert und weiter analysiert werden.

Beispiel 10 Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante mit Immobilisierung der löslichen Proteine (Targets) aus Beispiel 6 an anti- Fluorescein-Antikörper modifiziertem Chromatographiematerial

Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. 5 µl der löslichen nativen cytoplasmatischen Protein-Fraktionen als Target-Fraktion in PBS aus Beispiel 6 (cytoplasmatische Proteine, lösliche Fraktion aus Kern- und Membranfraktionen) werden auf eine Biogel PD6-Säule gegeben, die vorher mit Carbonat-Puffer (50 mM NaHCO₃/Na₂CO₃, pH 9.5, 150 mM NaCl) equilibriert wurde. Es wird mit Carbonatpuffer eluiert und die Proteinfraktion werden gesammelt (Reinigungsschritt und Pufferwechsel). Zu den gesammelten und vereinigten Proteinfraktionen wird 0.2 mg FITC (20 mg/ml in DMSO) gegeben. Man lässt für 30 min bei Raumtemperatur reagieren. Anschließend wird die Reaktionslösung auf eine Biogel PD6-Säule gegeben, die vorher mit PBS equilibriert wurde, es wird mit PBS eluiert und die Proteinfraktionen gesammelt (Reinigungsschritt). Zu den vereinigten Proteinfraktionen werden je 0.02 µg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente gegeben, die gemäß Beispiel 5 hergestellt wurden. Danach lässt man die Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab- Fragmente für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die Antigene binden. Die gesamte Probe (in ca. einem Säulenvolumen verdünnt) wird auf eine Affinitätschromatographie-Säule gegeben, die mit anti-FITC-Antikörpern belegt ist. Man lässt die FITC-markierten Antigene für ca. 1 Stunde bei Raumtemperatur (und evt. für weitere 12 Stunden bei 4°C) anbinden, wäscht mit PBST, danach mit Phosphat- Waschpuffer (50 mM, pH 7.2, 500 mM NaCl) und isoliert nach einer in den folgenden Beispielen (17-19) beschriebenen Methoden die Nukleinsäureoligomer-Einheit. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmenten von der Säule entfernt, und auf der Säule bleiben nur Komplexe dieser Nukleinsäureoligomer-F_ab-Fragmente mit dem Target, so daß die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer-Einheiten der Menge an Target entsprechen.

Beispiel 11 Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante mit Immobilisierung der löslichen nativen cytoplasmatischen Proteine (Targets) aus Beispiel 6 durch Bildung von Immunkomplexen mit spezifischen Antikörpern und Abtrennung der Immunkomplexe über Protein G-Affinitätschromatographie

Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Zu 5 µl der löslichen nativen cytoplasmatischen Protein-Fraktionen in PBS wird je 0.01 µg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente gegeben, die gemäß Beispiel 5 hergestellt wurden. Dazu gibt man weiterhin je 0.05 µg spezifische Antikörper, die die gleichen Antigene, aber ein anderes Epitop als die Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente erkennen und lässt für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C die Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente und die Antikörper an die Antigene anbinden. Bevorzugt werden hierfür IgG-Antikörper verwendet. Bei Verwendung anderer Antikörper wie IgE, IgM, oder IgA werden zusätzlich anti-Ig-Antikörper zugegeben. Die gesamte Probe (in ca. einem Säulenvolumen verdünnt) wird auf eine Affinitätschromatographie-Säule gegeben, die mit Protein A, Protein G oder anti-IgG-Antikörper (spezifisch nur für die F_c-Region) belegt ist. Man lässt die Immunkomplexe aus Antikörper, Antigenen und Nukleinsäureoligomer-markiertem F_ab-Fragmenten für ca. 1 Stunde bei Raumtemperatur (und evt. für weitere 12 Stunden bei 4°C) anbinden, wäscht mit PBST und danach mit Phosphat-Waschpuffer (50 mM, pH 7.2, 500 mM NaCl) und isoliert danach nach einer der in den folgenden Beispielen (17-19) beschriebenen Methoden die Nukleinsäureologomer-Einheiten für die anschließende Detektion. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab- Fragmenten von der Säule entfernt, und auf der Säule bleiben nur Komplexe dieser F_ab-Fragmente mit dem Target zurück, so daß die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer-Einheiten der Menge an Target entsprechen.

Beispiel 12 Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante mit nativen Membranproteinen unter nativen Bedingungen (intakte Membranen)

Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Die Membranfraktion aus Beispiel 6 wird in 9fachen Volumen PBS resuspendiert. Zu 5 µl dieser Suspension werden je 0.02 µg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente, die gemäß Beispiel 5 hergestellt wurden, gegeben. Man lässt die Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab- Fragmente für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die Membran-Antigene binden. Anschließend pelletiert man bei 4°C die Membranen durch Zentrifugation bei 25.000 × g für 60 min (bzw. bei 240.000 × g für 30 min). Das Pellet wird in PBS resuspendiert und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Pelletieren und Resuspendieren werden als "Waschschritte" anschließend dreimal wiederholt. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmenten entfernt, und im Pellet der Membranfraktion bleiben nur Komplexe dieser F_ab-Fragmente mit dem Target gebunden, so daß die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer-Einheiten der Menge an Target entsprechen. Nach den Waschschritten isoliert und analysiert man die Nukleinsäureoligomer-Einheiten nach einer der in den folgenden Beispielen (17-19) beschriebenen Methoden.

Beispiel 13 Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante mit unlöslichen (nativen oder denaturierten) Proteinen

Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Die Pelletfraktion aus den Beispielen 6 oder 7 wird in 9fachen Volumen PBS (gegebenenfalls über Ultraschallbehandlung) resuspendiert. Zu 5 µl dieser Suspension werden je 0.02 µg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente, die gemäß Beispiel 5 hergestellt wurden, gegeben. Man lässt die Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die Membran-Antigene binden. Anschließend pelletiert man bei 4°C die Proteine durch Zentrifugation bei 25.000 × g für 60 min (bzw. bei 240.000 × g für 30 min). Das Pellet wird in PBS (gegebenenfalls auch PBST) resuspendiert und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Pelletieren und Resuspendieren werden als "Waschschritte" anschließend dreimal wiederholt. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmenten entfernt, und im Pellet der Membranfraktion bleiben nur Komplexe dieser F_ab-Fragmente mit dem Target gebunden, so daß die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer-Einheiten der Menge an Target entsprechen. Nach den Waschschritten isoliert und analysiert man die Nukleinsäureoligomer-Einheiten nach einer der in den folgenden Beispielen (17-19) beschriebenen Methoden.

Beispiel 14 Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante zum Nachweis von Hapten-Analoga

Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Zu 90 µl der zu untersuchenden Lösung gibt man 10 µl 10 × PBS zu (z. B. zu wässrige Probe aus dem Lebensmittelbereich, die auf verschiedene Aflatoxine und Dioxine untersucht werden soll). Danach werden je 0.1 µg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente gegeben, die wie in Beispiel 5 geschildert hergestellt wurden und gegen die gewünschten Substanzen (wie z. B. Aflatoxine und Dioxine) gerichtet sind. Man lässt die Nukleinsäureoligomer- markierten F_ab-Fragmente für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die chemischen Substanzen binden. Um die verbleibenden, nicht mit den chemischen Substanzen (hier Aflatoxine und Dioxine) assoziierten Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente von der Untersuchungslösung abtrennen zu können, gibt man anschließend je 0.1 µg eines Komplexes aus der zu suchenden chemischen Substanz (Aflatoxine und Dioxine), kovalent angebunden an z. B. fluoreszeinmarkierte alkalische Phosphatase (FITC-AP) und 5 µg anti-AP- Antikörper zu, wobei die chemische Substanz als Hapten-Analogon fungiert und AP als Carrier, der immobilisiert werden kann. Man lässt die verbleibenden Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 6 Stunden bei 4°C an die Carrier-modifizierten Hapten-Analoga binden. Als Kontrolle wird bei diesem Schritt weiterhin 0.1 µg eines Komplexes aus DNP-AP und je 0.05 µg von zwei Kontroll-Nukleinsäureoligomere gleicher Struktur mit spezifischer Kodierungssequenz zugegeben, wobei eine ein anti-DNP-F_ab-Fragment, die zweite ein anti-FITC-F_ab-Fragment als Rezeptor-Einheit trägt, die beide quantiativ immobilisiert werden können, sowie ein spezifisches Nukleinsäureoligomer, das ein anti-Taq-F_ab- Fragment trägt, und das quantitativ eluiert werden kann. Die ersten beiden Kontroll- Nukleinsäureoligomere tragen nur für diese Kontroll-Nukleinsäureoligomere spezifische zusätzliche Primer-Bindungsregionen P k-1 und P k-2, um diese selektiv amplifizieren zu können.

Die gesamte Lösung wird auf eine Affinitätschromatographie-Säule gegeben (in einem Säulenvolumen verdünnt), auf der Protein G immobilisiert ist. Man lässt die Immunkomplexe aus Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmenten, dem Hapten- Analogon und den an AP gebundenen Antikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur binden. Danach eluiert man die Affinitätssäule mit PBST.

Da die gesuchten chemischen Substanzen meist in 50640 00070 552 001000280000000200012000285915052900040 0002010041766 00004 50521 nur geringen Konzentrationen in der Probenlösung vorkommen, und deshalb die Hapten-Analoga-gebundenen Komplexe quantitativ von den mit der chemischen Substanz belegten Komplexe abgetrennt werden müssen, bestimmt man die Menge an AP über die Fluoreszein- Fluoreszenz oder die enzymabhängige Chemofluoreszenz (korrelierend mit AP) und bestimmt die Menge an Kontroll-Nukleinsäureoligomeren über selektive PCR mit den Primern K-1 und K-2. Bei zu hohem Hintergrund mit AP oder Kontroll- Nukleinsäureoligomeren wiederholt man die affinitätschromatographische Abtrennung der Komplexe aus Carrier-modifiziertem Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit.

Das Eluat enthält bei effizienter Abtrennung die Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- markierten F_ab-Fragmenten und gesuchten chemischen Substanzen (Rezeptor-Target- Komplexe). Gegebenenfalls können diese Komplexe über Affinitätschromatographie aufkonzentriert werden. Dazu gibt man zum Eluat anti-F_ab-Antikörper, die die konstanten Regionen der Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmente erkennen, lässt die Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-markierten F_ab-Fragmenten und den gesuchten chemischen Substanzen für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die Antikörper binden. Anschließend trägt man die Lösung auf eine Affinitätschromatographie-Säule auf, die Protein G gebunden hat, und lässt die Immunkomplexe für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C bei geschlossenem Pumpkreislauf und ständigem langsamen Fluß an Protein G binden. Die Nukleinsäureoligomer-Einheiten können von dieser Säule oder direkt aus dem Eluat der ersten Säule, wie im folgenden Beispiel 17 beschrieben, isoliert werden.

Beispiel 15 Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante zum Nachweis von Antikörpern gegen Antigene im Serum oder anderen extrazellulären Flüssigkeiten

Der Nachweis von Antikörpern gegen bestimmte Antigene lässt Rückschlüsse auf einen Kontakt des Organismus mit diesen Antigenen zu, was bei Antigenen pathogener Keime wichtige diagnostische Information liefert. Der Nachweis der Antikörper ist dabei meist einfacher als der Nachweis der die Immunantwort auslösenden Antigene. Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Zu 3 Aliquots von je 10 µl des Serums eines Patienten (oder einer anderen extrazellulären Flüssigkeit), das auf Antikörper untersucht werden soll, gibt man 0.05 µg Nukleinsäureoligomer-markierte Antigene (die analog zur Methode in Beispiel 5 hergestellt wurden) sowie ca 1 mg anti-human Ig- Antikörper (die jeweils nur die F_c-Regionen der Antikörper erkennen) gegen IgE (1.Aliquot), IgM (2.Aliquot) oder IgG (3.Aliquot), und lässt die möglicherweise im Serum bzw. der extrazellulären Flüssigkeit vorhandenen Antikörper gegen diese (Nukleinsäureoligomer-markierten) Antigene bzw. (Nukleinsäureoligomer-markierten) Haptene an die Nukleinsäureoligomer-markierten Antigene anbinden, wobei sich parallel dazu die sekundären Immunkomplexe mit den anti-Ig-Antikörpern bilden (für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C inkubieren). Danach wird die Lösung auf eine Affinitätschromatographie-Säule (ca. in einem Säulenvolumen) aufgetragen, die Protein G gebunden hat, und man lässt die Immunkomplexe aus Nukleinsäureoligomer-markierten Antigen und spezifischem Antikörper bzw. Nukleinsäureoligomer-markierten Hapten und spezifischem Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an Protein G binden. Anschließend wird die Affinitätschromatographie-Säule mit PBS und Phosphat-Waschpuffer (50 mM, pH 7.2, 500 mM NaCl) gewaschen. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer-markierten Antigene entfernt, und auf der Säule bleiben nur die Nukleinsäureoligomer-markierten Antigene, die von den für die Antigene spezifischen Antikörper (Targets) gebunden wurden, so daß die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer-Einheiten der Menge an spezifischen Antikörpern gegen diese Antigene proportional sind. Nach den Waschschritten isoliert und analysiert man die Nukleinsäureoligomer-Einheiten nach einer der in den folgenden Beispielen (17-19) beschriebenen Methoden.

Die Isolate aus den verschiedenen Aliquots geben unterschiedliche Informationen: Aliquot1 gibt Auskunft über die Entwicklung von Allergien oder eine Infektion mit bestimmten Zellparasiten, Aliquot2 gibt Auskunft über eine akute Infektion, da IgM- Antikörper nur während einer kurzen Phase der nicht vollkommen differenzierten B- Zellen gebildet werden. Aliquot3 gibt Auskunft über eine Infektion, unabhängig davon, wann die Infektion stattgefunden hat (dabei können vor allem latente und schleichende Infektionen detektiert werden).

