DE19959857C1

DE19959857C1 - Testsystem zum Nachweis von Analyten sowie ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE19959857C1
Application number: DE19959857A
Authority: DE
Inventors: Petra Burgstaller; Dirk Konz
Original assignee: Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Current assignee: Phylos Inc
Priority date: 1999-12-10
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2001-06-28
Anticipated expiration: 2019-12-11
Also published as: WO2001042494A3; AU1385901A; CA2393703A1; EP1240356A2; WO2001042494A2; JP2003528298A

Abstract

Die Erfindung betrifft einen in-vitro Assay zum empfindlichen und spezifischen direkten Nachweis von Analyten. Hierbei werden als Detektor-Amplifikator-System Polypeptid-Nukleinsäure-Konjugate vorteilhaft verwendet und deren Signal mittels PCR verstärkt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsytem sowie ein Verfahren zum simulta nen parallelen Nachweis verschiedener Analyten.

Im Bereich der biologischen und biomedizinischen Diagnostik wird zur Identifizie rung und Quantifizierung von Proteinen aber auch anderen Substanzklassen, wie Biopolymeren, organischen Verbindungen, Tumorzellen, Viren, Bakterien oder um weltbelastenden Stoffen, vornehmlich vorzugsweise das Prinzip der Antigen- Antikörper-Reaktion verwendet. Zur Sichtbarmachung der Immunreaktion, die an einem unlöslichen Träger erfolgt, werden Systeme eingesetzt, wobei die Amplifikati on des Signals beispielsweise durch Fluoreszenz, Lumineszenz, Radioaktivität (RIA), enzymatische Farbreaktionen (ELISA), oder elektronendichte Korpuskeln (z. B. kolloidales Gold) erfolgen kann. Dabei ist der Antikörper entweder direkt mit dem Amplifikator gekoppelt oder indirekt durch einen zweiten Antikörper, der gegen den Primärantikörper gerichtet und mit dem Amplifikator markiert ist. Solche immunolo gischen Nachweismethoden - sogenannte Immunoassays - können eine quantitative Aussage treffen, sofern einer der Reaktionspartner mit einer gut nachweisbaren Markierungssubstanz derart gekoppelt ist, daß die immunologischen Eigenschaften der Komponenten erhalten bleiben. Als besonders vorteilhaftes Kopplungssystem hat sich das Avidin/Biotin-System mit hoher Empfindlichkeit erwiesen (vgl z. B. Wil chek M., Bayer E. A. Avidin-Biotin Technology. Meth. Enzymol. V. 184. Academic Press, 1990).

Die Nachweisgrenze solcher immunologischer Verfahren liegt bei etwa 10^-18 Mol. Sano et al. gelang es, die Sensitivität immunologischer Verfahren durch Kombination mit der extrem empfindlichen Polymerase-Ketten-Reaktion (kurz: PCR), die die Detektion von bis zu 10^-22 Mol (5 × 10² Moleküle) erlaubt, stark zu erhöhen (U.S.5,665,539; Sano, T., Smith, C. L., Cantor, C. R., Science 1992, 258, 120-122). Bei der sogenannten Immuno-PCR werden zur Sichtbarmachung der Immunreaktion Antikörper eingesetzt, die mit einem DNA-Marker verknüpft sind. Durch PCR- Amplifizierung dieser DNA können noch Mengen von ca. 500 Molekülen erfaßt wer den, was einer mehr als 1000-fachen Steigerung der Nachweisgrenze der Standard- Proteinanalytik enstpricht (vgl. Schema Fig. 1A).

Ähnliche Verfahren werden in WO 98/22624 und WO 96/32640 beschrieben. In WO 98/22624 ist beschrieben, wie doppelsträngige cDNA, die einen RNA- Polymerase-Promotor umfaßt, unter Verwendung von Glutaraldehyd an einen Anti körper gebunden wird, der an ein spezifisches Epitop eines Proteins bindet. Nach Immobilisierung des Proteins an einer festen Unterlage kann durch RNA-Synthese mittels einer RNA-Polymerase Nachweis der RNA erfolgen und damit die Bindung des Antikörpers nachgewiesen werden.

