JP2003528298A

JP2003528298A - 分析物を検出するためのアッセイシステムおよびその調整方法およびその使用

Info

Publication number: JP2003528298A
Application number: JP2001544366A
Authority: JP
Inventors: ブルクシュタラー，ペトラ; コンツ，ディルク
Original assignee: ファイロス・インコーポレーテッド
Priority date: 1999-12-10
Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2003-09-24
Also published as: WO2001042494A2; CA2393703A1; EP1240356A2; AU1385901A; WO2001042494A3; DE19959857C1

Abstract

(57)【要約】本発明は分析物の高感度で、特異的な直接検出を行うためのｉｎｖｉｔｒｏアッセイに関する。本発明においてポリペプチド核酸コンジュゲートを都合よく検出体‐増幅体系として使用し、これらコンジュゲートのシグナルをＰＣＲにより増幅する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は各種分析物の同時並行検出のためのアッセイシステムおよび方法に関
する。

【０００２】生物学的および生体医学的診断薬の分野において、タンパク質だけでなく、生
体ポリマー、有機化合物、腫瘍細胞、ウイルス、バクテリアまたは環境に関連す
る物質のような他の物質クラスは、主にそして好ましくは抗原‐抗体反応の原理
を使用することにより同定され且つ定量される。不溶性支持体上で起こる免疫反
応は、例えば、蛍光、ルミネセンス、放射能（ＲＩＡ）、酵素的呈色反応（ＥＬ
ＩＳＡ）、または電子濃密粒子（例えば、金コロイド）によりシグナルを増幅す
ることができる系を使用することにより可視化される。その抗体は、第２抗体を
介して増幅体に直接的にまたは間接的にカップリングするもので、その第２抗体
は、第１抗体に対して向けられ、そして、その増幅体で標識される。そのような
免疫学的検出方法、“イムノアッセイ”は、反応パートナーの一方がたやすく検
出できる標識物質に結合し、その結合成分の免疫学的性質が保持される限り、定
量的であると述べることができる。感受性の高いアビジン／ビオチン系はとりわ
け好都合なカップリング系であることが証明されてきた（例えば、Ｗｉｌｃｈｅ
ｋＭ．，ＢａｙｅｒＥ．Ａ．Ａｖｉｄｉｎ‐ＢｉｏｔｉｎＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８４巻，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
，１９９０を参照されたい）。

【０００３】そのような免疫学的方法の検出限界は約１０^-18ｍｏｌである。Ｓａｎｏらは
非常に感度の高いポリメラーゼ連鎖反応（略してＰＣＲ）と組み合わせることに
より、１０^-22ｍｏｌ（５ｘ１０²分子）まで検出が可能になるように免疫学的方
法の感度を非常に高めることに成功した（米国特許第５，６６５，５３９号；Ｓ
ａｎｏ，Ｔ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｌ．，Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ１９９２，２５８，１２０−１２２）。“イムノ‐ＰＣＲ”は免疫反応を可
視化するためにＤＮＡマーカーに連結した抗体を使用する。前記ＤＮＡのＰＣＲ
増幅は、約５００分子でさえ検出を可能にし、これは標準タンパク質分析の検出
限界の１０００倍以上に相当する（図１Ａの図を参照されたい）。