Beispiel 16 Assay zur Identifizierung allergieauslösender Reagentien über IgE- Nachweis

Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Zu 10 µl des Serums (oder einer anderen extrazellulären Flüssigkeit), eines Allergie-Patienten, das auf Antikörper gegen Allergene untersucht werden soll, gibt man je 0.05 µg Nukleinsäureoligomer-markierter Allergene (die analog zur Methode in Beispiel 5 hergestellt wurden) und lässt die möglicherweise im Serum bzw. der extrazellulären Flüssigkeit vorhandenen Antikörper gegen diese (Nukleinsäureoligomer-markierten) Allergene anbinden (für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C inkubieren). Danach wird die Lösung auf eine Affinitätschromatographie-Säule (ca. ein Säulenvolumen) aufgetragen, die mit anti-human IgE-Antikörpern belegt ist, und lässt die Immunkomplexe aus Nukleinsäureoligomer-markierten Allergen und spezifischem Antikörper des Patienten (Targets) für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die an der Säule immobilisierten anti-human IgE-Antikörper binden. Anschließend wird die Affinitätschromatographie-Säule mit PBST und Phosphat-Waschpuffer (50 mM, pH 7.2, 500 mM NaCl) gewaschen und die Nukleinsäureoligomer-Einheiten werden für die anschließende Detektion nach einer der in den folgenden Beispielen 17-19 beschriebenen Methoden isoliert und analysiert. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer-markierten Allergene von der Säule entfernt, und auf der Säule bleiben nur Nukleinsäureoligomer-markierte Allergene, die von spezifischen Antikörpern gebunden wurden, so dass die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer-Einheiten identisch zu der Menge der spezifischen Antikörper für diese Allergene ist.

Beispiel 17 Abtrennung des Nukleinsäureoligomers von der Rezeptor-Einheit (i) Denaturierung mit Guanidiniumhydrochlorid

Zu den im Eluat isolierten, im Pellet gebundenem, membrangebundenen oder säulengebundenen Nukleinsäureoligomeren, die die Rezeptor-Einheit (und gegebenenfalls zudem an das Target oder in den verschiedenen Immunkomplexen) gebunden sind (Beispiele 8-16), gibt man 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.2, 6 M Guanidinium/HCl, 10 mM DTT, 2% TritonX 100 vorgewärmt auf 90°C (ca. ein Säulenvolumen/ca. 3faches Volumen bei anderen Isolaten), eluiert im Fall der säulengebundenen Komplexe nach 2-3 min mit weiteren 3 Säulenvolumen des gleichen Puffers und sammelt im Fall der säulengebundenen Immunkomplexe das Eluat. Die Eluate werden kurz bei 15.000 × g zentrifugiert, zum Überstand werden 5 µg Poly-dT(33) zur Unterstützung der Präzipitation gegeben, die Probe wird anschließend mit einem halben Volumens 3 M Kaliumacetat pH 5.0 und dem vierfachen Volumens Ethanol (-20°C) versetzt und die DNA bei 15.000 × g bei 4°C über 40 min präzipitiert. Das Pellet wird abgetrennt und mit 70% Ethanol (-20°C) und 100% Ethanol (-20°C) gewaschen und an der Luft getrocknet. Alternativ wird nach Zugabe der Carrier-DNA 1/2 Volumen Ethanol und ½ Volumen 3 M Kaliumacetat pH 5.0 zugegeben und auf eine 'spin column' mit einer aktivierten Glasfasermembran aufgetragen. Nach 10 min, nachdem die Lösung sich abgekühlt hat, wird zentrifugiert, mit dem gleichen Puffer, und anschließend mit Ethanol gewaschen, Die Nukleinsäureoligomere werden schließlich mit 50 µl TE-Puffer von der Glasfasermembran eluiert (Kits von Qiagen, Promega, u. a.). Zur Amplifikation wird das Pellet im PCR-Puffer aufgenommen (vgl. Beispiel 18), zur direkten Detektion ohne Amplifikation im Hybridisierungspuffer (vgl. Beispiel 19).

(ii) Spaltung des Linkers nach Reduktion

Zur Spaltung der RS-SR'-Einheit (im Linker zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor-Einheit, vgl. Beispiel 2) gibt man zu den im Eluat isolierten, im Pellet gebundenem, membrangebundenen oder säulengebundenen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, die gegebenenfalls an das Target oder in den verschiedenen Immunkomplexen gebunden sind (Beispiele 8-16), 10 mM DTT in PBS (ein Säulenvolumen oder 1-3 Volumen der Probe), lässt für 15 min einwirken, eluiert mit 1-2 Säulenvolumen des gleichen Puffers und sammelt im Fall der säulengebundenen Komplexe das Eluat. Die Eluate werden kurz bei 15.000 × g zentrifugiert. Zum Überstand werden 5 µg Poly-dT(33) zur Unterstützung der DNA- Präzipitation gegeben, die Probe wird anschließend mit einem halben Volumens 3 M Kaliumacetat pH 5.0, und dem vierfachen Volumens Ethanol (-20°C) versetzt und die DNA bei 15.000 × g bei 4°C über 40 min präzipitiert. Das Pellet wird abgetrennt und mit 70% Ethanol (-20°C) und 100% Ethanol (-20°C) gewaschen und an der Luft getrocknet. Zur Amplifikation wird das Pellet im PCR-Puffer aufgenommen (vgl. Beispiel 18), zur direkten Detektion ohne Amplifikation im Hybridisierungspuffer (vgl. Beispiel 19). Alternativ können die Nukleinsäureoligomere wie unter (i) beschrieben auch über Glasfasermembranen aufgereinigt werden. Diese Methode hat wie die in iii) und iv) beschriebenen Methoden den Vorteil, daß die DNA vom Protein getrennt und weniger Proteine im Eluat mit ausgewaschen werden.

(iii) Spaltung des Linkers nach Oxidation

Zur Spaltung der RC(OH)-C(OH)R'-Einheit (im Linker zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor-Einheit) gibt man zu den isolierten freien oder säulengebundenen Komplexen (Beispiele 8-16) 10 mM NaIO₄ in PBS (ein Säulenvolumen oder das gleiche Volumen der Eluationslösung), lässt für 15 min einwirken, eluiert mit 1-2 Säulenvolumen PBS und sammelt im Fall der säulengebundenen Komplexe das Eluat. Zum Eluat werden 5 µg Poly-dT(33) zur Unterstützung der DNA-Präzipitation gegeben, und es wird wie unter (i) beschrieben, über Ethanol-Präzipitation oder über Glasfasermembran isoliert.

(iv) Photolytische Spaltung des Linkers

Zur Spaltung der RN=NR'-Einheit (im Linker zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor-Einheit, vgl. Beispiel 3) bestrahlt man die isolierten freien oder in einem Becherglas suspendierten säulengebundenen Komplexe (Beispiele 8-16) in PBS unter Rühren für 10 min mit dem Licht einer 500 W Xenon- Lampe mit aufgesetztem 330 bis 350 nm Interferenzfilter. Das Säulenmaterial wird filtriert, kurz mit PBS-Puffer nachgewaschen und das Filtrat gesammelt. Die vereinigten Filtrate werden mit 5 µg Poly-dT(33) zur Unterstützung der DNA-Präzipitation versetzt, und wie unter (i) beschrieben über Ethanol-Präzipitation oder über Glasfasermembran isoliert.

Beispiel 18 Amplifizierung und nachträgliche Markierung des Nukleinsäureoligomers

Handelt es sich bei den an den Rezeptor-Einheit gebundenen Nukleinsäureoligomeren um DNA bzw. RNA, die Primer-Bindungsregionen (wie z. B. das in Beispiel 1 konstruierte Nukleinsäureoligomer) besitzen, die für alle verwendeten Rezeptor- gebundenen Nukleinsäureoligomere innerhalb einer qualitativen und/oder quantitativen Targetanalyse (Proteomanalyse etc.) identisch sind, so können die in der Untersuchungslösung vorhandenen Nukleinsäureoligomere, die anhand einer der Methoden (i) bis (v) in Beispiel 17 abgetrennt wurden, durch PCR amplifiziert werden. Bei identischen Primern und identischer, bzw. nahezu identischer Länge aller Nukleinsäureoligomere und den Auswahlkriterien für die einzelnen Sequenzen, wie sie in Beispiel 24 beschrieben sind, ist eine Amplifikation über PCR möglich, ohne dass die Repräsentanz einzelner Nukleinsäureoligomere, bzw. die Zusammensetzung der Nukleinsäureoligomer-Mischung, sich verändert.

(i) Exponentielle Amplifikation

Nach Abtrennung der DNA aus den Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz (vgl. Beispiel 17) löst man das DNA-enthaltende Pellet in 10 mM Tris/HCl pH 8.0. Ein Aliquot davon (1/20-1/100) wird zur Amplifikation eingesetzt. Damit die Amplifizierungsrate exakt ermittelt werden kann wird vor der Amplifikation eine definierte Menge (10 fg, 1 pg, 50 pg, 1 ng) von 4 Kontroll-Nukleinsäureoligomeren (mit eigenen spezifischen Kodierungsregionen und ansonsten identischen Aufbau wie die zur Markierung verwendeten Nukleinsäureoligomere) zum Isolat der Nukleinsäureoligomere zugegeben. Man gibt die beiden universalen Primer P1 und P2 (ein Primer bevorzugt mit einem Detektions- Marker) und die Nukleotid-Bausteine dCTP, dGTP, dATP und dTTP zu und führt z. B. eine Standard-PCR mit 11 bis 18 Zyklen durch um eine in etwa 1000fache bis 100.000fache Amplifikation zu erreichen. Bei Verwendung von unterschiedlichen Primer-Gruppen, die jede für sich universal nur für eine bestimmte Gruppe von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten sind (wie in Beispiel 1 die Primer 2-1, 2-2, 3- 1 und 3-2) werden für jedes Primer-Paar entsprechend 4 spezifische Kontroll- Nukleinsäureoligomere in definierter Menge vor der PCR zugegeben, und die PCR optional in separaten PCR-Reaktionen amplifiziert. Die Lösung wird nach erfolgter PCR-Synthese mit 5 µg Poly-dT(33) zur Unterstützung der Präzipitation und mit 4 Volumen 6 M Guanidiniumchlorid versetzt, um die Polymerase zu zerstören. Zu dieser Lösung wird anschließend ein halbes Volumen 3 M Kaliumacetat pH 5.0 und das vierfache Volumen Ethanol (-20°C) gegeben und die DNA bei 15.000 × g bei 4°C über 40 min präzipitiert. Das Pellet wird mit 70% Ethanol (-20°C) und 100% EtOH (-20°C) gewaschen und an der Luft getrocknet. Zur direkten Detektion wird das Pellet im Hybridisierungspuffer gelöst (vgl. Beispiel 19), zur nachträglichen Modifikation mit Detektions-Marker führt man anschließend eine lineare Amplifikation mit gleichzeitigem Einbau eines Detektions-Markers wie in Beispiel 18ii) beschrieben oder eine nachträgliche chemische Modifikation mit Detektions-Marker wie in Beispiel iii) beschrieben durch. Für die nachträgliche Modifikation mit einem Detektions-Marker wird nach der PCR ein zusätzlicher Chromatographieschritt eingeführt, um die nicht umgesetzten Primer von den amplifizierten Nukleinsäureoligomeren abzutrennen. Dazu wird der gesamte Ansatz auf eine Sephacryl S100-Säule aufgetragen und die erste Fraktion (ca. 25 kDa), die die Amplifikationsprodukte enthalten, gesammelt, die zweite Fraktion (ca. 4 kDa), die die Primer enthält, wird verworfen.

(ii) Lineare Amplifikation

Unter sonst gleicher Vorgehensweise wie unter Beispiel 18i) erhält man bei Weglassen des Primers P1 (Zusatz von Primer P2, der einen Detektions-Marker wie z. B. Rhodamin trägt) bei Durchlaufen von 10 bis 40 Synthesezyklen (analog zur PCR) eine 10fache bis 40fache Amplifikation als ss-DNA, wobei die komplementäre Sequenz des Nukleinsäureoligomers als ss-DNA erhalten wird. Setzt man die Amplifikationsprodukte aus Beispiel 18(i) ein kann wahlweise auch mit Primer 1 (ebenfalls mit Detektions-Marker) spezifisch das Nukleinsäureoligomer als ss-DNA amplifiziert werden. Vorteil dieses Amplifikationsschrittes ist, dass die zu detektierenden Nukleinsäureoligomere bereits als ss-DNA vorliegen.

• a) Neben der beschriebenen Methode kann auch durch Zugabe von Nukleotiden, die einen Detektions-Marker tragen, über PCR die DNA oder über in-vitro Transskription die RNA mit einem Detektionsmarker versehen werden, daneben kann der Detektions- Marker analog zu den Anbindungsvorschriften der Beispiele 2-5 an das Nukleinsäureoligomer nachträglich angebunden werden.