In WO 96/32640 wird ein Verfahren beschrieben, bei dem DNA, die einen RNA- Polymerase-Promotor umfaßt, mittels des Avidin-Biotin- oder des Streptavidin-Biotin- Systems oder mittels Protein-A-Affinitätsbindung an einen Antikörper gebunden wird. Nach Bindung des so markierten Antikörpers an das Antigen kann durch RNA- Synthese mittels einer RNA-Polymerase und anschließenden Nachweis der RNA die Bindung des Antikörpers festgestellt werden.

In einer Reihe von Druckschriften konnte die Leistungsfähigkeit der Immuno-PCR im Hinblick auf analytische und biomedizinische/diagnostische Fragestellungen demon striert werden (Maia, M., Takahashi, H., Adler, K., Garlick, R. K., Wands, J. R., J. Vi rol. Methods 1996, 62, 273-286; Sann, P. P., Weiss, F., Samson, M. E., Bloom, F. E., Pich, E. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 272-275; Suzuki, A., Itoh, F., Hinoda, Y., Imai, K., J. Cancer Res. 1995, 86, 885-889; Sperl, J., Paliwal, V., Ra mabhadran, R., Nowak, B., Askenase, P. W., J. Immunol. Method. 1995, 186, 181-194; Niemeyer, C. M., Adler, M., Blohm, D., Anal. Biochem. 1997, 246, 140-145). In den genannten Beispielen erfolgte die Markierung der Antikörper mit DNA indirekt über Moleküle, die bifunktionell sowohl Antikörper als auch DNA binden. Sano et al. verwendet ein rekombinantes Fusionsprotein, bestehend aus einem Protein A- und Streptavidin-Anteil, das gleichzeitig den Fc-Teil des Antikörpers sowie biotinylierte DNA zu binden vermag. Der Einsatz eines solchen Fusionsproteines ist jedoch von Nachteil, wenn das zu analysierende Serum oder Gewebematerial IgG-haltige Be standteile enthält, da es unspezifisch an diese bindet. Als Alternative können die käuflich erwerbbaren Proteine Streptavidin und Avidin eingesetzt werden (Ruszicka, V., März, W., Russ, A., Gross, W., Science 1993, 260, 698; Zhou, H., Fisher, R. J., Papas, T. S., Nucleic Acids Res. 1993, 21, 6038-6039). Sie weisen jeweils vier Bin dungsstellen für Biotin auf, wodurch ein biotinylierter Antikörper mit biotinylierter DNA verknüpft wird. Allerdings muß das immobilisierte Antigen sukzessive mit einem biotinylierten Primärantikörper, Streptavidin und biotinyliertem DNA-Marker inkubiert werden, da es durch einfaches Mischen der Komponenten zu einem kom plexen Gemisch aller mögicher Kombinationen kommt. Darüber hinaus sind zahlrei che Waschschritte erforderlich, um überschüssige Komponenten zu entfernen und unspezifische Bindung zu verhindern. Steht kein biotinylierter Primärantikörper zur Verfügung, kann auch ein biotinylierter sekundärer Antikörper verwendet werden, wodurch sich die Komplexität des Assays jedoch weiter erhöht.

Es wurde nun überaschend gefunden, daß Polypeptid-Nukleinsäure-Konjugate, bei denen die Verknüpfung von Polypeptid und Nukleinsäure über Puromycin, Pu romycinderivate oder ein anderes Molekül, welches die Struktur von beladenen tRNAs nachahmt, erfolgt, besonders geeignet zum Nachweis von Analyten sind. Erfindungsgemäß liegt bevorzugt kovalente Kopplung des Amplifikators (= Nuklein säure) über einen der vorher genannten Linker an den Detektor (= ein spezifisch an den Analyten bindendes Protein oder Peptid) vor, wodurch vorteilhaft die Zahl der benötigten Inkubationsschritte und damit auch die Komplexität des Assays, im Ver gleich zur oben beschriebenen Immuno-PCR nach Sano, wesentlich reduziert wird. Darüber hinaus wird auf diese Weise der parallele Nachweis mehrerer Analyte gleichzeitig ermöglicht (Multiplexing).