【０００４】分析的並びに生体医学的／診断的問題に関するイムノ‐ＰＣＲの能力は多数の
出版物で証明された（Ｍａｉａ，Ｍ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．，Ａｄｌｅｒ
，Ｋ．，Ｇａｒｌｉｃｋ，Ｒ．Ｋ．，Ｗａｎｄｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ１９９６，６２，２７３−２８６；Ｓａｎｎ，Ｐ．Ｐ．，Ｗｅ
ｉｓｓ，Ｆ．，Ｓａｍｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｂｌｏｏｍ，Ｆ．Ｅ．，Ｐｉｃｈ，Ｅ
．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９５，９２，２
７２−２７５；Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ．，Ｉｔｏｈ，Ｆ．，Ｈｉｎｏｄａ，Ｙ．，Ｉ
ｍａｉ，Ｋ．，Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９９５，８６，８８５−８８９；
Ｓｐｅｒｌ，Ｊ．Ｐａｌｉｗａｌ，Ｖ．，Ｒａｍａｂｈａｄｒａｎ、Ｒ．，Ｎｏ
ｗａｋ，Ｂ．，Ａｓｋｅｎａｓｅ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏ
ｄ．１９９５，１８６，１８１−１９４；Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｍ．，１９９
７，２４６，１４０−１４５）。前記の例では、抗体は、その抗体およびＤＮＡ
の両方に二官能基的に結合する分子を介して間接的にＤＮＡに標識された。Ｓａ
ｎｏらは、抗体のＦｃ部分とビオチン化ＤＮＡに同時に結合することができる、
タンパク質Ａ部分およびストレプトアビジン部分を含む組換え混成（フュージョ
ン）タンパク質を使用する。しかし分析される血清または組織材料がＩｇＧ含有
成分を含むとき、そのような融合タンパク質の使用は不都合である。なぜなら、
その材料は前記成分に非特異的に結合するからである。他のやり方として、市販
のタンパク質、ストレプトアビジン、およびアビジンを使用することができる（
Ｒｕｓｚｉｃｋａ，Ｖ、Ｍaｒｚ，Ｗ．，Ｒｕｓｓ，Ａ．，Ｇｒｏｓｓ、Ｗ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９３，２６０，６９８；Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ
Ｒ．Ｊ．，Ｐａｐａｓ，Ｔ．Ｓ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１
９９３，２１，６０３８−６０３９）。それらはいずれもビオチンに対し４つの
結合部位を有し、それによりビオチン化抗体はビオチン化ＤＮＡに連結される。
しかし、それら成分の単に混合すると全種類の可能な組合せの複雑な混合物にな
るため、固定された抗体は、ビオチン化第１抗体、ストレプトアビジンおよびビ
オチン化ＤＮＡマーカーと一緒に連続的にインキュベートしなければならない。
さらに、過剰な成分を除去し、非特異的な結合を防ぐために多くの洗浄ステップ
が必要である。もしビオチン化第１抗体が使用できない場合は、ビオチン化第２
抗体も使用できるが、このことはアッセイをさらに複雑化させる。

【０００５】驚くべきことに、この度、ポリペプチド‐核酸コンジュゲートが分析物の検出
に特に適することが見いだされた。ここでは、増幅体（＝核酸）は、リンカーを
介して検出体（特異的に分析物に結合するタンパク質またはペプチド）に直接的
にカップリングし、それによって、必要とされるインキュベーション工程の数を
有利に且つ実質的に減少させ、こうして、そのアッセイの複雑さをも減少させる
。加えて、この方法では、複数の分析物の同時での並行的検出が可能になる（マ
ルチプレキシング（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ））。

【０００６】したがって、本発明は、（ａ）不溶支持体上に固定される少なくとも１種の分析物、および（ｂ）前記分析物に適合するポリペプチド検出体であって、（ｃ）リンカーを介して増幅体にコンジュゲートしている前記ポリペプチド検出
体を含んでなるアッセイシステムに関する。

【０００７】したがって、本発明の目的は、分析物の直接的検出のためのそのようなアッセ
イシステムと共に、それらの方法および使用を提供することである。本発明によれば、非常に高い試料処理量が達せられることから、アッセイシス
テムとは、高処理能力を有するｉｎｖｉｔｒｏアッセイを意味する。高い感度
と高い特異性も得られる。

【０００８】検出される物質（分析物）に十分な親和性で結合してそれを検出するタンパク
質またはペプチドは、例えば、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、天然の結合性パートナ
ーまたは組合せ選択法により得られる結合体であり、それらは、好ましくは、ポ
リペプチド核酸コンジュゲートの提供でｉｎｖｉｔｒｏ翻訳により調製される
。これに関連して、明らかにＷＯ９８／３１７００における開示が参考にされる
。ＷＯ９８／３１７００では、好ましくは、タンパク質またはペプチドは、翻訳
に際して、それらをコードし且つそれらの合成のための遺伝的情報を生来的に運
ぶＲＮＡに共有結合している（表現型および遺伝型のカップリング）。前記ＲＮ
Ａ‐タンパク質コンジュゲートを生成するために、好ましくはピューロマイシン
、ピューロマイシン誘導体、または荷重ｔＲＮＡの構造に似ている他の分子が、
リンカーを介してＲＮＡに結合する。翻訳がコーディング配列の末端に到達する
とすぐに、ピューロマイシンはＡ部位を占有し、新規に合成されたタンパク質に
アミド結合により連結する。本発明に使用できる類似する技術は、例えば、ＤＥ
１９６４６３７２Ｃ１、ＷＯ９８／１６６３６、ＷＯ９１／０５０５８、米国特
許第５，８４３，７０１号、ＷＯ９３／０３１７２、またはＷＯ９４／１３６２
３中において当業者に示されている。このようにして調製されたポリペプチド‐
核酸コンジュゲート中のタンパク質またはペプチド（＝検出体）は、分析物の特
異的結合性検出を介して、検出体の遺伝子情報をＲＮＡの形でそのコンジュゲー
ト中に存在させることを可能にし、その情報が本発明により、好ましくは逆転写
酵素ＰＣＲ（略してＲＴＰＣＲ）によりシグナルへの変換で増幅される。した
がって、コンジュゲートのＲＮＡは増幅体（シグナル増幅）として働く。あるい
は、これに変わるやり方では、核酸の増幅が１ＰＣＲだけを必要とするように、
イムノＰＣＲで使用する前までにコンジュゲートのＲＮＡ部分を逆転写すること
が可能である。