Beispiel 19 (Parallele) Detektion der Nukleinsäureoligomere über Fluoreszenz (i) Parallele Detektion mit Dot-Plot-Technik auf modifizierter Nylonmembran (Hybond N+) über Fluoreszenzdetektion

Die Testsites tragen an ein Trägermaterial kovalent angebundene Sonden-Oligonukleotide, die komplementär zu den zu detektierenden Nukleinsäureoligomeren sind. Die Sonden-Oligonukleotide werden in einem beliebigen aber bekannten Muster auf die modifizierte Nylonmembran getropft. Anschließend wird die Membran bei 80°C für 2 Stunden gebacken, wodurch eine feste Anbindung der Sonden-Oligonukleotide erfolgt. Alternativ dazu kann das Sonden-Oligonukleotid 3' oder 5' terminal einen Linker tragen, der eine reaktive oder aktivierbare Gruppe besitzt, über die das Sonden-Oligonukleotid auf eine geeignete Trägeroberfläche in definierter Weise gebunden wird (z. B. eine NH₂-Gruppe am Sonden-Oligonukleotid und Isothiocyanat-Gruppe auf dem Träger).

Freie Bindungsstellen der Membran werden durch Inkubation für 30 min bei 45°C mit dem Hybridisierungspuffer 1 (7% SDS, 500 mM Na-Phosphatpuffer pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.1 mg/ml ssDNA aus einem Organismus mit möglichst geringer phylogenetischer Verwandtschaft, z. B. pBR322 aus E.coli, 0.5 mg/ml acetyliertes BSA) abgesättigt (Prähybridisierung). Die so gebildeten 'Dots' (Testsites mit Sondenoligonukleotid) werden von der Hybridisierungslösung, die die in Beispiel 17i-iv isolierten Nukleinsäureoligomere bzw. deren Amplifikationsprodukte, enthält, überschichtet. Doppelsträngige DNA-Nukleinsäureoligomere, die bei der Amplifikation entsprechend Beispiel 18i) anfallen, werden vorher 5 min lang bei 100°C denaturiert und kurz auf Eis gekühlt, bevor sie zur Hybridisierungslösung zugegeben werden. Man lässt die Sonden- Oligonukleotide und Nukleinsäureoligomere der Lösung bei ca. 40°C für ca. 3 bis 16 h hybridisieren. Nach Entfernung der nicht-hybridisierten Bestandteile (nicht-stringentes Waschen mit 2 × SSC, 0.1% SDS, 1 mM EDTA für 15-60 min bei 40°C und anschließend stringentes Waschen mit 0.4 × SSC, 0.1% SDS, 0.1 mM EDTA, für 5 min bei 50°C) werden anhand des Fluoreszenz-Musters die entsprechenden ss- Nukleinsäureoligomere aus der Targetanalyse detektiert (qualitative Analyse) und/oder quantitativ erfasst.

(ii) Parallele Detektion auf DNA-Chips über Fluoreszenzdetektion

Als Chip kann z. B. ein custom made Affymetrix GeneChip® (vgl. Wodicka et al. 1997, Nature Biotechnology, 15, 1359ff) verwendet werden. Die Testsites tragen an ein Trägermaterial kovalent angebunde Sonden-Oligonukleotide, die komplementär zu den zu detektierenden Nukleinsäureoligomeren sind. Die für die Targetanalyse eingesetzten Nukleinsäureoligomere (oder die Amplifikationsprodukte) enthalten entsprechend des Affymetrix-Protokolls ein Biotin als primären Detektions-Marker.

10 µg der Nukleinsäureoligomere werden als ss-Nukleinsäureoligomere in 250 µl (pro verwendeten Chip) Hybridisierungs-Puffer 3 (100 mM MES, 1 M NaCl, 20 mM EDTA, 0.01% TWEEN 20, pH 6.5-6.7) gemeinsam mit 0.1 mg/ml Herings-Spermien ss-DNA und 0.5 mg/ml acetylierter BSA aufgenommen und auf den Chip gebracht. Anschließend lässt man die zueinander komplementären Nukleinsäureoligomere für 16 h bei 43°C hybridisieren. Nach erfolgter Hybridisierung wird der Chip zur Entfernung der nicht-hybridisierten Bestandteile gewaschen (nicht-stringentes Waschen mit 900 mM NaCl 60 mM Na-Phosphat pH 7.6, 6 mM EDTA, 0.05% Triton X100 für 1 h bei 40°C und anschließend stringentes Waschen mit 75 mM NaCl 5 mM Na-Phosphat pH 7.6, 0.5 mM EDTA, 0.05% Triton X100 für 15 min bei 40°C) und Anbindung des Detektionsmarkers Streptavidin-modifiziertes Phycoerithrin nach Affymetrix-Vorschrift wird anhand einer Standardmethode, z. B. mit konvokalem Fluoreszenzmikroskop und gekoppelter CCD-Kamera, ausgelesen. Anhand des Musters der Fluoreszenz können bestimmte Nukleinsäureoligomere detektiert (qualitative Analyse) oder auch quantitativ erfasst werden (quantitative Analyse).

Beispiel 20 Kit zur Detektion von Antigenen und Antikörpern

Der Kit enthält ein Protokoll für die Durchführung des Assays (ähnlich wie in Beispielen 6-19 beschrieben, aber angepaßt an die mit dem Kit gelieferten Komponenten). Der Kit beinhaltet modifizierte Nukleinsäureoligomere mit verschiedenen Kodierungsregionen, an die, gegebenenfalls über einen (nach Induktion spaltbaren) Linker eine Komponente zweier konjugierter chemischer Substanzen, wie unter d) im Abschnitt "Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer" beschrieben (z. B. ein anti-Biotin-F_ab- Fragment), angebunden ist (Oligo20-anti-Biotin-F_ab, Herstellung analog zu Beispiel 5). Über die Komponente zweier konjugierter chemischer Substanzen kann eine mit dem entsprechenden Bindungspartner der Komponente modifizierte beliebige Rezeptor- Einheit wie z. B. eine biotinylierte Rezeptoreinheit - vom Anwender nach dessen Präferenzen durchführbar - angekoppelt werden. Der Kit beinhaltet weiterhin einen Satz von Sonden-Oligonukleotiden, die, je nach Protokoll, identisch oder komplemetär zu den Kodierungsregionen der Nukleinsäuroligomeren sind, und die optional, je nach Komplexität des Kits (Anzahl unterschiedlicher Kodierungs- und entsprechend Sonden- Nukleinsäureoligomeren) in definierten Muster auf einer Dot-Blot-Membran oder auf einem DNA-Chip immobilisiert sind. Daneben kann der Kit einen Satz Primer 1 und/­ oder Primer 2 enthalten, wobei der Primer oder einer der Primer zusätzlich einen Detektions-Marker tragen kann (vgl. Beispiel 1 und 19). Weitere Komponenten des Kits können speziell für bestimmte Anwendungen zusammengestellte Sätze von passend modifizierten Rezeptor-Einheiten sein, wie z. B. biotinylierte Antikörper oder biotinylierte F_ab-Fragmente (Kit zur Detektion von Antigenen) bzw. biotinylierte Antigene (Kit zur Detektion von Antikörpern), die zur Träger-gebundenen Abtrennung zusätzlich modifiziert sein können. Daneben passende Chromatographiematerialien für die Aufreinigung der Nukleinsäureoliogmer-Rezeptor-Einheiten (wie z. B. eine mit Biotin belegte Affinitätschromatographiesäule), weitere Antikörper, die zur Immobilisierung und zur Abtrennung der mit Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten eingesetzt werden können, wie z. B. spezifische Antikörper gegen die gleichen Targets aber gegen ein anderes Epitop (Antigen-Kit), anti-Ig-Antikörper, die gegen die F_c-Region der gesuchten Antikörper gerichtet sind. Daneben eine an die Targetanalyse angepasste Einheit zur Abtrennung der an die Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Komplexe gebundenen Antigene (Antigen-Kit) bzw. Antikörper (Antikörper-Kit) aus einem oder mehreren der Bestandteile: spezifische oder gruppenspezifische Antikörper für die Antigen-Targets (für den Antigen-Kit), spezifische gegen die F_c- Regionen gerichtete anti-Ig-Antikörper (Antikörper-Kit) Reagenzien zur Modifikation der Antigen-Targets (Antigen-Kit, vgl. Beispiel 10) und passend modifiziertes oder unmodifiziertes Trägermaterial, vgl. Beispiel 8-16, gegebenenfalls in Form einer Einmal-Kartusche oder als 'spin column'. Daneben verschiedenenste Puffer, gegebenenfalls in gebrauchsfertiger Form (insbesondere Inkubationspuffer, Waschpuffer und einen Eluationspuffer, der das zur Spaltung des spaltbaren Linkers notwendige Induktionsmittel enthält, Hybridisierungspuffer und Waschpuffer für die Detektions-Einheiten wie Dot-Blot-Membranen u. a.). Daneben andere Zusätze wie z. B. Oligo-dT(33) zur Unterstützung der Präzipitation von Nukleinsäureoligomeren, acetyliertes BSA oder ss-DNA sowie geeignete Reaktionsgefäße und Verbrauchsmaterialien. Daneben kann der Kit Komponenten für die PCR-Amplifikation wie z. B. eine Mischung aus Nukleotiden, PCR-Puffer und die entsprechenden Polymerasen, sowie z. B. Isolierungspuffer, Waschpuffer und eine geeignete 'spin column' mit einer modifizierten Glasfasermembran zur Abtrennung und Aufreinigung der Amplifikationsprodukte, enthalten.

In einer einfachen Version besteht der Kit aus einem oder mehreren Nukleinsäureoligomeren mit angebundenem Antibiotin-F_ab-Fragment. Als Nukleinsäureoligomere werden vorzugsweise DNA, RNA oder PNA verwendet, die analog zu Beispiel 1 konstruiert sind, ein über einen nach Induktion spaltbaren Linker (z. B. Linker mit -S-S-Gruppe, vgl. Beispiel 2) kovalent angebundenes anti-Biotin-F_ab- Fragment besitzen (Herstellung analog zu Beispiel 5) und neben einer Kodierungsregion (konstruiert z. B. nach der Anweisung in Beispiel 25) gegebenenfalls zusätzlich einem (Fluoreszenz-)Farbstoff als Detektions-Marker und eine oder zwei Primer-Bindungsregionen zur späteren PCR-Amplifikation aufweisen. Diese Nukleinsäureoligomere mit identischem Antibiotin-F_ab-Fragment werden mit einem Protokoll zur Handhabung und Weiterverwendung (analog der Vorschrift in Beispiel 25) angeboten und können mit biotinylierten Antigenen oder biotinylierten Antikörpern kombiniert werden.

In einer besonderen Ausführungsform umfasst der Kit eine Vorschrift zur Präparation von biotinylierten F_ab-Fragmenten und der Präparation der Eingangs dieses Beispiels erwähnten modifizierte Nukleinsäureoligomere (z. B. Oligo20-anti-Biotin-F_ab) sowie mindestens eine der dazu nötigen Komponenten wie Papain immobilisiert an Agarose, Protease-Puffer, PMSF als Proteaseinhibitor zum Abstoppen des proteolytischen Verdaus, eine Gelfiltrationssäule für die Aufreinigung, ein Biotinylierungs-Agens und den entsprechenden Biotinylierungs-Puffer für die Biotinylierung, und eine weiter Gelfiltrationssäule zur Abtrennung des freien Biotins, einer Biotin- Affinitätschromatographie-Säule zur Abtrennung nicht umgesetzter biotinylierter Nukleinsäureoligomere sowie eine Protein G-Affinitätssäule zur Abtrennung nicht proteolytisch gespaltener Antikörper und freier F_c-Fragmente, wobei die Säulen als Einmal 'spin columns' oder Einmalkartuschen zur Verfügung gestellt werden können, sowie Reaktionsgefäße und anderes Verbrauchsmaterial. Das Protokoll umfasst die Schritte: a) Zugabe von Puffer für den proteolytischen Verdau und Inkubation mit Papain (immobilisiert auf Agarose) für 4 h bis zu 16 h (je nach Subklasse des verwendeten Antikörpers), Zugabe von PMFS und Zentrifugation, um das Papain abzutrennen, b) Inkubation des gereinigten Antikörpers nach Zugabe des Inkubationspuffers mit dem aktivierten Biotin-Molekül, wobei das molare Verhältnis zwischen Antikörper und Biotin-Molekül ca. 1 : 1-1 : 1.5 liegen sollte, c) Reinigung und Abtrennung des nicht umgesetzten Biotins über die Gelfiltrationssäule, d) Reinigung und Abtrennung des F_c-Fragmentes und nicht proteolytisch prozessierter Antikörper über ProteinG-Affinitätschromatographie, e) Inkubation je eines Nukleinsäureoligomers mit spezifischer Kodierungssequenz und angebundenem anti-Biotin-F_ab-Fragment, Inkubation bei Raumtemperatur für 4 h und f) Abtrennung der nicht an die biotinylierten Rezeptoren angebundenen Nukleinsäureoligomer über Biotin- Affinitätschromatographie.

Beispiel 21 Kit zum Screenen nach potentiellen Antagonisten für ein Enzym oder ein Rezeptor-Protein

Die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten werden vom Anweder unter Verwendung des oben genannten Kits (Beispiel 20) nach dessen Präferenzen zusammengestellt, wobei die Substanzen, die als potentielle Antagonisten untersucht werden sollen, vom Anwender selbst als biotinylierte Formen zur Verfügung gestellt werden können. Jede Substanz wird in Inkubationspuffer zu je einem spezifischen Nukleinsäureoligomer mit angebundenem anti-Biotin-F_ab-Fragment zugegeben, 1-4 h inkubiert, die Inkubationslösung auf eine mit Biotin belegte Affinitätschromatographiesäule gegeben, weitere 1-4 h inkubiert, um die nicht angebundenen Nukleinsäureoliogmer-anti-Biotin- F_ab-Fragmente abzutrennen.

Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Zu 1-10 µg eines Proteins (Enzym, Rezeptor- Protein oder funktionelles Peptid mit der aktiven Domäne dieser Proteine) in 10 µl eines geeigneten Puffers (10 mM Kaliumphosphat pH 8.0, 135 mM Kaliumchlorid, 2 mM Mg- Sulfat) gibt man je 0.1 µg Nukleinsäureoligomer-markierte Substanzen, die auf ihr Potential als Antagonisten untersucht werden sollen (wobei diese analog zur Methode in Beispiel 5 hergestellt wurden) plus einen Antikörper (IgG), der gegen das Protein (bzw. Peptid) spezifisch gerichtet ist, aber nicht die aktiven Zentren blockiert. Man lässt die Substanzen an das Protein, bzw. Peptid anbinden (für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C inkubieren), gibt danach das Substrat oder den natürlichen Bindungspartner in physiologischer Konzentration zu und gibt die Lösung auf eine Affinitätschromatographie-Säule (ca. ein Säulenvolumen), die mit ProteinG belegt ist. Man lässt die Immunkomplexe aus Nukleinsäureoligomer- markierter Substanz, Protein (bzw. Peptid) und dem spezifischen Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an das ProteinG binden. Anschließend wird die Affinitätschromatographie-Säule mit dem Puffer inklusive dem natürlichen Bindungspartner in physiologischer Konzentration (Fraktion 1), dann inklusive dem natürlichen Bindungspartner in 50fach höherer Konzentration (Fraktion 2) und dann inklusive einem bekannten hochaffinen Antagonisten in hoher Konzentration (Fraktion3) eluiert - die Fraktionen werden separat gesammelt.

Durch die einzelnen Eluationsschritte werden zunächst nicht gebundene Nukleinsäureoligomer-markierte Substanzen, die nicht oder nur sehr schwach an das Protein binden können, entfernt (Fraktion 1), dann Nukleinsäureoligomer-markierte Substanzen, die als geringaffine Antagonisten in der Bindungsstelle des natürlichen Bindungspartners wirken (Fraktion 2), dann hochaffine Antagonisten (Fraktion 3). Auf der Säule verbleibenden Nukleinsäureoligomer-markierte Substanzen, die an das Protein, bzw. Peptid gebunden bleiben (Fraktion 4). Dabei enthält Fraktion 4 Substanzen, die hochaffine Antagonisten darstellen und deshalb nicht vom Protein abdissoziieren, aber auch Antagonisten oder Inhibitoren, die an einer anderen Bindungsstelle als die des natürlichen Bindungspartners oder des bekannten Antagonisten angebunden haben, oder aber Substanzen, die ohne jede Wirkung an das Protein, bzw. Peptid gebunden haben. Die Nukleinsäureoligomer-Einheiten der der noch auf der Säule verbliebenen Substanzen können nach einer der in Beispiel 17 beschriebenen Methoden als Fraktion 4 isoliert werden.

Beispiel 22 Kit zum Screenen nach Antikörpern von Hybridoma-Zellüberständen mit gleichzeitigem Epitop-Mapping

Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Als Nukleinsäureoligomer wird ein Oligo20- anti-Biotin-F_ab (oder ein analog mit einer Komponente zweier konjugierter chemischer Substanzen modifiziertes Nukleinsäureoligomer, vgl. Beispiel 20) benutzt. Als Rezeptor-Einheiten werden Peptide eingesetzt, die mit Biotin markiert werden. Im einfachsten Fall erreicht man die Biotinylierung durch in vivo Markierung in E.coli über rekombinante Expression als Fusionsprodukt mit einem Segment des Biotin Carboxylase Carrier Proteins (PinPoint-Vektoren der Fa. Promega). Die Peptide stellen Teile des Antigens dar, das bei der Immunisierung verwendet wurde und tragen ein oder mehrere Epitope dieses Antigens. Der Kit in dieser Ausführung erlaubt es dem Anwender, diese Rezeptor-Einheiten nach individuellen Präferenzen herzustellen und einzusetzen.

Zu je 10 µg eines spezifischen Oligo20-anti-Biotin-F_ab wird je ein spezifisches biotinyliertes Peptid in einem molaren Verhältnis von ca. 1.5 : 1 in PBS zugegeben. Man lässt das Nukleinsäureoligomer an das biotinylierte Peptid für 2 Stunden bei Raumtemperatur koppeln. Die Probe wird anschließend auf eine Affinitätssäule gegeben, die mit Biotin belegt ist, und man lässt die nicht gebundenen Nukleinsäureoligomere für 2 Stunden bei Raumtemperatur über anti-Biotin-F_ab- Fragment an das Biotin der Affinitätssäule binden. Danach werden die über Biotin-anti- Biotin-F_ab verknüpften gebrauchsfertigen Nukleinsäureoligomer-markierten Peptide eluiert (Nukleinsäureoligomer-markierte Rezeptor-Einheit).

Zu je 100 µl des Zellkultur-Überstands einer Hybridoma-Zell-Linie werden nun je 0.05 µg eines Nukleinsäureoligomer-markierten Peptids gegeben und man lässt diese für 2 Stunden bei Raumtemperatur (und evtl. weiteren 12 Stunden bei 4°C) an monoklonale Antikörper der Hybridoma-Zelllinien binden. Danach wird die Lösung auf eine Affinitätschromatographie-Säule (ca. ein Säulenvolumen) aufgetragen, die Protein G gebunden hat, und wartet ca. 2 h bei Raumtemperatur (und evtl. weiteren 12 Stunden bei 4°C), bis die Immunkomplexe aus Nukleinsäureoligomer-markierte Rezeptor-Einheit und den monoklonalen Antikörpern an das Protein G gebunden haben. Anschließend wird die Säule nacheinander mit PBST und Phosphat-Waschpuffer (50 mM, pH 7.2, 500 mM NaCl) gewaschen.

Die Trennung von freien Nukleinsäureoligomer arkierten Peptiden und Komplexen dieser Peptide mit dem Target, dem monoklonalen Antikörper (auf dem Säulenmaterial immobilisiert) erfolgt durch die Eluation und die Waschschritte, so daß am Ende der Waschschritte die Nukleinsäureoligomer-Einheiten nach einer der in Beispiel 17 beschriebenen Methoden für die Amplifikation und Detektion isoliert werden können.

Der Kit enthält hierfür jeweils fluoreszenzmarkierte Primer für die Amplifikation, je nach Komplexität des Kits (Anzahl unterschiedlicher spezifischer Kodierungs- Nukleinsäureoligomere) Dot-Blot-Streifen oder DNA-Chips, auf denen ein ganzen Satz an Sonden-Oligonukleotiden in definiertem Muster gebunden ist. Vorteil dieser Methode ist, daß das Screening früher einsetzen kann und weniger Material (insb. an Antigen) erfordert als die üblichen Methoden.

Beispiel 23 Kit zur Detektion von DNA-bindenden (bzw. RNA-bindenden) Biomolekülen, insbesondere DNA- bzw. RNA-bindenden Proteinen oder deren Antagonisten

Der Kit besteht aus Nukleinsäureoligomeren mit verschiedenen Kodierungsregionen, an die sich, gegebenenfalls über einen (nach Induktion spaltbaren) Linker, jeweils eine spezifische DNA- bzw. RNA-Sequenz (als ss- oder ds-DNA bzw. als ss- oder ds-RNA) als Rezeptor-Einheit für DNA-bindende (bzw. RNA-bindende) Biomoleküle, insbesondere DNA- bzw. RNA-bindende Proteine anschließt (z. B. die Sequenz ds-5'- CCAGGCCTGG-3' für die DNA-(Cytosine-5)-methyltransferase Haelll, das IoxP-site für CRE-Rekombinase, Promotorsequenzen, die spezifisch verschiedene Transskriptionsfaktoren und Transskriptionsregulatoren binden oder RNA-Sequenzen die Splice-Faktoren und hn-RNP binden). Diese zusätzlich angebundenen DNA- bzw. RNA-Sequenzen können auch als Rezeptor-Einheiten für Antagonisten von DNA- bzw. RNA-bindende Proteinen dienen (z. B. die Sequenz ds-5'-ATGCAT-3' als Bindungsstelle für DNA-bindende Topoisomerase II, aber auch als Bindungsstelle eines Inhibitors für DNA-bindenden Topoisomerase II wie LU-79553, vgl. Gallego & Reid, Biochemistry 1999, 38, 15104-15115). Daneben enthält der Kit eine Protokoll zur Handhabung des Kits, sowie optional für alle Nukleinsäureoligomere gleiche Primer (P1 und/oder P2), die wahlweise mit einem Detektions-Marker (z. B. einem Rhodamin oder Flurescein), das zur Spaltung des spaltbaren Linkers notwendige Induktionsmittel, passende oder beliebige DNA-bindende (bzw. RNA-bindende) Biomoleküle, deren Antagonisten (passend oder beliebig), die zur Träger-gebundenen Abtrennung zusätzlich modifiziert sein können, und eine Detektions-Einheit, die auf die verwendeten Nukleinsäureoligomere abgestimmt ist (z. B. eine gebrauchsfertige Dot- Plot Membran mit den zu den zu detektierenden Nukleinsäureoligomeren komplementären, auf kodierungssequenzspezifischen Spots immobilisierten Sonden- Oligonukleotiden, vgl. Beispiel 19). Daneben kann der Kit eine an die Targetanalyse angepasste Einheit zur Abtrennung der mit Target-besetzten und an die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Komplexe gebundenen DNA-bindenden (bzw. RNA- bindenden) Biomoleküle aus den Bestandteilen spezifische Antikörper für die DNA- bindenden (bzw. RNA-bindende) Biomoleküle oder deren Antagonisten, Reagenz zur Modifikation der DNA-bindenden (bzw. RNA-bindende) Biomoleküle oder deren Antagonisten, vgl. Beispiel 10 und passend modifiziertes oder unmodifiziertes Trägermaterial, vgl. Beispiel 8-16, gegebenenfalls in Form einer Einmal-Kartusche bzw. einzelne Bestandteile der Abtrennungseinheit, enthalten.

Beispiel 24 Exemplarische zelluläre Proteomanalyse (i) Proteinaufschluss

Gewebezellen (< 100 Zellen), z. B. das Zellmaterial einer Biopsie, wird - nach Zugabe von RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% Desoxycholat, 0.1% SDS, 50 mM Tris, pH 8.0, 10 µl pro mg Zellgewebe, mindestens jedoch 1 µl) im Mikrotip-Sonifier aufgeschlossen. Ein Großteil des zellulären Proteoms der Zellen wird wie in Beispiel 6ii) unter partiell denaturierenden Bedingungen in Lösung gebracht (Abtrennen der verbleibenden unlöslichen Protein-Fraktion (ECM/Cytoskelett) bei 800 × g/4°C/15 min und Reste des Zelldetritus aus dem abgetrennten Überstand bei 50.000 × g/4°C/30 min). Der RIPA-gepufferte Überstand enthält die partiell denaturierten löslichen cytoplasmatischen Proteine und einen Großteil der Membranproteine. Die im Pellet verbliebenen Proteine werden verworfen (oder es werden geeignete Rezeptor-Nukleinsäure-Komplexe an die unlöslichen Proteine im Pellet gebunden und diese Target-Rezeptor-Nukleinsäureoligomer-Komplexe in einem 2. Arbeitsgang, wie in Beispiel 13 geschildert, weiteranalysiert).

(ii) Konstruktion der Rezeptor-Nukleinsäureoligomer-Komplexe

Als Rezeptor-Einheiten werden z. B. biotinylierte F_ab-Fragmente der Antikörper aus Beispiel 24 verwendet (i. a. hängt die Auswahl der Rezeptor-Einheiten von der Fragestellung der Proteomanalyse ab und die Rezeptor-Einheiten werden entsprechend ausgewählt). Als Nukleinsäureoligomer wird eine synthetische ss-DNA der Sequenz
Rhodomin-5'-TTT-GACGAGACGTCATGG-K16-CTCACCAGAGCTTCG-TTT-3'-hexyl-NH₂
mit der Primer-Bindungsregion P1 (= GACGAGACGTCATGG), der dem Primer P2 komplementären Basenregion P'2 (= CTCACCAGAGCTTCG), der für eine Rezeptor- Einheit (bzw. eine bestimmte Rezeptor-Einheitgruppe) spezifischen 16 Basen langen Kodierungssequenz K16, siehe unten, sowie einer 3'-terminalen TTT-Hexyl-NH₂-Einheit und einer 5'-terminalen Rhodamin-TTT-Einheit, die in der Festphasensynthese kovalent gebunden wurden, benutzt. Nukleinsäureoligomer 1 zur Anbindung von Rezeptor- Einheit 1 besitzt z. B. die Kodierungssequenz 5'-GTTCCAAGCATGGTTG-3', wobei die Positionen 1, 2, 9 und 10 der Kodierungssequenz unabhängig sind, die Positionen 3, 5 und 7 durch die Permutationsvorschrift G → A → C → T → G von Position 1 abhängig ist, also für ein G an Position 1 folgt, dass Position 3 ein A, Position 5 ein C und Position 7 ein T ist. Analog sind durch die gleiche Permutationsvorschrift die Positionen 4, 6 und 8 von der unabhängigen Besetzung der Position 2 abhängig, sowie die Positionen 11, 13 und 15 von der unabhängigen Position 9 sowie die Positionen 12, 14 und 16 von der unabhängigen Position 10; durch diese einfache Permutationvorschrift ergeben sich aufgrund der 4 frei wählbaren Positionen 4⁴ = 256 verschiedene Kodierungssequenzen, die berücksichtigen, dass (a) der GC-Gehalt der Kodierungssequenz (50%) erhalten bleibt und dass sich (b) die einzelnen Kodierungssequenzen um mindestens 4 Basen unterscheiden. Will man zusätzlich gewährleisten, dass (c) nicht mehr als zwei der Basen eines Basenpaares (T und/oder A bzw. G und/oder C) benachbart sind, ist innerhalb dieser Besetzungsvorschrift einzig Position 8 nicht mehr völlig frei wählbar, also bedingt abhängig, so dass sich für Position 8 nur noch 3 Besetzungsmöglichkeiten ergeben und somit von den ursprünglichen 4⁴ = 256 nur noch 4³ × 3 = 192 verschiedenen Kodierungssequenzen verbleiben, die definitiv den Bedingungen (a) bis (c) genügen (von den 16 Besetzungsmöglichkeiten für die Basen 7 und 8 gibt es 8 Möglichkeiten, da 2 Basen eines Basenpaares benachbart sind, die dann nur noch 2 Wahlmöglichkeiten für die Position 9 erlauben, während für die anderen 8 Möglichkeiten, die keine 2 Basen eines Basenpaares benachbart aufweisen weiterhin alle 4 Wahlmöglichkeiten verbleiben, so dass für Base 9 rechnerisch statt 4 nur 3 Wahlmöglichkeiten bleiben; für eine längere Kodierungssequenz aus beliebigen Vielfachen einer Ber Sequenz, i. e. aus n × 8 Basen ergeben sich analog (4^2(n-1) × 3^n-1) Kodierungssequenzen, die den Bedingungen (a) bis (c) bzw. 4²ⁿ Kodierungssequenzen, die den Bedingungen (a) und (b) genügen).