Daher betrifft die Erfindung ein Testsystem, enthaltend:

a) mindestens einen immobilisierten Analyten auf einem unlöslichen Träger und
b) an den Analyten angepaßten Polypeptid-Detektor, wobei
c) der Polypeptid-Detektor über einen Linker an einen Amplifikator konjugiert ist, wobei es sich bei dem Linker um Puromycin, Puromycinderivate oder um ein an deres Molekül, welches die Struktur von beladenen tRNAs nachahmt, handelt.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein solches Testsystem zum direkten Nachweis von Analyten bereitzustellen samt Verfahren und Verwendung.

Im Sinne der Erfindung bedeutet Testsystem ein in-vitro-Assay mit high-throughput- Qualität, da ein sehr hoher Probendurchsatz erzielt wird. Eine hohe Empfindlichkeit und Sensitivität und auch Spezifizität wird erreicht.

Proteine oder Peptide, die die nachzuweisende Substanz (Analyt) mit hinreichender Affinität binden und daher detektieren, sind z. B. single-chain-Antikörper (scFv); natürliche Bindungspartner oder durch kombinatorische Selektionsmethoden er zeugte Binder, welche vorzugsweise mittels in-vitro-Translation unter Bereitstellung von Polypeptid-Nukleinsäure-Konjugaten hergestellt werden. Es wird hierbei aus drücklich auf die Offenbarung in WO 98/31700 verwiesen. Vorzugsweise in WO 98/31700 werden Proteine oder Peptide während der Translation kovalent mit der sie kodierenden RNA verknüpft und tragen so die genetische Information zu ihrer Synthese inhärent mit sich (Kopplung von Phänotyp und Genotyp). Um diese RNA- Protein-Konjugate zu erzeugen, wird vorzugsweise Puromycin, Puromycinderivate, oder ein anderes Molekül, welches die Struktur von beladenen tRNAs nachahmt, über einen Linker an die RNA gebunden. Sobald in der Translation das Ende der kodierenden Sequenz erreicht wird, besetzt Puromycin die A-site und wird mit dem neu synthetisierten Protein über eine Amidbindung verknüpft. Vergleichbare Tech niken, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, sind beispiels weise in DE 196 46 372 C1, WO 98/16636, WO 91/05058, U.S.5,843,701, WO 93/03172 oder WO 94/13623 für den Fachmann beschrieben. Das auf diese Weise hergestellte Protein oder Peptid (= Detektor) im Polypeptid-Nukleinsäure- Konjugat ermöglicht durch spezifische Bindung den Nachweis des Analyten, wobei im Konjugat die genetische Information des Detektors in Form von RNA vorliegt, dessen Information erfindungsgemäß vorzugsweise mittels Reverse-Transkriptase- PCR (kurz: RT-PCR) - unter Umwandlung in ein Signal - amplifiziert wird. Daher dient die konjugateigene RNA als Amplifikator (Signalverstärkung). Alternativ hierzu kann der RNA-Anteil des Konjugats bereits vor dem Einsatz in die Immuno-PCR revers transkribiert werden, so daß zur Amplifikation der Nukleinsäure ausschließ lich eine PCR erforderlich ist.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird mindestens ein Analyt zunächst an einen unlöslichen Träger (z. B. Kunststoff, Keramik, Metall, Gläser, kri stalline Materialien oder (bio)molekulare Filamente, wie Cellulose, Gerüstproteine) immobilisiert. Handelt es sich bei dem Analyten um ein Protein, erfolgt dies vor zugsweise direkt in Mikrotiterplatten aus Polystyrol, ein Material, das eine hohe, re produzierbare Protein-Adsorptionskapazität besitzt, oder beispielsweise an Materia lien, deren Oberflächen zur kovalenten Immobilisierung von Proteinen modifiziert wurde. In einer weiteren Ausführungsform kann der Analyt durch spezifisch binden de Capture-Antikörper immobilisiert werden (sog. Sandwich-Immuno-PCR). Nach Inkubation des Analyten mit dem Nukleinsäure-Protein-Konjugat und Entfernen von unspezifisch gebundenem Material wird die Nukleinsäure mittels RT-PCR bzw. PCR oder über andere geeignete Verfahren, z. B. Primer-Extension (vgl. Ruano, G, Lewis, M. E., Kouri, R. E., Anal. Biochem., 1993, 212, 1-6) oder SDA (Strand dis placement Amplification) (vgl. Walker, G. T., Little, M. C., Nadeau, J. G. and Shank, D. D., Proc. Natl. Acad. 1992, Sci 89, 392-396 und Walker, G. T., Fraiser, M. S., Schram, J. L., Little, M. C., Nadeau, J. G. and Malinowski, D. P., Nucleic Acids Res. 1992, 20, 1691-1696), amplifiziert. Der Nachweis der amplifizierten Produkte erfolgt entweder direkt im Reaktionsgefäß oder nach Auftrennung, z. B. mittels Gelelektro phorese. Zur Detektion werden entweder während der Amplifikation Markersubstan zen in die Nukleinsäure eingebaut, oder es erfolgt eine indirekte Markierung im An schluß an die Amplifikation, beispielsweise durch Hybridisierung von markierten Nukleinsäure-Sonden. Beispiele für Markierungsverfahren sind chemische, Enyzm-, Protein-, Hapten-, radioaktive Isotopen-, nicht-radioaktive Isotopen-, Chemilumines zenz- oder Fluoreszenzmarkierung.