【０００９】本発明の方法は少なくとも１分析物をはじめに不溶性支持体（例えばプラスチ
ック、セラミック、金属、ガラス、結晶質材料またはセルロース、構造タンパク
質のような（生体）分子フィラメント）に固定化することにより行われる。もし
分析物がタンパク質の場合、前記固定化は好ましくは、高い再現性のあるタンパ
ク質吸着能を有する材料であるポリスチレンからなるマイクロタイタープレート
中、または例えば、タンパク質の共有結合による固定化のため表面が修飾されて
いる材料上で直接行われる。別の態様において、分析物は特異的捕捉抗体により
固定化されてもよい（サンドッチイムノＰＣＲ）。分析物を核酸‐タンパク質コ
ンジュゲートと一緒にインキュベートし、非特異的結合材料を除去した後、核酸
はＲＴＰＣＲもしくはＰＣＲまたは他の適切な方法、例えばプライマー伸長法
（Ｒｕａｎｏ、Ｇ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．Ｅ．，Ｋｏｕｒｉ，Ｒ．Ｅ．，Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１２，１−６参照）またはＳＤＡ（鎖ディス
プレイスメント（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）増幅）（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．
，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｎａｄｅａｕ，Ｊ．Ｇ．，ａｎｄＳｈａｎｋ，Ｄ
．Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．１９９２，Ｓｃｉ８９，３９２−３
９６ａｎｄＷａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．，Ｆｒａｉｓｅｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｃｈｒ
ａｍ，Ｊ．Ｌ．，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｎａｄｅａｕ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄＭ
ａｌｉｎｏｗｓｋｉ，Ｄ，Ｐ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９
２，２０，１６９１−１６９６参照）により増幅される。増幅された産物は反応
容器中で直接、または、例えばゲル電気泳動によって分画後のいずれかで検出さ
れる。検出のために、マーカー物質を増幅中核酸に取り込ませるか、または例え
ば標識核酸プローブをハイブリダイズすることにより、増幅後に間接的標識を行
う。標識方法の例としては化学的、酵素、タンパク質、ハプテン、放射性同位体
、非放射性同位体、化学ルミネセンスおよび蛍光標識が挙げられる。

【００１０】従来のイムノＰＣＲでは、検出体抗体はストレプトアビジンまたはタンパク質
Ａ／ストレプトアビジン融合体のようなビオチン結合分子によるビオチン化ＤＮ
Ａにより間接的に標識される。これらの方法は３種のレポーター試薬添加までの
多くのインキュベーションステップ、そしてさらに過剰の非特異的結合試薬を除
去するための非常に多くの洗浄ステップを必要とする。検出体への核酸（＝増幅
体）の共有結合は、必要とするインキュベーションおよび洗浄ステップの数、そ
してアッセイの所要時間および複雑さを著しく減少させる。