Zur Anbindung der F_ab-Fragmente werden alle für die verschiedenen Antikörper notwendigen Nukleinsäureoligomer-Bestandteile mit unterschiedlicher Kodierungssequenz (beliebige aus den oben generierten maximal 192 Nukleinsäureoligomere) mit dem Linker Dithio-bis-propionsäure-sulfosuccinimidylester gekoppelt (je ein getrennter Ansatz Nukleinsäureoligomer pro Antikörper: 1 nMol des Nukleinsäureoligomers werden mit 50 nMol Dithio-bis-propionsäure- sulfosuccinimidylester in ca. 100 µl 100 mM NaHCO₃/Na₂CO₃, pH 9 aufgenommen, man lässt über Nacht bei Raumtemperatur im Dunklen stehen, isoliert und trennt die umgesetzte DNA in Carbonat-Puffer analog zur Vorschrift in Beispiel 3 ab). Die Nukleinsäureoligomer-Linker-Einheiten einer Reaktion werden anschließend mit je einer Art F_ab-Fragmente umgesetzt und isoliert (analog Beispiel 5) und die Anzahl der DNA-Einheiten pro F_ab-Fragment z. B. über das Verhältnis der Rhodamin-Fluoreszenz bei 575 nm (proportional der DNA) zur Absorption bei 285 nm (proportional den F_ab- Fragmenten) ermittelt.

(iii) Target-Rezeptor-Einheit-Kopplung

Die in PBS gelösten und mit den Nukleinsäureoligomeren markierten F_ab-Fragmente aller Ansätze werden vereinigt (ca. 10 ml) und 10 µl davon zu 10 µl Lösung der partiell denaturierten Proteine in RIPA- Puffer gegeben (entsprechend 1 mg Zellmaterial). Man lässt die Proteine für ca. 3 h bei Raumtemperatur und für ca. 24 h bei 4°C an die F_ab-Fragmente koppeln. Man gibt 1 µg eines Cocktails aus polyklonalen Antikörpern in PBS zu, die für dieselben Targets (Proteine) spezifisch sind wie die F_ab-Fragmente, (und optional weitere anti-Ig- Antikörper, die gegen die F_c-Regionen dieser Antikörpern spezifisch sind) und lässt die Antikörper für weitere ca. 3 h bei Raumtemperatur und für ca. 12 h bei 4°C an die Proteine koppeln.

(iv) Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäure-markiertem Rezeptor, Target und Target-spezifischem Antikörper

Eine mit Protein G belegte Agarose-Säule wird mit PBST, pH 7.5 equilibriert, die Lösung mit den Komplexen aus Nukleinsäure-markiertem Rezeptor, Target und Target-spezifischem Antikörper zur Immobilisierung der Immunkomplexe auf die Säule gegeben und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, damit die Immunkomplexe binden können. Danach wird die Säule mit PBS eluiert (das Eluat wird verworfen oder zur späteren Kontrolle aufbewahrt), und gewaschen (vergl. Beispiel 11).

(v) Abtrennung, Amplifizierung und Quantifizierung der DNA aus den Träger- immobilisierten Antikörper-Target-Rezeptor-DNA-Immunkomplexen

Zur Spaltung der -S-S-Einheit im Linker zwischen DNA und F_ab-Fragment wird ein Säulenvolumen 30 mM DTT in PBS zugegeben, man lässt die Säule für ca. 15 min stehen, eluiert mit PBS und isoliert und reinigt die DNA im Eluat analog zur Vorschrift in Beispiel 3 oder Beispiel 17. Anschließend wird die erhaltene DNA wie unter Beispiel 18i) und iii) beschrieben mit PCR unter Verwendung von Primer 2 und Rhodamin-modifizierten Primer P1 exponentiell amplifiziert, die amplifizierte DNA aufgeschmolzen (Erhitzen für 5 min auf 100°C, danach auf Eis abgekühlt), auf eine mit zu den ursprünglichen Kodierungssequenzen komplementären Sonden-Oligonukleotiden versehenen Dot- Plot-Membran gegeben, hybridisiert und gewaschen (wie in Beispiel 19i beschrieben), und danach die Fluoreszenz der Spots quantitativ bestimmt (vgl. Beispiel 19i).

Beispiel 25 Kit zur diagnostischen Untersuchung von Gewebematerial

Eine Transplantation erfordert eine intensive diagnostische Untersuchung der zur Verfügung stehenden Gewebe in möglichst kurzer Zeit, da die Organe möglichst rasch transplantiert werden sollen. Untersucht werden müssen insbesondere die Blutgruppen und andere polymorphe Gewebsmarker, insbesondere die Komponenten des MHC (major histocompatibility complex), um Abstoßungsreaktionen abschätzen zu können und die geeigneten Patienten für die Transplantation auswählen zu können; gleichzeitig ist es notwendig, eine Infektionsgefahr über das transplantierte Gewebe auszuschließen.

Ein Kit umfasst einen Satz von kompletten Nukleinsäureoligomere-Rezeptor-Einheiten sowie einen Satz von Nukleinsäureoligomere-anti-Biotin-F_ab-Einheiten, die zur Verfügung stehen, um analog Beispiel 20 zusätzliche Rezeptor-Einheiten, je nach Bedarf vom Anwender zusammengestellt, herstellen zu können.

Als Rezeptor-Einheiten kommen insbesondere F_ab-Fragmente gegen die Komponenten des major histocompatibility complex (MHC - derzeit 1219 Allele bekannt), gegen Blutgruppen-Epitope (um die polymorphen Gewebemarker zu bestimmen), sowie insbesondere Antigene, die typisch für bestimmte Infektionskrankheit sind (um über die Existenz von Antikörpern gegen diese Antigene eine Infektion nachzuweisen), und Antigene wie z. B. Rheumafaktoren (um Antikörper zu detektieren, die typisch sind für eine Autoimmunkrankheit) in Frage.

Die Erfassung dieser Antikörper ist ausschließlich über die Proteinanalytik möglich. Die Antikörper sind zudem relativ einfach zugänglich, da sie über das Blut-Kreislaufsystem im ganzen Organismus verteilt sind.

Besonders wichtig ist der Nachweis von Infektionen durch Krankheitserreger, die nur bei Immundefizienz ein Problem darstellen, von Infektionen durch virale Krankheitserreger, die noch lange nach überstandener Infektion persistieren können (HIV, Herpes simplex, Hepatitis A/B/C, Cytomegalovirus, Zoster, Retroviren, Mycoplasmen. . .), von Infektionen durch virale Krankheitserreger, die nicht einfach zu erkennen sind, da die Symptome nur schwer zuzuordnen sind (Adenovirus, Influenca etc.) sowie Infektionen durch andere Krankheitserreger, die oft aufgrund des schleichenden Krankheitsverlaufs nicht erfasst werden (Legionellose, Borelliose, Tuberkulose, Syphilis etc.).

Der Kit kann weitere Komponenten, wie in Beispiel 20 beschrieben, enthalten. Der Kit kann zudem Kontroll-Nukleinsäureoligomere, die wie alle eingesetzten Nukleinsäureoligomere aufgebaut sind und jeweils eine spezifische Kodierungssequenz besitzen, enthalten (Positiv-Bindungs-Kontrollen in drei verschiedenen Konzentrationen, z. B. mit anti-Human IgG-F_ab-Fragment als Rezeptor-Einheit, das stets in den sekundären Immunkomplexen gebunden wird; Positiv-Bindungs-Kontrollen für die Überprüfung der Immobilisierung unterschiedlicher isotypischer Antikörper aus unterschiedlichen Organismen, wobei jeweils ein intakter Antikörper, dessen Spezifität ein Antigen ist, das nicht in der Untersuchungslösung vorkommt, verschiedener Isotypen oder Immunglobulin-Klassen aus verschiedenen Organismen wie z. B. IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4 und IgM aus Maus, polyklonale Kaninchen-Antikörper verwendet wird; eine oder mehrere Negativ-Bindungs-Kontrollen zur Überprüfung der erfolgreichen Abtrennung der freien Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wobei Antikörper gegen Proteine phylogenetisch nicht verwandter Organismen gewählt werden, die nicht in der Untersuchungslösung vorkommen, also z. B. ein anti-Taq-F_ab- Fragment; eine Positiv/Negativ-Bindungs-Kontrolle mit einem der Antikörper, der für die Negativ-Kontrolle verwendet wurde und ein Tag trägt, das für die Immobilisierung verwendet wird wie z. B. ein mit Digoxigenin markiertes anti-Taq-F_ab-Fragment).

Der Kit erlaubt es, die folgenden Komponenten in einem Ansatz zu analysieren: zur Bestimmung der Blut- und Gewebemerkmale werden Nukleinsäureoligomer-markierte F_ab-Fragmente monoklonaler Antikörper gegen diese Gewebemarker, die an die Antigene spezifisch binden und Antikörper mit Spezifität gegen ein anderes Epitop dieser Targets eingesetzt. Zur Bestimmung der Antikörper werden Nukleinsäureoligomer-markierte Antigene der Krankheitserreger zum gleichen Ansatz zugegeben. Diese Antikörper werden durch Zugabe von anti-human IgG-, anti-human IgM-, anti-human IgA- und anti-human IgE-Antikörper als sekundäre Immunkomplexe gebunden, die wiederum über Protein G-Affinitätschromatographie immobilisiert werden können.

Claims (129)

1. Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen umfassend die Schritte:

• a) eine oder mehrere chemische Substanzen werden bereitgestellt,
• b) eine oder mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten werden bereitgestellt, wobei die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten aus jeweils einem Nukleinsäureoligomer bekannter Sequenz und jeweils einer daran angebundenen Rezeptor-Einheit bestehen und die Rezeptor-Einheit eine chemische Substanz spezifisch binden kann,
• c) die in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen werden mit den in Schritt b) bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei als Rezeptor-Einheit ein Antigen, ein Antikörper, ein gentechnisch hergestellter Antikörper, ein F_ab-Fragment, insbesondere ein gentechnisch modifiziertes F_ab-Fragment, ein Protein, insbesondere ein DNA- oder RNA-bindendes Protein, ein Peptid, ein Allergen, ein Enzym, ein Enzym-Antagonist, ein Hormon, ein Hormonrezeptor, ein Hapten, ein Oligoglycosid oder ein Lectin verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit bereitgestellt wird, deren Nukleinsäureoligomer-Bestandteil ein Desoxyribonukleinsäureoligomer, ein Ribonukleinsäureoligomer, ein Peptidnukleinsäureoligomer oder ein Nukleinsäureoligomer mit strukturell analogem Rückgrat ist, wobei der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil ein anderes Nukleinsäureoligomer mit komplementärer Basensequenz sequenzspezifisch unter Ausbildung von Basenpaaren binden kann.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Rezeptor-Einheit an eine der Phosphorsäure-Einheiten, an eine der Thiophosphat-Einheiten, an eine der Phosphorsäureamid-Einheiten, an eine der Zucker-Einheiten, insbesondere an eine Zucker-Hydroxy-Gruppe, an eine Carbonyl-, Carboxyl-, Amid- oder Amin- Gruppe, oder an eine der Basen des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils angebunden ist, insbesondere an eine endständige 3'- oder 5'-Einheit.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Rezeptor- Einheit über eine durch Induktion spaltbare Gruppe an den Nukleinsäureoligomer- Bestandteil angebunden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Rezeptor-Einheit über eine -CHOH-CHOH- Gruppe, eine -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO-Gruppe, eine -S-S-Gruppe, eine -N=N- Gruppe oder über Psoralen angebunden ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Rezeptor-Einheit und der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil jeweils mit einer chemischen Substanz modifiziert sind, die beiden chemischen Substanzen zueinander spezifische Bindungspartner darstellen und die Rezeptor-Einheit über die zueinander spezifische Bindung der beiden chemischen Substanzen an den Nukleinsäureoligomer-Bestandteil angebunden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei als die beiden chemischen Substanzen jeweils zwei spezifische Bindungspartner ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin und monovalentes Avidin, Biotin und monovaltentes Streptavidin, Biotin und Avidin, Biotin und Streptavidin, Chitin und Chitin-bindendes Protein, Antigen und Antikörper, Antigen und F_ab-Fragment des Antikörpers verwendet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei als Antigen und Antikörper jeweils zwei spezifische Bindungspartner ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin und anti-Biotin-Antikörper, FITC und anti-FITC-Antikörper, Digoxigenin und anti- Digoxigenin-Antikörper, DNP und anti-DNP-Antikörper, Rhodamin und anti- Rhodamin-Antikörper, His-Tag und anti-His-Tag-Antikörper, HA-Tag und anti-HA- Tag-Antikörper, Flag-Tag und anti-Flag-Tag-Antikörper, GST-Tag und anti-GST- Tag-Antikörper verwendet werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Rezeptor-Einheit an einen verzweigten oder unverzweigten Molekülteil beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge angebunden ist und der verzweigte oder unverzweigte Molekülteil alternativ an eine der Phosphorsäure-Einheiten, an eine der Thiophosphat- Einheiten, an eine der Phosphorsäureamid-Einheiten, an eine der Zucker- Einheiten, insbesondere an eine Zucker-Hydroxy-Gruppe, an eine Carbonyl-, Carboxyl-, Amid- oder Amin-Gruppe, oder an eine der Basen des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils gebunden ist, insbesondere an eine endständige 3'- oder 5'-Einheit.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Rezeptor-Einheit an einen verzweigten oder unverzweigten Molekülteil angebunden ist, der wenigstens eine durch Induktion spaltbare Gruppe enthält, die sich in dem die Rezeptor-Einheit und den Nukleinsäureoligomer-Bestandteil verbindenden Molekülteil befindet.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Rezeptor-Einheit an einen verzweigten oder unverzweigten Molekülteil angebunden ist, der wenigstens eine -CHOH- CHOH-Gruppe, eine -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO-Gruppe, eine -S-S-Gruppe, eine -N=N-Gruppe oder Psoralen enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der verzweigte oder unverzweigte Molkülteil in dem die Rezeptor-Einheit und den Nukleinsäureoligomer-Bestandteil verbindenden Molekülteil eine Bindung zweier chemischer Substanzen enthält, wobei die beiden chemischen Substanzen zueinander spezifische Bindungspartner darstellen und die Bindung der beiden chemischen Substanzen der zueinander spezifischen Bindung der beiden chemischen Substanzen entspricht.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei als die beiden chemischen Substanzen jeweils zwei spezifische Bindungspartner ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin und monovalentes Avidin, Biotin und monovalentes Streptavidin, Biotin und Avidin, Biotin und Streptavidin, Chitin und Chitin-bindendes Protein, Antigen und Antikörper, Antigen und F_ab-Fragment des Antikörpers verwendet werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei als Antigen und Antikörper jeweils zwei spezifische Bindungspartner ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin und anti-Biotin-Antikörper, FITC und anti-FITC-Antikörper, DNP und anti-DNP- Antikörper, Digoxigenin und anti-Digoxigenin-Antikörper, Rhodamin und anti- Rhodamin-Antikörper, His-Tag und anti-His-Tag-Antikörper, HA-Tag und anti-HA- Tag-Antikörper, Flag-Tag und anti-Flag-Tag-Antikörper, GST-Tag und anti-GST- Tag-Antikörper verwendet werden.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die in Schritt c) verwendeten verschiedenen Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten keine zu mehr als 75% zueinander komplementären Nukleinsäureoligomere aufweisen.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit wenigstens eine beliebige Primer-Bindungsregion oder RNA-Polymerase- Bindungsregion umfasst.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit bis zu drei spezielle Regionen aufweist, wobei die bis zu drei Regionen beliebige Primer-Bindungsregionen, RNA- Polymerase-Bindungsregionen oder deren Kombinationen sind.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die in Schritt c) verwendeten verschiedenen Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten identische Primer-Bindungsregionen und/oder identische RNA-Polymerase- Bindungsregionen umfassen.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die jeweilige Primer- Bindungsregion das Kettenende des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit darstellt.

21. Verfahren zur Detektion von chemischen Substanzen umfassend die Schritte:

• a) eine oder mehrere chemische Substanzen werden bereitgestellt,
• b) eine oder mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 definiert werden bereitgestellt,
• c) die in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen werden mit den in Schritt b) bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt,
• d) die in Schritt c) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz werden an ein geeignetes Chromatographiematerial gebunden, wodurch eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt,
• e) eine oder mehrere chemische Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz werden so gespalten, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, von dem Chromatographiematerial getrennt wird,
• f) die von dem Chromatographiematerial getrennten Nukleinsäureoligomer- Bestandteile werden ausgewaschen und durch ein geeignetes Verfahren detektiert.

22. Verfahren zur Detektion von chemischen Substanzen umfassend die Schritte:

• a) eine oder mehrere chemische Substanzen werden bereitgestellt,
• b) definierte Mengen ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 definiert werden bereitgestellt,
• c) die in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen werden mit den in Schritt b) bereitgestellten definierten Mengen von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt,
• d) die in Schritt c) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz werden an ein geeignetes Chromatographiematerial gebunden, wodurch eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt,
• e) die im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten werden ausgewaschen und deren Nukleinsäureoligomer-Bestandteile werden direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren detektiert.

23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei als Chromatographiematerial ein Ionenaustauscher, eine RP-Säule oder eine Membran verwendet wird.

24. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Bindung in Schritt d) über an das Chromatographiematerial gebundene, für die zu detektierende chemische Substanz spezifische Bindungspartner, insbesondere über an das Chromatographiematerial gebundene, für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifische Antikörper, über an das Chromatographiematerial gebundene, für den Komplex aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz spezifische Bindungspartner, über an das Chromatographiematerial gebundene, für mehrere Arten von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz spezifische Bindungspartner oder deren Mischungen erfolgt.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei als für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifischer Antikörper, anti-IgA-Antikörper, anti-IgG-Antikörper, anti-IgM-Antikörper, anti-IgE-Antikörper, anti-IgD-Antikörper und deren Mischungen verwendet werden.

26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei als für mehrere Arten von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz spezifische Bindungspartner F_c-γ-Rezeptoren, Kompliment-C1_q und deren Mischungen verwendet werden.

27. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei vor Schritt d) der Schritt
Modifizieren jeder zu detektierenden chemischen Substanz mit jeweils einer zweiten chemischen Substanz
durchgeführt wird und das in Schritt d) verwendete Chromatographiematerial ein mit einer dritten chemischen Substanz modifiziertes Chromatographiematerial ist, wobei die dritte chemische Substanz einen spezifischen Bindungspartner für die zweite chemische Substanz darstellt.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei als zweite chemische Substanz eine oder mehrere Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin, Hapten, Antikörper, Antigen, His-Tag, HA-Tag, Flag-Tag, funktionelles Protein, chitinbindendes Protein, Avidin, Streptavidin, Protein A und Protein G verwendet wird und als dritte chemische Substanz ein oder mehrere Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Streptavidin, Avidin, Biotin, Protein A, Protein G und zu der zweiten chemischen Substanz spezifischer oder zu mehreren zweiten chemischen Substanzen gruppenspezifischer Bindungspartner oder Antikörper, insbesondere anti-Ig-Antikörper, verwendet wird.

29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei als Hapten ein Hapten-Analogon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FITC, DNP, Digoxigenin und Rhodamin verwendet wird und als zu dem Hapten-Analogon spezifischer Antikörper eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anti-FITC-Antikörper, anti-DNP- Antikörper, anti-Digoxigenin-Antikörper und anti-Rhodamin-Antikörper verwendet wird.

30. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei vor Schritt d) der Schritt
Modifizieren jeder zu detektierenden chemischen Substanz mit einem chemischen Crosslinker oder einem Photocrosslinker
oder der Schritt
Modifizieren des Chromatographiematerials mit einem chemischen Grosslinker oder einem Photocrosslinker
durchgeführt wird und die Bindung in Schritt d) durch Reaktion des chemischen Crosslinkers oder des Photocrosslinkers erfolgt.

31. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei nach Schritt c) der Schritt
die in Schritt c) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz werden mit ein oder mehreren Arten von Antikörpern und mit anti-Ig-Antikörpern in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung sekundärer Immunkomplexe bestehend aus ein oder mehreren Antikörpern und ein oder mehreren Komplexen aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt,
und als Schritt d) der Schritt
die sekundären Immunkomplexe werden an ein mit Protein A und/oder Protein G modifiziertes Chromatographiematerial gebunden, wodurch eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt
durchgeführt wird.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 21, 23 bis 31 soweit sie sich auf Anspruch 21 rückbeziehen, wobei in Schritt e) die Spaltung der einen oder der mehreren chemischen Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz durch Zugabe eines Oxidationsmittels, durch Zugabe eines Reduktionsmittels, durch Zugabe von Harnstoff, durch Zugabe eines Biotin-Antagonisten, durch Zugabe einer zur Spaltung einer Amid-Bindung geeigneten Säure oder durch Einstrahlung von Licht erfolgt.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Spaltung durch Zugabe eines zur Spaltung einer -S-S-Gruppe, zur Spaltung einer -CHOH-CHOH-Gruppe oder zur Spaltung einer -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO-Gruppe geeigneten Reduktions- oder Oxidationsmittels erfolgt, insbesondere durch Zugabe von NaIO₄, durch Zugabe von H₂N-OH, durch Zugabe von DTT oder durch Zugabe von β-Mercaptoethanol.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 33, wobei das Inkontaktbringen der in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen mit den in Schritt b) bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in Lösung erfolgt.

35. Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte:

• a) eine oder mehrere chemische Substanzen werden bereitgestellt,
• b) die in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen werden an ein Chromatographiematerial gebunden,
• c) ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 definiert werden bereitgestellt,
• d) die in Schritt c) bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten werden mit den in Schritt b) an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz und eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt,
• e) eine oder mehrere chemische Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz werden so gespalten, dass der Nukleinsäureoligomer- Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, von dem Chromatographiematerial getrennt wird,
• f) die von dem Chromatographiematerial getrennten Nukleinsäureoligomer- Bestandteile werden ausgewaschen und durch ein geeignetes Verfahren detektiert.

36. Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte:

• a) eine oder mehrere chemische Substanzen werden bereitgestellt,
• b) die in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen werden an ein Chromatographiematerial gebunden,
• c) definierte Mengen ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 definiert werden bereitgestellt,
• d) die in Schritt c) bereitgestellten definierten Mengen an Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten werden mit den in Schritt b) an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt,
• e) die im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten werden ausgewaschen und deren Nukleinsäureoligomer-Bestandteile werden direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor- Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren detektiert.

37. Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, wobei als Chromatographiematerial ein Ionenaustauscher, eine RP-Säule oder eine Membran verwendet wird.

38. Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, wobei die Bindung in Schritt b) über an das Chromatographiematerial gebundene, für die zu detektierende chemische Substanz spezifische Bindungspartner, insbesondere über an das Chromatographiematerial gebundene, für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifische Antikörper erfolgt.

39. Verfahren nach Anspruch 38, wobei als für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifischen Antikörper anti-Ig-Antikörper verwendet werden.

40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei als für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifischen Antikörper, anti-IgA-Antikörper, anti-IgG-Antikörper, anti-IgM-Antikörper, anti-IgE-Antikörper, anti-IgD-Antikörper und deren Mischungen verwendet werden.

41. Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, wobei vor Schritt b) der Schritt
Modifizieren jeder zu detektierenden chemischen Substanz mit jeweils einer zweiten chemischen Substanz
durchgeführt wird und das in Schritt b) verwendete Chromatographiematerial ein mit einer dritten chemischen Substanz modifiziertes Chromatographiematerial ist, wobei die dritte chemische Substanz einen spezifischen Bindungspartner für die zweite chemische Substanz darstellt.

42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei als zweite chemische Substanz eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin, Hapten, Antigen, His-Tag, HA-Tag, Flag-Tag, funktionelles Protein, chitinbindendes Protein, Avidin, Streptavidin, Protein A und Protein G verwendet wird und als dritte chemische Substanz ein oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Streptavidin, Avidin, Biotin, Protein A, Protein G und zu der zweiten chemischen Substanz spezifischer oder zu mehreren zweiten chemischen Substanzen gruppenspezifischer Antikörper verwendet wird.

43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei als Hapten ein Hapten-Analogon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FITC, DNP, Digoxigenin und Rhodamin verwendet wird und als zu dem Hapten-Analogon spezifischer Antikörper eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anti-FITC-Antikörper, anti-DNP- Antikörper, anti-Digoxigenin-Antikörper und anti-Rhodamin-Antikörper verwendet wird.

44. Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, wobei vor Schritt b) der Schritt
Modifizieren jeder zu detektierenden chemischen Substanz mit einem chemischen Crosslinker oder einem Photocrosslinker
oder der Schritt
Modifizieren des Chromatographiematerials mit einem chemischen Crosslinker oder einem Photocrosslinker
durchgeführt wird und die Bindung in Schritt b) durch Reaktion des chemischen Crosslinkers oder des Photocrosslinkers erfolgt.

45. Verfahren nach einem der Ansprüche 35, 37 bis 44 soweit sie sich auf Anspruch 35 rückbeziehen, wobei in Schritt e) die Spaltung der einen oder der mehreren chemischen Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz durch Zugabe eines Oxidationsmittels, durch Zugabe eines Reduktionsmittels, durch Zugabe von Harnstoff, durch Zugabe eines Biotin-Antagonisten, durch Zugabe einer zur Spaltung einer Amid-Bindung geeigneten Säure oder durch Einstrahlung von Licht erfolgt.