In der herkömmlichen Immuno-PCR werden die Detektor-Antikörper indirekt durch biotin-bindende Moleküle, wie Streptavidin oder Protein-A/Streptavidin-Fusionen mit der biotinylierten DNA markiert. Diese Verfahren erfordern zahlreiche Inkubations schritte für die Addition von bis zu drei Reporter-Reagenzien und darüber hinaus eine große Anzahl an Waschschritten, um überschüssige und unspezifisch gebun dene Reagenzien zu entfernen. Durch die kovalente Verknüpfung der Nukleinsäure (= Amplifikator) mit dem Detektor wird die benötigte Anzahl an Inkubations- und Waschschritten und damit auch der Zeitaufwand und die Komplexität des Assays stark reduziert.

Darüber hinaus können im Gegensatz zur herkömmlichen Immuno-PCR mehrere Analyte gleichzeitig getestet werden. Die Entwicklung von Methoden zum parallelen Nachweis mehrerer Analyte in einer Probe wird aufgrund der Kosten- und Zeitredu zierung als ein wichtiges Ziel in der biomedizinischen Diagnostik eingestuft. Zudem wird auch der Bedarf zum Nachweis ganzer Gruppen von Analyten nicht nur in der klinischen Routine, sondern auch beispielsweise in der Umweltdiagnostik immer größer. Bisher wurden Multianalyt-Tests mittels Kombinationen von Radioisotopen (Morgan, C. R., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1966, 123, 230-233), Fluoreszenz- Markern (Kakabakos, S. E., Christopoulos, T. K., Diamandis, E. P., Clinical Chem. 1992, 38, 338-342), Chemilumineszenz-Markern (Yamamoto, K., Higashimoto, K., Minagawa, H., Okada, M., Kasahara, Y., Clinical Chem. 1991, 37, 1031) oder En zym-gelabelten Antikörpern (Kricka, L. J., Clinical Chem. 1992, 38, 327) durchge führt, wobei jedoch eine Überlappung der Signale verschiedener Marker und Unter schiede in der Signalintensität bei verschiedenen Analytkonzentrationen die Quanti fizierung und die Sensitivität stark beeinträchtigen. Dagegen sind Nukleinsäuren als Marker für Multianalyt-Assays ideal geeignet, da verschiedene DNA-Moleküle so wohl anhand ihrer Größe als auch anhand ihrer Sequenz genau und quantitativ voneinander unterschieden werden können, so daß durch den Gebrauch von Nu kleinsäuren eine beinahe unendliche Anzahl an Markierungen erstellt werden kann.