【００１１】さらに、慣用のイムノＰＣＲと対照的に、多数の分析物を同時にアッセイする
ことが可能である。１試料中の多数の分析物の並行検出のための方法の開発は、
費用および時間が軽減されるため、生体医学的診断法における重要な目的とみな
される。さらに、分析物の全グループを検出するための必要性は、臨床業務にお
いてだけでなく、例えば環境診断法においても着実に増大している。現在まで、
多分析物アッセイは放射性同位体（Ｍｏｒｇａｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ
．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９６６，１２３，２３０−２３３）、蛍光マー
カー（Ｋａｒａｂａｋｏｓ，Ｓ．Ｅ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、Ｔ．Ｋ．
Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍ．１９９２，３８
，３３８−３４２）、化学ルミネセンスマーカー（Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｋ．，Ｈ
ｉｇａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｍｉｎａｇａｗａ，Ｈ．，Ｏｋａｄａ，Ｍ．，Ｋ
ａｓａｈａｒａ，Ｙ．，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍ．１９９１，３７，１０３
１）または酵素標識抗体（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．，ＣｌｉＣｈｅｍ．１９９
２，３８，３２７）の組合せにより行われてきたが、各種マーカーシグナルの重
複および各種分析物濃度におけるシグナル強度の差が定量および感度を非常に悪
くする。対照的に、核酸は多分析物アッセイのマーカーとして理想的に好都合で
ある。なぜなら、各種ＤＮＡ分子をそれらのサイズを基準にしても配列を基準に
しても、ともに正確にそして定量的に互いに区別することが可能なので、核酸を
使用するとほとんど制限のない数の標識を産生することができるからである。

【００１２】すべての活性化された物質、とりわけ診断薬、バイオポリマー、抗原およびハ
プテンのような生物学的ドメイン、ホルモン、サイトカイン、フェロモン、二次
代謝産物、医薬品、オピエート、核酸さらに低分子量から高分子までの有機化合
物（除草剤または殺虫剤）のような物質は、本発明のアッセイシステム、および
方法に適している。

【００１３】実施例：以下の実施例はfusa遺伝子（ｆｕｓａｇｅｎｅ）とその後のＰＣＲ増幅の補助
での、ｃ−ｍｙｃに対する固定化抗体の検出について記載する。ｃ−ｍｙｃエピ
トープのアミノ酸配列をコードする１１４マーＤＮＡ鋳型

【００１４】

【化１】

【００１５】はオリゴヌクレオチドシンセサイザーで固相合成により調製され、その後１μＭ
プライマー

【００１６】

【化２】

【００１７】ならびに１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９．０中の０．０２Ｕ／μｌＴａ
ｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５０ｍＭＫＣｌ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２．５ｍＭＭｇＣｌ₂および０．２５ｍＭｄＮＴＰｓを使用
したＰＣＲにより増幅される。５′プライマーは転写開始部位として、Ｔ７プロ
モーター領域およびタバコモザイクウイルスゲノムの非翻訳配列由来の領域を導
入する。２本鎖ＰＣＲ産物は取り扱い説明書に従ってＭｅｇａｓｈｏｒｔｓｃｒ
ｉｐｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用すること
によりＲＮＡに転写され、前記ＲＮＡはその後ＭｉｃｒｏｓｐｉｎＳｅｐｈａ
ｄｅｘＧ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製される。ピューロマイ
シンリンカーは、１ｎｍｏｌリンカー（５′−Ａ₂₇ＣＣ−ピューロマイシン−
３′）および１ｎｍｏｌ副片配列（ｓｐｒｉｎｔ）（５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＮＡＧＣＴＴＴＴＧＧＴＧＣＴＴＧ−３′）を１ｎｍｏｌＲＮＡに添加し、
そして混合物を９５℃で３分間変性させることにより連結させる。１０ｘライゲ
ーションバッファー（３００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．８、１００ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭＡＴＰ）を添加し、室温で１５
分間アニーリングを行い、続いて室温で４時間ライゲーションさせる。その連結
されたＲＮＡを変性ポリアクリルアミドゲルにより非連結ＲＮＡから分離し、０
．３ＭＮａＯＡｃｐＨ５．２中で一晩、ゲルから溶出させた。Ｒｅｔｉｃ
Ｌｙｓａｔｅｉｎｖｉｔｒｏ翻訳キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してペプ
チド‐核酸コンジュゲートを生成するために５０ｐｍｏｌＲＮＡを使用する。
この後オリゴ−ｄＴセルロースにより精製を行う。この目的のために、翻訳混合
物を１００μｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１０ｍＭＥＤ
ＴＡｐＨ８．０、１ＭＮａＣｌおよび０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中
のオリゴ−ｄＴセルロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により４℃で１時間インキュ
ベートし、続いて結合した混成産物をｄｄＨ₂Ｏで溶出させる。ｃＤＮＡはＲＮ
Ａペプチドコンジュゲートに５倍の過剰な副片配列を添加することにより合成す
る。逆転写は、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３、７５ｍＭＫＣｌ、
３ｍＭＭｇＣｌ₂，１０ｍｍＤＴＴおよび０．５ｍＭｄＮＴＰｓ中の０．
００７Ｕ／μｌＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ
）を使用して行われる。