46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Spaltung durch Zugabe eines zur Spaltung einer -S-S-Gruppe, zur Spaltung einer -CHOH-CHOH-Gruppe oder zur Spaltung einer -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO-Gruppe geeigneten Reduktions- oder Oxidationsmittels erfolgt, insbesondere durch Zugabe von NaIO₄, durch Zugabe von H₂N-OH, durch Zugabe von DTT oder durch Zugabe von β-Mercaptoethanol.

47. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der einen oder den mehreren bereitgestellten chemischen Substanzen um ein oder mehrere Arten von Proteinen oder Antigenen handelt.

48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei es sich bei der einen oder den mehreren Arten von Proteinen um wenigstens eine Art von denaturiertem oder partiell denaturiertem Protein oder bei der einen oder den mehreren Arten von Antigenen um wenigstens eine Art von denaturiertem oder partiell denaturiertem Antigen handelt.

49. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 46, wobei es sich bei der einen oder den mehreren bereitgestellten chemischen Substanzen um ein oder mehrere Arten von Antikörpern oder Haptenen handelt.

50. Verfahren zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen chemischen Substanzen umfassend die Schritte:

• a) eine oder mehrere Arten unlöslicher chemischer Substanzen werden bereitgestellt,
• b) eine oder mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 definiert werden bereitgestellt,
• c) die in Schritt a) bereitgestellten unlöslichen chemischen Substanzen werden mit den in Schritt b) bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz erfolgt,
• d) die in Schritt c) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und unlöslicher chemischer Substanz werden abgetrennt,
• e) eine oder mehrere chemische Bindungen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz werden so gespalten, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers von der unlöslichen chemischen Substanz getrennt wird,
• f) die von der unlöslichen chemischen Substanz getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile werden abgetrennt und durch ein geeignetes Verfahren detektiert.

51. Verfahren nach Anspruch 50, wobei in Schritt e) die Spaltung der einen oder der mehreren chemischen Bindungen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischen Substanz durch Zugabe eines Oxidationsmittels, durch Zugabe eines Reduktionsmittels, durch Zugabe von Harnstoff, durch Zugabe eines Biotin-Antagonisten, durch Zugabe einer zur Spaltung einer Amid-Bindung geeigneten Säure oder durch Einstrahlung von Licht erfolgt.

52. Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Spaltung durch Zugabe eines zur Spaltung einer -S-S-Gruppe, zur Spaltung einer -CHOH-CHOH-Gruppe oder zur Spaltung einer -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO-Gruppe geeigneten Reduktions- oder Oxidationsmittels erfolgt, insbesondere durch Zugabe von NaIO₄, durch Zugabe von H₂N-OH, durch Zugabe von DTT oder durch Zugabe von β-Mercaptoethanol.

53. Verfahren nach einem der Ansprüche 50 bis 52, wobei es sich bei der einen oder den mehreren bereitgestellten unlöslichen chemischen Substanzen um ein oder mehrere Arten von unlöslichen Proteinen oder unlöslichen Antigenen handelt.

54. Verfahren nach Anspruch 53, wobei es sich bei der einen oder den mehreren Arten von unlöslichen Proteinen um wenigstens eine Art von denaturiertem oder partiell denaturiertem Protein oder bei der einen oder den mehreren Arten von unlöslichen Antigenen um wenigstens eine Art von denaturiertem oder partiell denaturiertem Antigen handelt.

55. Verfahren nach einem der Ansprüche 50 bis 52, wobei es sich bei der einen oder den mehreren bereitgestellten unlöslichen chemischen Substanzen um ein oder meherere Arten von Antikörpern oder Haptenen handelt.

56. Verfahren nach einem der Ansprüche 50 bis 55, wobei die Abtrennung in Schritt d) und/oder die Abtrennung in Schritt f) durch Zentrifugation, durch Filtration oder durch Size-Exclusion erfolgt.

57. Verfahren zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen chemischen Substanzen umfassend die Schritte:

• a) eine oder mehrere Arten unlöslicher chemischer Substanzen werden bereitgestellt,
• b) definierte Mengen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 definiert werden bereitgestellt,
• c) die in Schritt a) bereitgestellten unlöslichen chemischen Substanzen werden mit den in Schritt b) bereitgestellten definierten Mengen von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz erfolgt,
• d) die in Schritt c) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und unlöslicher chemischer Substanz werden abgetrennt,
• e) die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der von der unlöslichen chemischen Substanz getrennten, sich im Überstand befindenden Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten werden durch ein geeignetes Verfahren detektiert.

58. Verfahren nach Anspruch 57, wobei die Abtrennung in Schritt d) durch Zentrifugation, durch Filtration oder durch Size-Exclusion erfolgt.

59. Verfahren zur Detektion von Hapten-Analoga umfassend die Schritte:

• a) ein oder mehrere Hapten-Analoga werden bereitgestellt,
• b) ein Überschuss relativ zu den in Schritt a) bereitgestellten Hapten-Analoga von ein oder mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 definiert werden bereitgestellt,
• c) die in Schritt a) bereitgestellten Hapten-Analoga werden mit den in Schritt b) im Überschuss bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon erfolgt,
• d) die in Schritt a) bereitgestellten Hapten-Analoga werden in modifizierter Form bereitgestellt, wobei die Modifikation in der Anbindung eines Carrier-Moleküls an die Hapten-Analoga besteht, wobei an jede Art von Hapten-Analogon eine bestimmte Art von Carrier-Molekül gebunden wird, welches der Bedingung genügt, dass durch die Anbindung des Carrier-Moleküls keine signifikante Änderung der spezifischen Bindungsfähigkeit des Epitops der Hapten-Analoga erfolgt,
• e) die in Schritt d) bereitgestellten modifizierten Hapten-Analoga werden im Überschuss mit dem in Schritt c) gebildeten Gemisch aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und modifiziertem Hapten-Analogon erfolgt,
• f) die in Schritt e) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und modifiziertem Hapten-Analogon werden an ein geeignetes Chromatographiematerial gebunden, wodurch eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon erfolgt,
• g) die im Eluat verbleibenden Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und Hapten-Analogon werden ausgewaschen und deren Nukleinsäureoligomer-Bestandteile werden direkt als Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer- Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren detektiert.

60. Verfahren nach Anspruch 59, wobei die in Schritt d) bereitgestellten modifizierten Hapten-Analoga durch Anbindung einer Art von Carrier-Molekülen an mehrere Arten von Hapten-Analoga modifiziert sind.

61. Verfahren nach Anspruch 59 oder 60, wobei als Carrier-Moleküle beliebige Proteine oder Antigene verwendet werden.

62. Verfahren nach einem der Ansprüche 59 bis 61, wobei als Chromatographiematerial ein Ionenaustauscher, eine RP-Säule oder eine Membran verwendet wird.

63. Verfahren nach einem der Ansprüche 59 bis 61, wobei die Bindung in Schritt f) über an das Chromatographiematerial gebundene, für die mit Carrier-modifizierten Hapten-Analoga spezifische Bindungspartner, insbesondere über an das Chromatographiematerial gebundene, für die eine oder mehrere Arten von mit Carrier-modifizierten Hapten-Analoga spezifische Antikörper erfolgt.

64. Verfahren nach Anspruch 63, wobei als für die eine oder mehrere Arten von mit Carrier-modifizierten Hapten-Analoga spezifische Antikörper verwendet werden.

65. Verfahren nach einem der Ansprüche 59 bis 61, wobei vor Schritt f) der Schritt
Modifizieren des Carriers jedes zu detektierenden Hapten-Analogons mit jeweils einer chemischen Substanz
durchgeführt wird und das in Schritt f) verwendete Chromatographiematerial ein mit einer zweiten chemischen Substanz modifiziertes Chromatographiematerial ist, wobei die zweite chemische Substanz einen spezifischen Bindungspartner für die chemische Substanz darstellt.

66. Verfahren nach Anspruch 65, wobei als chemische Substanz eine oder mehrere Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin, Hapten, Antikörper, Antigen, His-Tag, HA-Tag, Flag-Tag, funktionelles Protein, chitinbindendes Protein, Avidin, Streptavidin, Protein A und Protein G verwendet wird und als dritte chemische Substanz ein oder mehrere Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Streptavidin, Avidin, Biotin und zu der chemischen Substanz spezifischer oder zu mehreren chemischen Substanzen gruppenspezifischer Bindungspartner oder Antikörper verwendet wird.

67. Verfahren nach Anspruch 66, wobei als Hapten eine zweite Art von Hapten- Analogon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FITC, DNP, Digoxigenin und Rhodamin verwendet wird und als zum zweiten Hapten-Analogon spezifischer Antikörper eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anti-FITC- Antikörper, anti-DNP-Antikörper, anti-Digoxigenin-Antikörper und anti-Rhodamin- Antikörper verwendet wird.

68. Verfahren nach Anspruch 59 oder 60, wobei vor Schritt f) der Schritt
Modifizieren des Carriers jedes zu detektierenden Hapten Analogons mit einem chemischen Crosslinker oder einem Photocrosslinker
oder der Schritt
Modifizieren des Chromatographiematerials mit einem chemischen Crosslinker oder einem Photocrosslinker
durchgeführt wird und die Bindung in Schritt f) durch Reaktion des chemischen Crosslinkers oder des erfolgt.

69. Verfahren nach einem der Ansprüche 59 bis 68, wobei das Inkontaktbringen der in Schritt a) bereitgestellten Hapten-Analoga mit den in Schritt b) bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in Lösung erfolgt.

70. Verfahren nach einem der Ansprüche 59 bis 69, wobei das Inkontaktbringen der in Schritt d) bereitgestellten modifizierten Hapten-Analoga mit dem in Schritt c) gebildeten Gemisch aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten und gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon in Lösung erfolgt.

71. Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte:

• a) eine oder mehrere chemische Substanzen werden bereitgestellt,
• b) ein Überschuss relativ zu den in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen von ein oder mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 definiert werden bereitgestellt,
• c) die in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen werden mit den in Schritt b) im Überschuss bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt,
• d) die in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen werden in modifizierter Form bereitgestellt, wobei die Modifikation in der Anbindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial besteht,
• e) das in Schritt c) gebildete Gemisch aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz werden mit den in Schritt d) an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen erfolgt,
• f) die im Eluat verbleibenden, in Schritt c) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz werden ausgewaschen und deren Nukleinsäureoligomer-Bestandteile werden direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren detektiert.

72. Verfahren nach Anspruch 71, wobei die Bindung in Schritt d) über an das Chromatographiematerial gebundene, für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifische Bindungspartner, insbesondere über an das Chromatographiematerial gebundene, für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifische Antikörper erfolgt.

73. Verfahren nach Anspruch 72, wobei als für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifische Antikörper anti-Ig-Antikörper verwendet werden.

74. Verfahren nach Anspruch 73, wobei als für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifische Antikörper, anti-IgA-Antikörper, anti-IgG-Antikörper, anti-IgM-Antikörper, anti-IgE-Antikörper, anti-IgD-Antikörper und deren Mischungen verwendet werden.

75. Verfahren nach Anspruch 71, wobei vor Schritt d) der Schritt
Modifizieren jeder zu detektierenden chemischen Substanz mit jeweils einer zweiten chemischen Substanz
durchgeführt wird und das in Schritt d) verwendete Chromatographiematerial ein mit einer dritten chemischen Substanz modifiziertes Chromatographiematerial ist, wobei die dritte chemische Substanz einen spezifischen Bindungspartner für die zweite chemische Substanz darstellt.

76. Verfahren nach Anspruch 75, wobei als zweite chemische Substanz eine oder mehrere Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin, Hapten, Antikörper, Antigen, His-Tag, HA-Tag, Flag-Tag, funktionelles Protein, chitinbindendes Protein, Avidin, Streptavidin, Protein A und Protein G verwendet wird und als dritte chemische Substanz ein oder mehrere Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Streptavidin, Avidin, Biotin und zu der zweiten chemischen Substanz spezifischer oder zu mehreren zweiten chemischen Substanzen gruppenspezifischer Bindungspartner oder Antikörper verwendet wird.

77. Verfahren nach Anspruch 76, wobei als Hapten ein Hapten Analogon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FITC, DNP, Digoxigenin und Rhodamin verwendet wird und als zu dem Hapten-Analogon spezifischer Antikörper eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anti-FITC-Antikörper, anti-DNP- Antikörper, anti-Digoxigenin-Antikörper und anti-Rhodamin-Antikörper verwendet wird.

78. Verfahren nach Anspruch 71, wobei die Modifikation in Schritt d) durch Reaktion eines chemischen Crosslinkers oder eines Photocrosslinkers erfolgt, wobei der chemische Crosslinker oder der Photocrosslinker vor Schritt d) durch den Schritt
Modifizieren der chemischen Substanzen mit einem chemischen Crosslinker oder einem Photocrosslinker
oder durch den Schritt
Modifizieren des Chromatographiematerials mit einem chemischen Crosslinker oder einem Photocrosslinker
an die chemischen Substanzen oder an das Chromatographiematerial gebunden wird.

79. Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte:

• a) ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 definiert werden bereitgestellt,
• b) relativ zu den in Schritt a) bereitgestellten ein oder mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wird ein Überschuss von ein oder mehreren chemischen Substanzen bereitgestellt,
• c) die in Schritt b) bereitgestellten chemischen Substanzen werden an ein Chromatographiematerial gebunden,
• d) die in Schritt a) bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten werden mit den in Schritt c) an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen in Kontakt gebracht, wodurch eine Bitdung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt,
• e) ein oder mehrere Arten von zweiten chemischen Substanzen werden bereitgestellt, wobei die zweiten chemischen Substanzen spezifisch an die in Schritt b) bereitgestellten chemischen Substanzen binden können,
• f) die in Schritt e) bereitgestellten ein oder mehreren Arten von zweiten chemischen Substanzen werden mit den in Schritt d) gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz in Kontakt gebracht, wobei durch die spezifische Bindung der zweiten chemischen Substanzen an die chemischen Substanzen zumindest ein Teil der in Schritt d) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz in die Bestandteile Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemische Substanz gespalten werden, wodurch die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in das Eluat freigesetzt werden,
• g) die in Schritt f) freigesetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten werden ausgewaschen und deren Nukleinsäureoligomer-Bestandteile werden direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren detektiert.

80. Verfahren nach Anspruch 79, wobei die Bindung in Schritt c) über an das Chromatographiematerial gebundene, für die zu detektierende chemische Substanz spezifische Bindungspartner, insbesondere über an das Chromatographiematerial gebundene, für die zu detektierenden eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifische Antikörper erfolgt.

81. Verfahren nach Anspruch 80, wobei als für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifischen Antikörper anti-Ig-Antikörper verwendet werden.

82. Verfahren nach Anspruch 81, wobei als für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifischen Antikörper, anti-IgA-Antikörper, anti-IgG-Antikörper, anti-IgM-Antikörper, anti-IgE-Antikörper, anti-IgD-Antikörper und deren Mischungen verwendet werden.

83. Verfahren nach Anspruch 79, wobei vor Schritt c) der Schritt
Modifizieren jeder zu detektierenden chemischen Substanz mit jeweils einer zweiten chemischen Substanz
durchgeführt wird und das in Schritt c) verwendete Chromatographiematerial ein mit einer dritten chemischen Substanz modifiziertes Chromatographiematerial ist, wobei die dritte chemische Substanz einen spezifischen Bindungspartner für die zweite chemische Substanz darstellt.

84. Verfahren nach Anspruch 83, wobei als zweite chemische Substanz eine oder mehrere Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin, Hapten, Antikörper, Antigen, His-Tag, HA-Tag, Flag-Tag, funktionelles Protein, chitinbindendes Protein, Avidin, Streptavidin, Protein A und Protein G verwendet wird und als dritte chemische Substanz ein oder mehrere Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Streptavidin, Avidin, Biotin, Protein A, Protein G und zu der zweiten chemischen Substanz spezifischer oder zu mehreren zweiten chemischen Substanzen gruppenspezifischer Bindungspartner oder Antikörper verwendet wird.

85. Verfahren nach Anspruch 84, wobei als Hapten ein Hapten-Analogon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FITC, DNP, Digoxigenin und Rhodamin verwendet wird und als zu dem Hapten-Analogon spezifischer Antikörper eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anti-FITC-Antikörper, anti-DNP- Antikörper, anti-Digoxigenin-Antikörper und anti-Rhodamin-Antikörper verwendet wird.

86. Verfahren nach Anspruch 79, wobei die Bindung in Schritt c) durch Reaktion eines chemischen Crosslinkers oder eines Photocrosslinkers erfolgt, wobei der chemische Crosslinker oder der Photocrosslinker vor Schritt c) durch den Schritt
Modifizieren der chemischen Substanzen mit einem chemischen Crosslinker oder einem Photocrosslinker
oder durch den Schritt
Modifizieren des Chromatographiematerials mit einem chemischen Crosslinker oder einem Photocrosslinker
an die chemischen Substanzen oder an das Chromatographiematerial gebunden wird.

87. Verfahren nach einem der Ansprüche 79 bis 86, wobei die Schritte f) und g) mehrmals durchgeführt werden und in Schritt f) steigende Konzentrationen an zweiten chemischen Substanzen verwendet werden.

88. Verfahren nach einem der Ansprüche 79 bis 87, wobei es sich bei den in Schrift b) bereitgestellten chemischen Substanzen um Rezeptorproteine oder Enzyme handelt.

89. Verfahren nach einem der Ansprüche 79 bis 88, wobei als Rezeptor-Einheit der in Schritt a) bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten Antagonisten für Bindungspartner von Rezeptorproteinen oder Enzymen verwendet werden.

90. Verfahren nach einem der Ansprüche 79 bis 89, wobei es sich bei den in Schritt e) bereitgestellten zweiten chemischen Substanzen um Bindungspartner von Rezeptorproteinen oder Enzymen handelt.

91. Verfahren nach einem der Ansprüche 79 bis 90, wobei nach der letzten Durchführung von Schritt g) die Schritte:

• a) eine oder mehrere chemische Bindungen der in Schritt d) an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz werden so gespalten, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, von dem Chromatographiematerial getrennt wird,
• b) die von dem Chromatographiematerial getrennten Nukleinsäureoligomer- Bestandteile werden ausgewaschen und durch ein geeignetes Verfahren detektiert

durchgeführt werden.

92. Verfahren nach Anspruch 91, wobei in Schritt h) die Spaltung der einen oder der mehreren chemischen Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz durch Zugabe eines Oxidationsmittels, durch Zugabe eines Reduktionsmittels, durch Zugabe von Harnstoff, durch Zugabe eines Biotin- Antagonisten, durch Zugabe einer zur Spaltung einer Amid-Bindung geeigneten Säure oder durch Einstrahlung von Licht erfolgt.

93. Verfahren nach Anspruch 92, wobei die Spaltung durch Zugabe eines zur Spaltung einer -S-S-Gruppe, zur Spaltung einer -CHOH-CHOH-Gruppe oder zur Spaltung einer -CO-O-CH₂-CH₂-O-CO-Gruppe geeigneten Reduktions- oder Oxidationsmittels erfolgt, insbesondere durch Zugabe von NaIO₄, durch Zugabe von H₂N-OH, durch Zugabe von DTT oder durch Zugabe von β-Mercaptoethanol.

94. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die eine oder mehreren Arten von bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Anbindung einer oder mehrerer gleicher oder unterschiedlicher funktioneller chemischer Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Farbstoff, insbesondere Fluoreszenzfarbstoff, redoxaktive Substanz, insbesondere Chinone und Übergangsmetallkomplexe, Biotin, Hapten, Antigen, Avidin und Streptavidin modifiziert ist und/oder zusätzlich durch ein Radiolabel, insbesondere durch ³⁵P, ³²S, ¹⁴C oder ³H modifiziert ist.

95. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 94, wobei vor einem beliebigen der nach dem Schritt
ein oder mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten werden bereitgestellt
durchgeführten Schritte der Schritt
Modifizieren der einen oder mehreren Arten bereitgestellter Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Anbindung einer oder mehrerer gleicher oder unterschiedlicher funktioneller chemischer Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Farbstoff, insbesondere Fluoreszenzfarbstoff, redoxaktive Substanz, insbesondere Chinone und Übergangsmetallkomplexe, Biotin, Hapten, Avidin und Streptavidin oder modifizieren der bereitgestellten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit durch Einführung eines Radiolabels, insbesondere durch Einführung von ³⁵P, ³²S, ¹⁴C oder ³H
durchgeführt wird.

96. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 95, wobei die Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile oder deren Amplifikate über die Hybridisierung an dazu komplementäre Nukleinsäureoligomere erfolgt.

97. Verfahren nach Anspruch 96, wobei die Detektion der Hybridisierungsereignisse elektrochemisch, durch optische Spektroskopie, durch Schwingungsspektroskopie, durch Totalreflexionsmethoden, durch Quarz-Crystal- Micro-Balance, durch Surface Plasmon Resonanz, durch Chemilumineszenz oder durch Radioaktivitätsmessung erfolgt.

98. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die elektrochemische Detektion amperometrisch, cyclovoltametrisch, impedanzspektroskopisch, oder potentiometrisch erfolgt.

99. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die Detektion mit Hilfe optischer Spektroskopie durch Absorptionsmessung oder durch Fluoreszenzmessung erfolgt.

100. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die Detektion mit Hilfe von Schwingungsspektroskopie durch IR-, durch Raman-, durch FTIR- oder durch FT- Raman-Spektroskopie erfolgt.

101. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die Detektion mit Hilfe von Totalreflexionsmethoden durch Attenuated total reflection erfolgt.

102. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 101, wobei eine oder mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 17 bis 20 definiert bereitgestellt werden und vor der Detektion der Nukleinsäureoligomer- Bestandteile der Schritt
Amplifizierung der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile mit Hilfe von DNA- und/oder RNA-Polymerase
durchgeführt wird.

103. Verfahren nach Anspruch 102, wobei vor dem Schritt
Amplifizierung der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile mit Hilfe von DNA- und/oder RNA-Polymerase
der Schritt
Zugabe einer definierten Menge eines Nukleinsäureoligomers, wobei das zugegebene Nukleinsäureoligomer den selben oder die selben Primer- Abschnitte wie die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile umfasst
durchgeführt wird.

104. Verfahren nach Anspruch 102 oder 103, wobei die Amplifizierung der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile durch eine Polymerase-Chain-Reaction (PCR) erfolgt.

105. Verfahren nach einem der Ansprüche 96 bis 104, wobei mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Bestandteilen gleichzeitig detektiert werden.

106. Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß den Ansprüchen 1 bis 105 umfassend eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 und 94 definiert.

107. Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß den Ansprüchen 1 bis 105 umfassend eine effektive Menge einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Bestandteilen wie in den Ansprüchen 7, 8, 9, 13, 14 und 15, sowie in den Ansprüchen 16 bis 20 soweit sie sich auf die Ansprüche 7, 8, 9, 13, 14 oder 15 rückbeziehen definiert, wobei der Kit weiterhin eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten mit einer chemischen Substanz modifizierten Rezeptor- Einheiten wie in den Ansprüchen 7, 8, 9, 13, 14 und 15, sowie in den Ansprüchen 16 bis 20 soweit sie sich auf die Ansprüche 7, 8, 9, 13, 14 oder 15 rückbeziehen definiert, umfasst, wobei die chemische Substanz, mit der die Rezeptor-Einheit modifiziert ist den spezifischen Bindungspartner der chemischen Substanz darstellt, mit der der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil modifiziert ist.

108. Kit zur Markierung chemischer Substanzen umfassend eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 und 94 definiert.

109. Kit zur Detektion chemischer Substanzen umfassend eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 und 94 definiert.

110. Kit zur Detektion von Proteinen oder Antigenen umfassend eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 und 94 definiert.

111. Kit zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen chemischen Substanzen, insbesondere unlöslichen Proteinen oder unlöslichen Antigenen umfassend eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 und 94 definiert.

112. Kit zur Detektion von Antikörpern umfassend eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 und 94 definiert.

113. Kit zur Detektion von Haptenen oder Hapten-Analoga umfassend eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 und 94 definiert.

114. Kit zur Detektion DNA- und/oder RNA-bindender Proteine umfassend eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 und 94 definiert.

115. Kit zur Detektion der Antagonisten von Enzymen oder der Antagonisten von Rezeptorproteinen oder der Antagonisten von DNA- und/oder RNA-bindenden Proteinen umfassend eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 und 94 definiert.

116. Kit nach einem der Ansprüche 106 bis 115, wobei der Kit zusätzlich Primer umfasst, insbesondere mit Rhodamin oder Fluorescein modifizierte Primer.

117. Kit nach einem der Ansprüche 106 bis 116, wobei der Kit zusätzlich die Nucleotid- Bausteine dCTP, dGTP, dATP und dTTP umfasst.

118. Kit nach einem der Ansprüche 106 bis 117, wobei der Kit zusätzlich wenigstens einen mit Rhodamin oder Fluorescin modifizierten Nucleotid-Baustein dCTP, dGTP, dATP oder dTTP umfasst.

119. Kit nach einem der Ansprüche 106 bis 118, wobei der Kit zusätzlich eine Gelfiltrationskartusche umfasst.

120. Kit nach einem der Ansprüche 106 bis 119, wobei als Rezeptor-Einheit der einen oder der mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten ein Antibiotin-F_ab-Fragment enthalten ist.

121. Kit zum Screenen von Hybridoma-Zellen umfassend eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 und 94 definiert.

122. Kit zum Screenen von Hybridoma-Zellen und gleichzeitigem Epitop-Mapping umfassend eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie in den Ansprüchen 1 bis 20 und 94 definiert.

123. Kit nach den Ansprüchen 121 oder 122, wobei der Kit zusätzlich eine mit Biotin belegte Chromatographiesäule umfasst.

124. Kit nach einem der Ansprüche 121 bis 123, wobei der Kit zusätzlich biotinylierte Peptide, Polypeptide oder Proteine umfasst.

125. Kit nach einem der Ansprüche 121 bis 124, wobei als Rezeptor-Einheit der einen oder der mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten ein Antibiotin-F_ab-Fragment enthalten ist.

126. Kit nach einem der Ansprüche 106 bis 125, wobei die eine oder mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten oder die effektive Menge derselben in einem Lösungsmittel gelöst vorliegen.

127. Kit nach Anspruch 126, wobei als Lösungsmittel ein Phosphat-Puffer verwendet wird.

128. Kit nach einem der Ansprüche 106 bis 127, wobei der Kit zusätzlich eine Chromatographiesäule umfasst.

129. Kit nach einem der Ansprüche 106 bis 128, wobei der Kit zusätzlich eine mit geeigneten Sondenoligonukleotid-Arten vorbelegte Dot-Plot-Membran zur Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten umfasst.