Für das erfindungsgemäße Testsystem und Verfahren kommen alle aktivierte Sun stanzen in Frage, insbesondere solche wie Diagnostika, Biopolymeren, biologische Domänen, wie Antigene und Haptene, Hormone, Pheromone, Sekundärmetabolite, Pharmaka, Opiate sowie auch nieder- bis makromolekulare, organische Verbindun gen (z. B. Herbizide oder Pestizide).

Beispiele

Im folgenden Beispiel wird der Nachweis eines immobilisierten Antikörpers gegen c- myc mit Hilfe eines Fusagens und anschließender PCR-Amplifikation beschrieben.

Ein 114-mer-DNA-Templat (5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCAAAAGCTTATTT CTGAAGAGGACTTGCTTAAGGGAAACTCACAGGAAGCTGTGTTAAAGTTGCAAG ACTGGGATGCACAAGCACCAAAAGCT-3'), das für die Aminosäuresequenz des c- myc-Epitopes codiert, wird mittels Festphasensynthese am Oligonukleotid- Synthesizer hergestellt und anschließend durch PCR mit 1 µM Primer 5'- TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACATTACAATGGTGAGCAAGGG CGAGGAG-3' und 5'-AGCTTTTGGTGCTTGTGCATC-3' sowie 0.02 U/µl Taq-Poly merase (Promega) in 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 50 mM KCl 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl₂ und 0.25 mM dNTPs amplifiziert. Dabei wird über den 5'-Primer eine T7- Promotoregion sowie ein Bereich aus der 5'-unstranslatierten Sequenz des Tabak mosaikvirus-Genoms als Initiationsstelle für die Translation eingeführt. Das doppelsträngige PCR-Produkt wird unter Verwendung des Megashortscript-Transcription- Kit (Ambion) nach Herstellerangaben in RNA umgeschrieben, die anschließend über Microspin-Sephadex-G25-Säulen (Pharmacia) gereinigt wird. Zur Ligation des Puromycin-Linkers wird 1 nmol RNA mit 1 nmol Linker (5'-A₂₇CC-Puromycin-3') und 1 nmol Splint (5'-TTTTTTTTTTNAGCTTTTGGTGCTTG-3') versetzt und 3 min. bei 95°C denaturiert. Nach Zugabe des 10 × Ligationspuffers (300 mM Tris-HCl pH 7.8, 100 mM MgCl₂, 100 mM DTT, 10 mM ATP) und 15-minütigem Annealing bei Raumtemperatur erfolgt die Ligation für 4 h bei Raumtemperatur. Die ligierte RNA wird von unligierter RNA über ein denaturierendes Polyacrylamidgel abgetrennt und in 0.3 M NaOAc pH 5.2 über Nacht aus dem Gel eluiert. 50 pmol RNA werden unter Verwendung des Retic-Lysate-In-Vitro-Translation-Kits (Ambion) zur Erzeugung des Peptid-RNA-Konjugates eingesetzt. Die Reinigung erfolgt anschließend über oligo-dT-Cellulose. Dazu wird der Translationsansatz mit 100 µl oligo-dT-Cellulo se (Pharmacia) in 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 1 M NaCl und 0.25% Triton X-100 1 h bei 4°C inkubiert und anschließend gebundenes Fusions produkt mit ddH₂O eluiert. Zur cDNA-Synthese werden die RNA-Peptid-Konjugate mit einem 5-fachen Überschuß an Splint versetzt. Die reverse Transkription erfolgt mit 0.007 U/µl Superscript-II-Reverse-Transcriptase (Gibco BRL) in 25 mM Tris-HCl pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 0.5 mM dNTPs.