【００１８】減少させる量のｃ−ｍｙｃ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対するモノクローナル抗体
９Ｅ１０を５０μｌＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ，２．７ｍＭＫＣｌ、８
ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、２ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄）で固定化するためにＴｏｐＹｉ
ｅｌｄ□反応容器（Ｎｕｎｃ）中、室温で一晩インキュベートする。それぞれ２
００μｌのＰＢＳで３回洗浄後、過剰の結合部位をそれぞれ２００μｌの４．５
％スキムミルク粉末、０．１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０，１ｍｇ／ｍｌサケ
精子ＤＮＡおよび０．２％アジ化ナトリウムにより室温で１時間阻害する。そ
れぞれ２００μｌのＴＥＰＢＳ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０，１０
０ｍＭＥＤＴＡ、１３７ｍＭＮａＣｌ，２．７ｍＭＫＣｌ、８ｍＭＮａ
Ｈ₂ＰＯ４、２ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄）で３回洗浄後、試料を室温で１時間、ＴＥ
ＰＢＳ５０μｌ中の１ｘ１０^-15ｍｏｌｍｙｃフサ遺伝子とともにインキ
ュベートする。それぞれ２００μｌのＴＥＰＢＳで再び３回洗浄後、ＰＣＲ増幅
は１μＭプライマー

【００１９】

【化３】

【００２０】および１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９．０、５０ｍＭＫＣｌ０．１％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２．５ｍＭＭｇＣｌ₂および０．２５ｍＭｄＮ
ＴＰｓ中の０．０２Ｕ／μｌＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し
て３０サイクル（１分間９５℃、１分間５５℃、１分間７２℃）行われる
。試料は２％強度のアガロースゲル上で分析する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１ＡはイムノＰＣＲの原理を示す。図１Ｂは本発明の原理を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA11 HA12 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ43 QR08 QR42 QR56 QS25 QS33 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）不溶性支持体上に固定される少なくとも１種の分析物、および（ｂ）前記分析物に適合するポリペプチド検出体であって、（ｃ）リンカーを介して増幅体にコンジュゲートしている前記ポリペプチド検出
体を含んでなるアッセイシステム。
【請求項２】（ｃ）のポリペプチド検出体が、ポリペプチド‐核酸コンジュ
ゲートである、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項３】該リンカーが、ピューロマイシン、ピューロマイシン誘導体、
または結合する修飾ｔ−ＲＮＡである、請求項１または２に記載のアッセイシス
テム。
【請求項４】体増幅体がＲＮＡであり、そして、そのシグナルがＰＣＲによ
って増幅されることに特徴付けられる、請求項１〜３のいずれかに記載のアッセ
イシステム。
【請求項５】ＲＴＰＣＲ法、またはプライマー伸長法、または鎖置換（ｃ
ｈａｉｎｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）増幅のような、請求項４に記載のＰＣＲ
。
【請求項６】該分析物が、診断物、生体ポリマー、抗原とハプテンのような
生物学的ドメイン、ホルモン、サイトカイン、フェロモン、二次代謝産物、医薬
品、オピエート、核酸、及び低分子量から高分子までの有機化合物（例えば、除
草剤または殺虫剤）からなる群から選択されることに特徴付けられる、請求項１
に記載のアッセイシステム。
【請求項７】該分析物が抗原であり、そして、該ポリペプチド検出体が抗体
、好ましくは１本鎖抗体であることに特徴付けられる、請求項１に記載のアッセ
イシステム。
【請求項８】分析物を検出するための方法であって、（ａ）少なくとも１種の分析物を、不溶性支持体上に固定し、且つ（ｂ）増幅体にリンカーを介してコンジュゲーした適合性ポリペプチド検出体に
結合させ、そして（ｃ）洗浄後、（ｄ）そのシグナルをＰＣＲによって増幅することに特徴付けられる方法。
【請求項９】各種分析物の並行して行われる検出のためのポリペプチド‐核
酸コンジュゲートの使用。