Abnehmende Mengen des monoklonalen Antikörpers 9E10 gegen c-myc (Chemi con) werden zur Immobilisierung in 50 µl PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM NaH₂PO₄, 2 mM Na₂HPO₄) über Nacht bei Raumtemperatur in Top-Yield Reakti onsgefäßen (Nunc) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit je 200 µl PBS werden überschüssige Bindestellen mit je 200 µl 4.5% Magermilchpulver, 0.1 mM EDTA pH 8.0, 1 mg/ml salmon-sperm-DNA und 0.2% Natriumazid für 1 h bei Raumtemperatur geblockt. Nach dreimaligem Waschen mit je 200 µl TEPBS (0,05% (v/v) Tween-20, 100 mM EDTA, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM NaH₂PO₄, 2 mM Na₂HPO₄) wer den die Proben mit je 1 × 10^-15 mol myc-Fusagen in 50 µl TEPBS 1 h bei Raumtem peratur inkubiert. Nachdem erneut dreimal mit je 200 µl TEPBS gewaschen wurde, erfolgt die PCR-Amplifikation in 50 µl Reaktionsvolumen mit 1 µM Primer 5'- TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACATTACAATGGTGAGCAAGGG CGAGGAG-3' und 5'-AGCTTTTGGTGCTTGTGCATC-3' sowie 0.02 U/µl Taq Poly merase (Promega) in 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 50 mM KCl 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl₂ und 0.25 mM dNTPs für 30 Zyklen (1 min 95°C, 1 min 55°C, 1 min 72°C). Die Proben werden auf einem 2%-igen Agarosegel analysiert.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1A zeigt das Prinzip der Immuno-PCR.

Fig. 1B zeigt das erfindungsgemäße Prinzip.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Testsystem enthaltend:

a) mindestens einen immobilisierten Analyten auf einem unlöslichen Träger und
b) an den Analyten angepaßten Polypeptid-Detektor, wobei
c) der Polypeptid-Detektor über ein Puromycin, Puromycinderivate oder eine bin dende modifizierte t-RNA an einen Amplifikator konjugiert ist.

2. Testsytem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß c) ein Polypeptid- Nukleinsäure-Konjugat ist.

3. Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Amplifi kator eine RNA ist, wobei das Signal mittels PCR verstärkt wird.

4. Testsystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der PCR um ein RT-PCR-Verfahren, das Primer-Extension-Verfahren oder die Strand-dis placement-Amplification handelt.

5. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt ausge wählt ist aus Diagnostika; Biopolymeren, biologische Domänen, wie Antigene und Haptene, Hormone, Pheromone, Sekundärmetabolite, Pharmaka, Opiate sowie auch nieder- bis makromolekulare organische Verbindungen (z. B. Herbi zide oder Pestizide).

6. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt ein Anti gen ist und der Polypeptid-Detektor ein Antikörper, vorzugsweise ein single-chain- Antikörper ist.

7. Verfahren zum Nachweis von Analyten, dadurch gekennzeichnet, daß:

a) mindestens ein Analyt an einem unlöslichen Träger immobilisiert wird und
b) an einen angepaßten Polypeptid-Detektor, welcher über Puromycin, Puromycin derivate oder eine bindende modifizierte t-RNA an einen Amplifikator konjugiert ist, bindet, und
c) nach Waschen
d) mittels PCR eine Amplifikation des Signals erfolgt.

8. Verwendung von Polypeptid-Nukleinsäure-Konjugaten, die über Puromycin, Pu romycinderivate oder eine bindende modifizierte t-RNA miteinander konjugiert sind, zum parallelen Nachweis verschiedener Analyten.